Využití DNA sekvencování v taxonomii prokaryot Mgr. Pavla Holochová, doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Česká sbírka mikroorganismů Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita, Brno
Molekulárně-biologické metody Molekulárněv taxonomii prokaryot • analýza genotypu - DNA, RNA, proteinů • DNA DNA: RFLP, PFGE, DNA-DNA hybridizace PCR metody, ribotypizace, DNA sekvencování
SEKVENCOVÁNÍ • přímá metoda pro detekci sekvenčních polymorfismů • nejvyšší rozlišovací schopnost • sledování evolučního vývoje organismů – tvorba fylogenetických stromů
DNA sekvencování • využití geneticky stabilních genů (housekeeping gene) - nepodléhají přestavbám (delece, inzerce, inverze) - nízká pravděpodobnost bodových mutací v průběhu času Geny vhodné pro sekvencování: 16S rRNA 23S rRNA gen pro elongační faktor Tu geny pro RNA polymerázu (rpoD, rpoB) recA hsp60 gyrB
Konstrukce fylogenetického stromu • PCR amlpifikace
sekvence
• sekvence uloženy v databázích: GenBank, Ridom databáze, cpn60 databáze,... • srovnání sekvencí počítačovými programy: ClustalW, PHYLIP, MEGA4, MUSCLE • konstrukce dendogramu - neighbor-joining (Saitou a Nei, 1987), - maximum likelihood (Felsenstein, 1981) - minimum evolution - ověření správnosti větví – bootstrap analýza • evoluční vzdálenost vyjádřena procentem podobnosti • výsledky nutno potvrdit dalšími metodami – polyfázový přístup
NEVÝHODY DNA SEKVENCOVÁNÍ • nekvalitní, chybné sekvence – problém databází řešení: kontrola sekvencí, využití specializovaných databází • chyby při tvorbě fylogenetických stromů řešení: konstrukce více typů stromů – srovnání výsledků • finanční náročnost
Rod Aeromonas • gram-negativní tyčky, fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní • 16 validně popsaných druhů • výskyt ve vodách, infekce studenokrevných živočichů, průjmovitá onemocnění u lidí • řazení některých druhů do komplexů (A. caviae, sobria, hydrophila) • 16S rRNA - nízká rozlišovací schopnost • další geny: gyrB, rpoD, cpn60 (hsp60/groEL) Phylogenetic analysis and identification of Aeromonas species based on sequencing of the cpn60 universal target. David Miñana-Galbis, Aintzane Urbizu-Serrano, Maribel Farfán, M. Carmen Fusté and J. Gaspar Loren. Int J Syst Evol Microbiol (2009)
Sekvencování u rodu Aeromonas Aeromonas:: cpn60 • zpracováno 47 kmenů rodu Aeromonas • sekvence dostupné v databázi chaperoninů cpnDB (http://cpndb.cbr.nrc.ca) • sekvenace firmou Eurofins MWG Operon, Německo • počítačové programy: ClustalW, MEGA4 • fylogenetický strom – neighbor-joining • ověření správnosti větví – bootstrap analýza • příslušnost k druhu: ≤ 3,5 % • příslušnost k rodu: 3,7 - 16,9 %
A. caviae komplex • druhy: encheleia eucrenophila media caviae • zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál • Výsledek: 3 – potvrzení druhu 5 – zařazení do druhu v komplexu A. caviae 2 – zařazení do jiného druhu
A. hydrophila komplex • druhy: hydrophila popoffii bestiarum salmonicida
• poddruhy A. hydrophila: hydrophila ranae dhakensis
• zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál • Výsledek: 8 – potvrzení druhu a upřesnění poddruhu 4 – zařazení do druhu v komplexu A. hydrophila 2 – zařazení do jiného druhu • identifikace A. hydrophila subsp. dhakensis (P1097) z klinického materiálu
A. salmonicida • poddruhy A. salmonicida: pectinolytica achromogenes salmonicida masoucida smithia nelze odlišit • zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb • Výsledek: 9 – potvrzení druhu 2 – zařazení do jiného druhu
A. sobria komplex • druhy: sobria jandaei veronii biovar Sobria veronii biovar Veronii enterpelogenes shubertii • zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb / klinický materiál
• Výsledek: 3 – potvrzení druhu 3 – zařazení do druhu v komplexu A. sobria 4 – zařazení do jiného druhu - druh „A. diversa“ diversa“ - CCM 7325 (klinický materiál) - nový druh – CCM 7641 (krasová voda)
Vyhodnocení výsledků 47 kmenů: • 23 vzorků - potvrzení druhu a upřesnění poddruhu (49 %) • 12 vzorků - zařazení do druhu v rámci v komplexu (26 %) • 10 vzorků - zařazení do jiného druhu (21 %)
• 2 kmeny –potvrzení nových druhů
Závěr • pro taxonomii rodu Aeromonas - sekvence genu cpn60 vhodnější než sekvence 16S rRNA • vysoká rozlišovací schopnost – potvrzení zařazení kmenů do druhu – identifikace druhu uvnitř komplexu – identifikace poddruhů • aplikovatelnost na kmeny klinické i kmeny z prostředí • odlišení nových druhů
Děkuji za pozornost
