SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi. Oleh :

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR KUERSETIN TOTAL DALAM DAUN TEH SEGAR (Camellia sinensis O.K), TEH HIJAU DAN TEH HITAM MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh : Anastasia Filipa Veritas da Silva NIM : 088114060

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012


VALIDASI METODE DAN PENETAPAN KADAR KUERSETIN TOTAL DALAM DAUN TEH SEGAR (Camellia sinensis O.K), TEH HIJAU DAN TEH HITAM MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh : Anastasia Filipa Veritas da Silva NIM : 088114060

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

"Karena itu Aku berkata kepadamu: Janganlah kuatir akan hidupmu, akan apa yang hendak kamu makan atau minum, dan janganlah kuatir pula akan tubuhmu, akan apa yang hendak kamu pakai. Bukankah hidup itu lebih penting dari pada makanan dan tubuh itu lebih penting dari pada pakaian? (Matius 6:25) Sebab itu janganlah kamu kuatir akan hari besok, karena hari besok mempunyai kesusahannya sendiri. Kesusahan sehari cukuplah untuk sehari." (Matius 6:34) Serahkanlah segala kekuatiranmu kepada-Nya, sebab Ia yang memelihara kamu. (I Petrus 5:7)

“Aku akan menyertai engkau; Aku tidak akan membiarkan engkau dan tidak akan meninggalkan engkau” (Yos 1:5b)

Kupersembahkan karyaku ini untuk : Papa mama tersayang Kakakku tersayang Advent dan Viany Adikku tersayang Vano Sahabat dan teman-temanku Kamu, dia dan mereka Almamater yang kubanggakan

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus atas segala kasih dan karunianya sehingga penelitian yang berjudul “Validasi Metode dan Penetapan Kadar Kuersetin Total dalam Daun Teh Segar (Camellia sinensis O.K.), Teh Hijau, dan Teh Hitam dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik” dapat terlaksana dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu pelaksanaan penelitian ini: 1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata Dharma, Yogyakarta. 2. C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Pharm., Apt. selaku Kepala Program Studi Fakutas Farmasi Sanata Dharma yang telah memberikan ijin penelitian di dalam lingkungan fakultas farmasi. 3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt selaku dosen pembimbing yang telah memberikan informasi, bimbingan, pengarahan, saran, dan koreksi selama pelaksanaan penelitian. 4. Dr. Ir. Ngadiman, M. Si selaku dosen pembimbing lapangan atas bimbingan, saran, dan koreksi selama proses pengambilan sampel. 5. Yohanes Dwiatmaka, M Si dan Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si selaku dosen penguji atas pengarahan, informasi, saran, dan koreksi selama pelaksanaan penelitian ini. 6. Mas Bimo, Pak Parlan dan Pak Kethul yang telah banyak membantu selama penulis melakukan penelitian.

vii


7. Semua pihak di PT Pagilaran atas bantuannya dalam proses pengambilan sampel. 8. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ilmu selama masa kuliah. 9. Bapak Sanjaya dan Angelia Puspita, S.Farm, Apt. yang telah banyak membantu dalam penyusunan skripsi dan sumbangan ilmu yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian. 10. Gregorius da Silva, Maria Anastasia Iing Susilowati, orang tua yang selalu memahami dan memberikan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan sampai menjadi seorang sarjana dengan pribadi yang kuat dan tegar. 11. Fransiskus Borgias Adventus da Silva, Maria Stella Viany da Silva, dan Silvester Rosario Valentino da Silva yang selalu memberikan dorongan semangat dan doa terutama saat kejenuhan datang. 12. Teman seperjuangan Alfonsus Heppy Rosario Dwiyoga, Adi Wirasaputra, dan Paulus Setya Dharma atas suka duka, bantuan, serta dukungannya selama ini. 13. Sahabat-sahabat penulis Ayen, Gina, Tia, Paulina, Tiwi, Putri, Arni, Betty , Efa, Ida, Vita atas bantuan, semangat, dukungan, dan doanya. 14. Arni, Putri, Betty, Shafiera, Wilda untuk warna-warni pengalaman yang kita buat dari masa SMF. 15. Teman-teman kelompok antistress Vica, Seco, Dimbek, Usy, Sasa, Ike, Yuni, Elisa, Novi untuk keceriaan, semangat dan masukan selama penelitian.

viii


16. Teman-teman kost Alma mbak Nia, Tika, Winda, dan Venti atas keceriaannya dan yang diberikan selama ini. 17. Teman-teman KKN kelompok 19 Anggit, Mas Kresna, Cik Lita, Fany, Sari, Blesta, Ayu, Gita untuk keceriaan, semangat dan dukungan selama ini. 18. Teman-teman angkatan 2008 khususnya FST A terima kasih atas bantuan, kenangan, dukungan, dan semua kebersamaan saat kuliah. 19. Kamu, dia, dan mereka yang telah memberikan doa, semangat dan warna dalam kehidupan penulis. Penulis menyadari masih terdapat kekurangan dalam penelitian ini. Oleh karena itu Penulis sangat mengharapkan kritik, saran, dan pendapat dari berbagai pihak guna penyempurnaan penelitian ini di masa datang. Akhir kata semoga penelitian ini dapat memberikan manfaat kepada semua pihak. Atas perhatiannya penulis ucapkan terima kasih.

Penulis

ix


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL......................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.............................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN.....................................................................

iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA.........................................................

v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA..........

vi

PRAKATA......................................................................................................

vii

DAFTAR ISI...................................................................................................

x

DAFTAR TABEL...........................................................................................

xvi

DAFTAR GAMBAR......................................................................................

xv

DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................

xvii

INTISARI.......................................................................................................

xx

ABSTRACT....................................................................................................

xxi

BAB I PENDAHULUAN...............................................................................

1

A. Latar Belakang....................................................................................

1

B. Rumusan Masalah...............................................................................

3

C. Keaslian Penelitian..............................................................................

3

D. Tujuan.................................................................................................

4

E. Manfaat...............................................................................................

4

1. Manfaat Teoritis...........................................................................

4

2. Manfaat Praktis............................................................................

4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.............................................................

5

x


A. Kuersetin.............................................................................................

5

B. Teh......................................................................................................

6

1. Keterangan Botani........................................................................

6

2. Deskripsi Tanaman......................................................................

6

3. Kandungan Kimia........................................................................

6

4. Jenis Teh......................................................................................

7

C. Ekstraksi..............................................................................................

14

1. Ekstrak..........................................................................................

14

2. Ekstraksi........................................................................................

14

3. Soxhlet..........................................................................................

14

4. Cairan Penyari...............................................................................

15

5. Solid Phase Extraction..................................................................

15

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi......................................................

17

1. Definisi dan Instrumentasi...........................................................

17

2. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif..............................................

19

E. Landasan Teori....................................................................................

19

F. Hipotesis.............................................................................................

21

BAB III METODE PENELITIAN.................................................................

22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian..........................................................

22

B. Variabel Penelitian..............................................................................

22

C. Definisi Operasional...........................................................................

22

D. Bahan-bahan Penelitian......................................................................

23

E. Alat-alat Penelitian..............................................................................

23

xi


F. Tata Cara Penelitian............................................................................

23

1. Pengambilan dan Pembuatan Sampel...........................................

24

2. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu............................................

24

3. Pembuatan Larutan Penyari..........................................................

25

4. Ekstraksi dan clean-up..................................................................

25

5. Pembuatan Fase Gerak.................................................................

26

6. Pembuatan Larutan Baku Kuersetin.............................................

26

7. Pembuatan Kurva Baku Kuersetin................................................

27

8. Penetapan nilai % recovery...........................................................

27

9. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Sampel...................................

28

G. Analisis Hasil......................................................................................

28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................

30

A. Pengambilan dan Pembuatan Sampel.................................................

31

B. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu..................................................

31

C. Ekstraksi dan Hidrolisis......................................................................

33

D. Clean-up..............................................................................................

36

E. Pembuatan Fase Gerak........................................................................

37

F. Analisis Kualitatif Kuersetin...............................................................

38

G. Validasi Metode..................................................................................

42

1. Akurasi..........................................................................................

43

2. Linearitas dan Limit of Quantitation.............................................

44

H. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Daun Teh Segar, Teh Hijau, dan Teh Hitam...........................................................................................

xii

45


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.........................................................

48

A. Kesimpulan.........................................................................................

48

B. Saran...................................................................................................

48

DAFTAR PUSTAKA.....................................................................................

49

LAMPIRAN....................................................................................................

52

BIOGRAFI PENULIS....................................................................................

111

xiii


DAFTAR TABEL Tabel I.

Jumlah flavonol teh...................................................................... 7

Tabel II.

Hasil penetapan kadar abu...........................................................

Tabel III.

Hasil penetapan kadar air............................................................. 32

Tabel IV.

Data peningkatan tinggi peak pada tR Kuersetin.......................... 41

Tabel V.

Rata-rata %recovery..................................................................... 43

Tabel VI.

Nilai Koefisien Korelasi............................................................... 44

Tabel VII.

Nilai Limit of Quantitation (LOQ)............................................... 45

Tabel VIII.

Kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam... 46

Tabel IX.

Kesalahan random........................................................................ 47

Tabel X.

Kesalahan sistematik.................................................................... 47

xiv

32


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Struktur kuersetin.....................................................................

5

Gambar 2.

Struktur flavonol......................................................................

7

Gambar 3.

Proses pelayuan........................................................................

9

Gambar 4.

Proses penggulungan...............................................................

9

Gambar 5.

Proses pengeringan..................................................................

10

Gambar 6.

Skematik prosedur SPE..........................................................

16

Gambar 7.

Peralatan KCKT......................................................................

18

Gambar 8.

Reaksi hidrolisis dengan HCL.................................................

35

Gambar 9.

Kromatogram baku kuersetin dan sampel................................

38

Gambar 10.

Kromatogram sampel yang telah dispiking..............................

40

Gambar 11.

Gugus polar dan nonpolar kuersetin........................................

41

Gambar 12.

Gugus auksokrom dan kromofor pada kuersetin.....................

42

xv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Sertifikat analisis kuersetin..........................................

53

Lampiran 2.

Surat Determinasi.......................................................

54

Lampiran 3.

Penimbangan sampel teh segar....................................

55

Lampiran 4.

Penimbangan sampel teh hijau....................................

56

Lampiran 5.

Penimbangan sampel teh hitam.....................................

57

Lampiran 6.

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari awal proses.................................

Lampiran 7.

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari awal proses................................

Lampiran 8.

60

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari proses clean-up..........................

Lampiran 11.

59

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari proses clean-up...........................

Lampiran 10.

58

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari awal proses...............................

Lampiran 9.

58

61

Penimbangan kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari proses clean-up..........................

61

Lampiran 12.

Data kadar air............................................................

62

Lampiran 13.

Data kadar abu teh segar..............................................

62

Lampiran 14.

Data kadar abu teh hijau..............................................

63

Lampiran 15.

Data kadar abu teh hitam.............................................

64

xvi


Lampiran 16.

Kromatogram sampel teh segar tanpa adisi...................

Lampiran 17.

Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin dari awal proses..........................................................

Lampiran 18.

Kromatogram

sampel

teh

hijau

75

Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari awal proses.........................................................

Lampiran 21.

71

tanpa

adisi.......................................................................... Lampiran 20.

67

Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin dari proses clean-up......................................................

Lampiran 19.

64

78

Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari proses clean-up...................................................

82

Lampiran 22.

Kromatogram sampel teh hitam tanpa adisi...................

86

Lampiran 23.

Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari awal proses...........................................................

Lampiran 24.

Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari proses clean-up.......................................................

Lampiran 25.

97

Data kadar kuersetin teh hitam dan contoh perhitungan kadar kuersetin..........................................................

Lampiran 28.

96

Data kadar kuersetin teh hijau dan contoh perhitungan kadar kuersetin...........................................................

Lampiran 27.

92

Data kadar kuersetin teh segar dan contoh perhitungan kadar kuersetin...........................................................

Lampiran 26.

88

Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan

xvii

99


kadar kuersetin dalam teh segar.................................. Lampiran 29.

Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hijau....................................

Lampiran 30.

102

Data recovery untuk proses clean-up sampel teh segar............................................................................

Lampiran 32.

101

Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hitam.....................................

Lampiran 31.

100

103

Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hijau................................................................................ 104

Lampiran 33.

Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hitam...........................................................................

Lampiran 34.

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk keseluruhan proses.........................................................

Lampiran 35.

108

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk proses clean-up.............................................................

Lampiran 39.

107

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk proses clean-up..............................................................

Lampiran 38.

106

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk keseluruhan proses.........................................................

Lampiran 37.

106

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk keseluruhan proses.........................................................

Lampiran 36.

105

108

Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk proses clean-up..............................................................

xviii

109


Lampiran 40.

Random error.................................................................. 109

Lampiran 41.

Systematic error.............................................................. 110

xix


INTISARI Telah dilakukan penelitian tentang validasi metode dan penetapan kadar kuersetin total dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam untuk mengetahui kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dn teh hitam. Ekstraksi dilakukan dengan soxhletasi dilanjutkan proses clean-up yang dilakukan dengan solid phase extraction. Kemudian kuersetin dianalisis dengan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik. Validasi metode dilihat dari parameter % recovery dan penetapan kadar kuersetin total dilakukan berdasarkan analisis data AUC sampel dan kurva baku kuersetin. Dari penelitian ini diketahui kadar kuersetin dalam teh hijau dan te hitam berturut-turut yakni 1431,8863 µg/g dan 2201,1904 µg/g. Nilai % recovery keseluruhan proses untuk daun teh segar, teh hijau dan teh hitam berturut-turut yakni 119,79%, 98,57% dan 102,40% dan nilai %recovery untuk proses clean-up berturut-turut yakni 141,55%, 108,92% dan 135,78%. Berdasarkan hasil tersebut proses clean-up pada daun teh segar dan teh hitam tidak memiliki akurasi yang baik. Kata kunci : kuersetin, daun teh segar, teh hijau, teh hitam, KCKT fase terbalik.

xx


ABSTRACT Has been done research on validation of analytical procedure and determination of total quercetin in fresh tea leaves, green tea and black tea to determine quercetin in the fresh tea leaves, green tea and black. Extraction is done by soxhletasi and clean-up process is done by solid phase extraction method. Then analyzed by of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Reversed phase. Seen from the parameter validation method is % recovery and the determination of total quercetin based on AUC data analysis of samples and standard curve of quercetin. Of this study green tea and black tea containing quercetin total 1431,8863 µg/g and 2201,1904 µg/g. Overall recovery process for fresh tea leaves, green tea and black tea respectively are 119,79%, 98,57% and 102,40% and recovery for clean-up respectvely are 141,55%, 108,92% and 135,78%. Based on these results the clean-up process for fresh tea leaves and black tea does not have good accuray. Key word : Quercetin, fresh tea leaves, green tea, black tea, HPLC reversed phase

xxi


BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Teh merupakan salah satu minuman yang dekat dengan kehidupan kita sehari-hari, yang sering dikonsumsi sebagai minuman penyegaran. Tidak hanya sebagai minuman kesegaran tetapi teh telah lama diyakini khasiatnya bagi kesehatan tubuh karena kandungan antioksidan di dalamnya. Ada banyak jenis teh yang diperdagangkan seperti teh wangi, teh hitam dan teh hijau. Berdasarkan pengolahannya, teh dibedakan menjadi teh hijau dan teh hitam. Teh hijau dibuat dengan cara non-fermentasi. Pada proses pengolahan tersebut terjadi inaktivasi enzim oksidase atau fenolase yang ada dalam pucuk daun teh segar, sehingga oksidasi enzimatik terhadap kandungan fenol dapat dicegah. Sebaliknya teh hitam dibuat dengan cara fermentasi dengan memanfaatkan terjadinya oksidasi enzimatik terhadap kandungan polifenol teh. Di dalam teh terdapat banyak kandungan senyawa aktif yang memiliki manfaat positif bagi masyarakat. Zat bioaktif yang utama terdapat dalam teh, adalahgolongan flavonoid. Berdasarkan struktur dan konformasi cincin C molekul dasarnya, flavonoid dapat digolongkan menjadi 6 kelas, yaitu flavon, flavanon, isoflavon, flavonol, flavanol dan antosianin. Adapun jenis flavonoid utamayang ditemukan pada teh adalah flavanol dan flavonol. (Hartoyo, 2003). Flavonol dalam daun teh terutama kuersetin. Kuersetin dalam tanaman terdapat dalam berbagai bentuk glikosida dan dapat pula bentuk aglikonnya (Erlund, 2002).

1


2

Kuersetin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan antara lain sebagai antioksidan, antikanker, antiinflamasi, antiplatelet, dan antihistamin. Menurut Hartoyo (cit., Septianingrum, dkk 2009) terdapat perbedaan kadar fenol pada teh hijau dengan teh hitam. Perbedaan ini disebabkan karena terdapat perbedaan dalam proses pengolahannya. Karena perbedaan inilah maka dilakukan penetapan kadar kuersetin dalam teh hijau, dan teh hitam untuk mengetahui kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam serta untuk mengetahui apakah proses pengeringan memiliki pengaruh terhadap kadar kuersetin. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). KCKT memiliki kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif sehingga KCKT menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Metode KCKT bersifat selektif dan sensitif sehingga cocok digunakan dalam analisis kuantitatif beberapa senyawa secara simultan (Khopkar, 1990). Kelebihan metode KCKT inilah yang dimanfaatkan oleh peneliti untuk memisahkan kuersetin dari senyawa-senyawa yang memiliki kepolaran yang mirip dengan kuersetin di dalam daun teh, teh hijau dan teh hitam.


3

B. Rumusan Masalah Permasalahan yang dapat dirumuskan berdasarkan latar belakang tersebut yakni berapakah kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam?

C. Keaslian Penelitian Berbagai penelitian terhadap kuersetin telah banyak dilakukan, mulai dari proses ekstraksi, isolasi, aktivitas farmakologisnya. Penelitian dengan judul “HPLC–UV And GC–MS Characterization Of The Flavonol Aglycons Quercetin, Kaempferol, And Myricetin In Tomato Pastes And Other Tomato-Based Products” pernah dilakukan untuk mengidentifikasi dan mengkuantifikasi lima flavonoid dalam tomat (Tokusoglu, 2003). Penetapan kadar flavonoid total terhitung sebagai kuersetin pernah dilakukan dengan menggunakan metode kolometri dalam teh hijau dan teh hitam [merk X] (Pertiwi, 2006). Namun penetapan kadar kuersetin aglikon dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam dengan menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik belum pernah dilakukan sebelumnya.


4

D. Tujuan Mengetahui kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam.

E. Manfaat 1. Manfaat teoritis Memberikan informasi mengenai kandungan kuersetin yang memiliki banyak khasiat dalam tanaman yang telah mengalami pengolahan seperti proses pengeringan, proses fermentasi. 2. Manfaat praktis Memberikan informasi mengenai proses penetapan kadar kuersetin dengan menggunakan metode yang valid.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kuersetin

Gambar 1. Struktur kuersetin

Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhydrat pada suhu 95 - 97° C. Kuersetin larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989). Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat membentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).Kuersetin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan manusia antara lain antioksidan, antiinflamasi, antiplatelet, antikanker, antivirus, dan antihistamin (Paulsen, 2003). Banyak tanaman yang mengandung kuersetin antara lain brokoli, wortel, bawang merah, bawang putih, paprika, buncis, bunga kol, dan teh (Miean dan Mohamed, 2000). Kuersetin dalam tanaman terdapat dalam berbagai bentuk glikosida dan dapat pula bentuk aglikonya (Erlund, 2002). Flavonoid yang secara umum terdapat sebagai glikosida, jika dihidrolisis dengan asam dalam suasana panas akan menghasilkan suatu aglikon dan sebagian kecil gula (Cuppett, 1998).

5


6

B. Teh 1. Keterangan Botani Menurut Steenis (2002), tanaman teh termasuk dalam famili theaceae dengan spesies Camellia sinensis O.K.

2. DeskripsiTanaman : Tanaman teh berbentuk pohon. Tingginya biasanya mencapai belasan meter. Namun, tanaman teh diperkebunan selalu dipangkas untuk memudahkan pemetikan sehingga tingginya 70 cm. Mahkota tanaman teh berbentuk jorong atau agak bulat telur terbalik. Tepi daun bergerigi, daun tunggal dan letaknya hampir berseling. Tulang daun menyirip, permukaan atas daun muda berbulu halus sedangkan permukaan bawahnya bulunya hanya sedikit. Permukaan daun tua halus dan tidak berbulu lagi. Bunga teh berwarna putih dengan serbuk sari berwarna kuning. Tanaman teh mengalami pertumbuhan tunas yang silih berganti. Tunas tumbuh pada ketiak atau bekas ketiak daun. Tunas yang tumbuh kemudian diikuti dengan pembentukan daun. Tunas baru pada teh memiliki daun kuncup (Nazaruddin dan paimin, 1993).

3. Kandungan Kimia Daun teh memiliki banyak kandungan senyawa kimia yang merupakan zat bioaktif. Zat bioaktif yang ada dalam teh, terutama merupakan golongan flavonoid. Adapun flavonoid yang ditemukan pada teh terutama berupa flavanol dan flavonol (Hartoyo, 2003). Flavonol utama yang ada di dalam daun teh adalah kuersetin, kaempferol dan myrycetin. Flavonol ini, terutama terdapat dalam


7

bentuk glikosidanya (berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya. Tabel I. Jumlah Flavonol Teh (Hartoyo, 2003)

Jenis Flavonol Myricetin Quercetin Kaempferol

Jumlah (g/kg) Teh Hijau Teh Hitam 0,83 – 1,59 0,24 – 0,52 1,79 – 4,05 1,04 – 3,03 1,56 – 3,31 1,72 – 2,31

Gambar 2. Gambar struktur flavonol

Selain flavonoid, daun teh juga mengandung alkaloid purin (metil santin): kafein, teobromin, teofilin; katekin : epikatekin, epigaloketekin, epigalokatekin galat, teaflavin, tearubigen; derivat asam kafeat: asam klorogenat dan teogalin; minyak atsiri : linalool (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 2010). 4. Jenis teh Ada tiga tipe utama pengolahan teh, yaitu teh hijau, teh oolong, dan teh hitam. Secara umum teh hijau merupakan teh yang tidak difermentasi, teh oolong merupakan teh yang mengalami fermentasi sebagian dan teh hitam merupakan teh yang mengalami fermentasi penuh (Panuju, 2009).


8

a. Teh Hijau.Daun teh di dikeringkan dari daun Camellia sinensis. Teh hijau dibuat dengan cara menginaktivasi enzim oksidase atau fenolase yang ada dalam pucuk daun teh segar, dengan cara pemanasan atau penguapan menggunakan uap panas, sehingga oksidasi enzimatik dapat dicegah. Aktivitas antioksidan teh hijau enam kali lebih besar dibanding teh hitam (Gruenwald dkk, 2007). Proses pengolahan teh hijau di kebun PT. PAGILARAN, Samigaluh, Kulonprogo terdiri dari proses pemetikan, pelayuan, penggulungan, pengeringan, sortasi dan pengepakan. 1. Pemetikan Pemetikan adalah pemungutan hasil pucuk tanaman teh yang memenuhi syarat-syarat pengolahan.Pengambilan pucuk dilakukan dengan sistem p+2 yakni tumbuhnya dua helai daun setelah peko. Proses pemetikan ini dilakukan jika tanaman sudah berumur 18 bulan karena pada umur ini dianggap kandungan dalam daun teh sudah optimal. 2. Pelayuan Pucuk teh yang telah dipetik selanjutnya dilakukan proses pelayuan. Daun teh yang telah dipetik dilayukan dengan melewatkan daun tersebut pada silinder panas sekitar 5-8 menit dengan suhu 90-100° C. Tujuan dilakukannya proses pelayuan yakni untuk menginaktivasi enzim polifenol oksidase yang ada dalam daun teh itu sendiri, sehingga dapat dicegah terjadinya proses oksidasi serta menurunkan kandungan air dalam pucuk menjadi 60-70% (Syah, 2006).


9

Gambar 3. Proses pelayuan

3. Penggulungan Pucuk teh yang telah melalui proses pelayuan selanjutnya dilakukan penggulungan dengan mesin roller press selama 10-14 menit. Lamanya proses

penggulungan

ini

tergantung

dari

jenis

pucuknya.

Proses

penggulungan ini dilakukan untuk memecah sel-sel daun sehingga cairan di dalam sel keluar di permukaan daun sehingga seduhan teh yang dihasilkan memiliki rasa yang lebih sepet (Syah, 2006).

Gambar 4. Proses penggulungan


10

4. Pengeringan Proses ini dilakukan dengan menggunakan alat repeat roll dengan suhu 7080° C selama 2,5 – 3 jam. Proses pengeringan dilakukan untuk mengurangi kadar air dalam pucuk teh yang sudah digulung hingga kadar air tersisa kurang lebih 2%. Selain itu proses pengeringan juga dilakukan untuk memperkuat bentuk dan aroma dari teh hijau.

Gambar 5. Proses pengeringan

5. Sortasi Teh yang berasal dari proses pengeringan masih bercampur baik bentuk maupun ukurannya. Selain itu teh juga masih mengandung debu, tangkai daun, dan kotoran lain yang akan sangat berpengaruh pada mutu teh nantinya, sehingga diperlukan proses sortasi. Proses sortasi dilakukan secara manual. Proses ini dilakukan dengan memisahkan daun teh yang rusak dan tangkai daunnya. 6. Pengemasan dan pengepakan Teh Hijau yang telah mengalami sortasi selanjutnya di lakukan proses pengemasan.


11

b. Teh Hitam. Teh hitam merupakan teh yang berasal dari pucuk daun teh segar yang dibiarkan sebelum digulung, kemudian daun-daun tersebut dibiarkan selama beberapa jam sebelum dipanaskan dan dikeringkan. Selama itu, enzim yang terdapat pada daun-daun teh akan mengkatalisis reaksi oksidasi senyawa-senyawa yang ada dalam teh sehingga menghasilkan warna, rasa, dan aroma (Hartoyo, 2003).Selama proses oksidasi, adanya enzim pada teh mengubah beberapa polifenol yang memiliki aktivitas terapetik menjadi senyawa yang kurang aktif (Gruenwald, 2007). Proses pengolahan teh hitam di kebun PT. PAGILARAN, Batang terdiri dari proses pemetikan, pelayuan, penggulungan atau penggilingan , fermentasi, pengeringan, sortasi dan pengepakan. 1. Pemetikan Pemetikan adalah pemungutan hasil pucuk tanaman teh yang memenuhi syarat-syarat pengolahan (Arifin, 2009). 2.

Pelayuan Daun-daun teh yang telah dipetik dari kebun segera dibawa ke pabrik dan kemudian dimulai proses pelayuan yang dilakukan dalam withering truck selama 10 – 18 jam. Hal ini dilakukan untuk mengurangi kadar air dari daun teh serta untuk membantu proses pengeringan agar lebih cepat, serta membuat daun teh agar lebih lentur dan mudah digulung, sehingga memudahkan proses penggulungan. Pada proses pelayuan, selama 1 – 2 jam pertama daun teh yang telah dihamparkan dalam withering truck dialiri dengan udara dingin (suhu 24° C) dan selama 10 – 18 jam berikutnya dialiri dengan udara panas


12

(suhu 28° C). Setiap 2 – 3 jam sekali tumpukan daun teh diaduk agar pelayuan berlangsung sempurna pada setiap petikan daun teh (Haryanto, 2012). 3. Penggulungan dan penggilingan Proses penggulungan dilakukan dengan menggunakan mesin open top roller selama ± 40 menit. Tujuan proses penggulungan ini adalah untuk meremas, menggulung dan merobek sel sehingga cairan didalam sel keluar ke permukaan daun sehingga air menempel di permukaan. Daun teh yang telah mengalami

tahap

sampai

tahap

penggulungan

berwarna

hitam

kecoklatan.Kelembapan di ruangan penggulungan ini harus diatur dengan menggunakan humidifier untuk menghambat proses oksidasi, sehingga proses oksidasi terjadi dalam waktu yang tepat. Kelembapan diatur sebesar 90 - 95° dan suhu ruangan 20 - 22° C.Dari hasil penggulungan, selanjutnya dimasukkan kedalam rotary roll breaker untuk proses pengayakan. Dari proses ini dihasilkan teh hitam dengan kualitas no. 1. Serbuk yang masih kasar dimasukkan kembali ke dalam rotorvane untuk dipotong dengan menggunakan pisau tumpul sehingga cairan yang masih ada dalam sel keluar ke permukaan. 4. Fermentasi Proses fermentasi terjadi di ruang oksidasi.Tujuan proses oksidasi ini yakni untuk menjaga kestabilan dan membentuk rasa asli dari teh hitam. Warna akhir produk yang dihasilkan yakni hitam.


13

Ruang oksidasi diatur sedemikian karena pada tahap ini merupakan tahap pengendali mutu teh hitam yang dihasilkan. Teh hitam didiamkan dalam ruangan oksidasi selama minimal 2 jam, maksimal 3 jam. Dilakukan selama 2-3 jam karena jika kurang dari 2 jam ataupun lebih dari 3 jam dapat terjadi kerusakan pada teh hitam. 5. Pengeringan Tujuan dari proses pengeringan ini adalah untuk mengurangi kadar air hingga kadar air dalam teh hitam kurang lebih 3%. Proses pengeringan ini dilakukan selama 22 – 23 menit. Suhu selama proses pengeringan yakni 100 °C pada waktu dimasukkan ke dalam mesin pengering dan 50 °C pada waktu keluar dari mesin pengering. Penurunan suhu ini dilakukan agar teh hitam yang dihasilkan tidak gosong, sehingga hasilnya menjadi tidak baik. 6. Sortasi kering Proses sortasi ini dilakukan berdasarkan warna, kasar halusnya serbuk teh hitam yang dihasilkan, berat jenis. 7. Pengepakan Setelah selesai proses sortasi, dilanjutkan ke tahap pengepakan. Pada proses pembuatan teh hitam, glikosida kuersetin tidak mengalami oksidasi, hal ini terjadi karena ketidakmampuan kuersetin untuk mengalami oksidasi yang mungkin disebabkan karena kelarutan bentuk aglikonnya yang sangat rendah dalam air (Gruenwald, 2007).


14

C. Ekstraksi 1.

Ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). 2.

Ekstraksi Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu

campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent (Harborne, 1987).Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung simplisia (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986). 3.

Soxhlet Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan soxhletasi menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 2000).


4.

15

Cairan Penyari Senyawa fenolik umumnya diekstraksi menggunakan air, metanol, etanol

aseton, etil asetat maupun kombinasi dari pelarut-pelarut tersebut. Keberadaannya yang tertempel dengan gula cenderung untuk menyebabkan senyawa fenolik lebih larut dalam air, dan dengan demikian kombinasi pelarut diatas dengan air cocok untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavonol cenderung untuk lebih larut dalam pelarut non-aquaeous (Escribano dan Santos, 2010). 5.

Solid-Phase Extraction Solid Phase Extraction merupakan alternatif metode yang cepat, mudah,

dan ekonomis karena secara signifikan mngurangi volume pelarut organik yang dibutuhkan. SPE digunakan untuk mengekstrak senyawa dari cairan matriks dan dapat juga digunakan sebagai metode pemurnian / fraksinasi(Escribano dan Santos, 2010). Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair adalah: a. Proses ekstraksi lebih sempurna b. Pemisahan analit dari pengganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien c. Mengurangi pelarut organik yang digunakan d. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan (Gandjar dan Rohman, 2009). Ada 4 tahap dalam prosedur SPE, yaitu: a.

Pengkondisian. Cartridge (Penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk

membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama,


16

sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. b.

Retensi (tertahannya) sampel.Larutan sampel yang dilewatkan ke cartridge

baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi. c.

Pembilasan. Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang

tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi. d.

Elusi. Tahap ini merupakan tahap akhir untuk mengambil analit yang dituju

jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

Gambar 6. Skematik prosedur SPE

D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1. Definisi dan Instrumentasi Menurut Hendayana (2006), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase


17

diam di bawah aliran fase gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai. Ada dua fase dalam kromatografi yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal apabila fase diam lebih polar dari fase gerak, sedangkan fase terbalik yaitu apabila fase diam lebih non polar dari fase geraknya (Munson, 1991). Menurut Harris (2011), komposisi pokok dari instrumentasi KCKT yakni kolom, sistem penghantar pelarut, katup penginjeksian sampel, detektor, dan perekam atau komputer untuk menampilkan hasil pemisahan. a.

Kolom.Kolom merupakan bagian KCKT yangmana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit (Rohman, 2009). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar (Rohman, 2009). Kolom kromatografi dapat dipanaskan untuk mengurangi kekentalan dari pelarut. Kekentalan pelarut yang berkurang ini mengakibatkan tekanan menurun atau mempercepat aliran (Harris, 2011). b.

Wadah fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase

gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Adanya partikel yang kecil dapat berkumpul dalam kolom atau dalam tabung


18

yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan suatu kekosongan pada kolom atau tabung tersebut. Karenanya, fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini (Gandjar dan Rohman, 2007). c.

Tempat penyuntikkan sampel.Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan

secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat (Rohman, 2009). d.

Detektor.Idealnya suatu detektor harus mempunyai karakteristik mempunyai

respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel, mempunyai sensitifitas yang tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak (Gandjar dan Rohman, 2007). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen–komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).

Gambar 7. Peralatan KCKT


19

2. Analisis Kualititatif dan Kuantitatif Analisis kualitatif KCKT berupa pengamatan waktu retensi (tR) senyawa baku dan senyawa yang tidak diketahui dibandingkan dengan cara kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).Masing-masing senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu seperti kolom, suhu, dan laju sehingga dapat digunakan sebagai salah satu dasar uji kualitatif (Noergrohati, 1994). Selain itu analisis kualitatif KCKT juga dilakukan dengan cara spiking. Spiking dilakukan dengan menambah sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan diselidiki dengan senyawa baku pada kondisi kromatografi yang sama. Jika pada puncak tertentu yang diduga mengandung senyawa yang diselidiki terjadi peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di-spiking dibandingkan dengan tinggi puncak /luas puncak yang tidak dilakukan spiking, maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung senyawa yang kita selidiki (Rohman, 2009). Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.(Gandjar dan Rohman, 2007).

E. Landasan Teori Daun teh merupakan salah satu tanaman yang banyak digunakan sebagai minuman yang dipercaya memiliki banyak khasiat. Berdasarkan proses pengolahannya teh dibagi menjadi teh hijau dan teh hitam. Teh hijau diproduksi dengan menguapkan air dari daun teh segar dan proses pelayuan dilakukan


20

sesegera mungkin untuk mencegah terjadinya proses oksidasi. Teh hitam diproduksi dengan mengoksidasi bagian daun. Selama proses oksidasi, adanya enzim pada teh mengubah beberapa polifenol yang memiliki aktivitas terapetik menjadi senyawa yang kurang aktif tetapi senyawa kuersetin tidak mengalami proses oksidasi karena sifat kuersetin yang sukar larut dalam air sehingga kuersetin tidak mampu mengalami proses oksidasi. Kuersetin merupakan senyawa yang berwarna kuning yang larut dalam asam asetat glasial, etil asetat, sukar larut dalam alkohol dan praktis tidak larut dalam air. Kuersetin merupakan salah satu senyawa alam yang terdapat dalam tanaman teh yang merupakan kelompok flavonoida golongan flavonol. Kuersetin memiliki banyak manfaat bagi kesehatan antara lain antioksidan, antiinflamasi, antiplatelet, antikanker, antivirus, dan antihistamin. Kebanyakan flavonoid di alam terdapat sebagai glikosida. Untuk dapat mengetahui kadar kuersetin total yang terdapat dalam daun teh maka perlu dilakukan proses hidrolisis untuk memecah ikatan antara kuersetin aglikon dengan gula yang terikat. Proses ekstraksi dilakukan menggunakan metode soxhletasi dan proses fraksinasi menggunakan solid-phase extractiondengan cartridge C18.Selanjutnya dari hasil fraksinasi dilakukan analisis dengan metode KCKT. Analisis kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau,dan teh hitam dapat dilakukan dengan metode KCKT karena metode ini selektif dalam memisahkan senyawa multikomponen dengan waktu yang relatif singkat. Penetapan kadar kuersetin total dalam daun teh segar, teh hijau,dan teh hitam dilakukan untuk


21

mengetahui apakah proses pengeringan dan proses fermentasi berpengaruh terhadap kadar kuersetin pada daun teh.

F. Hipotesis Daun teh segar, teh hijau dan teh hitam mengandung kuersetin.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental deskriptif, karena terdapat intervensi terhadap subyek uji.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas pada penelitian ini adalah jenis teh yang digunakan 2. Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar kuersetin yang terdapat dalam daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam. 3. Variabel pengacau pada penelitian ini adalah a. Kemurnian pelarut yang digunakan, sehingga digunakan pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian cukup tinggi. b. Suhu saat proses ekstraksi, dapat diatasi dengan menentukan suhu yang akan digunakan dan menjaganya dalam keadaan konstan yakni 90° C.

C. Definisi Operasional 1. Sistem kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan kolom fase diam oktadesil silika (C18) dan komposisi fase gerak metanol - aqua bidestilata – asam fosfat 5% (54 : 45 : 1) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit, suhu oven 30° C, λ 370 nm.

22


23

2. Teh yang digunakan yakni daun teh segar, teh hijau yang diperoleh dari perkebunan PT. PAGILARAN, Samigaluh dan teh hitam yang diperoleh dari perkebunan PT. PAGILARAN, Batang.

D. Bahan-bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yakni baku kuersetin (Sigma Aldrich), metanol pro analysis (E. Merck), Butyl Hidroksi Toluen (E. Merck), asam klorida, asam fosfat, aquabidestilata, sampel daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam.

E. Alat-alat Penelitian Alat yang digunakan seperangkat alat KCKT fase terbalik terdiri : seperangkat alat KCKT dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C18 merek SHIMADZHU, Dimensi 150 x 4,6 mm, 5 m, seperangkat komputer (chasing merek Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), degassing ultrasonikator (Retsch tipe T460 no V935922013 EY), organic solvent membrane filter Whatman (0,45m), membran filter Whatman ukuran pori 0,5 µm dan diameter 47 mm, neraca analitik dengan kepekaan 0,001 (Ohaus Carat Series PAJ 1003), milipore, mikropipet, indikator pH, Moisture Balance, Rotary evaporator, seperangkat alat gelas, solid-phase extraction cartridge C-18.


24

F. Tata Cara Penelitian 1. Pengambilan dan pembuatan sampel Sampel yang digunakan berupa lembaran pucuk daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam. Teknik pengambilan daun teh segar diambil secara acak mewakili setiap deret tanaman teh di lahan perkebunan teh PT. PAGILARAN. Sampel teh hijau dan teh hitam diambil secara acak dari hasil produksi di pabrik PT. PAGILARAN selanjutnya dilakukan proses pencacahan daun teh segar dan proses penyerbukan teh hijau dan teh hitam.

2. Penetapan Kadar Air dan Kadar Abu a. Daun Teh Segar: a.1. Uji Kadar Air. 5 gram teh segar yang telah di blender ditimbang seksama, masukkan ke dalam krus yang telah ditara sebelumnya, masukkan ke dalam alat gravimetri, catat kadar air yang terukur pada alat gravimetri. a.2. Uji Kadar Abu. 3 gram teh segar yang telah di blender ditimbang seksama, masukkan ke dalam krus platina yang telah dipijarkan dan ditara. Ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga aran habis, dinginkan, timbang. Jika dengan cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara.


25

b. Teh Hijau dan teh hitam. Dilakukan dengan cara yang sama seperti penetapan kadar abu dan kadar air dalam daun teh segar.

3. Pembuatan Larutan Penyari Larutan penyari yang digunakan untuk proses ekstraksi dan fraksinasi dalam penelitian ini adalah metanol-air (90-10) yang mengandung 1,85 M HCl. HCl 1,85 M dibuat dengan mengambil sebanyak 163,40 mL HCl 11,32 M dengan menggunakan buret kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 mL, kemudian ditambahkan dengan metanol-air (90-10) hingga batas tanda, kocok homogen.

4. Ekstraksi dan Clean-up a. Sampel daun teh segar. Masing-masing ditimbang kurang lebih 8 gram dengan seksama daun teh segar yang telah di blender, teh hijau dan teh hitam yang telah dihaluskan. Kemudian dimasukkan kedalam teabag dan dimasukkan dalam tabung soxhlet dengan 240 mL larutan penyari dalam labu erlenmeyer. Kedalam larutan penyari ditambahkan Butil Hidroksi Toluen (BHT) sebanyak 240 mg. Proses ekstraksi ini dilakukan pada suhu 90° C sebanyak sirkulasi yang telah dioptimasi pada proses optimasi ekstraksi yakni 18 kali sirkulasi. Ekstrak yang diperoleh selanjutnya dimasukkan kedalam labu takar 250 mL dan ditambahkan dengan larutan penyari hingga batas tanda.


26

25 mL ekstrak dipekatkan hingga volume 5 mL. Sebanyak 0,1 mL dimasukkan kedalam cartridge C-18 yang telah dikondisikan dengan larutan HCl pH 3. Selanjutnya elusi dengan metanol 6 mL. fraksi yang diperoleh ditampung dalam flakon.

5. Pembuatan fase gerak Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanolaquabidestilata-asam fosfat(54:45:1). Larutan asam fosfat 5% dibuat dengan mengambil sebanyak 29,4 mL asam fosfat 85% menggunakan buret 50 mL ke dalam labu takar 500 mL dan ditambahkan dengan akuabides hingga batas tanda. Kemudian disaring menggunakan anorganic membran filter (Whatman). Fase gerak ini selanjutnya didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator.

6. Pembuatan larutan baku kuersetin a. Pembuatan larutan stok. Kuersetin baku ditimbang lebih kurang 25 mg dengan seksama serbuk kuersetin dan dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu takar 25,0 mL hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi 1000 ppm. b. Pembuatan seri larutan baku kuersetin. Lima seri larutan baku kuersetin dibuat dengan konsentrasi10, 20, 30, 40 dan 50 ppm dengan cara mengambil larutan intermediet kuersetin dengan mikropipet100, 200, 300, 400 dan 500µL kemudian diencerkan dengan methanol p.a dalam labu takar 10,0 mL hingga batas tanda. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing selama 15 menit dengan ultrasonikator.


27

7. Pembuatan kurva baku kuersetin Seri larutan baku dengan konsentrasi 10, 20, 30, 40, dan 50 ppm, masingmasing larutan disaring dengan menggunakan millipore kemudian didegassing dengan ultrasonikator selama 15 menit dan 20 µL dari masing-masing larutan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik dengan fase diam C18 dan fase gerak metanol-aquabidestilata-asam fosfat (54:45:1) pada kecepatan alir 1,0 mL/menit. Dari kromatogram diperoleh luas area kuersetin untuk masing-masing konsentrasi. Luas area ini kemudian diplotkan terhadap konsentrasi kuersetin untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx + a. 8. Penetuan nilai % recovery a. %

Recovery

keseluruhan

proses.

Kedalam

masing-masing

sampel

ditambahkan kuersetin baku 5mg, 10mg, 15mg dan 20mg. Masing-masing sampel yang telah diadisi dengan kuersetin baku kemudian di ekstraksi dengan

metode

soxhletasi dan

dilakukan

proses clean-up

dengan

menggunakan SPE cartridge C18. Selanjutnya sampel disaring dengan milipore dan didegassing

selama 15 menit. Sejumlah 20µL diinjeksikan

kedalam sistem KCKT. Nilai AUC yang diperoleh selanjutnya dimasukkan kedalam persamaan kurva baku sehingga akan diperoleh kadar kuersetin dalam sampel. Kemudian dihitung nilai % recovery menggunakan rumus sebagai berikut : % recovery =

x 100%

b. Recovery proses SPE. Kedalam masing-masing ekstrak yang akan dilakukan proses clean-up ditambahkan kuersetin baku 5mg, 10mg, 15mg dan 20mg.


28

Masing-masing sampel yang telah diadisi dengan kuersetin selanjutnya disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Sejumlah 20µL diinjeksikan kedalam sistem KCKT. Nilai AUC yang diperoleh selanjutnya dimasukkan kedalam persamaan kurva baku sehingga akan diperoleh kadar kuersetin dalam sampel. Replikasi dilakukan 2 kali.

9. Penetapan kadar kuersetin dalam sampel Sampel yang digunakan yakni fraksi metanol daun teh segar, fraksi metanol teh hijau dan fraksi metanol teh hitam. Fraksi metanol kemudian disaring dengan millipore, kemudian didegassing selama 15 menit dengan ultrasonikator. Sampel yang telah dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT yang telah dioptimasi sehingga didapatkan kromatogram sampel dan dibaca AUC dari masing-masing replikasi. Masukkan hasil AUC ke persamaan kurva baku kuersetin dari hasil validasi sehingga diperoleh kadar kuersetin dalam sampel. Replikasi dilakukan 5 kali.

G. Analisis Hasil Metode yang valid yang akan digunakan untuk penetapan kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam dilihat dari parameter akurasi yang dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (% recovery) . Analisis kualitatif dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan baku kuersetin dan dengan cara spiking, kemudian dilihat terjadinya peningkatan tinggi puncak/luas puncak setelah di spiking. Analisis kuantitatif dapat dihitung


29

dengan memasukkan AUC sampel ke dalam persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva baku kuersetin hasil validasi y = bx + a sehingga di dapat kadarnya. Satuan kadar kuersetin adalah %b b.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan oleh Dharma (2012) mengenai optimasi proses ekstraksi kuersetin total, Dwiyoga (2012) mengenai optimasi dan validasi penetapan kadar kuersetin total dalam teh hijau, Wirasaputra (2012) mengenai optimasi jenis fase diam dan komposisi fase gerak proses clean-up dengan metode solid phase extraction. Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Dharma (2012) diperoleh proses ekstraksi yang optimum yakni menggunakan proses soxhletasi sekaligus dengan proses hidrolisis dengan menggunakan larutan penyari metanol-air (90-10) yang mengandung HCl 1,85 M pada suhu 90°C. Proses ekstraksi dengan metode soxhletasi ini dilakukan hingga tercapai 18 sirkulasi. Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Wirasaputra (2012) diperoleh proses clean-up yang optimal yakni tahap conditioning menggunakan air-HCl, tahap elusi menggunakan metanol 100% sebanyak 6-10 mL Dari hasil optimasi yang dilakukan oleh Dwiyoga (2012) diperoleh sistem KCKT yang optimum yakni menggunakan fase diam oktildesilsilan (C-18), campuran fase gerak metanol:aquabidest:asam fosfat 5% (54:45:1), kecepatan alir 1,0 mL/menit, suhu oven 30° C. Penelitian ini juga didasarkan pada validasi HPLC yang dilakukan oleh Dwiyoga (2012) yang telah memenuhi persyaratan validasi.

30


31

A. Pengambilan dan Pembuatan Sampel Sampel yang digunakan dalam penelitian yakni daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam. Teknik pengambilan sampel untuk daun teh segar dilakukan secara acak mewakili seluruh tanaman teh perkebunan teh, Kulonprogo, hal ini dilakukan untuk mendapatkan hasil yang representatif. Sampel teh hijau berupa tanaman kering, teknik pengambilan sampel dilakukan secara acak mewakili seluruh hasil produksi teh hijau. Begitu pula pada teknik pengambilan sampel teh hitam. Teh hijau dan teh hitam diperoleh dari pucuk daun teh segar yang diolah di pabrik PT. PAGILARAN, selanjutnya diserbukhaluskan dan kemudian diayak untuk mendapatkan ukuran partikel yang lebih kecil dan seragam. Daun teh segar yang diperoleh selanjutnya dilakukan sortasi basah untuk membuang bahan lain yang tidak diinginkan, selanjutnya dilakukantahapan pencucian. Daun teh yang sudah disortasi dan dicuci selanjutnya diblender untuk memperkecil ukuran partikel sehingga luas permukaan kontak dengan larutan penyari semakin besar dengan demikian jumlah senyawa yang tersari semakin besar. Kemudian ditimbang kurang lebih 8 gram dengan seksama masing-masing sampel dan dimasukkan kedalam tea bag.

B. Penetapan Kadar air dan Kadar Abu Daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam yang akan ditetapkan kadarnya harus memenuhi syarat kadar abu dan kadar air yang telah ditetapkan, oleh karena itu perlu dilakukan penetapan kadar abu dan penetapan kadar air untuk


32

mengetahui kelayakan dari daun teh segar, teh hijau dan teh hitam yang akan dianalisis. Penetapan kadar abu dilakukan untuk mengetahui tingkat pengotoran oleh logam dan silikat. Tabel II menyajikan data mengenai kadar abu dari daun teh segar, teh hitam, dan teh hijau. Sebelum digunakan krus platina dipijarkan terlebih dahulu untuk menghilangkan logam dan silikat yang mungkin masih terdapat dalam krus platina sehingga dapat meningkatkan kadar abu dari teh yang ditetapkan kadar abunya. Tabel II. Hasil penetapan kadar abu

Sampel Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

Kadar abu (%) 2,01 2,95 0,83

Dari data diatas dapat dikatakan seluruh sampel yang akan digunakan memenuhi syarat kadar abu yakni kurang dari 4 % (Rahardian, 2011). Penetapan kadar air dilakukan untuk mengetahui seberapa besar kandungan air dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam. Tabel III menyajikan data mengenai kadar air dari daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam. Tabel III. Hasil penetapan kadar air

Sampel Kadar air (%) Daun teh segar 78,04 Teh hijau 6,07 Teh hitam 7,88 Kadar air daun teh segar yakni lebih dari 70%, hal ini menunjukkan bahwa sebagian besar kandungan dalam daun teh segar yakni air. Hal ini karena daun teh segar belum mengalami pengolahan apapun seperti proses pengeringan sehingga kandungan air pada daun teh segar sangat tinggi. Berbeda dengan kadar


33

air pada teh hijau dan teh hitam, kadar air pada teh hitam yakni 7,88 % dan pada teh hijau kadar air nya yakni 6,07 %. Menurut Rahardian (2011), jumlah ini masih memenuhi syarat yakni kurang dari 8,00 %. Dilihat dari parameter kadar abu dan kadar air, daun teh segar, teh hijau dan teh hitam memiliki mutu yang baik.

C. Ekstraksi dan Hidrolisis Ekstraksi merupakan kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Dengan

diketahuinya

senyawa

aktif

yang

dikandung

simplisia

mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat

akan

(Direktorat

Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986). Proses terekstraksinya zat aktif dari sel tanaman adalah pelarut organik akan berdifusi menembus dinding sel dan masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik tersebut sehingga perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif didalam sel dan pelarut organik diluar sel, maka larutan akan terdisitribusi keluar sel dan proses ini terulang terus sampai terjadi kesetimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif didalam sel dan diluar sel (List dan Schmidt, 1989). Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sokletasi. Sokletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2000). Prinsip metode sokhletasi yakni


34

pelarut terkondensasi dari labu menuju pendingin, kemudian jatuh membasahi sampel dan mengisi bagian tengah alat sokhlet. Tabung sifon juga terisi dengan larutan penyari dan ketika mencapai bagian atas tabung sifon, larutan tersebut akan kembali ke dalam labu. Kebanyakan flavonoid di alam terdapat sebagai glikosida. Flavonoid glikosida menunjukkan kelarutan yang baik dalam air dibandingkan dengan aglikonnya. Beberapa senyawa flavonoid seperti flavon dan flavonol, umumnya tidak tertandai sebagai senyawa utuh, tetapi dalam bentuk aglikonnya. Kuersetin di dalam daun teh terdapat dalam berbagai bentuk glikosida antara lain kuersetin3-glukosida (isokuersetin), kuersetin-3-rhamnoside (kuersitrin) dan kuersetin-3rutinoside (rutin). Karena alasan tersebut, prosedur hidrolisis diperlukan untuk memecah ikatan glikosida selama proses ektraksi (Escribano dan Santos, 2010). Suhu yang digunakan selama proses ekstraksi yakni 90 °C. Dalam proses sokhletasi dibutuhkan pelarut yang dapat menyari zat yang diinginkan. Dari proses optimasi ekstraksi yang telah dilakukan sebelumnya, pelarut yang digunakan selama proses penyarian yakni metanol-air (90-10) yang mengandung HCL 1,85 M (Dharma, 2012). Menurut Markham (1988), adanya sejumlah gugus hidroksil atau mempunyai gugus gula, flavonoid juga bersifat polar dan karenanya cukup larut dalam pelarut polar seperti metanol. Kuersetin memiliki sejumlah gugus hidroksil, sehingga inilah alasan digunakan metanol sebagai cairan penyari. Pada suhu 90 °C metanol dalam larutan penyari akan menguap dan terembunkan kembali membasahi tea bag sehingga dapat menyari daun teh tersebut. Analit yang ingin di ekstraksi yakni kuersetin. Senyawa-senyawa yang


35

tersari dalam metanol akan tertampung dalam labu yang berisi larutan penyari yang mengandung HCl. Senyawa-senyawa tersebut akan mengalami proses hidrolisis. Proses hidrolisis ini dilakukan untuk merubah kuersetin bentuk glikosida menjadi kuersetin bentuk aglikonnya dalam suasana asam. Larutan HCl berfungsi sebagai katalisator yang dimaksudkan untuk mempercepat terjadinya reaksi hidrolisis serta untuk mempertahankan kuersetin tetap dalam bentuk molekulnya. Menurut Harborne (1987), flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan dalam beberapa bentuk glikosida dan aglikon flavonoid yang mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida, karena alasan itulah, maka dalam menganalisis flavonoid biasanya lebih baik bila memeriksa aglikon yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan yang telah dihidrolisis sebelum memperhatikan kerumitan glikosida yang mungkin terdapat dalam ekstrak asal. Dalam daun teh, kuersetin terdapat dalam bentuk glikosida dan aglikonnya, untuk dapat mengukur kuersetin total maka diperlukan proses hidrolisis untuk memutuskan ikatan antara glikosida dengan aglikonnya sehingga diperoleh kuersetin aglikon. OH OH OH

OH HO

H2O/H +

O

HO

O OH

O gula OH

O

Gula

OH

O

Gambar 8. Reaksi hidrolisis dengan HCl

D. Clean-up


36

Ekstrak yang diperoleh selanjutnya dilakukan proses clean-up untuk mendapatkan kuersetin dengan jumlah pengotor yang sedikit. Proses clean-up ini dilakukan dengan menggunakan kolom solid phase extraction cartridge C-18. Proses ini dimaksudkan untuk menghilangkan senyawa-senyawa yang bersifat lebih nonpolar dibandingkan dengan kepolaran kuersetin yang dapat mengganggu analisis dengan metode KCKT. Proses clean-up dilakukan dengan menggunakan Solid Phase Extraction (SPE) yang didasarkan pada polaritas dan keasaman. Secara umum SPE digunakan untuk menghilangkan senyawa phenolic non polar (Mumper dan Dai, 2010). Sebanyak 25 mL ekstrak metanol-air dipekatkan hingga volume 5 mL. Sebanyak 0,1 mL sampel dimasukkan kedalam cartridge yang telah dikondisikan terlebih dahulu dengan larutan HCl yang memiliki pH 3. Larutan HCl yang digunakan memiliki pH 3 dimaksudkan untuk membuat kuersetin berada dalam bentuk molekul dimana pada kondisi asam kuersetin berada dalam bentuk molekul utuh. Sifat kuersetin yang bersifat asam ditunjukkan dari adanya gugus – OH pada struktur kuersetin. Pengkondisian dengan larutan HCl ini dilakukan untuk memastikan interaksi yang terjadi antara analit yakni kuersetin dengan fase diam berlangsung secara konsisten sehingga memberikan hasil pemisahan yang optimal. Selanjutnya dilakukan proses elusi dengan metanol. Cartridge C-18 bersifat nonpolar sehingga akan menahan senyawa-senyawa dalam sampel yang cenderung bersifat nonpolar dan senyawa-senyawa yang cenderung bersifat polar, yang larut dalam metanol


37

akan terelusi keluar dari kolom. Kuersetin merupakan senyawa yang bersifat polar sehingga akan terelusi dengan metanol.

E. Pembuatan Fase Gerak Pada tahap analisis dengan KCKT digunakan fase diam C-18 dan fase gerak metanol : akuabides : asam fosfat 5% (45:54:1). Fase gerak bersifat lebih polar dibandingkan dengan fase diam sehingga pada penelitian ini digunakan metode KCKT fase terbalik. Metanol dipilih sebagai salah satu komposisi fase gerak karena metanol memiliki viskositas yang lebih kecil dibanding dengan etanol karena jika viskositas terlalu besar dapat meningkatkan tekanan pompa pada KCKT. Dari hasil optimasi jenis dan komposisi fase gerak digunakan pula akuabides agar kuersetin dapat terpisah dari senyawa-senyawa yang bersifat lebih polar dibanding kuersetin sehingga senyawa-senyawa polar dapat terelusi lebih dulu. Penggunaan asam fosfat pada komposisi fase gerak dimaksudkan untuk mengurangi tailing pada puncak kuersetin. Masing-masing komposisi dari fase gerak disaring dengan menggunakan kertas Whatman untuk mengilangkan partikel-partikel dalam fase gerak yang mungkin dapat menyumbat kolom. Selanjutnya larutan didegassing dengan ultrasonikator untuk menghilangkan gelembung udara yang dapat memperngaruhi tekanan pada pompa KCKT.


38

F. Analisis Kualitatif Kuersetin Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi kuersetin baku dengan waktu retensi kuersetin dalam sampel. Waktu retensi (tR) dapat digunakan untuk analisis kualitatif karena masing-masing senyawa memiliki waktu retensi yang spesifik pada kondisi tertentu (Noegrohati, 2004). Dari hasil kromatogram menunjukkan tR kuersetin baku, daun teh segar, teh hijau, dan teh hitam berturut-turut yakni 15,746 ; 15,858 ; 15,775 ; 15,657. Gambar 9. menunjukkan adanya kemiripan antara waktu retensi kuersetin baku dengan waktu retensi kuersetin dalam sampel sehingga dapat dikatakan bahwa didalam sampel daun teh segar, teh hijau dan teh hitam mengandung kuersetin.

Kuersetin

(a)

Kuersetin

(b) Gambar 9. (a) kromatogram baku kuersetin 30 ppm, (b) kromatogram sampel teh segar


39

Kuersetin

(c)

Kuersetin

(d) Gambar 9. (c) kromatogram sampel teh hijau, (d) kromatogram sampel teh hitam Analisis kualitatif juga dilakukan dengan menspiking sampel dengan baku kuersetin sehingga terjadi peningkatan tinggi puncak (Rohman, 2007). Dari kromatogram yang diperoleh dapat dilihat terjadi peningkatan tinggi puncak pada tR kuersetin. Tabel IV. menunjukkan peningkatan tinggi puncak pada tR kuersetin sehingga dapat dikatakan bahwa sampel daun teh segar, teh hijau dan teh hitam mengandung kuersetin.


40

Kuersetin

(a)

Kuersetin

(b) Kuersetin

(c) Gambar 10. (a) Kromatogram Daun teh segar yang telah dispiking (b) Kromatogram teh hijau yang telah dispiking (c) Kromatogram teh hitam yang telah dispiking


41

Tabel IV. Data peningkatan tinggi peak pada tR kuersetin

Sampel

Tinggi puncak sebelum dispiking

Tinggi puncak setelah dispiking

Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

1985 5599 6741

8318 37177 33139

Waktu retensi suatu analit dipengaruhi oleh interaksi analit dengan fase diam dan fase gerak. Pada penelitian ini digunakan fase diam C-18 yang bersifat non polar dan fase gerak campuran metanol:akuabides:asam fosfat 5% yang bersifat lebih polar dibandingkan dengan fase diam. Sistem fase gerak bersifat lebih polar dibanding fase diam maka senyawa-senyawa yang bersifat polar akan terelusi lebih dulu dibandingkan dengan senyawa yang bersifat lebih non polar karena senyawa yang bersifat lebih polar akan berinteraksi lebih kuat dengan fase gerak dibandingkan dengan fase diam, sehingga akan terlelusi lebih dahulu dan senyawa yang bersifat lebih nonpolar akan terelusi lebih lama. Dilihat dari kromatogram kuersetin bersifat lebih non polar dibanding dengan senyawasenyawa yang bersifat lebih polar sehingga kuersetin lebih lama tertahan di fase diam dan memiliki tR yang lebih lama dibanding senyawa-senyawa yang bersifat polar.

Gambar 11. Gugus polar dan non polar kuersetin


42

Senyawa yang dapat di baca oleh detektor UV harus memiliki gugus kromofor dan auksokrom. Kuersetin memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang ultraviolet. Gugus kromofor merupakan gugus yang bertanggung jawab pada penyerapan ultraviolet, sedangkan gugus auksokrom merupakan gugus yang bertanggungjawab terhadap pergeseran panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum kuersetin. Gambar 16. menunjukkan gugus auksokrom dan kromofor yang terdapat pada kuersetin Auksokrom Kromofor

Gambar 12. Gugus auksokrom dan kromofor pada kuersetin

G. Validasi Prosedur Analisis 1. Akurasi Validasi merupakan suatu pembuktian terhadap suatu pearameter berdasarkan hasil laboratorium bahwa parameter tersebut memenuhi syarat untuk penggunaannya (Gandjar dan Rohman, 2007). Parameter validasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketepaatan (akurasi), linieritas dan LOQ (limit of Quantitation).


43

Akurasi adalah ketepatan prosedur analisis yang menyatakan kedekatan antara suatu nilai yang sebenarnya. Dalam penelitian ini akurasi ditentukan dengan metode penambahan baku (standard addition method). Metode penambahan

baku

dilakukan

dengan

menambahkan

sejumlah

tertentu

baku/standar ke dalam sampel. Akurasi dinyatakan dengan % recovery. Recovery merupakan presentase analit yang dapat diekstraksi dan dianalisis dari sampel yang telah ditambahkan analit pada konsentrasi tertentu (Anonim, 2003). Penetapan % recovery ini dilakukan untuk mengetahui bahwa keseluruhan metode maupun metode clean-up yang digunakan untuk penetapan kadar kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam tidak menghilangkan kuersetin selama proses analisis. Nilai AUC yang diperoleh dari sampel yang diadisi selanjutnya dimasukkan kedalam persamaan kurva baku yakni y = 15390.57648 + 49597.53525x untuk kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 48032 – 235472 dan y = -368905.21654 + 61531.85173x untuk kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 255785 – 2705929. Tabel V. menunjukkan hasil penetapan % recovery kuersetin untuk keseluruhan proses analisis dan Tabel VI. menunjukkan hasil penetapan % recovery kuersetin untuk proses clean-up. Tabel V. Rata-rata % recovery


% recovery keseluruhan proses 119,79 98,57 102,40

% recovery proses clean-up 141,55% 108,92% 135,78%


44

Dari hasil yang diperoleh hanya sampel teh segar adisi 5 mg dan 20 mg yang tidak memenuhi persyaratan recovery berdasarkan Codex guideline yakni 70 – 110. Sedangkan untuk sampel adisi dari proses clean-up seluruh sampel tidak memenuhi syarat recovery berdasarkan Codex guideline. 2. Linearitas dan Limit of Quantification (LOQ) Data konsentrasi dan AUC dari matriks sampel yang telah dispike dengan baku kuersetin selanjutnya dimasukkan kedalam program powerfit untuk dapat mengetahui sebaran seluruh data adisi kuersetin baku kedalam matriks sampel sehingga diperoleh persamaan regresi linier. Linearitas merupakan kemampuan prosedur analisis untuk memperoleh hasil percobaan yang berbanding lurus dengan konsentrasi analit di dalam sampel (ICH, 2005). Hubungan yang linier ini dilihat dari nilai koefisien korelasi (r) yang menyatakan korelasi antara jumlah analit dengan AUC yang dihasilkan. Tabel VI. menunjukkan nilai r yang diperoleh dari masing-masing sampel dan masing-masing proses. Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa hanya teh hijau untuk keseluruhan proses dan teh segar untuk proses clean-up yang memenuhi kriteria yang ditetapkan untuk jumlah sampel 10 yakni r ≥ 0,682 (FAO,1993). Tabel VI. Nilai koefisien korelasi


r keseluruhan proses 0,97178 0,98608 0,97245

r proses clean-up 0,98217 0,92047 0,89729

Limit of Quantification (LOQ) merupakan konsentrasi terkecil dari analit dalam sampel uji yang dapat dianalisis secara kuantitatif. Tabel VII menunjukkan


45

nilai LOQ untuk masing-masing sampel. Nilai LOQ inilah yang nantinya akan digunakan sebagai batas bawah pengukuran sampel. Tabel VII. Nilai Limit of Quantitation (LOQ)

Sampel

Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

LOQ keseluruhan proses (µg/g) 1416,1943 240,824 341,8556

Rata-rata kadar sampel (µg/g) 1370,6028 1431,8863 2201,1904

Kadar kuersetin dalam daun teh segar memiliki nilai lebih kecil dari nilai LOQ sehingga kadar kuersetin yang dalam daun teh segar tidak dapat diyakini kebenaran kadarnya. Nilai LOQ yang diperoleh untuk sampel teh hijau dan teh hitam memiliki nilai lebih kecil dari kadar kuersetin yang diperoleh sehingga kadar kuersetin teh hijau dan teh hitam dapat terukur secara kuantitatif.

H. Penetapan Kadar Kuersetin dalam Ekstrak Metanol Daun Teh Segar, Teh hijau, dan Teh Hitam Analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung kadar kuersetin dalam ekstrak daun teh segar, teh hijau dan teh hitam. Perhitungan kadar kuersetin dilakukan berdasarkan persamaan kurva baku yang diperoleh dari proses validasi yakni y = 49597,53525 x + 15390,57648 untuk kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 48032 – 235472 dan y = 61531,85173 x – 368905,21654 untuk kuersetin yang memiliki nilai AUC antara 255785 – 2705929 Presisi sampel merupakan suatu kedekatan nilai data satu dengan yang lainnya dalam suatu kondisi analisis yang sama didalam matriks sampel. Nilai presisi dinyatakan dengan nilai Coefficient of Variation (CV). Semakin kecil nilai


46

CV menunjukkan nilai presisi yang semakin baik. Tabel VIII menunjukkan kadar kuersetin dalam sampel teh segar, teh hijau dan teh hitam serta nilai SD dan % CV. Tabel VIII. Kadar Kuersetin dalam daun teh segar, teh hijau dan teh hitam

Sampel

Teh segar

Teh hijau

Teh hitam

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5

Kadar kuersetin (ppm)

Kadar kuersetin (µg/g)

1,7116 1,7106 1,7304 1,7445 1,7407 7,1779 7,1532 7,1641 7,2085 7,1806 10,8269 10,8398 10,8439 10,8513

1361,4924 1373,2426 1372,6168 1367,2428 1378,4194 1432,0742 1430,2418 1433,5993 1432,1468 1431,3695 2195,6801 2203,4247 2201,7638 2205,5130

10,8035

2199,5704

Rata-rata kadar kuersetin (µg/g)

SD

1370,6028

7,1662

1431,8863

2201,1904

1,2257

3,7747

CV (%)

0,4922

0,0856

0,1715

Dari data penetapan kadar diperoleh rata-rata kadar kuersetin dalam daun teh segar yakni 1455,8785 µg/g dengan CV 0,4922 %; rata-rata kadar kuersetin dalam teh hijau yakni 1431,8863 µg/g dengan CV 0,0856 %; rata-rata kadar kuersetin dalam teh hitam yakni 2201,1904 µg/g dengan CV 0,1715 %. Kadar kuersetin yang diperoleh merupakan kadar kuersetin dalam berat kering sampel yang digunakan. Nilai %recovery dan kadar kuersetin teh segar yang lebih kecil dari LOQ dapat disebabkan karena adanya kesalahan yang sering terjadi dalam analisis


47

kuantitatif. Kesalahan yang terjadi yakni kesalahan random dan kesalahan sistematik. Kesalahan random adalah kesalahan yang selalu terjadi dalam analisis dikarenakan adanya sedikit variasi yang tidak dapat dikontrol (Gandjar dan Rohman, 2007). Tabel IX. Kesalahan random

sampel Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

S2 total 2,2590 x 109 3,3705 x 109 8, 0587 x 109

S2 clean-up 3,6502 x 1010 1,3961 x 1011 1,5583 x 1011

Kesalahan sistematik memiliki sifat yang konstan, serta dapat mengakibatkan hasilnya menyimpang dari rata-rata. Kesalahan ini dapat disebebakan oleh matriks sampel yang bervariasi, metode atau kesalahan personal. Tabel X. Kesalahan sistematik

sampel Daun teh segar Teh hijau Teh hitam

% Recovery total 119,79 98,57 102,40

% Recovery Clean-up 141,55% 108,92% 135,78%

Dari tabel IX. diketahui kesalahan random paling besar berasal dari proses clean-up dilihat dari nilai varians proses clean-up yang lebih besar dari nilai varians keseluruhan proses dan dari tabel X diketahui kesalahan sistematik paling besar juga berasal dari proses clean-up yang dilihat dari nilai % recovery clean-up yang lebih besar dari % recovery keseluruhan proses.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan Kadar kuersetin total dalam teh hijau dan teh hitam yakni 1431,8863 µg/g dan 2201,1904 µg/g sedangkan kadar kuersetin total dalam daun teh segar tidak dapat ditetapkan karena kadar kuersetin total lebih kecil dari nilai LOQ.

B. Saran Perlu dilakukan perbaikan terhadap preparasi sampel pada tahap clean-up sehingga dapat diperoleh kuersetin lebih banyak dengan jumlah pengotor yang sedikit.

48


DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2003, Guidelines On Good laboratiry practice in residue analysis,pp. 21. Ahmad, M.M., 2006, Anti Inflammatory Activities of Nigella sativa Linn (Kalongi, black seed), http://lailanurhayati.multiply.com/journal, diakses 22 april 2012 Arifin, S. 1994. Petunjuk Teknis Pengolahan Teh. Pusat Penelitian Teh dan Kina Gambung. Bandung. Bisset, G. N., dan Wichth, M., 2001, Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals, second ed, CRC Press, Boca Raton, 490 – 492. Dharma, S.P., 2012, Optimasi Proses Ekstraksi Kuersetin Total dalam Teh Hijau dengan Metode KLT-Densitometri, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Direktorat Jenderal Pengawasan Obatdan Makanan, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1989, Materia Medika Indonesia, jilid V, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 537. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 299, 1009-1010. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 1-12. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan Herbal, volume kelima, edisi I, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, 299, 64-65. Dwiyoga, A.R.H., 2012, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Kuersetin menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik dalam Teh Hijau (Camellia sinensis O.K.), Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Erlund, Iris., 2002, Chemical Analysis and Pharmacokinetics Of The Flavonoids Quercetin, Hesperitin And Naringenin In Humans, University of Helsinki, Helsinki, 21

49

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI50

Escribano-Bailon, M.T., Santos-Buelga, C.,M, 2010, Polyphenol Extraction from Food, 8. Gandjar, I. G. dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, cetakan kedua, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp. 378, 389-390. Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C., 2007, PDR®For Herbal Medicines Fourth Edition, Thompson Healthcare Inc, 414 – 419. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan¸ ITB, Bandung, 7-8 Hartoyo, A.,2003, Teh dan Khasiatnya Bagi Kesehatan, Kanisius, Yogyakarta, 913, 23-35. Haryanto, 2012, Pengolahan Teh Hitam , PT. PAGILARAN, Batang. Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi ElektroforesisModern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung, 21-25.

dan

Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI Press, Jakarta, 177181,211. List, P.H., dan Schmidt, P.C., 1989, Phytopharmaceutical Technology, 99-105, CRC Press, Boca Raton. Makasheva NE, Makashev YA, Sharonov BP,Grachev SA, Mironov VE. 1976. The kinetics of complex formation of some transition metals in quercetin and morin. Russian Chemical Bulletin 25:885-886. Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Terjemahan Kosasih Padmawinata, Bandung: Penerbit ITB Miean, K.H., Mohamed, S., 2000, Flavonoid (Myricetin, Quercetin, Kaempferol, Luteolin, andApigenin) Content of Edible Tropical Plants, University Putra Malaysia, Malaysia. Mumper, R. J., dan Dai, J., 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules Munson, J. W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa B., Volume II, hal. 13-5, Airlangga University Press, Surabaya. Nazaruddin, Paimin FB. 1993. Pembudidayaan dan Pengolahan Teh. Cetakan I. Jakarta: Penebar Swadaya. Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta, pp. 6-17.


Paulsen, Susan., 2003, Quercetin Monograph, diakses tanggal 11 Oktober 2011 Pertiwi, M.V., 2006, Penetapan Kadar Flavonoid Total Terhitung Sebagai Kuersetin dengan Menggunakan Metode Kolorimetri dalam Teh Hijau dan Teh Hitam [Merk X], Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Rahardian, Dimas, 2011, Teknologi Pengolahan Teh Hitam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi pertama, cetakan pertama, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, pp. 217-230.Syah, Andi., 2006, Taklukkan Penyakit Dengan Teh Hijau, AgroMedia Pustaka, Jakarta, 46, 69. Septianingrum, E.,Faradilla, R., Ekafitri, R., Murtini, S., dan Perwatasari, D., 2009, Kadar Fenol Aktivitas Antioksidan Pada Daun Teh Hijau dan Teh Hitam Komersial, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Steenis, Dr. C.G.G.J. Van, et al., 1992, Flora Untuk Sekolah di Indonesia, Cetakan Keenam, PT. Pradnya Paramita, Jakarta. The Merck Index, 1989, The Merck Index An Encyclopedia Of Chemicals Drugs and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.1278. Tokusoglu, O., Unal, M.K., Yildirim, Z., 2003, HPLC-UV and GC-MS Characterization of Flavonol Aglycons Quercetin, Kaempferol and Myricetin In Tomato Pastes and Other Tomato-Based Products, Acta Chromatographica Traverniers, I., Loose, M.D., Bockstaele, E.V 2004, Trends In Quality In The Analytical Laboratory. II. Analytical Method Validation And Quality Assurance, Trends in Analytical Chemistry volume III Tuminah, S., 2004, Teh (Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast) Sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan, Cermin Dunia Kedokteran No. 144, pp. 52 -53. Wirasaputra, A., 2012, Optimasi Clean-up Esktrak Metanol-air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin dalam Teh Hijau dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.


LAMPIRAN

52


Lampiran 1. Sertifikat analisis kuersetin


Lampiran 2. Surat Determinasi


Lampiran 3. Penimbangan sampel teh Segar a. Penimbangan sampel teh segar tanpa adisi Replikasi Replikasi Penimbangan I II Berat beker glass 61,281 61,412 Berat beker glass + zat 69,557 69,579 Berat beker glass + sisa 61,468 61,564 Berat zat 8,089 8,015

Replikasi III 61,611 69,745 61,639 8,106

Replikasi IV 61,506 69,746 61,591 8,200

b. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 5mg kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,521 61,386 Berat beker glass + zat 69,608 69,572 Berat beker glass + sisa 61,553 61,404 Berat zat 8,055 8,168 c. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,368 61,475 Berat beker glass + zat 69,534 69,534 Berat beker glass + sisa 61,416 61,416 Berat zat 8,118 8,118 d. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 15mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,426 61,566 Berat beker glass + zat 69,623 69,642 Berat beker glass + sisa 61,480 61,570 Berat zat 8,143 8,072 e. Penimbangan sampel teh segar dengan adisi 5mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,481 61,489 Berat beker glass + zat 69,536 69,544 Berat beker glass + sisa 61,506 61,497 Berat zat 8,030 8,047

Replikasi V 61,564 689,708 61,591 8,117


Lampiran 4. Penimbangan sampel teh hijau a. Penimbangan sampel teh hijau tanpa adisi Replikasi Replikasi Penimbangan I II Berat beker glass 44,9693 65,2246 Berat beker glass + zat 52,9843 73,2285 Berat beker glass + sisa 44,9801 65,2416 Berat zat 8,0042 7,9869

Replikasi III 61,5910 69,7002 61,7119 7,9803

Replikasi IV 44,8693 53,0172 44,9793 8,0379

b. Penimbangan sampel hijau dengan adisi 5mg kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 65,2246 44,9695 Berat beker glass + zat 73,3013 52,9875 Berat beker glass + sisa 65,2337 44,9857 Berat zat 8,0676 8,0018 c. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 44,9695 58,6507 Berat beker glass + zat 53,0847 66,6839 Berat beker glass + sisa 44,9786 58,6667 Berat zat 8,1061 8,0172 d. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 15mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 64,1046 64,1050 Berat beker glass + zat 72,1189 72,1290 Berat beker glass + sisa 64, 1217 64,1220 Berat zat 7,9972 8,0070 e. Penimbangan sampel teh hijau dengan adisi 20 mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 61,5980 58,6507 Berat beker glass + zat 69,6046 66,6536 Berat beker glass + sisa 61,6095 58,6607 Berat zat 7,9951 7,9929

Replikasi V 61,6008 69,6167 61,6055 8,0112


Lampiran 5. Penimbangan sampel teh hitam a. Penimbangan sampel teh hitam tanpa adisi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Replikasi Penimbangan I II III IV V Berat beker glass 65,1928 63,1850 63,1891 65,1986 58,6394 Berat beker glass + zat 52,3212 71,2075 71,2169 73,2189 66,6473 Berat beker glass + sisa 44,9801 63,1973 63,1973 65,2075 58,6496 Berat zat 8,0292 8,0105 8,0196 8,0114 7,9977 b. Penimbangan sampel hitam dengan adisi 5mg kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 63,1850 61,0284 Berat beker glass + zat 71,2004 69,0417 Berat beker glass + sisa 63,1943 61,0390 Berat zat 8,0061 8,0027 c. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi 10mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 58,6586 60,9172 Berat beker glass + zat 66,6799 68,9380 Berat beker glass + sisa 58,6497 60,9258 Berat zat 8,0302 8,0122 d. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi 15mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 44,9710 61,0277 Berat beker glass + zat 53,0048 69,0285 Berat beker glass + sisa 44,9813 61,0361 Berat zat 8,0235 7,9924 e. Penimbangan sampel teh hitam dengan adisi20 mg Kuersetin baku Penimbangan Replikasi I Replikasi II Berat beker glass 63,0958 60,9179 Berat beker glass + zat 71,1024 68,9202 Berat beker glass + sisa 63,1020 60,9193 Berat zat 8,0004 8,0009


Lampiran 6. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari awal proses a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2064 0,2118 0,2065 0,0053

Replikasi II 0,2118 0,2172 0,2120 0,0052

b. Penambahan kuersetin 10mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2066 0,2265 0,2076 0,0097

Replikasi II 0,2013 0,2116 0,2020 0,0096

c. Penambahan kuersetin 15mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2040 0,2194 0,2047 0,0147

Replikasi II 0,2043 0,2205 0,2057 0,0148

d. Penambahan kuersetin 20mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2065 0,227 0,2082 0,0195

Replikasi II 0,2015 0,2219 0,2020 0,0199

Lampiran 7. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari awal proses a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2046 0,2099 0,2046 0,0053

Replikasi II 0,2046 0,2099 0,2046 0,0053



Replikasi I 0,2050 0,2151 0,2050 0,0101

Replikasi II 0,2074 0,2176 0,2075 0,0101


Replikasi I 0,2038 0,2190 0,2038 0,0152

Replikasi II 0,2021 0,2173 0,2021 0,0152


Replikasi I 0,2108 0,2308 0,2109 0,0199

Replikasi II 0,1962 0,2164 0,1964 0,0200

Lampiran 8. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari awal proses a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2073 0,2126 0,2073 0,0053

Replikasi II 0,2046 0,2099 0,2046 0,0053


Replikasi I 0,2058 0,2160 0,2058 0,0102

Replikasi II 0,2114 0,2217 0,2115 0,0102



Replikasi I 0,2064 0,2215 0,2064 0,0151

Replikasi II 0,2076 0,2226 0,2077 0,0149


Replikasi I 0,2100 0,2302 0,2100 0,0202

Replikasi II 0,2046 0,2246 0,2046 0, 0200

Lampiran 9. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh segar dari proses clean-up a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2039 0,2097 0,2055 0,0042

Replikasi II 0,1971 0,2026 0,1982 0, 0044


Replikasi I 0,1999 0,2111 0,2013 0,0098

Replikasi II 0,1993 0,2095 0,2003 0, 0092


Replikasi I 0,2039 0,2191 0,2013 0,0144

Replikasi II 0,2113 0,2267 0,2169 0, 0151

d. Penambahan kuersetin 20mg Penimbangan Berat kertas

Replikasi I 0,2082

Replikasi II 0,2015


Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

0,2290 0,2095 0,0195

0,2246 0,2049 0, 0197

Lampiran 10. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hijau dari proses clean-up a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

Replikasi I 0,2177 0,2229 0,2177 0,0052

Replikasi II 0,2077 0,2128 0,2077 0, 0051


Replikasi I 0,2167 0,2268 0,2169 0,0099

Replikasi II 0,2118 0,2219 0,2118 0, 0101


Replikasi I 0,1990 0,2144 0,1992 0, 0152

Replikasi II 0,2087 0,2238 0,2089 0, 0149


Replikasi I 0,2071 0,2272 0,2071 0,0201

Replikasi II 0,2087 0,2288 0,2088 0, 0200

Lampiran 11. Penimbangan Kuersetin yang ditambahkan kedalam sampel teh hitam dari proses SPE a. Penambahan kuersetin 5mg Penimbangan Berat kertas

Replikasi I 0,2061

Replikasi II 0,2097


Berat kertas + zat Berat kertas + sisa Berat zat

0,2113 0,2061 0,0052

0,2148 0,2097 0, 0051


Replikasi I 0,2101 0,2201 0,2102 0,0099

Replikasi II 0,2042 0,2144 0,2045 0, 0099


Replikasi I 0,2094 0,2246 0,2094 0, 0152

Replikasi II 0,2123 0,2276 0,2127 0, 0149


Replikasi I 0,2085 0,2287 0,2085 0,0202

Replikasi II 0,2043 0,2245 0,2047 0, 0198

Lampiran 12. Data kadar air Sampel

Daun teh segar

Teh hijau

Teh hitam

Replikasi I II III I II III I II III Kadar air (%) 78,42 77,27 78,45 5,84 6,00 6,37 7,87 7,23 8,54 Rata-rata (%) 78,04 6,07 7,88 Lampiran 13. Data Kadar abu teh segar 1. Penimbangan daun teh segar Replikasi I II III Berat krus 26,7110 gram 29,3075 gram 30,9079 gram Berat krus + zat 29,6577 gram 32,3236 gram 33,8572 gram Berat zat 2,9467 gram 3,0161 gram 2,9493 gram


2. Penimbangan abu Replikasi I II III Berat krus 26,7110 gram 29,3075 gram 30,9079 gram Berat krus + abu 26,7337 gram 29,3791 gram 30,9929 gram Berat abu 0,0227 gram 0,0716 gram 0,0856 gram

3. Kadar abu =

x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 0,77 % 2,37 % 2,90 % Kadar abu rata-rata 2,01 % Lampiran 14. Data Kadar abu teh hijau 1. Penimbangan daun teh hijau Replikasi I II Berat kertas 0,5808 gram 0,5811 gram Berat kertas + zat 3,6078 gram 3,5882 gram Berat kertas + sisa 0,5808 gram 0,5813 gram Berat zat 3,027 gram 3,0069 gram

III 0,5802 gram 3,6679 gram 0,5802 gram 3,0877 gram


3. Kadar abu =

x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 2,99 % 2,80 % 3,05 % Kadar abu rata-rata 2,95 %


Lampiran 15. Data kadar abu teh hitam 1. Penimbangan teh hitam Replikasi I Berat kertas 0,5847 gram Berat kertas + zat 3,5891 gram Berat kertas + sisa 0,5848 gram Berat zat 3,0043 gram

II 0,5834 gram 3,5876 gram 0,5839 gram 3,0037 gram

III 0,5884 gram 3,6112 gram 0,5890 gram 3,0222 gram


3. Kadar abu =

x 100%

Replikasi I II III Kadar abu 2,16 % 0,24 % 0,08 % Kadar abu total 0,83 % Lampiran 16. Kromatogram sampel teh segar tanpa adisi Replikasi I


Parameter KCKT: Kolom

: C-18, ukuran partikel 5 µm

Fase gerak

: Metanol : akuabides : asam fosfat 5% (45:54:1)

Kecepatan alir

: 0,8 mL/menit

Detektor Vis

: 370nm

Volume injeksi

: 20µL

Replikasi II


Replikasi III

Replikasi IV


Replikasi V

Lampiran 17. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin baku dari awal proses Adisi kuersetin 5 mg replikasi I


Adisi kuersetin 5 mg replikasi I

Adisi kuersetin 10 mg Replikasi I


Adisi kuersetin 10mg replikasi II

Adisi kuersetin 15mg replikasi I






Lampiran 18. Kromatogram sampel teh segar dengan adisi kuersetin dari proses clean-up adisi kuersetin 5mg replikasi I


adisi kuersetin 5 mg replikasi II

adisi kuersetin 10mg replikasi I









Lampiran 19. Kromatogram sampel teh hijau tanpa adisi Replikasi I


Replikasi II

Replikasi III


Replikasi IV

Replikasi V


Lampiran 20. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari awal proses Adisi kuersetin 5 mg replikasi I

Adisi kuersetin 5 mg replikasi II











Lampiran 21. Kromatogram sampel teh hijau dengan adisi kuersetin dari proses clean-up Adisi kuersetin 5mg replikasi I












Lampiran 22. Kromatogram sampel teh hitam tanpa adisi Replikasi I

Replikasi II


Replikasi III

Replikasi IV


Replikasi V

Lampiran 23. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari awal proses Adisi kuersetin 5mg replikasi I












Lampiran 24. Kromatogram sampel teh hitam dengan adisi kuersetin dari proses clean-up Adisi kuersetin 5mg replikasi I












Lampiran 25. Data kadar kuersetin teh segar dan contoh perhitungan kadar kuersetin Sampel

AUC Kuersetin

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 4 Replikasi 5 Rata-rata

100284 100230 101215 101913 101726 101704

Konsentrasi kuersetin (ppm) 1,7116 1,7106 1,7304 1,7445 1,7407 1.7276

Berat sampel (g) 8,089 8,015 8,106 8,200 8,117 8,1054

Kadar kuersetin (µg/g) 1361,4924 1373,2426 1372,6168 1367,2428 1378,4194 1370,6028

SD

CV (%)

7,1959

0,4943

1. Contoh perhitungan kadar kuersetin teh segar Seluruh hasil clean-up dengan SPE diuapkan, kemudian dilarutkan dalam 3mL pelarut metanol. Sebanyak 20 µL sampel diinjeksikan kedalam sistem KCKT.


a. Kadar kuersetin dalam daun teh segar replikasi 1 = 100284, kemudian dimasukkan kedalam persamaan kurva baku y = 15390,57648 + 49597,53525 x 100284 = 15390,57648 + 49597,53525 x 49597,53525 x = 100284 – 15390,57648 49597,53525 x = 84893,42352 x = = 1,7116 µg/mL i.

Volume ekstrak = 250 mL Kadar kuersetin dalam ekstrak = 1,7116 µg x 3 mL x

,

x

= 2418,45 µg ii.

Berat sampel = 8,089 g Kadar air = 78,04 % Berat kering sampel = 8,089 x 21,96% = 1,7763 gram Kadar kuersetin dalam berat kering sampel =

, ,

= 1370,60 µg/g

Lampiran 26. Data kadar kuersetin teh hijau dan contoh perhitungan kadar kuersetin Sampel

AUC Kuersetin


371396 370172 370711 372913 371532 371345

Konsentrasi kuersetin (ppm) 7,1779 7,1532 7,1641 7,2085 7,1806 7,1769

Berat sampel (gram) 8,0042 7,9869 8,1081 8,0379 8,0112 8,0041


SD

CV (%)

1,2257

0,0856


1. Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam teh hijau Dari proses ekstraksi sampel di tambahkan dengan larutan penyari ke dalam labu takar 250 mL. Diambil 25 mL dipekatkan hingga volume 5 mL. selanjutnya diambil 0,1 mL dimasukkan kedalam SPE dan dielusi dengan 6 mL metanol. Seluruh hasil clean-up dengan SPE diuapkan, kemudian dilarutkan dalam 3mL pelarut metanol. Sebanyak 20 µL sampel diinjeksikan kedalam sistem KCKT. a. AUC kuersetin dalam teh hijau replikasi 1 = 371396 , kemudian dimasukkan kedalam persamaan kurva baku y = 15390,57648 + 49597,53525 x 371396 = 15390,57648 + 49597,53525 x 49597,53525 x = 371396 – 15390,57648 49597,53525 x = 356005,4235 x = 7,1779 ppm = 7,1779 µg/mL i.

Volume ekstrak = 250 mL Kadar kuersetin dalam ekstrak = 7,1779 µg x 3 mL x

,

x

= 10766,85 µg ii.

Berat sampel = 8,0042 g Kadar air = 6,07 % Berat kering sampel = 8,0042 g x 93,93 % = 7,5183 gram Kadar kuersetin dalam berat kering sampel =

, ,

= 1432,09 µg/g


Lampiran 27. Data kadar kuersetin teh hitam dan contoh perhitungan kadar kuersetin Sampel

AUC Kuersetin


552378 553017 553222 553587 551219 552685

Konsentrasi kuersetin (ppm) 14,9725 14,9828 14,9862 14,9921 14,9536 14,9774

Berat sampel (gram) 8,0292 8,0075 8,0106 8,0124 7,9977 8,0137


SD

CV (%)

3,7747

0,1715

1. Contoh perhitungan kadar kuersetin dalam teh hitam a. AUC kuersetin dalam teh hijau replikasi 1 = 552378 , kemudian dimasukkan kedalam persamaan kurva baku y = 61531,85173 x – 368905,21654 y = 61531,85173 x – 368905,21654 552378 = 61531,85173 x – 368905,21654 61531,85173 x = 552378 + 368905,21654 61531,85173 x = 921283,2165 x = 14,9725 ppm = 14,9725µg/mL i.

Volume ekstrak = 250 mL

Kadar kuersetin dalam ekstrak = 14,9725 µg x 3 mL x = 22458,75 µg ii.

Berat sampel = 8,0292 g Kadar kuersetin =

, ,

,

%

= 3036,39 µg/g

,

x


100

Lampiran 28. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh segar

adisi

0

5 10 15 20

berat basah

berat kering

8,089 8,015 8,106 8,2 8,117 8,055 8,168 8,118 8,118 8,143 8,072 8,03 8,047

1,7762 1,7601 1,7801 1,8007 1,7825 1,7689 1,7937 1,7827 1,7827 1,7882 1,7726 1,7634 1,7671

kuersetin yang ditambahkan

5300 5900 9200 9600 14700 13900 19200 19900

AUC 100284 100230 101215 101913 101726 228219 322200 231804 333445 422594 383461 630491 630957

konsentrasi konsentrasi kuersetin kuersetin (ug/mL) (ug) 1,7116 1,7106 1,7304 1,7445 1,7407 4,2911 11,2317 4,3634 11,4144 12,8632 12,2273 16,2419 16,2495

2567,4690 2565,8359 2595,6257 2616,7356 2611,0801 6436,6633 16847,4992 6545,0860 17121,6256 19294,8659 18340,8965 24362,8996 24374,2596

%recovery

72,55% 241,63% 42,98% 151,36% 113,63% 113,31% 113,39% 109,46%

rata-rata

157,09% 97,17% 113,47% 111,43%


101

Lampiran 29. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hijau

adisi

0

5 10 15 20

berat basah

berat kering

8,0042 7,9869 7,9803 8,0379 8,0112 8,0676 8,0018 7,9972 7,9929 7,9951 8,0172 8,1061 8,007

7,5183 7,5021 7,4959 7,5500 7,5249 7,5779 7,5161 7,5118 7,5077 7,5098 7,5306 7,6141 7,5210


5300 5300 10100 10100 15200 15200 19900 20000

AUC

konsentrasi kuersetin (ug/mL)

konsentrasi kuersetin (ug)

371396 370172 370711 372913 371532 578330 633234 688935 744189 921628 993673 1197134 1331568

12,0312 12,0113 12,0201 12,0558 12,0334 15,3942 16,2865 17,1918 18,0897 20,9734 22,1443 25,4509 27,6357

18046,78055 18016,94234 18030,08188 18083,76139 18050,0959 23091,33863 24429,76739 25787,62511 27134,58604 31460,12627 33216,41178 38176,3064 41453,48715

%recovery

95,20% 120,46% 76,65% 89,99% 88,25% 99,81% 101,16% 117,04%

rata-rata

107,83% 83,32% 94,03% 109,10%


102

Lampiran 30. Data recovery untuk keseluruhan proses penetapan kadar kuesetin dalam teh hitam

adisi

0

5 10 15 20

berat basah

berat kering

8,0292 8,0105 8,0196 8,0114 7,9977 7,9943 8,0124 7,9943 8,0124 7,9943 8,0124 7,9943 8,0124

7,3965 7,3793 7,3877 7,3801 7,3675 7,3643 7,3810 7,3643 7,3810 7,3643 7,3810 7,3643 7,3810


5300 5300 10200 10200 15100 14900 20200 20000

AUC

konsentrasi kuersetin (ug/mL)

konsentrasi kuersetin (ug)

552378 553017 553222 553587 551219 629800 860939 860944 1054044 1095425 1309389 1490065 1569528

14,9725 14,9828 14,9862 14,9921 14,9536 16,2307 19,9871 19,9872 23,1254 23,7979 27,2752 30,2115 31,5029

22458,69068 22474,26798 22479,26539 22488,16322 22430,43702 24346,05465 29980,67298 29980,79487 34688,11298 35696,88321 40912,81595 45317,26653 47254,38522

%recovery

35,47% 141,78% 73,67% 119,82% 87,62% 123,80% 113,12% 123,94%

rata-rata

88,63% 96,75% 105,71% 118,53%


103

Lampiran 31. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh segar

adisi


0 5 10 15 20

4200 4400 9100 9200 14400 15100 19300 19100

Faktor pengenceran 5x.

AUC 100284 101215 284413 539925 1089407 1518659 1879939 1925574 2307309 2704978

konsentrasi kuersetin (ug/mL) 1,7116 1,7304 5,4241 14,7701 23,7001 30,6762 36,5476 37,2893 43,4932 49,9560

konsentrasi konsentrasi kuersetin kuersetin (ug/3mL) (ug) (5mL) 5,134938 5,1912513 16,272326 44,310232 71,100357 92,02864 109,64293 111,86788 130,47946 149,8679

256,7469 259,5626 813,6163 2215,5116 3555,0179 4601,4320 5482,1466 5593,3939 6523,9729 7493,3952

kadar * fp 1026,987608 1038,250265 3254,465233 8862,046478 14220,07148 18405,72806 21928,58645 22373,57549 26095,89155 29973,58081

%recovery

rata-rata

52,90% 177,94% 144,92% 188,84% 145,11% 141,33% 129,86% 151,52%

115,42% 166,88% 143,22% 140,69%


104

Lampiran 32. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hijau

adisi


0 5

5200 5100 10 9900 10100 15 15200 14900 20 20100 20000 faktor pengenceran 3x

AUC 93598 552434 495318 1510224 1587859 2171543 2028321 2309507 2604379 2436290



236,5261 2246,0056 2106,7704 4580,8695 4770,1251 6193,0077 5843,8666 6529,3311 7248,1588 6838,3978

kadar * fp

%recovery

rata-rata

709,5784177 6738,016747 6320,311132 13742,60848 14310,3754 18579,02314 17531,59977 19587,99327 21744,47639 20515,19355

49,93% 196,45% 106,94% 147,08% 90,84% 106,47% 89,66% 83,96%

123,19% 127,01% 98,66% 86,81%


105

Lampiran 33. Data recovery untuk proses clean-up sampel teh hitam

adisi


0 5 10 15 20

5200 5100 9900 9900 15200 14900 20200 19800

Faktor pengenceran 5x

AUC 68313 206343 266386 546891 732972 1146423 1181007 2082260 1559513 2600519



160,0556 577,5058 759,0965 2232,4931 2686,1142 3694,0093 3778,3169 5975,3570 4701,0243 7238,7490

kadar * fp

%recovery

rata-rata

800,2780267 2887,528925 3795,48231 11162,46534 13430,57115 18470,0465 18891,58427 29876,78512 23505,12168 36193,74519

37,53% 182,72% 117,04% 167,94% 112,16% 188,14% 107,23% 173,48%

110,12% 142,49% 150,15% 140,36%


106

Lampiran 34. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk keseluruhan proses

Persamaan regresi linier y = 24,91494x + 96488,43601 r = 0,97178 Sa = 1,90151 x 104 Sb = 1,82348 Variance = 2,2590 x 109 LOQ =

,

, ,

= 2518,56 µg

LOQ dalam berat sampel kering = 2518,56 µg / 1,7784 g = 1416,1943 µg/g Rata-rata kadar sampel kering = 1375, 3204 µg/g

Lampiran 35. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk keseluruhan proses

111


Persamaan regresi linier y = 42,20372 x + 359893,78332 r = 0,98608 Sa = 2,31892 x 104 Sb = 2,14575 Variance = 3,3705 x 109 LOQ =

,

,

= 1813,2136 µg

,

LOQ dalam berat kering = 1813,2136 µg / 7,5292 g = 240,824 µg/g Rata-rata kadar sampel kering = 1327,6654 µg/g

Lampiran 36. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk keseluruhan proses

Persamaan regresi linier y = 46,90771 x + 529730,51821 r = 0,97245 Sa = 3,58436 x 104 Sb = 3,31231 Variance = 8, 0587 x 109 LOQ =

,

, ,

= 2521,6298 µg

LOQ dalam berat kering = 2521,6298 µg / 7,3763 g = 341,8556 µg/g

107


108

Rata-rata kadar sampel kering = 1962,8358 µg/g

Lampiran 37. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh segar untuk proses clean-up

Persamaan regresi linier y = 6129,08590 x + 21435,98335 r = 0,98217 Sa = 1,02504 x 105 Sb = 8,73481 Variance = 3,6502 x 1010

Lampiran 38. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hijau untuk proses clean-up

Persamaan regresi linier y = 111,30347 x + 460347,40870


109

r = 0,92047 Sa = 2,05322 x 105 Sb = 16,7082 Variance = 1,3961 x 1011

Lampiran 39. Kurva hubungan konsentrasi vs AUC teh hitam untuk proses clean-up

Persamaan regresi linier y = 101,68366 x + 18158,79297 r = 0,89729 Sa = 2,17059 x 105 Sb = 17,6863 Variance = 1,5583 x 1011

Lampiran 40. Random error sampel

S2 total

S2 SPE

Daun teh segar

2,2590 x 109

3,6502 x 1010

Teh hijau

3,3705 x 109

1,3961 x 1011

Teh hitam

8, 0587 x 109

1,5583 x 1011


Lampiran 41. Systematic error % Recovery

% Recovery

total

Clean-up

Daun teh segar

119,79

141,55%

Teh hijau

98,57

108,92%

Teh hitam

102,40

135,78%

sampel

110


BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Penetapan Kadar Kuersetin Dalam Ekstrak Metanol-Air Daun Teh Segar, Teh Hijau, dan Teh Hitam” memiliki nama lengkap Anastasia Filipa Veritas da Silva. Penulis lahir di Bogor tanggal 6 November 1990 sebagai anak ketiga dari pasangan Gregorius da Silva dan Maria Anastasia Iing Susilowati. Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis adalah TK Santa Maria Monica, Bekasi Timur (1995-1996), SD Santa Maria Monica, Bekasi Timur (1996-2002), SMP Santa Maria Monica, BekasiTimur (2002-2005), SMF Kristen BPK Penabur, Jakarta Pusat (2005-2008), dan pada tahun 2008 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lainpanitia pelepasan wisuda (2008), redaksi PHARMAHOLIC (2009), panitia seminar POFASADHA “Memahami Anak Muda” (2009), anggota Paduan Suara Fakultas Farmasi (2009), peserta Kampanye Informasi Obat “Health by herbal, herbal for healthy” (2010), panitia Inisiasi Sanata Dharma (INSADHA) (2010), asisten praktikum Farmakognosi-Fitokimia (2011) dan praktikum Formulasi Sedian Solid (2012).

111

SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhin Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi. Oleh :

Recommend Documents