SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi. Oleh : Vanny Christy Silviani

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOLIK BUAH CABAI RAWIT PUTIH (Capsicum frutescens L.) DENGAN METODE DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR KAPSAISIN SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) – DENSITOMETRI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh : Vanny Christy Silviani NIM : 098114068

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOLIK BUAH CABAI RAWIT PUTIH (Capsicum frutescens L.) DENGAN METODE DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR KAPSAISIN SECARA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) – DENSITOMETRI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh : Vanny Christy Silviani NIM : 098114068

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013 i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

iv


v


vi


PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat, kasih, dan penyertaanNya yang selalu dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanolik Buah Cabai Rawit Putih (Capsicum Frutescens L.) Dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil) dan Penetapan Kadar Kapsaisin secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) – Densitometri”. Skripsi ini dibuat sebagai syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm). Penulis menyadari bahwa dalam penyelesaian skripsi tidak lepas dari bantuan, dukungan, bimbingan, kritikan, dan saran dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada : 1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Pemimbing yang telah memberikan bimbingan, saran, kritikan, dan motivasi kepada penulis selama penelitian hingga penyelesaian skipsi. 3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang memberikan arahan, kritik, dan saran untuk skripsi ini. 4. Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku Dosen Penguji yang memberikan arahan, kritik, dan saran untuk skripsi ini.

vii


5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah memberikan nasihat dan dukungan selama penulis menyelesaikan masa studi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 6. Rini Dwiastuti, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 7. Seluruh staff laboratorium, terutama Mas Bimo, Mas Wagiran, Pak Parlan, Mas Kayat atas segala bantuan yang diberikan selama penelitian skripsi. 8. Mama terkasih yang selalu mendukung penulis dengan doa, semangat, dan cinta sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan. 9. Yenny dan Christina, teman seperjuangan dalam penelitian skripsi. Terima kasih untuk semua dukungan, kerjasama, diskusi, persahabatan, canda, dan doa dari kalian berdua. 10. Pdt. Drs. Samuel J. Suwondo dan keluarga yang selalu memberi dukungan kepada penulis selama menempuh pendidikan. 11. Hanna Silviani yang membantu penulis dalam menyempurnakan naskah skripsi serta selalu mendukung penulis. 12. Teman-temanku tersayang, Adel, Rizza, Evy, Yani, Prita yang selalu memberikan motivasi, dukungan, kerjasama, keceriaan, dan pengalaman berharga yang tak terlupakan. 13. Sahabat-sahabat terbaikku, Amanda, Yuni, Mimi, Horior community yang selalu memberikan doa, semangat, dan dukungan yang selalu diberikan.

viii


14. Teman-teman FST 2009, kelas B 2009, kelompok praktikum B 2009 atas kebersamaannya yang mengisi canda dan tawa serta motivasi selama perkuliahan. 15. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu dan mendukung dari awal penelitian hingga penyelesaian skripsi. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini sehingga dengan penuh kerendahan hati penulis menerima setiap kritikan dan saran yang dapat membangun sehingga dapat memperbaiki skripsi ini. Akhir kata, penulis berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan meningkatkan pengetahuan mengenai farmasi, terutama dalam bidang bahan alami.

Yogyakarta, 17 Januari 2013

Penulis

ix


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................ ii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS ...................................................... v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ......... vi PRAKATA ..................................................................................................... vii DAFTAR ISI .................................................................................................. x DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv INTISARI....................................................................................................... xvi ABSTRACT ..................................................................................................... xvii BAB I PENGANTAR .................................................................................... 1 A. Latar Belakang ......................................................................................... 1 1. Permasalahan...................................................................................... 5 2. Keaslian penelitian ............................................................................. 5 3. Manfaat penelitian .............................................................................. 6 B. Tujuan Penelitian ..................................................................................... 7 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................. 8 A. Cabai Rawit Putih .................................................................................... 8 1. Klasifikasi tanaman ............................................................................ 8 2. Morfologi tanaman ............................................................................. 8 3. Kandungan kimia ............................................................................... 9 4. Kegunaan buah cabai rawit putih ....................................................... 9 B. Kapsaisin .................................................................................................. 10 C. Radikal Bebas........................................................................................... 11 D. Antioksidan .............................................................................................. 12 E. Metode DPPH .......................................................................................... 13

x


F. Ekstraksi ................................................................................................... 15 G. Spektrofotometri Visibel .......................................................................... 17 H. Kromatografi Lapis Tipis ......................................................................... 18 I. Densitometri ............................................................................................. 20 J. Validasi Metode Analisis ......................................................................... 20 K. Landasan Teori ......................................................................................... 24 L. Hipotesis................................................................................................... 25 BAB III METODOLOGI PENELITIAN....................................................... 26 A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................. 26 B. Variabel ................................................................................................... 26 1. Variabel bebas .................................................................................. 26 2. Variabel tergantung .......................................................................... 26 3. Variabel pengacau terkendali ........................................................... 26 4. Variabel pengacau tak terkendali ..................................................... 26 C. Definisi Operasional ............................................................................... 27 D. Bahan dan Alat Penelitian ....................................................................... 27 1. Bahan penelitian............................................................................... 27 2. Alat penelitian .................................................................................. 28 E. Tata Cara Penelitian ................................................................................ 28 1. Determinasi buah ............................................................................. 28 2. Pengumpulan bahan ......................................................................... 28 3. Pembuatan ekstrak buah cabai rawit putih....................................... 29 4. Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH .................. 29 a. Pembuatan larutan DPPH ......................................................... 29 b. Pembuatan larutan stok kapsaisin ............................................. 29 c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin ..................................... 29 d. Pembuatan larutan uji ............................................................... 30 e. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ...................................... 30 f. Penentuan panjang gelombang maksimum ............................... 30 g. Penentuan operating time (OT) ................................................ 30 h. Penentuan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih ........... 31

xi


i. Validasi metode uji aktivitas antioksidan ................................. 31 j. Estimasi aktivitas antioksidan ................................................... 32 5. Penentuan kadar kapsaisin ............................................................... 32 a. Pembuatan fase gerak ............................................................... 32 b. Pembuatan larutan stok kapsaisin ............................................. 32 c. Pembuatan larutan seri baku kapsaisin ..................................... 32 d. Pembuatan larutan uji ............................................................... 32 e. Penentuan kadar kapsaisin buah cabai rawit putih ................... 33 F. Analisis Hasil .......................................................................................... 33 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 35 A. Hasil Determinasi Buah .......................................................................... 35 B. Hasil Pengumpulan Bahan ...................................................................... 36 C. Hasil Preparasi Sampel ........................................................................... 37 D. Hasil Uji Pendahuluan ............................................................................ 40 E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ................................. 42 1. Penentuan panjang gelombang maksimum ...................................... 42 2. Penentuan operating time (OT) ....................................................... 44 F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan .................................. 46 1. Spesifisitas metode uji aktivitas antioksidan ................................... 47 2. Akurasi metode uji aktivitas antioksidan ......................................... 48 3. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ........................................... 49 4. Linearitas metode uji aktivitas antioksidan...................................... 50 G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH ................ 51 H. Hasil Penetapan Kadar Kapsaisin ........................................................... 58 I.

Analisis Statistik Aktivitas Antioksidan ................................................. 64

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 66 A. Kesimpulan ............................................................................................. 66 B. Saran ....................................................................................................... 66 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 67 LAMPIRAN ................................................................................................... 71 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 99

xii


DAFTAR TABEL

Tabel I.

Kriteria akurasi yang masih dapat diterima menurut Harmita (2004) ....................................................................... 22

Tabel II.

Kriteria presisi yang masih dapat diterima menurut Harmita (2004) ....................................................................... 23

Tabel III.

Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum DPPH ..... 43

Tabel IV.

Hasil pengukuran absorbansi seri kurva baku kapsaisin yang direaksikan dengan DPPH ............................................. 46

Tabel V.

Nilai perolehan kembali (% recovery) uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin ............................................ 48

Tabel VI.

Nilai CV uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin ......... 49

Tabel VII.

Hasil aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih ............................................................................... 54

Tabel VIII.

Hasil perhitungan IC50 baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih .................................................. 57

Tabel IX.

Tingkat kekuatan aktivitas antioksidan .................................. 58

Tabel X.

Data nilai Rf baku kapsaisin dan sampel ................................ 61

Tabel XI.

Data penetapan kadar kapsaisin.............................................. 64

xiii


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1.

Struktur senyawa kapsaisin (Henderson And Slickman, 1999) ....................................................................................... 10

Gambar 2.

Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001) ........................................... 15

Gambar 3.

Penyarian dengan alat Soxhlet (Cornell University, 2011) .... 17

Gambar 4.

Morfologi berbagai spesies Capsicum (Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas, 1996) ............................................................. 35

Gambar 5.

Hasil uji pendahuluan ekstrak etanol buah cabai rawit putih, kontrol negatif (DPPH), dan kontrol positif (kapsaisin)............................................................................... 42

Gambar 6.

Gugus kromofor dan gugus auksokrom DPPH (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010) ..................................... 43

Gambar 7.

Grafik penentuan Operating Time baku kapsaisin ................. 45

Gambar 8.

Struktur senyawa kapsaisin .................................................... 52

Gambar 9.

Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa kapsaisin ................................................................................. 53

Gambar 10.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi I .................... 55

Gambar 11.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi II ................... 55

Gambar 12.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi III ................. 56

Gambar 13.

Interaksi kapsaisin dengan fase diam silika gel 60 F254 ......... 60

Gambar 14.

Interaksi kapsaisin dengan fase gerak toluena-kloroform-aseton (45:25:30, v/v/v) ........................... 60

Gambar 15.

Kurva persamaan regresi linier baku kapsaisin ...................... 62

xiv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Gambar buah cabai rawit putih dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta ............................................................................. 71

Lampiran 2.

Sertifikat analisis kapsaisin .................................................... 72

Lampiran 3.

Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah cabai rawit putih ........................................................................................ 73

Lampiran 4.

Data penimbangan bahan untuk uji aktivitas antioksidan ...... 74

Lampiran 5.

Data perhitungan konsentrasi bahan untuk uji aktivitas antioksidan .............................................................................. 75

Lampiran 6.

Scanning larutan pengoreksi untuk uji aktivitas antioksidan .............................................................................. 80

Lampiran 7.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ............................. 82

Lampiran 8.

Data uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ...................................................................................... 86

Lampiran 9.

Perhitungan nilai IC50 baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih ............................................................ 89

Lampiran 10. Sistem KLT densitometri yang digunakan ............................. 91 Lampiran 11. Data perhitungan konsentrasi bahan untuk penetapan kadar kapsaisin ................................................................................. 92 Lampiran 12. Kromatogram baku kapsaisin ................................................. 94 Lampiran 13. Data persamaan kurva baku kapsaisin .................................... 95 Lampiran 14. Kromatogram kapsaisin dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih ............................................................................... 96 Lampiran 15. Data dan perhitungan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih .................................................. 97 Lampiran 16. Uji statistik dengan SPSS 16.0 ............................................... 98

xv


INTISARI Cabai rawit putih (Capsicum frutescens L.) merupakan buah yang sering digunakan baik sebagai bahan pangan dan pengobatan. Kandungan utama dalam buah cabai rawit putih adalah kapsaisin yang memiliki gugus fenolik sehingga memiliki aktivitas antioksidan. Antioksidan dapat menangkap radikal bebas sehingga mengurangi resiko terjadinya penyakit kronis. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan aktivitas antioksidan yang terdapat pada ekstrak etanol buah cabai rawit putih dan menetapkan kadar kapsaisin dalam buah cabai rawit putih. Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1difenil-2-pikrilhidrazil). Prinsip metode DPPH adalah penangkapan DPPH yang merupakan radikal bebas oleh senyawa antioksidan sehingga intensitas absorbansi DPPH berkurang. Pengukuran absorbansi dilakukan dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517,5 nm. Penetapan kadar kapsaisin menggunakan metode KLT – densitometri dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak toluena-kloroform-aseton (45:25:30, v/v/v). Penurunan intensitas berkorelasi dengan kadar antioksidan. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas antioksidan ekstrak etanol cabai rawit putih yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar (90,02±10,16) µg/mL. Hasil analisis kuantitatif kadar kapsaisin ekstrak etanol buah cabai rawit putih sebesar (0,1099±0,0001)% (b/b) dengan catatan metode yang digunakan belum tervalidasi. Kata kunci : Buah cabai rawit putih (Capsicum frutescens L.), kapsaisin, radikal bebas, antioksidan, DPPH, KLT - densitometri

xvi


ABSTRACT White chili pepper (Capsicum frutescens L.) is a fruit that often used as food and medicine. White chili pepper contains capsaicin which has phenolic group that has antioxidant activity. Antioxidant can scavenge free radical thereby reducing the risk of chronic diseases. This experiment aimed to determine antioxidant activity and the contents of capsaicin in ethanol extract of chili pepper fruit. The antioxidant activity was tested by DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) method. The principle of DPPH method was scavenging DPPH as free radical by antioxidant compounds which could reduce intencity of DPPH absorbance. Absorbance was measured by visible spectrophotometer in maximum wave lenght (517,5 nm). Level of capsaicin was assayed by TLC – densitometry and used silica gel 60 F254 as stationary phase and toluenechloroform-acetone (45:25:30, v/v/v) as mobile phase. The intencity decrement is correlated with antioxidant concentration. The result of examination showed that antioxidant activity in ethanol extract of chili pepper fruit as IC50 is (90,02±10,16) µg/mL. Level of capcaicin in ethanol extract of white variety of chili pepper fruit is (0,1099±0,0001)% (w/w) but the TLC – densitometry method has not been validated yet. Keywords : White chili pepper (Capsicum frutescens L.), capsaicin, free radical, antioxidant, DPPH, TLC – densitometry

xvii


BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Penelitian di bidang kesehatan mengenai antioksidan semakin banyak dilakukan untuk mencegah timbulnya penyakit yang disebabkan oleh senyawa radikal bebas. Radikal bebas, seperti reactive oxygen species (ROS) bersifat sangat reaktif dan dapat mengoksidasi substansi-substansi dalam tubuh sehingga dapat menyebabkan terjadinya berbagai penyakit seperti jantung, kanker, penuaan dini, dan penyakit degerenatif lain (Parke, 1999; Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Untuk mengatasi radikal bebas tersebut, maka diperlukan suatu senyawa antioksidan yang dapat menangkap radikal bebas sehingga menghambat terbentuknya penyakit yang merugikan. Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang hanya memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan sehingga bersifat sangat tidak stabil (Fessenden dan Fessenden, 1982). Radikal bebas dapat terbentuk oleh senyawa endogen yang dihasilkan oleh tubuh maupun senyawa eksogen. Radikal bebas yang berasal dari senyawa endogen terbentuk dari proses metabolisme namun hanya bersifat sementara karena akan diubah menjadi senyawa yang tidak berbahaya. Sedangkan radikal yang terbentuk dari senyawa eksogen dapat berasal dari radiasi sinar UV, xenobiotik, polutan (Sapakal, Shikalgar, Ghadge, Adnaik, Naikwade, and Magdum, 2008). Saat terbentuk radikal yang berlebihan, maka akan terjadi pengambilan elektron dari atom oksigen sehingga oksigen hanya

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

memiliki satu elektron dan bersifat sangat reaktif untuk mengambil elektron dari senyawa lain. Reaksi radikal dapat menyebabkan terjadinya reaksi berantai (Simex, 2008). Radikal bebas dapat mengoksidasi lipid, protein, DNA, dan asam nukleat tak jenuh dalam tubuh untuk mencapai kestabilan elektron sehingga menyebabkan terjadinya penyakit degeneratif (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Oleh karena berbahayanya radikal bebas bagi tubuh, maka perlu dilakukan penelitian mengenai senyawa antioksidan yang dapat menangkal kerja radikal bebas. Antioksidan adalah senyawa kimia menghambat reaksi oksidasi dengan menyumbangkan satu elektronnya kepada senyawa radikal. Bukti penelitian menunjukkan bahwa antioksidan dapat mengurangi resiko penyakit kronis, seperti kanker dan jantung (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menstabilkan, mendeaktivasi, atau memakan radikal bebas sebelum menyerang sel dalam tubuh. Antioksidan dapat memelihara sel dan menjaga

kesehatan

sehingga

menghindari

terjadinya

penyakit-penyakit

degeneratif yang dapat menyerang sistem kesehatan. Kerja antioksidan adalah mengurangi kapasitas radikal bebas, menghambat peroksidasi lipid, mengurangi jumlah logam berat dengan cara khelating (Sapakal, Shikalgar, Ghadge, Adnaik, Naikwade, and Magdum, 2008). Antioksidan dapat berasal dari senyawa alam maupun secara sintetik. Saat ini masyarakat lebih memilih penggunaan bahanbahan yang alami karena resiko yang didapat lebih kecil dibandingkan dengan senyawa-senyawa sintetik. Dengan demikian, banyak peneliti yang mempelajari potensi antioksidan yang berasal dari sumber makanan dan tumbuhan obat.


Cabai rawit (Capsicum frutescens L.) merupakan salah satu buah yang sering digunakan masyarakat di Indonesia sebagai bahan pangan. Cabai rawit memiliki manfaat sebagai obat sariawan, tonik, stimulan kuat untuk jantung dan aliran darah, antirematik, antikoagulan, stomakik, karminatif, diaforetik, dan diuretik (Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005). Menurut Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi (2005), buah cabai rawit memiliki tiga macam varietas, yaitu cabai rawit merah (cabai kecil), cabai rawit putih (cabai domba), dan cabai rawit hijau (ceplik). Di dalam buah cabai rawit terkandung berbagai macam senyawa seperti kapsaisin, kapsantin, karotenoid, alkaloid atsiri, resin, flavonoid, minyak atsiri, provitamin A, vitamin B1 dan vitamin C (Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005; Howard, Talcott, Brenes, dan Villalon, 2000). Salah satu kandungan tertinggi dalam buah cabai rawit adalah kapsaisin. Kapsaisin merupakan senyawa yang bertanggung jawab dalam menghasilkan rasa pedas. Kapsaisin memiliki aktvitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Menurut Henderson dan Slickman (1999), kapsaisin memiliki aktivitas antioksidan dengan menangkap radikal bebas. Gugus fenol pada kapsaisin yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan. Selain itu, bentuk isomer cis – trans kapsaisin juga memiliki peran dalam menangkap radikal bebas. Karena itu, perlu diteliti mengenai kegunaan kapsaisin sebagai antioksidan dalam buah cabai rawit putih sehingga dapat dikembangkan sebagai salah satu free radical scavenger yang umum digunakan di masyarakat.


Ekstraksi yang digunakan pada buah cabai rawit ini menggunakan larutan etanol. Alasan pemilihan ekstraksi didasari pada sifat fisika kimia dari senyawa yang akan diuji, yaitu kapsaisin yang bersifat non polar. Dengan demikian digunakan etanol agar kapsaisin dapat terekstraksi. Pada beberapa penelitian yang telah dilakukan, ekstraksi kapsaisin terbukti paling efektif dan menghasilkan rendemen yang tinggi menggunakan penyarian dengan alat Soxhlet (Boonkird, Phisalaphong, Phisalaphong, 2008; Gonzáles and Al-Tamirano, 1973) sehingga digunakan alat Soxhlet untuk mengekstraksi buah cabai rawit putih. Metode yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih ini adalah metode DPPH. Metode DPPH adalah metode yang mengukur kemampuan antioksidan dalam menghambat radikal bebas DPPH. Metode ini digunakan untuk pengujian senyawa antioksidan yang memiliki mekanisme dengan mendonorkan hidrogen atau mendonorkan elektron pada senyawa radikal sehingga reaksi radikal terhenti (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001). Tujuan pengujian dengan metode DPPH adalah untuk mengetahui konsentrasi dari senyawa antioksidan yang ekuivalen dapat memberikan 50% efek antioksidan dan dinyatakan sebagai Inhibition Concentration 50 (IC50). DPPH memberikan serapan yang kuat pada panjang gelombang 517 nm karena merupakan senyawa radikal yang memiliki elektron tidak berpasangan. Saat elektron berpasangan dengan senyawa antioksidan, maka intensitas DPPH yang diserap akan berkurang sehingga absorbansinya turun. Keberadaan antioksidan dapat mengubah warna DPPH yang semula ungu menjadi kuning. Karena itu, metode DPPH sering digunakan pada pengujian aktivitas antioksidan


karena metode ini mudah digunakan, cepat, dan menghasilkan hasil yang reprodusibel (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Pada penelitian ini juga dilakukan uji kandungan kapsaisin karena kapsaisin merupakan senyawa dalam buah cabai rawit yang memiliki aktivitas antioksidan. Penentuan kadar kapsaisin dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) – densitometri. Penentuan kadar kapsaisin dilakukan untuk menentukkan jumlah kapsaisin yang terdapat dalam sampel.

1.

Permasalahan a. Berapa nilai aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih yang dinyatakan dengan IC50 menggunakan metode DPPH? b. Berapa kadar kapsaisin buah cabai rawit putih dengan metode kromatografi lapis tipis – densitometri?

2.

Keaslian penelitian Penelitian mengenai uji aktivitas antioksidan pada cabai pernah dilakukan oleh Bachtiar (2009). Penelitian yang dilakukan adalah mengamati pengaruh suhu dan lama penyimpanan dingin terhadap kandungan vitamin C dan aktivitas antioksidan pada cabai merah (Capsicum annum L.) dengan menggunakan metode DPPH. Howard, Talcott, Brenes, dan Villalon (2000) melakukan penelitian mengenai aktivitas antioksidan pada berbagai spesies Capsicum dengan metode β-karoten – linoleat. Alvarez-Parrilla, De La Rosa,


Amarowicz, Shahidi (2011) meneliti aktivitas antioksidan pada buah Jalapeno dan Serrano Peppers menggunakan metode DPPH. Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang telah dilakukan adalah pada penelitian ini menguji aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih (Capsicum frutescens L.) dengan menggunakan DPPH dan menetapkan kadar kapsaisin dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) – densitometri. Sejauh penelusuran peneliti, penelitian ini belum pernah dilakukan.

3.

Manfaat penelitian a.

Manfaat

teoritis.

Penelitian

ini

diharapkan

dapat

memberikan

perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi mengenai aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih pada radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC50. b.

Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai potensi buah cabai rawit putih sebagai antioksidan alami yang dapat dikembangkan sebagai sediaan farmasi untuk mencegah senyawa radikal bebas dan memelihara kesehatan masyarakat.


B. Tujuan 1. Tujuan umum Menguji aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih dengan menggunakan metode DPPH. 2. Tujuan khusus a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih yang

dinyatakan sebagai IC50 dengan menggunakan metode DPPH. b. Menetapkan kadar kapsaisin buah cabai rawit putih dengan metode kromatografi lapis tipis – densitometri.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Cabai Rawit Putih 1.

Klasifikasi tanaman Klasifikasi tanaman cabai rawit putih dalam sistematika tumbuhan menurut Plantamor (2008) adalah sebagai berikut.

2.

Kingdom

: Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom

: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi

: Spermatophyta (Tumbuhan berbiji)

Divisi

: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (Tumbuhan berkeping biji dua)

Sub Kelas

: Asteridae

Ordo

: Solanales

Famili

: Solanaceae (Suku terung-terungan)

Genus

: Capsicum

Spesies

: Capsicum frutescens L.

Morfologi tanaman Tumbuhan cabai rawit putih berasal dari Amerika tropik, tumbuh di daerah kering. Perdu setahun, percabangan banyak, tinggi 50-100 cm. Batangnya berbuku-buku atau bagian atas bersudut. Daun tunggal, bertangkai, letak berselingan. Helaian daun bulat telur, ujung meruncing,

8


pangkal menyempit, tepi rata, pertulangan menyirip, panjang 5-9,5 cm, lebar 1,5-5,5 cm, berwarna hijau. Bunga keluar dari ketiak daun, mahkota bentuk bintang, bunga tunggal atau 2-3 bunga letaknya berdekatan, berwarna putih, putih kehijauan, kadang-kadang ungu. Buahnya berupa buah buni, tegak, kadang-kadang merunduk, berbentuk bulat telur, lurus atau bengkok, ujung meruncing, panjang 1-3 cm, lebar 2,5-12 mm, bertangkai panjang, dan rasanya pedas. Buah muda berwarna hijau tua, putih kehijauan, atau putih, buah yang masak berwarna merah terang (Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005).

3.

Kandungan kimia Buah

cabai

rawit

putih

mengandung

kapsaisin,

kapsantin,

karotenoid, alkaloid atsiri, resin, minyak menguap, vitamin (A dan C), dan flavonoid. Kapsaisin memberikan rasa pedas pada cabai, berkhasiat untuk melancarkan aliran darah serta pemati rasa kulit. Biji mengandung alkaloid, antara lain solanina, solamidina, solamargina, solasodina, solasomina, dan steroid saponin (kapsisidin) (Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005; Howard, Talcott, Brenes, dan Villalon, 2000).

4.

Kegunaan buah cabai rawit putih Cabai rawit memiliki manfaat sebagai obat sariawan, tonik, stimulan kuat untuk jantung dan aliran darah, antirematik, antikoagulan, stomakik,


karminatif, diaforetik, dan diuretik (Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005). B. Kapsaisin Kapsaisin adalah senyawa yang menimbukan rasa pedas. Kapsaisin (trans-8-methyl-N-vanillyl-6-nonenamide), senyawa alkaloid berbentuk kristal, lipofilik, tidak berwarna, dan tidak berbau memiliki formula C18H27NO3. Kapsaisin memiliki kelarutan di dalam lemak, minyak, dan alkohol (Escogido, Mondragon, Tzompantzi, 2011). Kapsaisin disintesis secara alami dari plasenta buah cabai dari kondensasi enzimatik vanililamina dan rantai asam lemak yang diperpanjang oleh enzim fatty acid synthase. Penelitian menunjukkan bahwa kapsaisinoid, khususnya kapsaisin memiliki aktivitas biologi dan fisiologi yang bervariasi seperti antioksidan, antikarsinogenik, metabolisme energi dan pengurangan akumulasi lemak, serta antiinflamasi (Escogido, Mondragon, Tzompantzi, 2011). Substituen pada posisi 3 dan 4 dari cincin aromatis fenolik khususnya gugus 4-OH fenolik memiliki kemampuan aktivitas agonis. Sifat donor-akseptor ikatan hidrogen pada gugus fenol merupakan kunci aktivitas agonis (Escogido, Mondragon, Tzompantzi, 2011).

Gambar 1. Struktur senyawa kapsaisin (Henderson and Slickman, 1999)


Kapsaisin memiliki aktivitas antioksidan dengan menangkap radikal bebas. Gugus fenol pada kapsaisin yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan dalam mendonorkan elektron kepada radikal bebas (Henderson and Slickman, 1999). C. Radikal Bebas Untuk hidup, kita memerlukan oksigen, namun oksigen juga merupakan sumber radikal bebas. Radikal bebas

tersebut beberapa di antaranya toksik

(beracun) dan sangat reaktif dapat mempercepat proses penuaan dan kematian (Kochar and Rossell, 1990). Radikal bebas merupakan atom atau gugus atom yang memiliki satu elektron tidak berpasangan. Radikal bebas bersifat sangat reaktif dan berenergi tinggi karena adanya elektron tidak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1982). Awal terjadinya radikal bebas antara lain dari proses reduksi molekul oksigen dalam rangkaian transport dalam mitokondria atau dalam proses-proses lain yang terjadi secara acak dari berbagai proses kimiawi dalam tubuh yang melibatkan senyawa organik maupun inorganik. Radikal bebas yang berupa peroksil anion ini akan bereaksi dengan dua proton (2H+) membentuk hidrogen peroksida (H2O2) (Pratt, 1992). Hidrogen peroksida dapat pula terbentuk dari air (H2O) yang terkena radiasi (sinar ß maupun γ) dan karena proses-proses lain. Dengan keberadaan zat besi (Fe2+) hidrogen peroksida tersebut mengalami serangkaian reaksi sehingga terbentuk radikal hidroksil (OH) yang sangat reaktif. Radikal bebas yang


terbentuk ini mempunyai masa paruh yang sangat pendek, tetapi tetap mempunyai potensi besar yang dapat merusak sel. Radikal hidroksil, yang diduga dalam kehidupan kita banyak terbentuk dianggap lebih berbahaya dibanding bentuk radikal bebas yang lain (Pratt, 1992).

D. Antioksidan Antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi lipid. Dalam arti khusus, antioksidan adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi antioksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid (Kochar and Rossell, 1990). Antioksidan

sangat

beragam

jenisnya.

Berdasarkan

sumbernya

antioksidan dibagi dalam dua kelompok yaitu antioksidan sintetik (antioksidan yang diperoleh dari hasil sintetis reaksi kimia) dan antioksidan alami (antioksidan hasil ekstraksi bahan alami). Antioksidan alami di dalam makanan dapat berasal dari senyawa antioksidan yang sudah ada dari satu atau dua komponen makanan, senyawa antioksidan yang terbentuk dari reaksi-reaksi selama proses pengolahan, senyawa antioksidan yang diisolasi dari sumber alami dan ditambahkan ke makanan sebagai bahan tambahan pangan (Pratt, 1992). Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan diklasifikasikan menjadi dua kategori, yaitu antioksidan pencegah dan antioksidan pemutus rantai. Antioksidan pencegah bekerja dengan menghambat pembentukan reactive oxygen species, seperti enzim katalase, peroksidase, superoksida dismutase, dan transferin. Antioksidan pemutus rantai merupakan senyawa yang menangkap


radikal oksigen kemudian memutus rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya vitamin C, vitamin E, asam urat, bilirubin, polifenol, dan sebagainya. Antioksidan pemutus rantai memiliki dua jalur reaksi. Jalur pertama merupakan jalur transfer atom hidrogen dengan mekanisme radikal oksigen menangkap hidrogen dari antioksidan sehingga terbentuk kompleks antioksidan-radikal yang bersifat stabil. Jalur kedua, antioksidan mendeaktivasi radikal bebas dengan transfer elektron tunggal. Transfer elektron tunggal sangat dipengaruhi oleh kestabilan pelarut pada muatan tertentu (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, and Deemer, 2002).

E. Metode DPPH Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Tujuan metode ini adalah mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal ini dapat dicapai dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode tersebut. DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa


antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Perubahan absorbansi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak membutuhkan biaya

tinggi

dalam

menentukan kemampuan antioksidan

menggunakan radikal bebas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH). DPPH sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical scavengers atau donor hidrogen

dan mengevaluasi

aktivitas

antioksidannya, serta

mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal-antioksidan yang terbentuk. Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001). Elektron tunggal pada radikal bebas DPPH memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga menimbulkan warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning seiring penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang tertangkap. Mekanisme penangkapan radikal ditunjukkan pada reaksi di bawah ini.


Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan (Prakash, Rigelhof, Miller, 2001)

F. Ekstraksi Tujuan ekstraksi adalah menyari zat pokok atau komponen kimia yang diinginkan dari bahan mentah obat menggunakan pelarut yang sesuai dengan kelarutan zat sehingga zat yang diinginkan masuk dalam cairan penyari. Bahan mentah yang berasal dari tumbuh-tumbuhan ataupun hewan tidak perlu diproses lebih lanjut kecuali dikumpulkan atau dikeringkan. Tiap-tiap bahan mentah obat disebut ekstrak, tidak mengandung hanya satu unsur saja tetapi berbagai unsur, tergantung pada obat yang digunakan dan kondisi dari ekstraksi (Fouad, 2005). Semakin banyak permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari maka proses ekstraksi bertambah baik ( Harborne, 1987). Pada proses ekstraksi, pelarut yang digunakan untuk ekstraksi harus dapat mendesak masuk ke dalam sel yang masih utuh sehingga dibutuhkan pelarut yang dapat membuka lintasan untuk memungkinkan pelarut masuk ke bagian dalam sel. Membran akan mengalami peningkatan volume melalui pengambilan


molekul bahan pelarut. Kemampuan pelarut untuk mengikat zat perancah selulose menyebabkan struktur perancah tersebut menjadi longgar, sehingga terbentuk ruang antarmiselar, yang memungkinkan pelarut mencapai ke dalam ruang dalam sel. Masuknya pelarut dalam intrasel menyebabkan protoplasma membengkak dan zat yang terkandung dalam sel akan terlarut sesuai dengan kelarutannya. Perbedaan konsentrasi larutan di dalam sel dengan cairan pengekstraksi yang baru (tidak mengandung zat aktif) akan menyebabkan terjadinya proses difusi melalui ruang antarmiselar. Zat di dalam sel akan keluar menuju pelarut hingga mencapai kesetimbangan konsentrasi (Voigt, 1994). Penyarian dengan alat Soxhlet merupakan metode ekstraksi dengan cara mengaliri bahan yang akan diekstrak dengan pelarut yang sesuai dan selalu diperbaharui. Bahan yang akan diekstrak dibungkus dalam suatu kantung ekstraksi, kemudian kantung dimasukkan dalam sebuah alat ekstraksi (Soxhlet) yang bekerja secara terus-menerus. Soxhlet diletakkan di antara labu penampung hasil ekstraksi dan suatu pendingin aliran balik yang dihubungkan oleh suatu pipa pipet. Dalam labu penampung hasil ekstraksi, pelarut yang ada di dalamnya diuapkan. Melalui pipa pipet, pelarut tersebut dialirkan menuju pendingin aliran balik dan berkondensasi sehingga pelarut menetes lagi ke bahan yang diekstraksi. Pelarut akan tertampung dalam wadah penampung hingga mencapai tinggi maksimal, kemudian secara otomatis pelarut ditarik ke dalam labu penampung. Karena itu, zat yang terekstraksi akan terendam oleh bahan pelarut murni yang selalu baru melalui penguapan kontinyu (Voigt, 1994).


Gambar 3. Penyarian dengan alat Soxhlet (Cornell University, 2011) Keuntungan

dari

penyarian

dengan

alat

Soxhlet

adalah

tidak

membutuhkan pelarut dalam jumlah yang banyak dan pelarut yang masuk ke dalam bahan yang akan diekstraksi secara terus menerus diperbaharui dengan pelarut yang tidak mengandung zat aktif (Voigt, 1994).

G. Spektrofotometri Visibel Spektrofotometri visibel merupakan teknik spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer. Distribusi elektron didalam suatu senyawa organik secara umum yang dikenal sebagai orbital elektron pi (п), sigma (α) dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila pada molekul dikenakan radiasi elektromagnetik maka akan terjadi ekstasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital elektro anti bonding (Mulja dan Suharman, 1995). Penerapan spektrofotometri UV-vis pada senyawa organik didasarkan pada transisi n- п* ataupun п- п*. Transisi ini terjadi dalam daerah spektrum


sekitar 200 ke 700 nm yang digunakan dalam eksperimen dan karenanya memerlukan gugus kromofor dalam molekul itu (Day dan Underwood, 1999). Kromofor merupakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah-daerah UV dan visibel, pada senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus jenuh yang terikat pada kromofor. Terikatnya gugus auksokrom pada kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2001). DPPH memberikan absorbansi maksimal di daerah visibel (cahaya tampak), sehingga untuk menganalisis penurunan absorbansi DPPH karena adanya senyawa antioksidan dapat menggunakan spektrofotometer visibel. Berkurangnya absorbansi dari reaksi DPPH dengan antioksidan menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas. Semakin rendah absorbansi mengindikasikan semakin tinggi kemampuan aktivitas antioksidan (Chaisawvong and Sangsrichan, 2009).

H. Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis merupakan metode kromatografi cair terbuka yang paling sederhana di mana fase diam berupa lapis tipis yang terdiri atas bahan padat yang dilapisi kepada permukaan penyangga dasar yang biasanya terbuat dari lempeng kaca, tetapi dapat pula terbuat dari plat polimer atau logam. Lapisan pelekat pada permukaan dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum (pati). Pada KLT, lapisan itu berfungsi sebagai permukaan padat


yang menyerap, walaupun dapat pula dipakai sebagai penyangga zat cair. Fase geraknya mengalir karena kerja kapiler (Gritter, 1991). Fase diam pada KLT dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap (kromatografi cair-padat) atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair (kromatografi cair-cair) empat penyerap (fase diam) yang paling umum dipakai adalah silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatome) atau selulosa (Gritter, 1991). Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori karena ada gaya kapiler. Yang digunakan hanyalah pelarut tingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem pelarut multi komponen ini harus berupa suatu campuran sederhana yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian volume sedemikian rupa sehingga volume total 100 (Stahl, 1985). Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah teknik yang mudah digunakan dalam memisahkan komponen dari suatu kompleks, seperti ekstrak dari jaringan tanaman. Bila kromatografi lapis tipis dikombinasikan dengan detektor yang tepat, KLT dapat menjadi metode kuantitatif senyawa yang memiliki pemisahan yang baik (Gonzáles, Lara, Carbajal, and Flota, 2007). KLT dapat digunakan untuk analisis baik secara kualitatif, kuantitatif, maupun semi-kuantitatif. Keuntungan dari KLT adalah reprodusibilitas sampel yang tinggi, biaya operasional yang murah, dan kemudahan identifikasi senyawa target, dengan menggunakan analisis spektrum UV-visibel. Saat ini, KLT menjadi


teknik yang sering digunakan karena kemampuan sistem analisis yang sensitif dan peningkatan kemampuan dari KLT dalam menganalisis (Turner, Subrahmanyam, and Piletsky, 2009).

I. Densitometri Densitometri merupakan metode analisis instrumental berdasarkan interaksi analit dengan radiasi elektromagnetik dalam bentuk bercak pada KLT. Densitometri dilakukan untuk analit dengan konsentrasi kecil yang memerlukan pemisahan terlebih dahulu dengan KLT. Evaluasi bercak KLT discanning dengan sumber sinar dalam bentuk celah. Sinar yang dipantulkan ditangkap oleh detektor untuk diukur. Pengukuran absorbansi dapat dibuat dengan absorbansi maupun fluorosensi (Rohman, 2009). Kebanyakan pengukuran densitometri dilakukan dengan cara absorbansi pada kisaran sinar UV (190-380 nm). Signal optik oleh adanya partikel pada lempeng menghasilkan persamaan matematis yang menyatakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi analit melalui kurva kalibrasi (Rohman, 2009).

J. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis merupakan penilaian terhadap parameter hasil analisis laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi syarat yang telah ditetapkan sehingga hasil analisis dapat dipercaya (Harmita, 2004). Kesahihan metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang digunakan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut memberikan hasil


yang diharapkan dengan accuracy dan prescision yang memadai (Mulya dan Suharman, 1995). Pedoman-pedoman kesahihan metode analisis didukung oleh parameter-parameter sebagai berikut. 1.

Accuracy (kecermatan) Accuracy berarti kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan menggunakan metode tersebut terhadap harga yang sebenarnya. Accuracy biasanya dinyatakan berupa persen perolehan kembali (recovery) dari penambahan zat atau sampel yang diketahui kadarnya (Hong and Shah, 2000). Akurasi dipengaruhi oleh sebaran galat (kesalahan) sistematik dalam seluruh tahapan analisis, sehingga untuk mengurangi kesalahan sistematik dapat dilakukan dengan menggunakan instrumen yang telah terkalibrasi, menggunakan pelarut dan pereaksi yang berkualitas untuk analisis, pengontrolan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasil analisis, dan pelaksanaan penelitian sesuai prosedur yang ditetapkan (Harmita, 2004). Parameter kecermatan bergantung pada konsentrasi matriks sampel dan keseksamaan metode (RSD). Rentang perolehan kembali yang diijinkan berbeda, tergantung konsentrasi analit pada matriks. Parameter akurasi yang diperbolehkan diuraikan pada tabel di bawah ini.


Tabel I. Kriteria akurasi yang masih dapat diterima menurut Harmita (2004) Analit pada matrik sampel, dalam % Rata-rata yang diperoleh, % 100 98-102 > 10 98-102 >1 97-103 > 0,1 95-105 0,01 90-107 0,001 90-107 0,0001 (1 ppm) 80-110 0,00001 (100 ppb) 80-110 0,000001 (10 ppb) 60-115 0,0000001 (1 ppb) 40-120

2.

Precision (ketelitian atau keseksamaan) Precision merupakan ukuran kedekatan masing-masing hasil analisis dari beberapa pengukuran di bawah kondisi analisis yang sama. Menurut USP 23/NF 18, presisi diartikan sebagai derajat antara hasil uji individual ketika prosedur diaplikasikan berulang kali dengan pengambilan sampel berulang kali dari sampel yang homogen (Hong and Shah, 2000). Parameter keseksamaan dilihat dari simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) dari kadar analit yang dianalisis. Secara umum, suatu metode dikatakan seksama bila simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Namun parameter keseksamaan ini dapat berubah karena dipengaruhi beberapa faktor, seperti konsentrasi analit yang dianalisis, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Rentang keseksamaan yang diperbolehkan dapat dilihat pada tabel di bawah ini.


Tabel II. Kriteria presisi yang masih dapat diterima menurut Harmita (2004) Analit pada matrik sampel, dalam % RSD yang diperoleh, % >1 2,5 0,1 5 0,0001 (1 ppm) 16 0,0000001 (1 ppb) 32 Untuk menentukan presisi metode analisis diperlukan penentuan berulang kali dengan prosedur yang sama. Makin kecil kadar zat yang dianalisis dan makin panjang tahapan prosedur metode analisis akan didapat harga simpangan relatif yang makin besar (Mulya dan Suharman, 1995). 3.

Specificity (selektivitas) Menurut USP 23/NF 18 (1995), Specificity adalah kemampuan pengukuran analit secara akurat dan spesifik dengan kehadiran komponen lain dalam matriks sampel. Komponen tersebut mungkin mengandung zat aktif, ekspien, pengotor, dan produk degredasi. Selektivitas seringkali dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode pada sampel yang mengandung bahan tambahan, seperti cemaran, hasil penguraian, senyawa yang memiliki kemiripan struktur, senyawa asing dibanding sampel yang tidak mengandung bahan tambahan (Harmita, 2004).

4.

Sensitivity (Sensitivitas) Sensitivity metode analisis adalah kemampuan metode analisis untuk memisahkan perbedaan kecil dalam konsentrasi analit. Ada dua faktor yang mempengaruhi sensitivitas yaitu slope kurva baku dan keterulangan (Skoog, 1994).


5. Linearity (rentang kelurusan) Rentang kelurusan yaitu suatu rentangan kadar yang terendah sampai kadar tertinggi yang ditentukan dengan kadar dan direlasikan dengan serapan pada spektrofotometri dengan koefisien korelasi yang mendekati satu (Mulya dan Suharman, 1995). Linearitas dinyarakan sebagai variansi di sekitar garis regresi yang dihitung dari data hasil uji analit pada berbagai konsentrasi menggunakan persamaan matematik. Persamaan matematik dalam penentuan linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil uji dengan konsentrasi analit (Harmita, 2004).

K. Landasan Teori Radikal bebas merupakan senyawa yang tidak stabil karena memiliki satu elektron yang tidak berpasangan. Radikal bersifat sangat reaktif untuk menstabilkan kekurangan elektronnya dengan menyerang elektron pada molekul di sekitarnya, namun dapat menyebabkan kerusakan sel sehingga timbul penyakitpenyakit degeneratif. Dengan demikian, diperlukan adanya senyawa yang dapat menghambat reaksi radikal bebas yang disebut sebagai antioksidan. Buah cabai rawit putih memiliki kandungan kapsaisin yang telah diteliti dapat digunakan sebagai antioksidan. Kapsaisin memiliki gugus fenolik yang dapat menangkap radikal bebas dengan cara mendonorkan atom hidrogen kepada radikal bebas sehingga menurunkan aktivitas radikal bebas. Karena kapsaisin merupakan senyawa alami, maka aman untuk digunakan.


Metode yang digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah metode DPPH. DPPH merupakan radikal bebas yang memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm. Senyawa antioksidan akan berpasangan dengan elektron bebas DPPH yang menyebabkan penurunan absorbansi. Dari

nilai

perubahan absorbansi dapat dihitung IC50 yang merupakan parameter kemampuan (aktivitas) dari antioksidan tersebut yang dapat menghambat 50% senyawa radikal. Kapsaisin

yang

merupakan

senyawa

dalam

cabai

rawit

yang

mempengaruhi aktivitas antioksidan, maka perlu ditetapkan kadar kapsaisin dalam cabai rawit putih. Kadar kapsaisin ditetapkan secara kromatografi lapis tipis – densitometri. Dari bercak yang dihasilkan, dapat ditetapkan kadarnya dengan scanning bercak menggunakan densitometri.

L. Hipotesis 1.

Ekstrak etanol buah cabai rawit putih mempunyai aktivitas antioksidan yang dapat dinyatakan sebagai IC50 menggunakan metode DPPH.

2.

Kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih perlu ditetapkan secara kromatografi lapis tipis – densitometri karena mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian aktivitas antioksidan pada cabai rawit putih ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena adanya perlakuan terhadap subyek uji dan menggunakan rancangan deskriptif.

B. Variabel 1.

Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak etanol cabai rawit putih.

2.

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH (%IC) dan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol cabai rawit putih.

3.

Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah lokasi pengambilan sampel, umur tanaman, bobot sampel tanaman yang digunakan, dan waktu pemanenan.

4.

Variabel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah cuaca, curah hujan, cahaya matahari, dan kelembaban ruangan.

26


C. Definisi Operasional 1.

Cabai rawit putih adalah buah yang belum masak dari tanaman cabai rawit (Capsicum frutescens L.) yang didapat dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.

2.

Ekstrak etanol buah cabai rawit putih adalah ekstrak kental yang didapat dari penyarian buah cabai rawit putih dengan alat Soxhlet menggunakan pelarut etanol.

3.

Metode DPPH adalah metode pengujian aktivitas antioksidan dalam menangkap radikal bebas DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Reaksi DPPH dengan senyawa antioksidan dapat menyebabkan perubahan intensitas warna sehingga absorbansi menurun.

4.

Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan ekstrak etanol cabai rawit putih dalam menangkap radikal bebas DPPH.

5.

Inhibition concentration 50 (IC50) merupakan nilai konsentrasi ekstrak etanol cabai rawit putih yang dapat menangkap 50% radikal bebas DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1.

Bahan penelitian Bahan yang digunakan pada penelitian ini, yaitu cabai rawit putih (Capsicum frutescens L.) yang didapat dari pasar Beringharjo, Yogyakarta, bahan kimia farmasetis berupa aquadest, bahan kualitas teknis berupa etanol 96% (Bratachem), bahan kualitas pro analitik meliputi etanol 96% (E.Merck), kapsaisin (Sigma-Aldrich), metanol (E.Merck), kloroform (E.Merck), toluena


(E.Merck), aseton (E.Merck), DPPH (Sigma-Aldrich), silica gel 60 F254 dan aluminium foil.

2.

Alat penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu vortex, spektrofotometer

UV-VIS (Shimadzu), blender, corong Buchner, oven,

mikropipet 10 – 1000 µL; 1 – 10 mL (Socorex), neraca analitik (Ohaus), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath (Memmet), densitometer (Shimadzu), tabung reaksi bertutup (Schott), dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex dan Iwaki).

E. Tata Cara Penelitian 1.

Determinasi buah Determinasi buah cabai rawit putih yang digunakan berdasarkan pengamatan morfologinya dilakukan dengan membandingkan literatur dari Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas (1996).

2.

Pengumpulan bahan Buah cabai rawit putih diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.


3.

Pembuatan ekstrak buah cabai rawit putih Buah cabai rawit putih sebanyak 1 kg yang masih segar dibersihkan dan dicuci kemudian dibuang bagian tangkainya. Buah cabai rawit putih dikeringkan pada oven dengan suhu 500C, kemudian dihaluskan dengan blender. Simplisia yang telah halus ditimbang sebanyak 25,0 g, dibungkus menggunakan kertas saring. Simplisia dimasukkan dalam labu alas bulat berisi 350,0 mL etanol p.a. Soxheltasi dilakukan pada suhu 700C selama 8 jam sampai didapat hasil ekstrasi yang jernih. Filtrat hasil ekstraksi dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator.

4.

Penentuan aktivitas antioksidan dengan metode DPPH a.

Pembuatan larutan DPPH, sebanyak 15,80 mg serbuk DPPH dilarutkan dengan 100,0 mL etanol p.a hingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan DPPH ditutup dengan aluminium foil dan harus selalu dibuat baru.

b.

Pembuatan larutan stok kapsaisin, sebanyak 2,50 mg kapsaisin dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, kemudian dilarutkan etanol p.a hingga batas.

c.

Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL larutan stok kapsaisin, kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan baku kapsaisin sebesar 25; 50; 75; 100; dan 125 µg/mL.


d.

Pembuatan larutan uji, sejumlah 25,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang kemudian ditambahkan etanol p.a sampai 25,0 mL. Dari larutan tersebut diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 dan 5,0 mL kemudian ditambah etanol p.a sampai 10,0 mL sehingga diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 100; 200; 300; 400 dan 500 µg/mL.

e.

Uji pendahuluan aktivitas antioksidan, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi ditambahkan 1,0 mL etanol p.a, larutan baku kapsaisin 75 µg/mL, dan larutan uji 300 µg/mL. Kemudian ditambahkan 3,0 mL etanol p.a pada masing-masing larutan. Larutan divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, perubahan warna yang terjadi diamati.

f.

Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,50; 1,0; dan 1,50 mL larutan DPPH. Larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan divortex selama 30 detik. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400 – 600 nm.

g.

Penentuan operating time (OT), sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1,0 mL larutan baku kapsaisin 25; 75; dan 125 µg/mL. Kemudian larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca


absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm setiap 5 menit selama 1 jam. h.

Penentuan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih, i.

Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol), pada labu ukur 5 mL, dimasukkan sebanyak 1,0 mL larutan DPPH. Larutan ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan baku dan larutan uji.

ii.

Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji, sebanyak 1,0 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL kemudian ditambah dengan 1,0 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya, larutan tersebut ditambah dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.

i.

Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h (i) dan (ii) divalidasi akurasi (% recovery), presisi (% CV), spesifisitas (spektra kontrol), dan linearitas (nilai r). konsentrasi standar kapsaisin terukur konsentrasi standar kapsaisin teoritis


Standar e iasi S konsentrasi standar kapsaisin terukur rata rata konsentrasi standar kapsaisin terukur j.

Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h (i) dan (ii), dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kapsaisin dan ekstrak buah cabai rawit putih.

5.

Penentuan kadar kapsaisin a.

Pembuatan fase gerak, fase gerak yang digunakan pada penelitian ini dibuat dalam perbandingan, yaitu toluena - kloroform - aseton (45:25:30, v/v/v). Fase gerak dituang dalam bejana kromatografi kemudian kertas saring dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak. Bejana ditutup rapat dan dibiarkan hingga seluruh kertas saring terbasahi oleh fase gerak.

b.

Pembuatan larutan stok kapsaisin, baku kapsaisin ditimbang seksama 5,0 mg ditimbang seksama dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml, kemudian dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan stok kapsaisin 0,50 mg/mL.

c.

Pembuatan larutan seri baku kapsaisin, larutan stok kapsaisin 0,50 mg/mL ditotolkan dengan volume 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 μL pada lempeng silika gel 60 F254 sehingga diperoleh seri kapsaisin dengan jumlah 0,5; 1,0; 2,0; dan 4,0 µg.

d.

Pembuatan larutan uji, sejumlah 50,0 mg ekstrak buah cabai rawit putih ditimbang seksama kemudian dilarutkan dengan metanol sebanyak 500,0 µL. Larutan tersebut divortex selama 10 menit dengan pemanasan di atas waterbath pada suhu 600C. Kemudian larutan disentrifugasi selama 2


menit dan disaring dengan ayakan mesh 60. Larutan uji dibuat replikasi sebanyak tiga kali. e.

Penetuan kadar kapsaisin buah cabai rawit putih, sebanyak 10,0 μL larutan uji ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254, kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak toluena - kloroform - aseton (45:25:30, v/v/v). Pengembangan dilakukan setinggi 10 cm, lempeng silika kemudian dikeluarkan dan ditunggu hingga kering. Bercak diamati di bawah lampu UV 254 nm kemudian dianalisis dengan densitometer pada panjang gelombang maksimum. Bercak seri baku kapsaisin diukur AUC-nya dengan densitometri pada panjang gelombang pengamatan yang telah diperoleh. Puncak kromatogram dan nilai AUC yang muncul diamati. Dengan metode regresi linear, nilai seri kadar (µg/mL) diplotkan terhadap nilai AUC masing-masing seri larutan baku sehingga diperoleh persamaan y = bx + a dimana y merupakan nilai respon (AUC), x merupakan konsentrasi senyawa baku, a adalah intersept, dan b adalah slope. Kadar kapsaisin dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan kurva baku yang paling baik.

F. Analisis Hasil Aktivitas penangkapan radikal (%) dapat dihitung dengan menggunakan rumus : bsorbansilarutan kontrol – bsorbansilarutan baku uji bsorbansilarutan kontrol


Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun larutan baku kapsaisin, sedangkan sumbu y adalah % IC, Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan baku kapsaisin dan larutan uji. Uji kadar kapsaisin total dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Nilai kadar tersebut didapatkan dari analisis data kromatogram dengan menggunakan densitometer. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan nilai Rf sampel dengan nilai Rf baku. Analisis kuantitatif yang dilakukan berdasarkan data AUC dari baku sehingga diperoleh persamaan regresi linear y = bx + a yang merupakan hubungan antara kadar dengan luas area yang dihasilkan. Data AUC sampel kemudian dimasukkan dalam persamaan regresi masing-masing baku sebagai y sehingga diperoleh kadar kapsaisin dalam sampel.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Buah Determinasi buah cabai rawit putih merupakan tindakan awal yang dilakukan dalam suatu penelitian yang menggunakan buah sebagai bahan uji. Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran identitas dari buah yang digunakan untuk penelitian dan menghindari adanya kesalahan pengambilan sampel. Jaminan kebenaran sampel sangat penting karena pada buah cabai terdiri dari berbagai macam spesies dan varietas. Masing-masing spesies buah cabai memiliki kandungan fitokimia yang berbeda. Determinasi buah dilakukan dengan membandingkan beberapa spesies dari Capsicum yang mengacu pada Bosland, Bailey, Iglesias-Olivas (1996).

Gambar 4. Morfologi berbagai spesies Capsicum (Bosland, Bailey, IglesiasOlivas, 1996) 35


Pembuktian determinasi buah dilakukan dengan membandingkan ciri-ciri dari buah dengan karakteristik spesies Capsicum pada literatur, yaitu panjang buah 2,5 – 5 cm; lebar buah 0,6 cm; bentuk buah datar (tidak bergelombang) dan tegak lurus; rasa buah sangat pedas; dan warna buah yang kuning kehijauan pucat saat belum masak. Morfologi buah cabai rawit putih yang digunakan sama dengan morfologi Tabasco (Capsicum frutescens L.) seperti yang terlihat di gambar 4.. Dari hasil determinasi tanaman, telah dibuktikan bahwa buah yang digunakan pada penelitian ini merupakan buah cabai rawit putih (Capsicum frutescens L.).

B. Hasil Pengumpulan Bahan Buah cabai rawit putih diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta pada September 2012. Pengambilan sampel pada satu tempat untuk mencegah adanya variasi kandungan metabolit dalam sampel sehingga mengurangi faktor pengacau yang dapat mempengaruhi hasil penelitian. Pemilihan buah cabai rawit yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah cabai rawit yang berwarna hijau muda pucat hampir mendekati putih pada seluruh bagian buah dan dalam keadaan segar. Buah cabai rawit yang digunakan adalah cabai rawit yang dipanen pagi hari sehingga menghindari perubahan senyawa kapsaisin menjadi metabolit lain. Pemanenan pada siang hari dapat merusak potensi senyawa antioksidan karena radiasi UV dari sinar matahari sehingga hasil pengujian aktivitas antioksidan tidak menunjukkan hasil yang sesungguhnya karena senyawa antioksidan sudah banyak berkurang.


C.

Hasil Preparasi Sampel

Buah cabai rawit putih yang telah dikumpulkan, dibersihkan, dibuang bagian tangkai, dan dicuci untuk menghilangkan pengotor-pengotor yang ada. Kemudian buah cabai rawit dikeringkan dengan pengovenan selama tiga hari pada suhu 40–600C agar menghilangkan kandungan air yang terdapat di dalam simplisia. Pengeringan simplisia dilakukan untuk mempermudah pembentukan serbuk simplisia yang kemudian diekstraksi dengan alat Soxhlet. Simplisia yang telah dikeringkan kemudian diblender dengan tujuan memperkecil ukuran partikel sehingga meningkatkan jumlah senyawa dalam buah cabai rawit putih yang terekstraksi. Semakin kecil ukuran partikel, maka luas permukaan spesifik partikel semakin besar sehingga jumlah penyari yang kontak dengan serbuk simplisia semakin besar. Semakin banyak pelarut kontak dengan simplisia maka pelarut makin mudah menembus sel dan mudah menarik senyawa dalam sel untuk keluar sehingga jumlah senyawa yang terekstraksi makin banyak pula. Serbuk simplisia yang digunakan diayak dengan pengayak nomor 40 agar didapat serbuk dengan ukuran yang cukup halus. Tujuan ekstraksi adalah menarik senyawa tertentu yang diinginkan dari dalam sel tumbuhan maupun bahan baku obat ke dalam pelarut yang memiliki kepolaran yang sesuai sehingga senyawa tersebut larut dalam pelarut. Teknik ekstraksi dan pelarut yang digunakan bergantung pada kandungan dan stabilitas senyawa yang akan diekstraksi. Pada penelitian ini, senyawa yang akan diekstraksi adalah kapsaisin yang banyak terkandung dalam buah cabai rawit putih.


Ekstraksi yang dilakukan adalah ekstraksi padat cair, yang melibatkan perpindahan senyawa dari padatan ke dalam cairan pengekstrak. Prinsip ekstraksi padat cair adalah adanya kontak antara pelarut dengan suatu padatan sehingga terjadi perpindahan massa zat aktif yang mula-mula berada dalam sel tanaman menuju pelarut dengan atau tanpa adanya faktor luar seperti aliran pelarut ataupun panas yang dapat mempercepat dan meningkatkan efektivitas ekstraksi (Rohman, 2009). Sampel yang digunakan adalah serbuk simplisia dari buah cabai rawit putih yang diekstrak menggunakan etanol. Metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah penyarian dengan alat Soxhlet. Penyarian dengan alat Soxhlet merupakan metode ekstraksi dengan pelarut yang mengalir dan menggunakan panas. Penyarian dengan alat Soxhlet dipilih karena telah digunakan pada beberapa penelitian dan terbukti memberikan hasil ekstraksi kapsaisin dengan rendemen yang tinggi. Keuntungan dari penggunaan alat Soxhlet adalah pelarut yang digunakan hanya sedikit dibanding perklorasi dan pelarut selalu baru, hasil dari penguapan secara kontinyu sehingga hasil ekstraksi yang didapat lebih banyak dibanding ekstraksi menggunakan maserasi karena kemungkinan terjadinya kejenuhan pelarut pada metode maserasi. Ekstraksi kapsaisin dilakukan dengan membasahi serbuk buah cabai rawit putih dengan etanol. Hasil dari ekstraksi ditampung pada labu alas bulat yang dipanaskan. Tujuan pemanasan labu alas bulat agar pelarut yang tertampung dapat menguap dan menyari simplisia dalam tabung Soxhlet. Suhu yang digunakan untuk memanaskan pelarut adalah 700C. Ekstraksi kapsaisin dilakukan


pada suhu tersebut karena memberikan rendemen hasil ekstraksi yang tinggi (Boonkird,

Phisalaphong, Phisalaphong, 2008) serta suhu 700C sudah dapat

digunakan untuk menguapkan pelarut etanol tanpa merusak senyawa kapsaisin. Ekstraksi dengan alat Soxhlet dihentikan setelah delapan jam, yaitu saat hasil penyarian pada tabung Soxhlet bening karena kapsaisin telah terekstraksi sempurna. Selama delapan jam ekstraksi, penyarian dengan Soxhlet mengalami sirkulasi pelarut sebanyak delapan kali. Hasil ekstraksi yang didapat berupa ekstrak cair berwarna hijau muda. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah etanol. Etanol digunakan pada proses ekstraksi penelitian ini karena memiliki sifat yang nonpolar sehingga dapat digunakan untuk menyari senyawa kapsaisin yang juga bersifat nonpolar. Metanol memiliki nilai indeks polaritas 6,6, sedangkan etanol memiliki indeks polaritas sebesar 5,2 (Snyder, Kirkland, Glajh, 1997). Berdasarkan nilai indeks polaritas, etanol memiliki kepolaran yang lebih rendah dibandingkan dengan metanol, sehingga etanol akan lebih efektif dalam mengestraksi kapsasin yang bersifat nonpolar. Pada penelitian yang telah dilakukan (Boonkird, Phisalaphong, Phisalaphong, 2008), etanol terbukti efektif dalam mengekstraksi kapsaisin sehingga jumlah kapsaisin yang didapat semakin banyak. Selain itu etanol 96% lebih ekonomis pada tahap penguapan pelarut karena tidak membutuhkan energi yang tinggi dibanding pelarut etanol lain dengan konsentrasi lebih rendah. Etanol lebih aman digunakan karena toksisitasnya lebih rendah dibanding pelarut organik lainnya serta lebih mudah terpenetrasi ke dalam membran sehingga dapat


mendorong senyawa dalam sel untuk terekstraksi. Etanol dapat mendenaturasi enzim polifenol oksidase sehingga mencegah terjadinya browning. Ekstrak yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan rotary vacuum evaporator pada kondisi suhu 600C. Prinsip dari rotary vacuum evaporator adalah destilasi hampa udara. Kondisi hampa udara dapat mengakibatkan penurunan tekanan sehingga pelarut dapat teruapkan pada suhu di bawah titik didih pelarut. Penurunan titik didih dapat mencegah terjadinya kerusakan senyawa dalam pelarut akibat suhu yang terlalu tinggi. Hasil dari penguapan dengan rotary vacuum evaporator berupa ekstrak pekat etanol yang kemudian diuapkan lagi pada waterbath sehingga didapat ekstrak kental etanol buah cabai rawit putih. Bobot ekstrak etanol yang didapat adalah 4,0943 g sehingga rendemen yang didapat dari ekstrak etanol buah cabai rawit putih sebesar 13,65 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan Uji pendahuluan aktivitas antioksidan bertujuan untuk menguji kemampuan aktivitas antioksidan dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih secara kualitatif. Peran penting adanya uji pendahuluan adalah untuk menentukan uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif selanjutnya. Uji pendahuluan dilakukan dengan membandingkan perubahan warna yang terjadi akibat adanya aktivitas antioksidan dari baku kapsaisin, senyawa uji ekstrak buah cabai rawit putih, dengan kontrol positif. Adanya senyawa antioksidan dapat berperan sebagai


penangkapan radikal bebas atau donor hidrogen sehingga menggambarkan kemampuan aktivitas antioksidan secara kualitatif. Senyawa antioksidan pada ekstrak buah cabai rawit putih berperan sebagai radical scavenger. Atom hidrogen dari gugus fenol kapsaisin akan ditangkap oleh DPPH yang bersifat radikal sehingga terbentuk kompleks DPPHkapsaisin yang bersifat stabil (Ou, Huang, Woodill, Flanagan, and Deemer, 2002). Saat DPPH membentuk kompleks dengan antioksidan, maka terjadi perubahan warna. Hasil dari uji pendahuluan yang dilakukan menunjukkan bahwa adanya perubahan intensitas warna pada larutan DPPH yang ditambah dengan ekstrak etanol buah cabai rawit putih (gambar 5) bila dibandingkan dengan larutan DPPH saja sebagai kontrol negatif (gambar 5). Kontrol negatif berfungsi sebagai pembanding yang menunjukkan tidak terjadinya reaksi penangkapan radikal bebas karena tidak ada senyawa antioksidan sehingga pada kontrol negatif tidak terjadi perubahan warna, sedangkan larutan DPPH yang ditambah baku kapsaisin digunakan sebagai kontrol positif yang berfungsi untuk menunjukkan hasil positif dari reaksi penangkapan radikal oleh senyawa antioksidan (gambar 5). Setelah 30 menit hasil uji pendahuluan menunjukkan bahwa kontrol negatif DPPH tetap berwarna ungu, kontrol positif dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning. Dari hasil uji pendahuluan, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol buah cabai rawit putih memiliki kemampuan antioksidan dalam menangkal radikal bebas.


Gambar 5. Hasil uji pendahuluan ekstrak etanol buah cabai rawit putih, kontrol negatif (DPPH), dan kontrol positif (kapsaisin) E. 1.

Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) Penetapan

panjang

gelombang

maksimum

dilakukan

untuk

mendapatkan panjang gelombang yang dapat memberikan penyerapan optimal. Pada panjang gelombang maksimum perubahan kadar yang kecil dapat terdeteksi sehingga menjamin validitas metode yang digunakan untuk analisis. DPPH digunakan untuk menentukan panjang gelombang maksimum karena DPPH memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang dapat tereksitasi saat terkena sumber cahaya.


Gambar 6. Gugus kromofor dan gugus auksokrom DPPH (Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010) Secara teoritis, panjang gelombang maksimum DPPH berkisar antara 515 – 520 nm (Molyneux, 2004). Pentingnya menetapkan panjang gelombang maksimum karena instrumen yang digunakan memiliki kondisi yang berbedabeda dalam memberikan serapan. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum perlu diukur agar didapat absorbansi maksimum sebelum menetapkan aktivitas antioksidan. Larutan DPPH yang akan diukur panjang gelombang maksimumnya diencerkan dengan etanol sebagai kontrol sehingga dapat diketahui absorbansi maksimal tanpa adanya gangguan dari senyawasenyawa lain. Panjang gelombang maksimum didapat dari scanning DPPH dari 400 – 600 nm. Konsentrasi larutan DPPH yang digunakan adalah 0,020 mM; 0,040 mM; dan 0,080 mM. Tabel III. Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum DPPH Konsentrasi larutan λ maksimum hasil λ maksimum rata-rata DPPH scanning 0,020 mM 517,5 nm 0,040 mM 517,0 nm 517,5 nm 0,080 mM 518,0 nm


Dari hasil scanning ketiga konsentrasi larutan DPPH, didapat ratarata panjang gelombang maksimum pada 517,5 nm. Panjang gelombang maksimum yang didapat tidak berbeda jauh dengan panjang gelombang maksimum DPPH secara teoritis, yaitu pada 517 nm (Azeez, Adeoye, Majolagbe, Lawal, Badiru, 2012). Dengan demikian, panjang gelombang yang digunakan untuk penetapan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih, yaitu 517,5 nm.

2.

Penentuan operating time (OT) Penentuan operating time perlu dilakukan untuk mengetahui waktu yang optimal DPPH bereaksi dengan senyawa antioksidan. Reaksi antioksidan dengan DPPH yang optimal akan meminimalkan kesalahan yang terjadi karena reaksi kedua senyawa telah bereaksi sempurna. Saat reaksi berjalan sempurna, maka akan didapat absorbansi pengukuran yang stabil. Operating time diperoleh dari pengukuran absorbansi DPPH yang telah direaksikan dengan larutan baku kapsaisin pada panjang gelombang maksimal yaitu 517,5 nm. Konsentrasi larutan baku kapsaisin yang digunakan adalah konsentrasi rendah (5 µg/mL), konsentrasi tengah (15 µg/mL), dan konsentrasi tinggi (25 µg/mL). Pengukuran dilakukan selama 60 menit dan diukur setiap lima menit (Noviana, Supardjan, dan Nurrochmad, 2007).


Penentuan Operating Time Baku Kapsaisin Selisih absorbansi

0,05 0,04 0,03 25 µg/mL 0,02

75 µg/mL

0,01

125 µg/mL

0 0

5

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Waktu (menit)

Gambar 7. Grafik penentuan Operating Time baku kapsaisin Dari hasil pengukuran operating time, didapat penurunan absorbansi secara drastis dari menit ke 0 hingga menit ke 30, yang menunjukkan bahwa reaksi yang terjadi masih belum optimal. Dari menit ke 30 hingga menit ke 60 juga masih mengalami penurunan absorbansi namun penurunannya tidak tajam (Gambar 7). Kurva yang terus menurun kemungkinan disebabkan kondisi lingkungan yang tidak memadai seperti adanya cahaya, reaksi oksidasi dengan udara yang mengurangi stabilitas DPPH sehingga absorbansi DPPH terus menurun. Karena absorbansi terus mengalami penurunan, maka penentuan operating time didapat dari selisih penurunan absorbansi yang mendekati stabil (Prasetya, 2010). Operating time yang digunakan selama 30 menit karena pada menit ke 30 nilai selisih penurunan absorbansi paling mendekati stabil dan secara teoritis, pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH digunakan operating time pada menit ke 30 (Andayani, Maimunah, dan Lisawati, 2008).


F.

Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Tujuan metode validasi adalah menjamin bahwa metode yang digunakan dalam penelitian ini valid dan memenuhi persyaratan parameter yang telah ditetapkan sehingga memberikan hasil analisis sesuai dengan yang diharapkan. Dengan demikian perlu adanya suatu pedoman yang dapat menjamin kevalidan suatu metode analisis. Metode analisis yang valid dapat memberikan hasil analisis yang akurat dan memiliki ketelitian tinggi pada penelitian yang dilakukan. Validasi metode analisis tidak hanya menentukan karakteristik metode yang digunakan tetapi juga verifikasi bahwa metode yang digunakan sesuai dengan tujuan sehingga mengurangi kemungkinan terjadinya kesalahan pada sampel dengan jumlah yang sedikit. Validasi metode yang digunakan pada penelitian ini dilakukan dengan menguji akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas dari kurva standar baku kapsaisin. Validasi dilakukan sebanyak tiga kali replikasi. Untuk analisis, digunakan hasil dari validasi yang menunjukkan hasil terbaik. Tabel IV. Hasil pengukuran absorbansi seri kurva baku kapsaisin yang direaksikan dengan DPPH Replikasi I Replikasi II Replikasi III Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi Kapsaisin Absorbansi Kapsaisin Absorbansi Kapsaisin Absorbansi (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) 5 0,598 5,008 0,600 5,016 0,594 10 0,526 10,016 0,535 10,032 0,512 15 0,453 15,024 0,451 15,048 0,427 20 0,385 20,032 0,385 20,064 0,362 25 0,310 25,040 0,319 25,080 0,288 Persamaan regresi linier Persamaan regresi linier Persamaan regresi linier A = 0,6695 A = 0,6716 A = 0,6648 B = -0,0143 B = -0,0142 B = -0,0154 y = -0,0143x + 0,6695 y = -0,0142x + 0,6716 y = -0,0154x + 0,6648 r = 0,9999 r = 0,9990 r = 0,9989


Hasil yang didapat dari seri kurva baku kapsaisin digunakan untuk pengukuran akurasi dan presisi. Persamaan regresi linier yang digunakan untuk menghitung akurasi dan presisi adalah persamaan regresi linier replikasi I karena memiliki nilai r yang paling baik dari ketiga replikasi. Nilai r yang baik adalah nilai r yang mendekati satu. Persamaan yang digunakan adalah y = -0,0143x + 0,6695 dengan nilai r 0,9999 (Tabel IV) 1.

Spesifisitas metode uji aktivitas antioksidan Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur analit secara akurat tanpa adanya gangguan dari komponen-komponen lain seperti matriks sampel, produk hasil sintesis, eksipien, produk degradasi, dan senyawa pengotor (Gonzáles and Herrador, 2007). Spesifisitas pada penelitian ini dilakukan dengan membaca absorbansi senyawa-senyawa lain yang digunakan dalam uji aktivitas antioksidan pada panjang gelombang maksimum DPPH, yaitu 517,5 nm. Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH, namun senyawa yang diukur tidak hanya DPPH sehingga perlu adanya pengujian spesifisitas dari metode. Adanya senyawa lain yang terbaca pada panjang gelombang yang digunakan akan mempengaruhi hasil pembacaan absorbansi sehingga memungkinkan ketidakvalidan metode. Dari hasil scanning larutan baku kapsaisin (Lampiran 7), larutan uji (Lampiran 7), dan pelarut etanol (Lampiran 7) menunjukkan tidak adanya absorbansi pada panjang gelombang 517,5 nm, sehingga saat pengukuran DPPH yang ditambahkan senyawa baku kapsaisin maupun larutan uji,


absorbansi yang terukur hanyalah absorbansi dari DPPH hasil reaksi. Berdasarkan hasil tersebut, metode uji aktivitas antioksidan memenuhi persyaratan validasi untuk spesifisitas. 2.

Akurasi metode uji aktivitas antioksidan Akurasi adalah ukuran derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit secara teoritis yang dinyatakan dalam nilai persen perolehan kembali (% recovery). Hasil akurasi yang baik untuk sampel dengan konsentrasi analit sebesar 10 ppm bila persen perolehan kembali yang didapat antara 90 – 107% (González and Herrador, 2007). Pengukuran akurasi dilakukan pada baku kapsaisin peringkat rendah (5 µg/mL), peringkat sedang (15 µg/mL), dan peringkat tinggi (25 µg/mL) dengan replikasi sebanyak tiga kali. Tabel V. Nilai perolehan kembali (% recovery) uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin % Recovery Kadar kapsaisin Peringkat (µg/mL) Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rendah 5 99,72% 96,77% 104,96% Sedang 15 100,65% 101,42% 106,34% Tinggi 25 100,27% 97,61% 103,63% Berdasarkan data nilai perolehan kembali baku kapsaisin (Tabel V), nilai perolehan kembali berada pada rentang 96,77% - 104,96% untuk peringkat rendah, 100,65% - 106,34% untuk peringkat sedang, dan 97,61% 103,63% untuk peringkat tinggi. Hasil perolehan kembali aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin yang didapat memenuhi syarat akurasi untuk sampel dengan kadar 10 -100 ppm, yaitu pada rentang 90% - 107% (Harmita, 2004). Dapat disimpulkan bahwa metode yang digunakan memiliki akurasi


yang baik sehingga pada penetapan aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih dapat memberikan akurasi yang baik pula. 3.

Presisi metode uji aktivitas antioksidan Presisi merupakan derajat penyebaran hasil pengukuran sampel bila metode dilakukan secara berulang dan pengambilan sampel harus homogen (Harmita, 2004). Presisi dinyatakan berdasarkan nilai Coeffisient of Variant (CV), semakin kecil nilai CV menunjukkan bahwa penyebaran hasil makin kecil yang berkorelasi dengan semakin baiknya presisi dari metode yang digunakan sehingga validitas metode memenuhi kriteria parameter yang ditentukan. Penentuan nilai presisi yang diperbolehkan bergantung pada kadar analit yang terdapat dalam matriks sampel, instrumen yang digunakan, dan tahapan prosedur penelitian yang dilakukan. Untuk sampel dengan konsentrasi

ppm, batas CV yang diperbolehkan ≤ 5

(González and

Herrador, 2007). Pengukuran presisi dilakukan pada baku kapsaisin konsentrasi peringkat rendah (5 µg/mL), peringkat sedang (15 µg/mL), dan peringkat tinggi (25 µg/mL) dengan replikasi sebanyak tiga kali. Tabel VI. Nilai CV uji aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin Kadar Rata-rata kadar Peringkat kapsaisin kapsaisin SD CV (%) (µg/mL) terukur (µg/mL) Rendah 5 5,0324 0,2130 4,23 Sedang 15 15,4452 0,4869 3,15 Tinggi 25 25,1669 0,7791 3,10 Berdasarkan nilai CV pada Tabel VI, baku kapsaisin memenuhi parameter presisi pada peringkat rendah, peringkat sedang, maupun peringkat


tinggi dengan nilai CV berturut-turut 4,23%; 3,15%; dan 3,10%. Metode yang digunakan telah memenuhi batas presisi, yaitu kurang dari 5%, sehingga menjamin presisi yang baik pula pada uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih. 4.

Linearitas metode uji aktivitas antioksidan Kurva kalibrasi pada metode ini merupakan hubungan proposional antara absorbansi analit (respon) dengan konsentrasi analit (Gonzáles and Herrador, 2007). Hasil dari kurva kalibrasi dapat diukur secara matematik sehingga menunjukkan linearitas metode. Linearitas dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Linearitas dikatakan semakin baik apabila koefisien korelasi dari kurva kalibrasi menunjukkan hasil semakin mendekati satu (Mulja dan Hanwar, 2003). Linearitas dilakukan dengan mengukur regresi linier dari konsentrasi baku kapsaisin dengan aktivitas antioksidan dengan tiga kali replikasi. Dari pengukuran tiga replikasi, replikasi I menunjukkan nilai linearitas yang paling baik dengan nilai r = 0,9999, sedangkan nilai linearitas baku kapsaisin replikasi II dan III berturut-turut 0,9990 dan 0,9989. Nilai r ini memenuhi syarat linearitas yang baik, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini memenuhi parameter linearitas. Hasil dari validasi metode analisis uji aktivitas antioksidan menunjukkan

bahwa metode yang digunakan dalam mengukur kemampuan antioksidan menangkap radikal DPPH memenuhi parameter spesifisitas, akurasi, presisi, dan


linearitas sehingga dapat disimpulkan metode ini memiliki validitas yang baik dan hasil pengukuran dapat dipercaya.

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Uji aktivitas antioksidan pada penelitian ini menggunakan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) sebagai radikal bebas. Prinsip metode DPPH adalah penangkapan radikal bebas oleh senyawa antioksidan yang dapat menyebabkan pengurangan intensitas warna radikal DPPH. Senyawa antioksidan akan mendonorkan atom hidrogen kepada radikal bebas sehingga dapat menstabilkan radikal DPPH. Pendonoran hidrogen berdampak pada perubahan warna yang semula berwarna ungu menjadi kuning. Aktivitas antioksidan dapat diukur dengan mengkuantifikasi

penurunan

absorbansi

radikal

DPPH

menggunakan

spektrofotometer visibel. Metode DPPH digunakan karena dapat mengukur secara langsung konsentrasi senyawa antioksidan yang menangkal radikal, prosedur yang dilakukan sederhana, dan sesuai digunakan untuk menguji senyawa polihidroksi aromatik seperti kapsaisin sebagai antioksidan. Kandungan zat aktif dalam buah cabai rawit putih adalah kapsaisin, dihidrokapsaisin, kapsantin, karotenoid, senyawa fenolik, flavonoid, dan vitamin C. Senyawa-senyawa fitokimia di atas menunjukkan kemampuan antioksidan yang tinggi dalam menangkal radikal bebas. Meskipun demikian, pada penelitian ini, vitamin C tidak banyak berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan karena vitamin C mudah terdegradasi oleh adanya suhu tinggi dan cahaya saat proses ekstraksi.


Senyawa kapsaisin memiliki gugus OH yang dapat berperan dalam mendonorkan atom hidrogennya untuk radikal bebas. Karena kandungan kapsaisin sangat tinggi pada buah cabai rawit putih maka kapsaisin banyak berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan.

Gambar 8. Struktur kapsaisin Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh kapsaisin ditunjukkan oleh gambar 9.

PPH yang merupakan radikal bebas dilambangkan sebagai R•.

Adanya senyawa kapsaisin yang memiliki gugus OH akan mendonorkan atom hidrogen pada elektron bebas yang terdapat pada DPPH sehingga radikal DPPH menjadi senyawa yang bersifat netral. Penangkapan elektron bebas ini akan berpengaruh terhadap perubahan warna DPPH akibat tidak adanya delokalisasi elektron pada DPPH. Dengan demikian, warna DPPH yang semula berwarna ungu akan mengalami penurunan intensitas warna menjadi kuning.


Gambar 9. Mekanisme penghambatan radikal bebas oleh senyawa kapsaisin


Kurva persamaan regresi linier untuk ekstrak etanol buah cabai rawit putih menggambakan hubungan linier konsentrasi ekstrak etanol yang digunakan dengan aktivitas antioksidan yang ditunjukkan sehingga dapat menentukan nilai IC50. Kurva regresi liner ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi I, II, dan III ditunjukkan pada gambar 10, 11, 12. Persamaan regresi linier dan hasil pengukuran % IC untuk ekstrak etanol buah cabai rawit putih ditunjukan pada tabel VII. Tabel VII. Hasil aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (µg/mL) 20,32 40,64 60,96 81,28 101,6 20 40 60 80 100 20 40 60 80 100

% IC 14,8148 25,9259 37,4202 48,7867 60,0255 14,2683 23,4146 31,8293 40,6098 49,1463 13,6304 23,7221 34,8624 47,5754 59,1088

Persamaan regresi linier y = 0,5575 x + 3,4100 r = 0,9999

y = 0,4348 x + 5,7683 r = 0,9999

y = 0,5740 x + 1,3368 r = 0,9992


Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi I Aktivitas antioksidan (%)

70

y = 0,5575 x + 3,4100 r = 0,9999

60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100

120

Konsentrasi ekstrak etanol cabai rawit putih (µg/mL)

Gambar 10. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi I

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi II Aktivitas antioksidan (%)

60

y = 0,4348 x + 5,7683 r = 0,9999

50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100

120


Gambar 11. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi II


Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi III Aktivitas antioksidan (%)

70

y = 0,5740 x + 1,3368 r = 0,9992

60 50 40 30 20 10 0 0

20

40

60

80

100

120


Gambar 12. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih replikasi III

Penurunan intensitas warna setara dengan konsentrasi senyawa kapsaisin yang menangkap radikal bebas. Parameter yang digunakan untuk mengukur kemampuan antioksidan dalam menangkap radikal bebas adalah IC50 (Inhibiton concentration 50) yang merupakan konsentrasi senyawa antioksidan yang dibutuhkan untuk menangkap radikal bebas sebanyak 50%. Nilai IC50 didapat dari hubungan regresi linier antara konsentrasi senyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan. Hubungan konsentrasi antioksidan dengan aktivitas antioksidan berbanding terbalik. Suatu antioksidan dikatakan memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi apabila konsentrasi antioksidan yang dapat menangkap 50% radikal semakin kecil.


Dari hasil perhitungan, didapat nilai IC50 untuk baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih di tunjukan pada tabel VIII. Tabel VIII. Hasil perhitungan IC50 baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih IC50 (µg/mL) Sampel Replikasi I Replikasi II Replikasi III Rata-rata Baku 16,0735 16,3602 15,5368 15,99 kapsaisin Ekstrak buah cabai 83,5695 101,7288 84,7643 90,02 rawit putih

SD 0,42 10,16

Nilai rata-rata IC50 pada sampel ekstrak etanol buah cabai rawit putih sebesar (90,02±10,16) µg/mL yang berarti dibutuhkan ekstrak etanol sebanyak (90,02±10,16) µg/mL untuk dapat menangkap 50% radikal DPPH. Sedangkan untuk baku kapsaisin, nilai IC50 sebesar (15,99±0,42) µg/mL. Semakin kecil nilai IC50 menunjukkan bahwa sampel yang digunakan semakin poten karena hanya dibutuhkan sedikit sampel untuk dapat efektif menangkap radikal bebas. Jadi ekstrak kapsaisin termasuk dalam antioksidan yang kuat. Dari nilai IC50 yang didapatkan dari perhitungan, baku kapsaisin lebih besar dibanding ekstrak etanol buah cabai rawit putih yang berarti kandungan kapsaisin yang terdapat dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih tidak terlalu banyak sehingga nilai IC50 yang ditunjukkan lebih kecil dibanding baku kapsaisin. Tingkat kekuatan aktivitas antioksidan pada baku kapsaisin termasuk dalam tingkat sangat kuat karena nilai IC50 kurang dari 50 µg/mL (Ariyanto, 2006), sedangkan tingkat kekuatan aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol buah cabai rawit putih termasuk dalam tingkat kuat karena nilai IC50 antara 50 – 100 µg/mL (Ariyanto, 2006).


Tabel IX. Tingkat kekuatan aktivitas antioksidan Tingkat aktivitas antioksidan dengan metode DPPH

Sampel

Baku kapsaisin Ekstrak buah cabai rawit putih

IC50 (µg/mL)

Sangat kuat (< 50 µg/mL)

Kuat (50 - 100 µg/mL)

Sedang (101 - 150 µg/mL)

Lemah (>150 µg/mL)

15,9902



-

-

-

90,0209

-



-

-

H. Hasil Penetapan Kadar Kapsaisin Kapsaisin merupakan senyawa dalam ekstrak yang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan sehingga perlu dilakukan penetapan kadar kapsaisin yang terkandung dalam ekstrak buah cabai rawit putih karena kadar kapsaisin berkorelasi dengan aktivitas antioksidan yang dihasilkan dalam menangkal radikal bebas. Penetapan kadar kapsaisin dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) – densitometri. Prinsip metode KLT adalah pemisahan senyawa berdasarkan afinitas dan koefisien distribusi sampel pada fase gerak dan fase diamnya (Rohman, 2009). Sedangkan prinsip dari densitometri adalah perhitungan kadar analit secara kuantitatif berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang berupa bercak pada lempeng KLT (Rohman, 2009). Metode KLT – densitometri ini sesuai untuk menetapkan kadar kapsaisin karena prosedurnya lebih mudah dan lebih efisien dibandingkan menggunakan kromatografi kolom. KLT

–

densitometri sesuai untuk pengukuran kadar dalam jumlah kecil. Dengan demikian, kadar kapsaisin yang kecil akan lebih sensitif terukur menggunakan


KLT – densitometri. Kapsaisin yang diukur merupakan senyawa hasil ekstraksi buah cabai rawit putih yang merupakan senyawa dari alam sehingga saat pengukuran akan mengandung banyak senyawa alam lain. KLT dapat digunakan untuk memisahkan terlebih dahulu kapsaisin dengan senyawa lainnya sehingga kapsaisin terukur secara spesifik. Bila pengukuran kapsaisin yang merupakan isolasi senyawa alam diukur menggunakan metode KCKT, maka sampel kemungkinan akan menyumbat kolom KCKT sehingga kapsaisin lebih sesuai diukur menggunakan KLT. Sistem kromatografi yang digunakan merupakan kromatografi adsorpsi karena fase diam merupakan silika gel yang telah diaktifkan. Sistem adsorpsi didasarkan pada interaksi sampel dengan fase diam dengan cara adsorpsi di permukaan fase diam sehingga sampel tetap terikat pada fase diam namun dapat bergerak saat dielusi. Kapsaisin dapat dipisahkan dengan sistem kromatografi lapis tipis fase normal, yaitu menggunakan fase gerak yang bersifat non polar sedangkan fase diamnya bersifat lebih polar. Fase gerak yang digunakan adalah campuran toluena, kloroform, dan aseton dengan perbandingan 45:25:30. Fase gerak yang digunakan memiliki nilai indeks polaritas 3,505 yang bersifat cenderung non polar. Campuran fase gerak tersebut dapat memisahkan kapsaisin dari senyawa lainnya secara optimal. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 F254 yang bersifat polar. Pemisahan kapsaisin dengan senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak buah cabai rawit putih dapat terjadi karena adanya perbedaan interaksi masing-masing senyawa dengan fase diam maupun fase geraknya. Kapsaisin lebih berinteraksi dengan fase


gerak yang juga bersifat non polar sehingga kapsaisin dapat terelusi. Interaksi yang terjadi pada senyawa kapsaisin dengan fase diam merupakan interaksi hidrogen (gambar 13), sedangkan interaksi yang terjadi pada fase diam adalah interaksi hidrogen, interaksi dipol-dipol, dan interaksi van der Waals (gambar 14).

Gambar 13. Interaksi kapsaisin dengan fase diam silika gel 60 F254

Gambar 14. Interaksi kapsaisin dengan fase gerak toluena-kloroform-aseton (45:25:30, v/v/v)


Analisis kualitatif dilakukan pertama kali untuk melihat apakah terkandung senyawa kapsaisin atau tidak di dalam sampel. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan antara nilai Rf baku kapsaisin dengan nilai Rf sampel. Nilai Rf baku dan sampel dapat dilihat di bawah ini. Tabel X. Data nilai Rf baku kapsaisin dan sampel Sampel Nilai Rf Baku kapsaisin 0,61 Ekstrak etanol buah cabai rawit putih 0,61 Dari kromatogram didapat bahwa nilai Rf baku kapsaisin sama dengan nilai Rf pada sampel yaitu pada 0,61. Kesamaan nilai Rf antara baku dan sampel menunjukkan adanya kesamaan polaritas dan sifat dari senyawa sehingga dapat disimpulkan bahwa senyawa pada sampel dengan nilai Rf 0,61 merupakan kapsaisin. Kurva baku dibuat untuk menyatakan hubungan linear antara konsentrasi analit dengan AUC (Area Under Curve) yang teramati oleh densitometri. Pada penelitian ini digunakan 4 seri baku, yaitu pada konsentrasi 0,0125; 0,025; 0,05; dan 0,1 µg/µL. Kurva baku yang digunakan adalah kurva baku yang memenuhi parameter linearitas, yaitu nilai r (koefisien korelasi) mendekati satu. Dari persamaan kurva baku yang diperoleh dapat digunakan untuk menghitung kadar kapsaisin dalam sampel.


Kurva persamaan regresi linier baku kapsaisin Area UnderCurve

300000 y = 63313,1955x - 20950,4178 r = 0,9994

250000 200000 150000 100000 50000 0 0

1

2

3

4

5

Konsentrasi kapsaisin (µg/µL)

Gambar 15. Kurva persamaan regresi linier baku kapsaisin Persamaan kurva baku yang didapat adalah y = 63313,1955 x – 20950,4178. Dari gambar 15, dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan AUC (Area Under Curve) seiring dengan penambahan konsentrasi baku sehingga didapatkan linearitas yang baik yaitu 0,9994. Persamaan kurva baku yang didapatkan akan digunakan untuk perhitungan kadar kapsaisin dalam sampel. Pada penelitian ini belum dilakukan validasi metode penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak buah cabai rawit putih yang meliputi, akurasi dan presisi. Penetapan akurasi perlu dilakukan untuk membuktikan bahwa metode yang dilakukan untuk penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak buah cabai rawit putih memberikan hasil yang akurat. Hasil akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery). Penetapan presisi bertujuan untuk membuktikan reprodusibilitas dari metode penetapan kadar kapsaisin dengan menentukan derajat penyebaran hasil analisis, yang dinyatakan dalam Coeffisient of Variant (CV).


Akurasi dan presisi dilakukan dengan menambahkan sejumlah baku kapsaisin ke dalam sampel minimal sebanyak tiga kali replikasi. Penambahan baku kapsaisin pada sampel digunakan untuk mengetahui bahwa di dalam sampel terdapat kapsaisin, yang dibuktikan dengan penambahan AUC pada Rf yang sesuai dengan Rf baku kapsaisin. Jumlah adisi baku dalam sampel hasil pengukuran didapat dengan memasukkan AUC adisi baku dalam sampel dalam persamaan regresi linier. Jumlah adisi baku dan sampel hasil pengukuran dikurangi dengan jumlah sampel tanpa penambahan baku, sehingga didapat jumlah baku adisi, kemudian dibandingkan dengan jumlah baku adisi secara teoritis untuk dapat menetapkan % recoverynya. Presisi dihitung dari nilai CV jumlah baku adisi hasil pengukuran. Kelemahan pada penelitian ini adalah belum dilakukan uji akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel, maka perlu dilakukan penelitian mengenai akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel untuk membuktikan bahwa metode penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak buah cabai rawit putih yang digunakan memenuhi syarat validasi, yaitu akurasi dan presisi. Analisis kuantitatif kapsaisin dilakukan sebanya tiga kali replikasi dengan menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan maksimal, yaitu 228 nm. Hasil dari pengukuran kadar kapsaisin tertera pada Tabel XI.


Replikasi I II III

Tabel XI. Data penetapan kadar kapsaisin Jumlah Jumah spoting Persamaan kurva kapsaisin AUC sampel baku terukur (µg) (µg) 1018 49874,71 1,1186 y = 63313,1955 x – 1042 51554,00 20950,4187 1,1452 r = 0,9994 1004 48966,14 1,1043 Rata-rata SD CV

Kadar kapsaisin (%) 0,1099 0,1099 0,1100 0,1099 0,0001 0,0525

Dari hasil analisis kuantitatif kapsaisin, diperoleh kadar kapsaisin 0,1099% (b/b) dengan jumlah kapsaisin sebesar 1,1186 µg tiap 1018 µg sampel untuk replikasi I; 0,1099% (b/b) (1,1452 µg) untuk replikasi II; dan 0,1100% (b/b) (1,1043 µg) untuk replikasi III. Rata-rata kadar kapsaisin dalam ekstrak buah cabai rawit putih adalah (0,1099±0,0001) % (b/b). Nilai CV yang diperoleh untuk penetapan kadar kapsaisin adalah 0,0525%. Nilai CV yang diperoleh memenuhi persyaratan presisi yang baik, yaitu CV<2,5% untuk konsentrasi 10%. Dapat disimpulkan bahwa penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak buah cabai rawit putih memiliki reprodusibilitas yang baik.

I. Analisis Statistik Aktivitas Antioksidan Untuk menentukkan kebermaknaan nilai IC50 baku kapsaisin dengan ekstrak etanol buah cabai rawit putih dilakukan analisis hasil uji secara statistik menggunakan software SPSS 16.0. Sebelum pengujian kebermaknaan, perlu dilakukan pengujian normalitas dari data % IC yang didapat untuk mengetahui data terdistribusi normal atau tidak kemudian menentukkan langkah uji statistik selanjutnya. Uji normalitas yang dilakukan menggunakan uji Shapiro-Wilk


menghasilkan nilai signifikansi 0,209 untuk baku kapsaisin dan 0,359 untuk ekstrak etanol cabai rawit putih. Nilai signifikansi yang diperoleh lebih besar dari nilai signifikansi yang ditentukan yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%) sehingga hipotesis null diterima. Hipotesis null yang digunakan adalah data terdistribusi normal, sehingga dapat disimpulkan bahwa % IC baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih mengikuti distribusi normal. Karena uji normalitas menunjukkan bahwa data terdistribusi normal, maka uji yang dilakukan selanjutnya, yaitu uji T tidak berpasangan yang merupakan uji parametrik. Tujuan dari uji T tidak berpasangan untuk melihat signifikansi IC50 baku kapsaisin dan ekstrak buah cabai rawit putih apakah sama atau berbeda. Hipotesis null (H null) yang digunakan adalah nilai IC50 baku kapsaisin tidak berbeda signifikan dengan IC50 ekstrak etanol buah cabai rawit putih. Hipotesis alternatif yang digunakan adalah nilai IC50 baku kapsaisin berbeda signifikan dengan IC50 ekstrak etanol buah cabai rawit putih. Hasil analisis statistik diperoleh nilai signifikansi baku kapsaisin dan ekstrak buah cabai rawit putih sebesar 0,000. Bila dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 maka H null ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 baku kapsaisin berbeda signifikan dengan IC50 ekstrak etanol buah cabai rawit putih di mana nilai IC50 baku kapsaisin lebih kecil dari IC50 ekstrak etanol buah cabai rawit putih.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1.

Nilai aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol buah cabai rawit putih menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50 sebesar (90,02 ± 10,16) µg/mL.

2.

Kadar kapsaisin pada ekstrak etanol buah cabai rawit putih dengan metode kromatografi lapis tipis – densitometri sebesar (0,1099±0,0001)% (b/b) dengan catatan metode yang digunakan belum tervalidasi.

B. Saran 1.

Perlu dilakukan penelitian aktivitas antioksidan dengan fraksinasi ekstrak buah cabai rawit putih sehingga diketahui aktivitas antioksidan masingmasing senyawa yang terkandung dalam buah cabai rawit putih.

2.

Perlu dilakukan penetapan aktivitas antioksidan buah cabai rawit putih dengan metode yang lain.

3.

Perlu dilakukan validasi metode analisis penetapan kadar kapsaisin secara kromatografi lapis tipis – densitometri, yang meliputi akurasi dan presisi.

4.

Perlu dilakukan uji korelasi lebih lanjut melalui uji statistik antara kadar kapsaisin dengan aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit putih.

66


DAFTAR PUSTAKA Alvarez-Parrilla, E., De La Rosa, L. A., Amarowicz, R., and Shahidi, F., 2011, Antioxidant Activity of Fresh and Processed Jalapeno and Serrano Peppers, J. Agric. Food Chem., 59, 163–173. Andayani, R., Maimunah, dan Lisawati, Y., 2008, Penentuan Aktivitas Antioksidan, Kadar Fenolat Total dan Likopen pada Buah Tomat (Solanum lycopersicum L), Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, Vol. 13, No. 1, 31-37. Ariyanto, 2006, Uji Aktivitas Antioksidan, Penentuan Kandungan Fenolik dan Flavonoid Total Fraksi Kloroform dan Fraksi Air Ekstrak Metanolik Pegagan (Centella asiatica L. Urban), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Astuti, K.W., 2012, Pengaruh Metode Ekstraksi Terhadap Perolehan Kembali Cannaninoid dari Daun Ganja, Indo. J. Legal Forensic Sci., 2(1), 21-23. Azeez, L., Adeoye, M.D., Majolagbe, T.A., Lawal, A.T., Badiru, R., 2012, Antioxidant Activity and Phytochemical Contents of Some Selected Nigerian Fruits and Vegetables, Am. J. Chem., 2(4), 209-213. Boonkird, S., Phisalaphong, C., Phisalaphong, M., 2008, Ultrasound-Assisted Extraction of Capsaicinoids from Capsicum frutescens on A Lab- and Pilot-Plant Scale, Ultrasonics Sonochemistry, Vol. 15, 1075-1079. Bosland, P. W., Bailey, A. L., Iglesias-Olivas, J., 1996, Capsicum Pepper Varieties and Classification, New Mexico State University, USA. Chaisawvong, N., and Sangsrichan, S., 2009, Antioxidant and Radical Scavenging Activity of Herbal Medicine Samples, Pure and Applied Chemistry International Conference, 42-44. Cornell University, 2011, Soxhlet Extractors in Series for Removing Extractives from Willow Biomass, http://willow.cals.cornell.edu.html, diakses tanggal 2 Januari 2013. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412. Escogido, M.L.R., Mondragon, E.G.G., Tzompantzi, E.V., 2011, Chemical and Pharmacological Aspects of Capsaicin, Molecules, 16, 1253-1270.


Fessenden, R.J., dan Fessenden, J.S., 1982, Kimia Organik, Jilid I, edisi ketiga, diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., Penerbit Erlangga, Jakarta, hal. 223-224. Fouad,

T., 2005, Antioxidant, Nature, and Chemistry, http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidant, diakses tanggal 9 Mei 2012.

Gonzáles, M.M., Lara, F.M., Carbajal, G.G., and Flota,F.V., 2007, Capsaisinoid Quantitation by In Situ Densitometry of Thin Layer Chromatography Plates, J. Liq. Chrom. & Rel. Technol, 30, 1697–1704. González, A.G., and Herrador, M.Á., 2007, A Practical Guide to Analytical Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends Anal. Chem., Vol. 26, No. 3, 227-238. González, A.T., Al-Tamirano, C.W., 1973, A New Method for The Determination of Capsaicin in Capsicum Fruits, J. Food Sci., Vol. 38, 342-344. Gritter, R.J., 1991, Pengantar Kromatografi, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, hal.110-158. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia : Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, edisi 2, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, hal. 47-109 Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, 117-135. Henderson, D.E., and Slickman, A.M., 1999, Quantitative HPLC Determination of the Antioxidant Activity of Capsaicin on the Formation of Lipid Hydroperoxides of Linoleic Acid: A Comparative Study against BHT and Melatonin, J. Agric. Food Chem., 47, 2563-2570. Hong, D.D., and Shah, M., 2000, Drug Stability Principles and Practice, Edisi III, Maecel Dekker Inc., New York, pp.361- 367. Howard, R.L., Talcott, S.T., Brenes, C.H., and Villalon, B., 2000, Changes in Phytochemical and Antioxidant Activity of Selected Pepper Cultivars (Capsicum Species) As Influenced by Maturity, J. Agric. Food Chem., 48, 1713-1720. Khochar, S.P., and Rossell, 1990, Detection Estimation and Evaluation of Antioxidant in Food System, Elvisier Applied Science, London, pp.12-44.


Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, J. Sci. Technol., 26(2), 211–219. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, hal. 6-9. Noviana, Supardjan, dan Nurrochmad, A., 2007, Uji Aktivitas Penangkapan Radikal 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil (DPPH) oleh Heksagamavunon-1 (HGV-1), Pharmacon, Vol. 8, No. 1, 23-27. Ou, B., Huang, D.J., Woodill, M.H., Flanagan, J.A., and Deemer, E.K., 2002, Analysis of Antioxidant Activities of Common Vegetables Employing Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) and Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) Assays : A Comparative Study, J. Agric. Food Chem., 50, 3122-3128. Parke, D.V., 1999, Nutritional Antioxidant and Disease Prevention : Mechanism of Action, Division of Molecular Toxicology, School of Biological Science, University of Surrey, Guildford, UK. Plantamor, 2008, Cabai Rawit, http://www.plantamor.com/index.php?plant=273, diakses tanggal 11 Mei 2012. Prakash, A., Rigelhof, F., dan Miller, E., 2010, Antioxidant Activity, Medallion Laboratories, Analithycal Progress, Vol 19, No.2, 1-4. Prasetya, B.T., 2010, Perbandingan Pengaruh Penambahan Logam Zn dan Mg Terhadap Daya Antioksidan Seduhan Kelopak Bunga Rosella (Hibiscus sabdariffa L.) Menggunakan Metode DPPH, Skripsi, 26-27, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Pratt, D.E., 1992, Natural Antioxidant from Plants Material, Americans society, Washington DC, pp.50-97. Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu, Yogyakarta, hal. 53-54. Sapakal V.D., Shikalgar T.S., Ghadge R.V., Adnaik R.S., Naikwade N.S., and Magdum C.S., 2008, In Vivo Screening of Antioxidant Profile: A Review, J. Herb. Med. Toxicol. 2, 2, 1-8. Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Penerbit Liberti, Yogyakarta, hal 1-43.


Sentra Informasi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2005, Tanaman Obat Indonesia, http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=213, diakses tanggal 14 April 2012. Simex, 2008, Radikal Bebas, http://www.simexpharmaceutical.com/news/radikalbebas-6.html, diakses tanggal 14 April 2012. Skoog, A.D., West, M., Donald, J.F., 1994, Analytical Chemistiy, 6th ed, Saunde College Publishing, United Stated of America, pp.161-195. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd ed., Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 208-209, 252. Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., dan Soediro, I., ITB Press, Bandung, hal. 3-13. Turner, N.W., Subrahmanyam, S., and Piletsky, S.A., 2009, Analytical Methods for Determination of Mycotoxins: A Review, Analytica Chimica Acta, 632, 168–180. United States Pharmacopeia Convention, 1995, The United States Pharmacopoeia 23rd revision, United States Pharmacopoeia Convention Inc., Rockville, MD, p. 1982. Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, edisi ke-5, diterjemahkan oleh Noerono, S., Gajah Mada University Press, Yogyakarta, hal. 561586. Witt, S., Lalk, M., Hager, C., dan Voigt, B., 2010, DPPH-Test: Determination of Scavenger Properties, http://www.balticanalytics.de/index.php?id=7&L=1, diakses tanggal 2 Januari 2013.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar buah cabai rawit putih dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta


Lampiran 2. Sertifikat analisis kapsaisin


Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstrak etanol buah cabai rawit putih Penimbangan simplisia buah cabai rawit putih yang digunakan Bobot beaker glass kosong

= 70,8857 g

Bobot beaker glass + simplisia

= 100,8849 g

Bobot beaker glass + sisa

= 70,8870 g

Bobot simplisia

= 29,9979 g

Penimbangan ekstrak etanol buah cabai rawit putih Bobot cawan kosong

= 55,4862 g

Bobot cawan + ekstrak

= 59,5805 g

Bobot ekstrak

= 4,0943 g

Rendemen ekstrak etanol = =

obot ekstrak yang didapat obot simplisia yang digunakan ,

g ,

g

= 13,65 %


Lampiran 4. Data penimbangan bahan untuk uji aktivitas antioksidan 1.

Penimbangan DPPH

Bobot kertas kosong Bobot kertas + DPPH Bobot kertas + sisa Bobot DPPH

2.

Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

0,19737

0,20027

0,20865

0,20141

0,20432

0,21025

0,19747

0,20029

0,20867

0,00394

0,00394

0,00158

Replikasi I (g)

Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

0,20167

0,20189

0,21345

0,20793

0,20822

0,21975

0,20168

0,20196

0,21348

0,00625

0,00626

0,00627

Penimbangan baku kapsaisin

Bobot kertas kosong Bobot kertas + kapsaisin Bobot kertas + sisa Bobot kapsaisin

3.

Replikasi I (g)

Penimbangan ekstrak etanol buah cabai rawit putih

Bobot gelas arloji kosong Bobot gelas arloji + ekstrak Bobot gelas arloji + sisa Bobot ekstrak

Replikasi I (mg)

Replikasi II (mg)

Replikasi III (mg)

14.234,1

14.414,8

14.414,8

14.269,1

14.462,9

14.507,9

14.243,7

14.437,9

14.482,9

25,4

25,0

25,0


Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi bahan untuk uji aktivitas antioksidan Konsentrasi DPPH 1.

Replikasi I BM = 394,33 n=

massa n

M=V=

2.

,

=

mg ,

,

= 0,0100 mmol

mmol ,

5L

= 0,4000 mM

Replikasi II BM = 394,33 n=

massa n

M=V=

3.

mg

=

,

,

= 0,0100 mmol

mmol ,

5L

= 0,4000 mM

Replikasi III BM = 394,33 n=

massa n

M=V=

=

,5 mg ,

,

= 0,0040 mmol

mmol ,

L

= 0,4000 mM

Konsentrasi baku kapsaisin 1.

Konsentrasi larutan induk Replikasi I , 5 mg 5 mL

= 0,2500 mg/mL = 250 µg/mL

Replikasi II ,

mg 5 mL

= 0,2504 mg/mL = 250,4 µg/mL

Replikasi III ,

mg 5 mL

= 0,2508 mg/mL = 250,8 µg/mL


2.

Konsentrasi larutan intermediet Replikasi I a. Konsentrasi 25 µg/mL

d. Konsentrasi 100 µg/mL

C1 . V1 = C2. V2

C1 . V1 = C2. V2

250 µg/mL . 1 mL = C2 . 10 mL

250 µg/mL . 4 mL = C2 . 10 mL

C2 = 25 µg/mL

C2 = 100 µg/mL

b. Konsentrasi 50 µg/mL

e. Konsentrasi 125 µg/mL

C1 . V1 = C2. V2

C1 . V1 = C2. V2

250 µg/mL . 2 mL = C2 . 10 mL

250 µg/mL . 5 mL = C2 . 10 mL

C2 = 50 µg/mL

C2 = 125 µg/mL

c. Konsentrasi 75 µg/mL C1 . V1 = C2. V2 250 µg/mL . 3 mL = C2 . 10 mL C2 = 75 µg/mL

Replikasi II Konsentrasi awal

250,4 µg/mL

Volume pengambilan 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

10 mL

25,04 µg/mL 50,08 µg/mL 75,12 µg/mL 100,16 µg/mL 125,20 µg/mL


Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

10 mL


Replikasi III Konsentrasi awal

250,8 µg/mL


3.

Konsentrasi larutan uji Replikasi I Konsentrasi awal 25 µg/mL 50 µg/mL 75 µg/mL 100 µg/mL 125 µg/mL

Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

1 mL

5 mL

5 µg/mL 10 µg/mL 15 µg/mL 20 µg/mL 25 µg/mL

Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

1 mL

5 mL


Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

5 mL


Replikasi II Konsentrasi awal 25,04 µg/mL 50,08 µg/mL 75,12 µg/mL 100,16 µg/mL 125,2 µg/mL Replikasi III Konsentrasi awal 25,08 µg/mL 50,16 µg/mL 75,24 µg/mL 100,32 µg/mL 125,4 µg/mL

1 mL


Konsentrasi ekstrak etanol buah cabai rawit putih 1.

Konsentrasi larutan induk Replikasi I 5, mg 5 mL

= 1,016 mg/mL = 1.016 µg/mL

Replikasi II 5, mg 5 mL

= 1,0 mg/mL = 1.000 µg/mL

Replikasi III 5, mg 5 mL

2.

= 1,0 mg/mL = 1.000 µg/mL

Konsentrasi larutan intermediet Replikasi I Konsentrasi awal

1.016 µg/mL


Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

10 mL

101,6 µg/mL 203,2 µg/mL 304,8 µg/mL 406,4 µg/mL 508 µg/mL


Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

10 mL



Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

10 mL


Replikasi II Konsentrasi awal

1.000 µg/mL

Replikasi III Konsentrasi awal

1.000 µg/mL


3.

Konsentrasi larutan uji Replikasi I Konsentrasi awal 101,6 µg/mL 203,2 µg/mL 304,8 µg/mL 406,4 µg/mL 508 µg/mL

Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

1 mL

5 mL


Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

1 mL

5 mL


Volume pengambilan

Volume pengenceran

Konsentrasi akhir

5 mL


Replikasi II Konsentrasi awal 100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL Replikasi III Konsentrasi awal 100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL

1 mL


Lampiran 6. Scanning larutan pengoreksi untuk uji aktivitas antioksidan 1.

Scanning pelarut etanol

2.

Scanning baku kapsaisin


3.

Scanning ekstrak etanol buah cabai rawit putih


Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan 1.

Penetuan λ maksimum a. Spektra DPPH 0,020 mM

b. Spektra DPPH 0,040 mM


c. Spektra DPPH 0,080 mM


2.

Penentuan operating time Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi konsentrasi 25 µg/mL Replikasi I Replikasi II Replikasi III 0,496 0,350 0,630 0,477 0,316 0,610 0,463 0,294 0,598 0,455 0,276 0,586 0,446 0,259 0,577 0,438 0,251 0,570 0,433 0,242 0,565 0,427 0,234 0,559 0,422 0,226 0,555 0,417 0,217 0,551 0,413 0,214 0,550 0,411 0,208 0,546

Rata-rata Selisih Absorbansi absorbansi 0,492 0,468 0,024 0,452 0,016 0,439 0,013 0,427 0,012 0,420 0,008 0,413 0,006 0,407 0,007 0,401 0,006 0,395 0,006 0,392 0,003 0,388 0,004

Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60


Rata-rata absorbansi 0,484 0,454 0,434 0,417 0,404 0,391 0,381 0,371 0,362 0,354 0,346 0,339

Selisih absorbansi 0,030 0,020 0,018 0,013 0,013 0,010 0,010 0,009 0,008 0,008 0,007


Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60


Rata-rata absorbansi 0,391 0,348 0,314 0,296 0,280 0,269 0,258 0,250 0,241 0,234 0,227 0,222

Selisih absorbansi 0,043 0,034 0,018 0,016 0,011 0,011 0,009 0,008 0,007 0,007 0,005

Penentuan Operating Time Baku Kapsaisin Selisih absorbansi

0,05 0,04 0,03 25 µg/mL 0,02

75 µg/mL

0,01

125 µg/mL

0 0

5

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Waktu (menit)

Operating time yang digunakan adalah 30 menit.


Lampiran 8. Data uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH % IC =

bsorbansilarutan kontrol – bsorbansilarutan baku uji bsorbansilarutan kontrol

Baku kapsaisin Replikasi

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi kontrol

I

5 10 15 20 25

0,878 0,878 0,878 0,878 0,878

1.

Konsentrasi 5 µg/mL % IC =

2.

= 48,4055%


5.

= 40,0911%


4.

= 31,8907%


3.

Absorbansi larutan baku 0,598 0,526 0,453 0,385 0,310

= 56,1503%


= 64,6925%

% IC 31,8907 40,0911 48,4055 56,1503 64,6925



Absorbansi Absorbansi kontrol larutan baku 0,878 0,600 0,878 0,535 0,878 0,451 0,878 0,385 0,878 0,319 0,878 0,594 0,852 0,512 0,852 0,427 0,852 0,362 0,852 0,288

Konsentrasi (µg/mL)

Replikasi

5,008 10,016 15,024 20,032 25,04 5,016 10,032 15,048 20,064 25,080

II

III

% IC 31,6629 39,0661 48,6333 56,1503 63,6674 32,3462 39,9061 49,8826 57,5117 66,1972

Persamaan regresi linier y = 1,6193 x + 23,5080 r = 0,9991 y = 1,7007 x + 23,5765 r = 0,9992

Ekstrak etanol buah cabai rawit putih Replikasi

I

1.

Konsentrasi (µg/mL) 20,32 40,64 60,96 81,28 101,6

Absorbansi kontrol 0,783 0,783 0,783 0,783 0,783


2.

= 37,4202%


5.

= 25,9259%


4.

= 14,8148%


3.

Absorbansi larutan uji 0,667 0,580 0,490 0,401 0,313

= 48,7867%


= 60,0255%

% IC 14,8148 25,9259 37,4202 48,7867 60,0255



Replikasi

II

III

Konsentrasi Absorbansi Absorbansi (µg/mL) kontrol larutan uji 20 0,820 0,703 40 0,820 0,628 60 0,820 0,559 80 0,820 0,487 100 0,820 0,417 20 0,763 0,659 40 0,763 0,582 60 0,763 0,497 80 0,763 0,400 100 0,763 0,312

% IC 14,2683 23,4146 31,8293 40,6098 49,1463 13,6304 23,7221 34,8624 47,5754 59,1088

Persamaan regresi linier y = 0,4348 x + 5,7683 r = 0,9999 y = 0,5741 x + 1,3368 r = 0,9992


Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 baku kapsaisin dan ekstrak etanol buah cabai rawit putih Baku kapsaisin 1.

Replikasi I Persamaan regresi linier : y = aktivitas antioksidan (%) x = kadar baku kapsaisin (µg/mL) IC50 adalah nilai kadar baku kapsaisin saat aktivitas antioksidan sebesar 50% 50 = 1,6333 x + 23,7472 x=

2.

= 16,0735 µg/mL

Replikasi II Persamaan regresi linier : 50 = 1,6193 x + 23,5080 x=

3.

= 16,3602 µg/mL

Replikasi III Persamaan regresi linier : 50 = 1,7007 x + 23,5765 x=

= 15,5368 µg/mL


Ekstrak etanol buah cabai rawit putih 1.

Replikasi I Persamaan regresi linier : y = aktivitas antioksidan (%) x = kadar ekstrak etanol buah cabai rawit putih (µg/mL) IC50 adalah nilai kadar ekstrak etanol saat aktivitas antioksidan sebesar 50% 50 = 0,5575 x + 3,4100 x=

2.

= 83,5695 µg/mL

Replikasi II Persamaan regresi linier : 50 = 0,4348 x + 5,7683 x=

3.

= 101,7288 µg/mL

Replikasi III Persamaan regresi linier : 50 = 0,5741 x + 1,3368 x=

= 84,7643 µg/mL


Lampiran 10. Sistem KLT densitometri yang digunakan


Lampiran 11. Data perhitungan konsentrasi bahan untuk penetapan kadar kapsaisin Konsentrasi baku kapsaisin Konsentrasi larutan induk mg mL

= 0,520 mg/mL = 0,520 µg/µL

Jumlah analit seri baku kapsaisin 1.

Kapsaisin 0, 125 µg C = 0,520 µg/µL . 1,0 µL = 0,520 µg

2.

Kapsaisin 0, 250 µg C = 0,520 µg/µL . 2,0 µL = 1,040 µg

3.

Kapsaisin 0,500 µg C = 0,520 µg/µL . 4,0 µL = 2,080 µg

4.

Kapsaisin 1,000 µg C = 0,520 µg/µL . 8,0 µL = 4,160 µg

Konsentrasi ekstrak etanol buah cabai rawit putih 1.

Replikasi I Konsentrasi larutan uji induk mg 5

L

= 0,1018 mg/µL = 101,8 µg/µL

Jumlah analit dalam 10 µL spoting sampel C = 101,8 µg/µL . 10,0 µL = 1.018 µg

2.

Replikasi II Konsentrasi larutan uji induk mg 5

L

= 0,1042 mg/µL = 104,2 µg/µL



3.

Replikasi III Konsentrasi larutan uji induk mg 5

L

= 0,1004 mg/µL = 100,4 µg/µL



Lampiran 12. Kromatogram baku kapsaisin


Lampiran 13. Data persamaan kurva baku kapsaisin Baku kapsaisin (µg) AUC 0,520 8948,54 1,040 45095,01 2,080 115733,3 4,160 240264,4 A = - 20950,4187 B = 63313,1955 r = 0,9994

Kurva persamaan regresi linier baku kapsaisin Area UnderCurve

300000 y = 63313,1955x - 20950,4178 r = 0,9994

250000 200000 150000 100000 50000 0 0

1

2

3

Konsentrasi kapsaisin (µg/µL)

4

5


Lampiran 14. Kromatogram kapsaisin dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih


Lampiran 15. Data dan perhitungan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol buah cabai rawit putih

Replikasi I II III

Jumlah spoting sampel (µg) 1018 1042 1004

AUC 49874,71 51554,00 48966,14

Persamaan kurva baku y = 63313,1955 x – 20950,4187 r = 0,9994 Rata-rata SD CV

Jumah kapsaisin terukur (µg) 1,1186 1,1452 1,1043

Replikasi I Persamaan regresi linier : y = AUC x = jumlah kapsaisin ekstrak etanol buah cabai rawit putih (µg) y = 63313,1955 x – 20950,4187 49874,71 = 63313,1955 x – 20950,4187 x = 1,1186 µg

Kadar kapsaisin dalam ekstrak etanol cabai rawit putih μg .

μg

= 0,1099%

Kadar kapsaisin (%) 0,1099 0,1099 0,1100 0,1099 0,0001 0,0525


Lampiran 16. Uji Statistik dengan SPSS 16.0 1.

Uji normalitas Tests of Normality a

Kolmogorov-Smirnov Statistic Kapsaisin

df

.154

Ekstrak_buah_cabai_rawit_putih

Sig. 15

.122

Shapiro-Wilk

15

Statistic

df

Sig.

.200

*

.922

15

.209

.200

*

.938

15

.359

a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance.

2.

Uji T tidak berpasangan Independent Samples Test Levene's Test for Equality of

t-test for Equality of Means

Variances 95% Confidence Interval of F

Sig.

t

df

Sig. (2-

Mean

Std. Error

tailed)

Difference

Difference

the Difference Lower

Upper

Equal variances 14.291

.019 -12.614

4

.000 -74.0307000 5.8690820 -90.3258839 -57.7355161

-12.614 2.007

.006 -74.0307000 5.8690820 -99.2018119 -48.8595881

assumed IC50

Equal variances not assumed


BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji kti itas ntioksidan Ekstrak Etanolik Buah Cabai Rawit Putih (Capsicum Frutescens L.) dengan Metode DPPH (1,1-Difenil-2Pikrilhidrazil) dan Penetapan Kadar Kapsaisin secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) – ensitometri” memiliki nama lengkap Vanny Christy Silviani. Penulis dilahirkan di kota Yogyakarta pada tanggal 27 Agustus 1991 sebagai putri pertama dari dua bersaudara pasangan Himawan dan Lianti Safitri. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Mater Dei Marsudirini Yogyakarta (1995-1997), SD Marsudirini Yogyakarta (1997-2003), SMP Stella Duce 1 Yogyakarta (2003-2006), SMA Stella Duce 1 Yogyakarta (2007-2009). Penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis aktif dalam berbagai kegiatan seperti sie publikasi, dekorasi, dan dokumentasi Donor Darah JMKI (2009), graphic designer redaksi Buletin Pharmaholic (2009), bendahara Seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-paru (2011), staff Data Entry for Development of Disaster Based Village Information System (2012). Penulis juga pernah menjadi asisten dosen mata kuliah praktikum Biokimia (2011), asisten dosen mata kuliah praktikum Spektroskopi (2011), asisten dosen mata kuliah praktikum Farmakognosi-Fitokimia I (2011), asisten dosen mata kuliah praktikum Kimia Analisis (2011), asisten dosen mata kuliah praktikum Kimia Organik (2012), asisten dosen mata kuliah praktikum Formulasi dan Teknologi Sediaan Solid (2012), dan asisten dosen mata kuliah praktikum Bioanalisis (2012).

SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi. Oleh : Vanny Christy Silviani

Recommend Documents