SITOTOKSISITAS FRAKSI AKTIF BIJI MAHONI (Swietenia mahagoni) PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D RIDA FARIDA CAHYANI SETIANI

SITOTOKSISITAS FRAKSI AKTIF BIJI MAHONI (Swietenia mahagoni) PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D

RIDA FARIDA CAHYANI SETIANI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

ABSTRAK RIDA FARIDA CAHYANI SETIANI. Sitotoksisitas Fraksi Aktif Biji Mahoni (Swietenia mahagoni) pada Sel Kanker Payudara T47D. Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan PUSPITA EKA WUYUNG. Fraksi etil asetat biji mahoni (Swietenia mahagoni) berdaun kecil telah dilaporkan memiliki toksisitas terhadap larva udang Artemia salina dan berpotensi sebagai obat. Penelitian ini bertujuan menguji sitotoksisitas fraksi aktif biji mahoni terhadap sel kanker payudara T47D. Fraksi etil asetat difraksinasi menggunakan kromatografi kolom klasik dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform-etil asetat secara bergradien sehingga diperoleh 8 fraksi. Fraksi 2 dengan nilai konsentrasi letal 50 sebesar 74.30 ppm mampu menghambat pertumbuhan sel T47D dengan nilai konsentrasi inhibisi 50 sebesar 49.12 ppm. Berdasarkan hasil uji fitokimia dapat diketahui bahwa fraksi 2 mengandung senyawa alkaloid dan steroid/triterpenoid. ABSTRACT RIDA FARIDA CAHYANI SETIANI. Cytotoxicity of Active Fraction from Swietenia mahagoni Seed at Breast Cancer T47D. Supervised by DUDI TOHIR and PUSPITA EKA WUYUNG. Ethyl asetate fraction was reported to be toxic to Artemia salina and has a potency as medicine. The purpose of this study was to examine cytotoxicity of active fraction from Swietenia mahagoni seed toward breast cancer T47D. Ethyl acetate fraction was fractionated used clasic cromatography coloum with silica gel as the stationary phase and chloroform-ethyl acetate as the mobile phase gradiently and yielded 8 fraction. Fraction 2 with 50 lethal concentration 74.30 ppm could inhibit the growth of T47D cell with 50 inhibition concentration of 49.12 ppm. Based on phytocemical assay, fraction 2 consisted of alkaloid and steroid/triterpenoid.

SITOTOKSISITAS FRAKSI AKTIF BIJI MAHONI (Swietenia mahagoni) PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D

RIDA FARIDA CAHYANI SETIANI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2009

Judul Nama NIM

: Sitotoksisitas Fraksi Aktif Biji Mahoni (Swietenia mahagoni) pada Sel Kanker Payudara T47D : Rida Farida Cahyani Setiani : G44202028

Disetujui Pembimbing I

Pembimbing II

Drs. Dudi Tohir, MS. NIP 19571104 198903 1 001

Dra. Puspita Eka Wuyung, MS. NIP 19650420 199103 2 004

Diketahui Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Dr. Drh. Hasim, DEA NIP 19610328 198601 1 002

Tanggal Lulus:

PRAKATA Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas Rahmat dan Rahim-Nya sehingga skripsi ini dapat diselesaikan. Shalawat dan salam semoga tercurah kepada Nabi Muhammad SAW. Skripsi ini merupakan laporan hasil penelitian dengan judul Efek Sitotoksik Fraksi Aktif Biji Mahoni (Swietenia mahagoni) pada Sel Kanker Payudara T47D. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Kultur sel, Pusat Teknologi Farmasi dan Medika, Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB), Deputi Bidang Teknologi Agroindustri dan Bioteknologi, Badan Penelitian dan Pengembangan Teknologi (BPPT) Serpong, Tangerang. Penelitian ini dilaksanakan selama bulan Desember 2008 hingga Mei 2009 di bawah bimbingan Drs. Dudi Tohir, MS dan Dra. Puspita Eka Wuyung, MS. Terimakasih penulis ucapkan kepada Bapak Drs. Dudi Tohir, MS. selaku pembimbing pertama dan Ibu Dra. Puspita Eka Wuyung, MS. selaku pembimbing kedua atas pemberian perhatian, arahan, dan dorongan semangat selama penelitian dan penulisan skripsi ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Bapak M. Solkhan, S.Hut. selaku kepala UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi Unit Jasa & Informasi yang telah membantu penulis dalam penyediaan sampel penelitian; Bapak Sabur dan Ibu Yenni selaku laboran Laboratorium Kimia Organik yang telah membantu penulis selama penelitian; Bapak Drs. Agung Eru W., M.Si., Apt. selaku Ketua Laboratorium Teknologi Farmasi dan Medika yang telah mengizinkan penulis untuk melakukan pengujian sampel dan Drs. Tarwadi, M.Sc selaku Koordinator Tim Bioassay yang telah memeriksa hasil pengujian serta Rahma Micho W, S.Si, Fery Azis W, S.Si, dan Apriyanta, S.Si selaku staf Laboratorium Kultur Sel yang telah membantu penulis dalam mengerjakan pengujian; rekan-rekan di Laboratorium Kimia Organik atas kerjasama dan dukungannya selama penelitian; staf Departemen Kimia yang membantu kelancaran penelitian dan penyusunan skripsi; rekan-rekan mahasiswa Kimia IPB khususnya rekan-rekan Kimia angkatan 39, rekan-rekan Baituz Zuhruf dan rekan-rekan Tidar serta yang teristimewa bapak, ibu dan kakak atas cinta kasih, dorongan, dan doanya. Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan. Bogor, Juni 2009 Rida Farida Cahyani Setiani

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 27 Desember 1983 sebagai anak kedua dari dua bersaudara, anak dari pasangan M Zubaidi dan Ruqayah. Penulis lulus dari Sekolah Menengah Umum Negeri 1 Boyolali pada tahun 2002. masuk IPB melalui jalur USMI pada tahun 2002 pada Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Pendidikan Agama Islam pada tahun 2004 dan 2005, Teknik Laboratorium Kimia Organik pada tahun 2005, dan Kimia Bahan Alam pada tahun 2006. Selama bulan Juli hingga Agustus 2006 penulis mengikuti praktik lapangan di Laboratorium Penelitian Mikrobiologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Bogor.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR viii DAFTAR LAMPIRAN viii PENDAHULUAN 1 TINJAUAN PUSTAKA Swietenia mahagoni 1 Kanker Payudara 1 Uji Antikanker 2 BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan 2 Ekstraksi dan Fraksinasi 2 Uji Toksisitas Fraksi Terhadap Larva Udang 3 Uji Sitotoksik Fraksi Aktif Terhadap sel T47D 3 Uji Fitokimia 3 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak dan Fraksi 4 Toksisitas Fraksi Terhadap Larva Udang 4 Sitotoksisitas Fraksi Teraktif Terhadap sel T47D 4 Uji Fitokimia 5

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan 6 Saran 6 DAFTAR PUSTAKA 6 LAMPIRAN 7

DAFTAR TABEL 1 2

Hasil uji BSLT fraksi-fraksi biji S. Mahagoni. Hasil uji fitokimia fraksi etil asetat dan fraksi 2

Halaman 4 5

DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4

Buah dan biji S. Mahagoni Reaksi pembentukan formazan Kurva pengaruh konsentrasi fraksi 2 terhadap persen proliferasi Kurva pengaruh konsentrasi cisplatin terhadap persen proliferasi

Halaman 1 5 5 5

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7

Identifikasi S. mahagoni. Diagram alur penilitian. Kromatogram pencarian fraksi hasil kolom kromatografi Data hasil uji BSLT Data hasil uji sitotoksik fraksi 2 terhadap sel T47D Data hasil uji sitotoksik kontrol positif cisplatin terhadap sel T47D Foto hasil uji steroid/triterpenoid

Halaman 9 10 11 12 13 14 15

8

Foto hasil uji alkaloid

15

1

PENDAHULUAN Kanker payudara merupakan kanker yang paling banyak ditemukan pada wanita setelah kanker leher rahim. Pada Tahun 2005 The American Cancer Society menyebutkan bahwa 3% kasus kematian wanita di Amerika Serikat disebabkan oleh kanker payudara. Sementara hasil perhitungan ekstrapolasi statistik didasarkan pada data penderita kanker payudara di Amerika, Kanada, dan Australia menunjukkan angka prevalensi penderita kanker payudara di Indonesia sebesar 876665 (Kusminarto 2006). Tjidarbumi (2002) menyebutkan bahwa penderita kanker payudara di Indonesia sebanyak 12.10%, terbanyak kedua setelah kanker leher rahim (19.18%). Upaya pengobatan kanker secara konvensional baik berupa operasi, radioterapi, maupun kemoterapi membutuhkan biaya yang sangat besar dan menimbulkan efek samping bagi kesehatan. Oleh karena itu saat ini banyak dilakukan penelitian untuk mencari obat antikanker dari bahan alam yang diharapkan lebih efektif dan aman. Penelitian terdahulu telah berhasil dilakukan isolasi senyawa bioaktif dari biji mahoni (Swietenia mahagoni) yang diduga berpotensi sebagai senyawa obat dengan nilai konsentrasi letal 50 (LC50) sebesar 17,7 ppm (Sianturi 2001). Putri (2004) melaporkan bahwa fraksi aktif biji mahoni dapat menghambat pertumbuhan Sacharomyces cerevisiae sebagai uji awal terhadap senyawa antikanker. Beranjak dari penelitian sebelumnya maka penelitian ini bertujuan untuk menentukan sitotoksisitas dari fraksi biji mahoni pada sel kanker payudara T47D. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi bahwa senyawa bioaktif yang terkandung dalam biji mahoni berpotensi sebagai antikanker.

TINJAUAN PUSTAKA Swietenia mahagoni Swietenia mahagoni atau mahoni berdaun kecil merupakan tanaman tropis yang termasuk famili Meliaceae. Di Indonesia terdapat tiga spesies pohon mahoni, yaitu S. macrophylla (mahoni berdaun lebar), S.

mahagoni (mahoni berdaun kecil), dan Swietenia sp. Berdasarkan klasifikasi tumbuhan mahoni berdaun kecil termasuk dalam divisi Spermatophyta, subdivisi Angiospermae, kelas Dikotiledonae, ordo Rutales, famili Meliaceae, subfamili Swietenidae, genus Swietenia, dan spesies: Swietenia mahagoni (Heyne 1950). Biji mahoni (Gambar 1) biasanya dimanfaatkan untuk mengobati berbagai penyakit, di antaranya demam, susah tidur, tekanan darah tinggi, eksim, kencing manis, dan disentri, serta dapat menambah nafsu makan (Syamsuhidayat & Hutapea 1991). Selain itu biji mahoni juga berkhasiat sebagai obat malaria, anemia, dan diare.

Gambar 1 Buah dan biji S. Mahagoni Penelitian pada batang mahoni yang diekstraksi dengan etanol terbukti sebagai antimalaria Plasmodium falciparum, klon D6 dan W2 yang diuji secara in vitro (McKinon et al. 1997). Ekstrak heksan kulit batang mahoni mengandung triterpenoid dan menunjukkan nilai LC50 dengan uji BSLT (brine shrimp lethality test) sebesar 3.73 µg/ml, sehingga spesies ini sangat berpotensi sebagai obat (Sukardiman 2000). Penelitian pada biji mahoni terbukti mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escheria coli dan bakteri subtilis (Hartati 2002). Shahidur et al. (2009) melaporkan bahwa ekstrak metanol biji Swietenia mahagoni mengandung dua jenis senyawa yang disebut limonoid, yaitu swietenolid dan 2­hidroksi­3­O­tigloilswietenolide dan memi­liki aktifitas sebagai antibakteri. Kandungan senyawa kimia biji mahoni di antaranya flavonoid, saponin, alkaloid, steroid/triterpenoid, dan tanin (Syamsuhidayat dan Hutapea 1991; Sianturi 2001; Haryanti 2002; Putri 2004). Kanker Payudara Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang paling sering ditemui di dunia terutama pada wanita. Diperkirakan

2

pada tahun 2009 di Amerika Serikat terdapat 192370 kasus baru kanker payudara pada wanita dan 1910 kasus baru pada pria (National Cancer Institut 2009). Kanker payudara adalah kanker yang terjadi pada jaringan payudara, biasanya pada duktus (saluran yang mengalirkan susu ke puting) dan lobulus (kelenjar yang menghasilkan air susu) (National Cancer Institut 2009). Kanker payudara ditandai dengan benjolan, perubahan ukuran, kulit yang kemerahan, keberadaan aleora (lingkaran hitam di sekitar puting susu), ruam, pengencangan atau pelonggaran payudara, dan rasa sakit di daerah payudara (Tjidarbumi 1986). Beberapa faktor yang berperan memicu timbulnya kanker di antaranya ialah gen p53, gen BRCA1 dan gen BRCA2 (Hahn & Payne 2003; Jerry 2007), hormon estrogen yang abnormal, onkogen (gen pemicu pembelahan sel secara berlebih), hilangnya gen supresor untuk tumor, dan keberadaan bahan karsinogen (Warren et al. 2002; Lewis 2003). Selain itu riwayat keluarga penderita kanker payudara, kehamilan pada usia lebih dari 35 tahun, menstruasi dini atau menopause yang terlambat, konsumsi lemak jenuh, dan penumpukan lemak berlebih (di paha dan pinggul) juga dapat meningkatkan risiko terkena kanker payudara (Hahn & Payne 2003). Pengobatan kanker dapat dibagi menjadi tiga, yaitu operasi, radiasi, dan terapi pendamping. Terapi pendamping dapat dibagi menjadi terapi hormonal, kemoterapi, dan imunoterapi (Hahn & Payne 2003). Uji Antikanker Antikanker adalah agen yang memiliki sifat sitostatik (dapat menghambat pertumbuhan sel kanker) dan atau sitosidal (dapat mematikan sel kanker) (Boik 1996). Beberapa metabolit sekunder memiliki aktivitas sebagai agen antikanker. Oleh karena itu, akhir­akhir ini banyak dikembangkan penelitian untuk mencari senyawa metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas sebagai senyawa antikanker yang kemudian akan dikembangkan dalam kemoterapi untuk pengobatan kanker. Untuk mengetahui suatu senyawa merupakan agen antikanker dari tanaman obat, National Cancer Institute (NCI) Amerika Serikat, menentukan prosedur

screening, yaitu preparasi, prescreen, screen, monitoring, secondary testing, dan clinical trials. Preparasi yang dilakukan adalah berupa pengumpulan tanaman dan ekstraksi. Prescreen test dilakukan dengan uji in vitro atau in vivo secara sederhana untuk mengidentifikasi ekstrak yang berpotensi antikanker. Ekstrak yang aktif kemudian di­screening melawan sel yang lebih banyak secara in vivo. Ekstrak yang berhasil di­screening akan dilakukan tahap monitoring, yaitu difraksinasi untuk memperoleh senyawa aktif yang murni. Senyawa yang murni ini kemudian diuji secara in vivo. Senyawa yang berhasil menunjukkan aktivitas antikaker ini dilakukan secondary testing untuk menentukan apakah senyawa tersebut dapat digunakan untuk clinical trials. Menurut Hidayat (2002), pencarian bahan bioaktif yang mempunyai aktivitas antikanker dapat dilakukan dengan beberapa metode berikut: (i) uji kematian larva udang laut atau BSLT, (ii) uji hambat tumor pada lempeng kentang (potato disc crown gall tumor inhibition assay), (iii) uji proliferasi kuncup lemna (lemna frond proliferation assay), (iv) Uji sitotoksik in vitro dan in vivo.

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah biji mahoni yang diambil dari Kebun Raya Purwodadi, Jawa Timur dan telah diidentifikasi oleh UPT Balai Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Purwodadi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) (Lampiran 1), lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) F 254, silika G 60, larva udang Artemia salina, tween 80, air laut, media RPMI (rosewell park memorial institute) 1640, penisilin­sterptomisin (Gibco), FBS (fetal bovin serum), Cisplatin (Kalbe farma), MTT (3­[4,5­dimetiltiazol­2­il]­2,5­difeniltetrazoli um bromida), dimetil sulfoksida (DMSO), dan sodium dodesil sulfat (SDS). Alat­alat yang digunakan adalah alat­alat kaca, tabung cryo (Corning), sumuran (96 well plate), laminar (Airstream) ESCO Class II BSC, inkubator CO2 (Memmert), mikroskop cahaya inverted (Zeiss) Axiovert 40 CFL, ELISA reader (thermo electron corporation) Mustikan Ascent, dan

3

hemositometer (Assistant).

Uji Sitotoksik Fraksi Teraktif Terhadap Sel T47D

Ekstraksi dan Fraksinasi Biji mahoni yang telah dikeringudarakan digiling kemudian sebanyak 120 g diekstraksi dengan Soxhlet menggunakan pelarut n-heksana selama 48 jam. Residu yang dihasilkan dimaserasi selama 24 jam dengan pelarut metanol dan 4 kali penggantian pelarut. Ekstrak yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan penguap putar. Ekstrak metanol pekat dipartisi dengan menggunakan etil asetat:air (3:2). Ekstrak etil asetat yang diperoleh dipekatkan dengan penguap putar. Ekstrak etil asetat pekat difraksinasi dengan menggunakan kromatografi kolom berisi silika G 60 dengan eluen kloroform dan etil asetat secara bergradien. Masing­masing fraksi ditampung dalam vial sampai volume 10 ml. Fraksi yang diperoleh di­KLT dengan eluen pengembang kloroform:etil asetat (7:3). Fraksi dengan nilai Rf yang sama digabung dan dikeringkan dengan penguap putar. Setiap fraksi diuji toksisitas terhadap larva udang A. salina untuk menentukan fraksi teraktif yang akan dilanjutkan uji sitotoksik terhadap sel T47D. Uji Toksisitas terhadap Larva Udang Telur udang ditetaskan dalam gelas piala 1 l berisi air laut dan dilengkapi dengan aerator. Setelah 24 jam, telur udang menetas menjadi larva udang. Sebanyak 20 mg dari masing­masing fraksi dilarutkan dalam air laut sampai volumenya 4 ml. Sampel yang tidak larut ditambahkan 10 μl tween 80 (batas penambahan tween 80 adalah 50µl tiap 10 ml) dan dari larutan ekstrak dipipet sebanyak 500, 50, dan 5 μl ke dalam vial tempat uji larva udang, lalu ditambahkan air laut sampai volume larutan dalam vial menjadi 2 ml sehingga konsentrasi ekstrak menjadi 1000, 100, dan 10 ppm. Masing­masing vial diberi 10 ekor larva udang. Blangko dibuat dengan menggunakan air laut yang telah mengandung 10 µl tween 80 dengan volume total 4 ml. Setelah 24 jam dihitung jumlah udang yang mati dan ditentukan nilai LC50. Masing­masing ekstrak diuji dengan 3 kali ulangan dengan 1 blangko.

Sel T47D dalam medium RPMI diinokulasikan ke dalam sumuran dengan jumlah inokulan 100 µl (kepadatan 2.5 × 104 sel/sumuran). Sebanyak 100 µl fraksi aktif dengan konsentrasi 250, 100, 50, dan 20 µg/ml ditambahkan pada inokulan kemudian diinkubasi pada inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC selama 24 jam. Pada akhir inkubasi medium pada masing­masing sumuran dibuang dan dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan 100 µl MTT 0.75% (dalam medium) lalu diinkubasi selama 4 jam dalam inkubator CO2. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan yang berwarna biru. Formazan dilarutkan dalam larutan SDS lalu diinkubasi selama 18 jam pada suhu kamar dalam gelap. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 570 nm. Pengujian dilakukan secara triplo dengan 1 blangko media RPMI, 1 kontrol negatif sel T47D, dan 1 kontrol positif cisplatin. Uji Fitokimia Uji Saponin Sebanyak 0.1 g sampel diekstrak dengan metanol, pelarut kemudian diuapkan sampai kering, lalu residu diekstrak dengan dietil eter tiga kali, dan fraksi yang larut dalam dietil eter dipisahkan. Sebanyak 5 ml akuades ditambahkan ke dalam sisa residu yang tidak larut dalam dietil eter dan dikocok. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa dengan tinggi 2­3 cm. Uji Steroid/Triterpenoid Burchard)

(Lieberman

Fraksi yang larut dalam dietil eter dalam uji saponin ditambahkan anhidrida asam asetat dan H2SO4 pekat (reagen Lieberman Burchard) kemudian dikocok. Warna hijau kebiruan menunjukkan adanya kandungan steroid/triterpenoid. Uji Alkaloid Sebanyak 0.1 g sampel diekstrak dengan CHCl3 kemudian ditambahkan 5 ml CHCl3

4

dan 4 tetes NH4OH pekat lalu dikocok. Setelah itu ditambahkan 5 ml H2SO4 4 N kemudian dikocok hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan asam (tidak berwarna) dipipet ke dalam plat tetes lalu ditambahkan reagen Meyers, Wagner, Dragendorf pada masing­masing lubang plat. Kandungan alkaloid ditunjukkan dengan adanya endapan putih pada reangen Meyers, coklat pada reagen Wagner, dan jingga pada reagen Dragendorf. Uji Tanin Sebanyak 0.1 g sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air panas dan dikocok sampai dingin. Sebanyak 6 tetes filtrat dipipet ke dalam plat tetes lalu ditambahkan beberapa tetes FeCl3 1%. Warna kuning kehijauan menunjukkan adanya kandungan tanin. Uji Flavonoid Sebanyak 0.1 g sampel ditambah 10 ml air panas lalu dipanaskan lagi selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 ml filtrat ditambahkan sedikit serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 1 ml amil alkohol kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah/jingga/kuning pada lapisan amil alkohol.

HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak dan Fraksi Secara umum, penelitian terdiri atas 4 tahap, yaitu ekstraksi, fraksinasi, uji BSLT, dan uji Sitotoksik (Lampiran 2). Ekstraksi dengan metode Soxhletasi menggunakan pelarut n­heksana bertujuan untuk menghilangkan kandungan lemak pada biji mahoni. Lemak perlu di hilangkan lebih dahulu agar tidak mengganggu analisis senyawa metabolit sekunder target. Setelah kandungan lemak hilang, dilakukan maserasi dengan metanol untuk menarik semua senyawa aktif yang terdapat dalam sampel. Ekstrak metanol dipekatkan dengan penguap putar pada suhu 40 oC. Diharapkan pada suhu tersebut senyawa metabolit sekunder tidak rusak. Tahap ekstraksi ini diperoleh ekstrak metanol pekat sebesar 20.73 g

(16.92%). Ekstrak metanol pekat dipartisi dengan etil asetat:air (3:2) untuk memisahkan senyawa polar dan semipolar. Senyawa polar terekstrak oleh air sedangkan senyawa semipolar terekstrak oleh etil asetat. Rendemen fraksi etil asetat yang diperoleh ialah 5.89 g (4.9%). Untuk meningkatkan kemurnian senyawa yang terekstrak oleh etil asetat maka sebanyak 2,12 g fraksi etil asetat difraksinasi pada kolom dengan fase diam silika G 60 dan fase gerak kloroform dan etil asetat secara bergradien dengan peningkatan kepolaran. Dari sini diharapkan terjadi pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan polaritasnya. Untuk mengetahui jumlah fraksi yang diperoleh, dilakukan uji kualitatif dengan KLT. Hasilnya memperlihatkan adanya 8 fraksi (Lampiran 3). Fraksi 1 bersifat cenderung nonpolar karena terbawa oleh CHCl3, sedangkan fraksi 8 bersiat semipolar karena terbawa oleh etil asetat. Toksisitas terhadap Larva Udang Untuk menentukan fraksi aktif yang akan digunakan pada tahap uji sitotoksik maka dilakukan uji BSLT dengan A. salina. Uji BSLT merupakan metode yang cepat dan sederhana untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa (MacLaughin 1991). Aktivitas suatu senyawa ini ditunjukkan sebagai nilai LC50. Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit (Lampiran 4). Hasil uji BSLT (Tabel 1) dari fraksi 1 sampai fraksi 8 kecuali fraksi 6 menunjukkan bahwa semua fraksi merupakan fraksi yang aktif karena memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Nilai LC50 fraksi 6 tidak ditentukan karena rendemen yang diperoleh sangat kecil sehingga tidak dapat diuji. Tabel 1. Hasil uji BSLT fraksi­fraksi biji mahoni Fraksi Bobot (g) LC50 (ppm)* Etil asetat 5.8886 56.69 1 1.1722 227.23 2 0.2336 74.30 3 0.0253 42.26 4 0.1947 71.64 5 0.0291 90.44

5

6 7 8

0.0011 0.1394 0.0179

­ 226.00 252.32

* (­): nilai LC50 tidak ditentukan.

Fraksi 3 merupakan fraksi yang paling aktif dengan nilai LC50 42.26 ppm, tetapi karena rendemen sangat kecil maka dipilih fraksi 2 yang memiliki rendemen cukup banyak dan nilai LC50 74.30 ppm untuk uji sitotoksik terhadap sel T47D. Sitotoksisitas Fraksi Aktif Terhadap sel T47D Sel T47D merupakan kultur sel kanker yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Sel ini dikulturkan dalam media RPMI yang mengandung 0.1% penisilin­streptomisin sebagai antibakteri gram positif dan negatif agar terhindar dari kontaminasi. Selain itu juga mengandung FBS sebagai faktor pertumbuhan sel dan NaHCO3 sebagai pengatur pH dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC (Schafer et al. 2000). Sifat sitotoksik fraksi 2 dapat ditentukan dari kemampuannya membunuh dan menghambat pertumbuhan sel T47D. Kemampuan membunuh dan menghambat pertumbuhan ditentukan sebagai nilai persen penghambatan proliferasi (%PP). Nilai %PP ditentukan dari perbandingan persentase sel hidup terhadap kontrol negatif sel (Lampiran 5). Jumlah sel yang masih hidup dapat ditentukan dengan menggunakan reagen MTT. Sel hidup memiliki enzim suksinat dehidrogenase yang diproduksi dalam mitokondria. Enzim ini akan mereduksi MTT yang merupakan garam tetrazolium berwarna kuning membentuk kristal formazan berwarna biru (Gambar 2). Warna biru formazan dapat diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm sehingga jumlah sel hidup dapat dihitung. Nilai absorbans formazan sebanding dengan tingkat kehidupan sel dalam media kultur.

Gambar 2. Reaksi pembentukan formazan Efek penghambatan proliferasi fraksi 2 naik sejalan dengan peningkatan konsentrasi (Gambar 3). Namun, pada konsentrasi 250 ppm sudah tidak terjadi kenaikan yang signifikan. Dari profil penghambatan proliferasi diperoleh nilai IC50 dari fraksi 2 sebesar 49.12 ppm (Lampiran 5). Fraksi 2 berpotensi sebagai antikanker karena memiliki nilai IC50 kurang dari 50 ppm (Mans et al. 2000).

Gambar 3.

Kurva pengaruh konsentrasi fraksi 2 terhadap persen penghambatan proliferasi

Dalam penelitian ini juga dilakukan pengujian kontrol positif dari obat antikanker cisplatin. Cisplatin merupakan obat kemoterapi yang banyak digunakan untuk pengobatan kanker payudara, overium, serviks, karsinoma dan sarkoma ostogenik. Ciplatin adalah senyawa turunan + cis­diklorodiaminplatinum(2 ) (Reedijk & Lohman 1985). Nilai %PP sel T47D oleh cisplatin cenderung berlangsung linier (Gambar 4). Cisplatin mampu menghambat pertumbuhan sel dengan nilai IC50 6,08 ppm (Lampiran 6).

6

Gambar 4. Kurva pengaruh konsentrasi cisplatin terhadap persen penghambatan proliferasi Mekanisme kerja antikanker dari cisplatin yaitu dengan membentuk tautan pada rangkaian DNA sehingga dapat mengganggu transkripsi dan translasi. Cisplatin ­ melepaskan 2 ion Cl membentuk ion N­Pt2+ dihidrat kemudian mengikat atom N7 dari nukleotida guanosin yang berdekatan pada rangkaian yang sama (Reedijk & Lohman 1985). Uji Fitokimia Uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat dan fraksi 2 hasil kolom (Tabel 2). Tabel 2. Hasil uji fitokimia fraksi etil asetat dan fraksi 2 Uji fitokimia Fraksi* Fraksi 2* etil asetat Saponin ­ ­ Steroid/triterpenoi + + d + + Alkaloid ­ ­ Tannin ­ ­ Flavonoid * (+): senyawa tersebut ada dalam fraksi

Fraksi etil asetat dan fraksi 2 menunjukkan hasil positif pada uji steroid/triterpenoid dengan terbentuknya warna hijau kebiruan (Lampiran 8). Keduanya juga menunjukkan hasil positif pada uji alkaloid, yaitu terbentuk endapan berwarna putih dengan reagen Meyers, cokelat dengan reagen Wagner, dan jingga dengan reagen Dragendorf (Lampiran 9). Sementara pada uji saponin, flavonoid, dan tanin menunjukkan hasil negatif. Hal ini menunjukkan bahwa kedua fraksi tersebut mengandung senyawa golongan alkaloid dan

steroid/triterpenoid. Efek farmakologi dari senyawa golongan alkaloid terhadap kanker telah dilaporkan, yaitu alkaloid vinkristin dan vinblastin dari tanaman Vinca yang menghentikan pembelahan sel pada tahap metafase sehingga sel kanker dapat dihambat pertumbuhannya (Nogrady 1992). Senyawa golongan triterpenoid dalam biji mahoni merupakan senyawa limonoid (Shahidur et al. 2009). Efek farmakologi limonoid dalam buah jeruk mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara dengan cara menginduksi kematian sel secara apoptosis (kematian sel terprogram) (Harris et al. 2009). Limonoid dari Azadicarta indica juga mampu menghambat proliferasi sel koriokarsinoma manusia (BeWo) dengan cara menginduksi apoptosis (Kumar et al. 2008).

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil yang telah dipaparkan dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi 2 dengan nilai LC50 74.30 ppm dan rendemen 0.2336 g, mampu menghambat pertumbuhan sel T47D dengan nilai IC50 sebesar 49.12 ppm. Fraksi 2 mengandung senyawa alkaloid dan steroid/triterpenoid. Saran Perlu dilakukan pemisahan lebih lanjut pada fraksi 2 untuk mendapatkan senyawa yang lebih murni sehingga struktur senyawa aktifnya dapat dielusidasi. Selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme penghambatan pertumbuhan sel kanker serta pengujian sitotoksik terhadap sel normal.

DAFTAR PUSTAKA Boik J. 1996. Cancer and Natural Medicine: A Textbook of Basic Science and Clinical Research. New York: Oregon Medical Pr. Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York: Mc­Graw Hill. Harris ED, Poulose SM, Patil B. 2009. Impact of citrus limonoids on human

7

h e a l t h . http://www.actahort.org/books/744/744_ 12.htm [25 Juni 2009]. Haryanti F. 2002. Isolasi senyawa antibakteri dari biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

candidate anticancer compound. The Oncologys 5:185­98. Meyer BN, Ferigni NR, Putnam JE, Jacobsen RE, Nicholas, McLaughin JL. 1982. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituent. Planta med 45:31­34.

Heyne K. 1950. Denuttige Planted van Indonesian. Ed ke­3. Gravenhage: NV Uitgeverij van Noeves.

[NCI] National Cancer Institut. 2009. Breast c a n c e r . http://www.cancer.gov/cancer­topics/ types/breast.htm [11 Mei 2009].

Hidayat MA 2002. Uji aktifitas antikanker ekstrak heksan daun Eupatorium triplinerve Vahl. terhadap kultur sel meiloma. Jurnal Ilmu Dasar 3:92­97.

Nogrady T. 1992. Kimia Medisinal. Rasyid R, Musadad A, penerjemah; Niksolihin SM, editor. Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: Medicinal Chemistry.

Jerry DJ. 2007. Roles of estrogen and progesterone in breast cancer prevention. Breast Canc Res 9:102.

Putri NE. 2004. Inhibisi fraksi aktif biji mahoni pada pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae sebagai uji antikanker. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Kumar V, Abbas AK, Fausato N. 2005. Cellular Adaptation, Cell Injury, and Cell Death. Di dalam: Robin, Kumar, editor. Patologic Basis of Disease. Ed ke­7. Philadelphia: WB Saunders. Kusminarto. 2006. Deteksi sangat dini kanker payudara. http://kompas.com/ kompas­cetak/0604/17/ilpeng/25748.htm [21 Juni 2009]. Lewis R. 2003. Human Genetics: Concept and Aplication. New York: McGraw­Hill. MacKinon S, Durst T, Arnason JT. 1997. Antimalarial activity of tropical meliaceae extracts and gedunin derivatives. J Natural Product 60:336­341. MacLaughin J. 1991. Crown Gad Tumours on Potato Disc and Brine Shrimp Lethality: Two Simple Bioassay for Higher Plant Screening and Fractination. Di dalam: Hostettmann K, editor. Methods in Plant Biochemistry. Ed ke­6. New york: Pergamon. Mans DRA, Adriana Bd’R, Schwartsmann G. 2000. Anticancer drugs discovery and development in Brazil: targeted plants collection as a rational strategy to acquire

Reedijk J, Lohman PHM. 1985. Cisplatin: Synthesis, antitumor activity, and mecanism of action. Pharm Weekly 7:173­80. Schafer JM, Lee ES, O’Regan RM, Yao K, Jordan VC. 2000. Rapid development of tamoxifen­stimulated mutant p53 breast tumor (T47D) in athymic mice. Clin Cancer Res 6:4373­4380. Shahidur R, Azad C, Husne­Ara A, Sheikh ZR, Mohammad SA, Lutfun N, Satyajit DS. 2009. Antibacterial actifity of two limonoids from swietenia mahagoni against multiple­drug­resistant (MDR) bacterial strains. J Nat Med 63:41­45. Sianturi AHM. 2001. Isolasi dan fraksinasi senyawa bioaktif dari biji mahoni (Swietenia mahagoni Jacq.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sukardiman. 2000. Isolasi dan sitotoksik senyawa triterpen dari kulit batang Swietenia mahagoni Jacq. [skripsi]. Surabaya: Fakultas Farmasi, Universitas Airlangga.

8

Syamsuhidayat SS, Hutapea JR. 1991. Inventaris Tanaman Obat di Indonesia. Volume ke­1. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Depkes RI. Tjidarbumi D. 1986. Tumor Ganas pada Wanita. Jakarta: Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia. Tjidarbumi D, Mangunkusumo R. 2002. Cancer in Indonesia, present and future. Jpn J Clin Oncol 32:S17­S21. Warren BS et al. 2002. Phytoestrogen and breast cancer. http://envirocancer.cornel. edu [22 Juni 2009].

LAMPIRAN

9

Lampiran 1 Identifikasi Swietenia mahagoni.

10

Lampiran 2 Diagram alur penilitian.

120 g Biji mahoni Soxhlet dengan n-heksana 48 jam

Residu

Ekstrak Heksana Maserasi dengan metanol 4 x 24 jam

Residu

Ekstrak Metanol Dipekatkan dengan penguap putar Dipartisi dengan etil asetat:air (3:2)

Ekstrak etil asetat

Ekstrak air

dipekatkan KK

Fraksi-fraksi Uji BLST

Fraksi aktif Uji sitotoksik pada sel kanker payudara T47D

Fraksi antikanker

11

Lampiran 3 Kromatogram pencarian fraksi hasil kolom kromatografi.

12

Lampiran 4 Data hasil uji BSLT. Fraksi

Konsentrasi

Etil Asetat

10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000 10 100 1000

F1 F2 F3 F4 F5 F7 F8

% kematian 6.67 53.33 99.99 13.33 26.67 76.67 6.67 60.00 96.67 23.33 63.33 93.33 6.67 63.33 96.67 6.67 43.33 96.67 10.00 13.33 86.67 1.00 3.33 96.67

Log konsentrasi 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Probit 3.52 5.08 8.09 3.87 4.39 5.74 3.52 5.25 6.88 4.26 5.33 6.88 3.52 5.33 6.88 3.52 4.82 6.88 3.72 3.87 6.13 2.67 3.12 6.75

Persamaan linear y=2.285x+0.9933 r=0.9675 y=0.935x+2.7967 r=0.9385 y=1.68x+1.8567 r=0.9997 y=1.31x+2.87 r=0.9889 y=1.68x+1.8833 r=0.998 y=1.68x+1.7133 r=0.9832 y=1.205x+2.1633 r=0.7965 y=2.04x+0.1 r=0.8316

LC50 56.6864

227.2326 74.3040 42.2624 71.6438 90.4418 225.9997 252.3253

13

Lampiran 5 Data hasil uji sitotoksik fraksi 2 terhadap sel T47D. Konsentrasi (ppm)

Absorbansi rerata

Kontrol 20 50 100 250

1.285667 1.133333 0.425667 0.226333 0.162000

% penghambatan proliferasi

Log konsentrasi (Y)

Probit % PP ( X)

11.84859 66.89137 82.39564 87.39953

1.301029996 1.698970004 2.000000000 2.397940009

3.82 5.44 5.92 6.13

% penghambatan proliferasi (%PP)= (A kontrol-A perlakuan) / A kontrol × 100% Grafik antara konsentrasi terhadap % penghambatan poliferasi

Grafik dan perhitungan IC50 :

y = mx + c y = 2.0701x + 1.4989 IC50 y = 5.00 x = 1.691271 Antilog (x) = 49.12142

14

IC50 = 49.12142 ppm

Lampiran 6 Data hasil uji sitotoksik kontrol positif cisplatin terhadap sel T47D. Konsentrasi (ppm)

Absorbansi rerata

Kontrol 3 6 9 12 15 18

1.285667 0.764333 0.671000 0.576333 0.494000 0.505000 0.445667

% penghambatan proliferasi

Log konsentrasi (X)

Probit % PP (Y)

40.54965 47.80918 55.17241 61.57635 60.72077 65.33575

0.477121255 0.778151250 0.954242509 1.079181246 1.176091259 1.255272505

4.77 4.95 5.13 5.31 5.28 5.39

Grafik %penghambatan proliferasi terhadap konsentrasi:

Grafik dan perhitungan IC50 :

IC50 = 6,082037 ppm

15

Lampiran 7 Foto hasil uji steroid/triterpenoid.

Fraksi etil asetat

Fraksi 2

Hijau kebiruan Lampiran 8 Foto hasil uji alkaloid.

Endapan putih oleh reagen Meyers Endapan coklat oleh reagen Wagner Endapan jingga oleh reagen Dragendorf

Daun tapak dara

Ekstra k MeOH

Fraksi etil asetat

Fraksi 2