UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO Naskah Publikasi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh: Dian Indah Pratiwi M0405005
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2009
PENGESAHAN
Naskah Publikasi
UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO
Oleh: Dian Indah Pratiwi M0405005
Telah disetujui untuk dipublikasikan
Surakarta,
April 2009
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Okid Parama Astirin, M.S. NIP. 131 569 270
Dinar Sari C. W., S. Farm. Apt. M. Si NIP. 132 310 094
Mengetahui Ketua Jurusan Biologi
Dra. Endang Anggarwulan, M. Si NIP. 130 676 864
UJI SITOTOKSISITAS DAN EFEK ANTIPROLIFERASI SARI Pandanus conoideus Lam. VARIETAS BUAH KUNING PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO CYTOTOXICITY TEST AND ANTIPROLIFERATIVE EFFECT OF YELLOW FRUITS Pandanus conoideus Lam. ON IN VITRO BREAST CANCER LINE T47D Dian Indah Pratiwi, Okid Parama Astirin, dan Dinar Sari C. W. Biology Department, Sciences and Mathematics Faculty, Sebelas Maret University, Surakarta ABSTRACT Breast cancer was the most common cancer in Indonesian woman after cervix cancer. Many breast cancer treatment like surgery, chemotherapy, and radiotherapy had not effectiveness result. That is caused many alternative treatment such as herbal medicine. Yellow fruit Pandanus conoideus Lam. was one of plants that has empirical study became anticancer agent because the lack of carotene, beta carotene and -tocopherol. The aims of this study were to know cytotoxicity and antiproliferative effect of yellow fruits P. conoideus Lam. on in vitro breast cancer cell line T47D. Direct counting method used in cytotoxicity test using haemocytometer and tryphan blue staining. RPMI 1640 used as medium to culture cell, and treatmented with yellow fruits P. conoideus Lam. from I Made Budi. Doubling time sampling done at 0, 24, 48, 72 hours. The result from cytotoxicity test showed that LC50 yellow fruits P. conoideus Lam was 0,25 µl/ml. Doubling time test showed that yellow fruits P. conoideus Lam. in 0,125 µl/ml can inhibit cancer grow with doubling time 1,9 times compared with the control. The result cloclused that yellow fruit P. conoideus Lam. potent as anticancer agent on breast cancer cell line T47D. Key words: Yellow fruits Pandanus conoideus Lam., breast cancer cell line T47D, cytotoxicity test, antiproliferative effect, in vitro PENDAHULUAN Jumlah penderita kanker saat ini semakin meningkat, dan menempati urutan keenam sebagai penyebab kematian (Hariani, 2005). Meningkatnya insiden kanker di Indonesia sesuai dengan laporan World Health Organization (WHO) memperlihatkan
bahwa kanker payudara masih menduduki peringkat kedua penyakit keganasan pada wanita setelah kanker leher rahim dan menyebabkan
502.000 kematian per tahun
(Riyasa, 2001). Usaha penyembuhan kanker dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi pada umumnya belum mampu memberikan hasil yang memuaskan (Sugiyanto et al., 2003). Penggunaan terapi radiasi, kemoterapi dan terapi hormon, banyak menimbulkan efek pada jaringan sehat non target ditandai dengan rontoknya rambut, dan kulit yang menghitam (Jiang et al., 2004). Hal tersebut mengakibatkan banyak dijumpai cara-cara pengobatan alternatif antara lain dengan obat tradisional (Sugiyanto et al., 2003). Selama ribuan tahun, produk alam telah memerankan peran yang sangat penting dalam mengatasi dan mencegah penyakit manusia (Chin et al., 2006). Pencarian agen anti-kanker dari bahan tanaman dimulai sejak tahun 1950 dengan ditemukan dan dikembangkannya antara lain vinka alkaloida, dan isolasi dari podofilotoksin (Reedy et al., 2003). Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning merupakan salah satu tanaman yang terbukti secara empiris memiliki aktivitas sebagai anti kanker. Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning ini memiliki kandungan karoten, betakaroten dan tokoferol. Kandungan tokoferol dari P. conoideus Lam. varietas buah kuning ini lebih tinggi daripada P. conoideus Lam. varietas buah merah yang telah dikenal sebelumnya sebagai agen anti kanker (Budi dan Paimin, 2005). Sel kanker payudara T47D adalah galur sel kanker payudara yang diisolasi dari penderita kanker payudara yang memiliki reseptor positif esterogen/progesteron (Keydar et al., 1979 dalam Schafer et al., 2000). Sel ini mengandung satu kopi missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding domain, L2) gen p53, dimana terjadi perubahan kodon CCT menjadi TTT sehingga merubah asam amino leusin menjadi fenilalanin. Mutasi gen p53 ini banyak dijumpai (55%) pada penderita kanker (Davidoff et al., 1990).
Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek sitotoksisitas sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada sel kanker payudara T47D secara in vitro.serta menguji kemampuan penghambatan proliferasi sel kanker payudara T47D setelah pemberian sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning. BAHAN DAN METODE Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur sel T47D yang diperoleh dari ATCC (American Type Culture and Collection), sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning yang didapatkan dari I Made Budi, media RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640, tryphan blue, tripsin-EDTA 0,25%, PBS(Phospate Buffer Saline) 20%, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, hepes, fungizon, penicillin/streptomycin, alkohol 70%, HCL, NaOH. Metode Penelitian Sel kanker payudara T47D ditumbuhkan hingga konfluen dalam media RPMI 1640 lengkap dengan metode mengacu Freshney (2000). Kerapatan sel dihitung dengan metode direct counting yaitu, dengan mengambil suspensi sel sebanyak 20µl kemudian ditambah dengan tryphan blue 180 µl, sel dihitung dengan bantuan haemocytometer pada mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 kali. Jumlah sel total yang diperoleh dibagi 4 dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan konstanta 104/ml. Untuk keperluan uji sitotoksisitas sel T47D tiap sumuran dibutuhkan 2 × 104 sel dalam 100 µl media RPMI 1640 (Zhu et al., 2003; Gadek et al., 2002). Larutan uji dibuat dengan melarutkan sari buah kuning pada media RPMI steril, dari larutan induk kemudian dibuat serangkaian seri kadar yang dibutuhkan dengan pengenceran menggunakan media RPMI 1640 (Freshney, 2000). Seri kadar yang akan dicobakan untuk uji sitotoksisitas adalah: 1 µl/ml; 0,5 µl/ml; 0,25 µl/ml; 0,125 µl/ml; 0,0625 µl/ml; 0,03125 µl/ml; 0,015625 µl/ml; 0,0078125 µl/ml; 0,00390625 µl/ml.
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memasukkan 100 µl medium RPMI 1640 komplit yang mengandung suspensi sel dengan kerapatan sekitar 2 × 104 sel/ml dimasukkan ke dalam 30 sumuran mikrokultur 96 sumuran. Selanjutnya sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning diberikan 100 µl pada peringkat konsentrasi yang berbeda secara triplet dengan menggunakan mikropipet. Kontrol RPMI dan kultur sel T47D digunakan untuk mengurangi bias penelitian. Sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO, kadar CO 5%, suhu 37 C. Setelah 24 jam media RPMI 1640 dibuang dan diresuspensi dengan 100 µl tripsin-EDTA 0,25%. Penghitungan dilakukan dengan metode direct counting yaitu, dengan menambahkan 100 µl trypan blue, kemudian diambil kira-kira 10 µl diletakkan pada haemocytometer dan dihitung jumlah sel mati dan sel hidup dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100 . Uji doubling time dilakukan dengan starvasi overnight 2×104 sel T47D dalam 100 µl media RPMI 1640 yang mengandung FBS 0,5 %. Pada masing-masing sumuran ditambahkan larutan uji 3 konsentrasi di bawah LC50 24 jam sebanyak 100 µl secara triplet. Kontrol media RPMI 1640 200 µl dan kultur sel. Penghitungan sel hidup dan sel mati dilakukan pada jam ke 0, 24, 48, dan 72 dengan metode direct counting. Hasil pengamatan kematian sel uji ditampilkan dalam bentuk persentase kematian sel dengan rumus:
(Doyle and Griffith, 2000). Data ditampilkan dalam bentuk kurva hubungan konsentrasi (sampel) sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dengan persentase kematian sel uji. Beda nyata antara masing-masing konsentrasi yang diberikan dianalisis menggunakan Analisis of Variance (ANOVA). Aktivitas sitotoksik dinyatakan dengan LC50 24 jam yang ditetapkan dengan analisa probit. Analisis waktu penggandaan dilakukan dengan membandingkan nilai slope grafik jumlah sel pada berbagai waktu pengamatan. Waktu penggandaan dihitung
dengan memasukkan nilai log jumlah sel awal ke dalam persamaan grafik jumlah sel dan waktu pengamatan untuk masing-masing konsentrasi (Mursyidi, 1985). HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Sitotoksisitas Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik dari sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning terhadap sel kanker payudara T47D dengan parameter LC50. Uji ini dilakukan dengan metode direct counting menggunakan pengecatan trypan blue. Zat warna trypan blue ini memiliki muatan negatif yang tidak dapat berikatan dengan sitoplasma pada sel hidup. Sel yang hidup akan tampak transparan (Gambar 1) (Freshney, 2000). Jika jarak antara pemberian tryphan blue dan pengamatan terlalu lama maka sel yang hidup juga akan berwarna biru. Penghitungan harus segera dilakukan setelah pengecatan (Moeljoprawiro et al., 2007). 1
2
Gambar 1. Sel kanker payudara T47D setelah diwarnai dengan tryphan blue, (1) sel mati tampak berwarna biru, (2) sel hidup tampak jernih. Morfologi sel setelah perlakuan dengan menggunakan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dapat dilihat pada Gambar 2, pada kontrol (a) terlihat banyak jumlah sel yang hidup dan menempel pada dasar flask, dan saling bertumpuk-tumpuk. Pada perlakuan dengan dosis 1 µl/ml (Gambar 2.c) tampak semua sel mati, sel yang mati terlihat bulat dan tidak menempel pada dasar flask dengan sitoplasma keruh. Pada perlakuan dosis 0,25 µl/ml (Gambar 2.b) tampak sel mati dan hidup, sel hidup
terlihat menempel dan sebagian bulat jernih dengan ukuran yang lebih kecil dibandingkan sel mati.
1
2 1
(a)
(b)
2
(c) Gambar 2. Kenampakan sel T47D pada uji sitotoksisitas dengan perlakuan sari P. conoideus Lam. pada konsentrasi : (a) kontrol; (b) konsentrasi 0,25 µl/ml; (c) konsentrasi 1 µl/ml. Keterangan: 1. Sel hidup, 2. Sel mati Persentase kematian tiap-tiap konsentrasi dapat dilihat pada Tabel 1. Berdasarkan hasil analisa probit maupun direct counting yang dilakukan didapatkan nilai LC50 sebesar 0,25 µl/ml. Hasil analisa probit ini diperoleh dengan mengubah persentase kematian menjadi angkat probit dengan menggunakan tabel probit (Lampiran 3), kemudian dibuat grafik persamaan regresi linier probit dan log konsentrasi. Menurut Menurut Ueda et al. (2002) ekstrak tanaman yang memiliki LC50 < 100 g/ml berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen anti kanker. Tabel 1. Rata-rata persentase kematian sel T47D setelah perlakuan dengan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
No.
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Konsentrasi Persentase Kematian sel (µl/ml) (%) I II III Kontrol 0 0 0 1 72,09 68,18 70,45 0,5 59,57 58,33 59,57 0,25 50 50 50 0,125 40,39 39,52 39,52 0,0625 32,14 31,58 31,58 0,03125 26,67 26,23 26,23 0,015625 20,64 19,05 19,05 0,0078125 13,64 13,64 13,43 0,00390625 5,71 7,04 5,71
Rerata(%)±SD
0±0 70,24±1,96 59,16±0,72 50±0 39,87±0,44 31,77±0,32 26,37±0,25 19,58±0,92 13,57±0,12 6,15±0,77
Senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik pada P. conoideus Lam. varietas buah kuning adalah karoten, betakaroten, dan -tokoferol. Ketiga senyawa ini bersifat sebagai antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas (Budi dan Paimin, 2005). Interaksi ketiga senyawa tersebut dengan sel kanker dimulai dari membran sel, -tokoferol, karoten dan betakaroten merupakan senyawa yang larut dalam lemak sehingga dapat berdifusi melalui membran sel, kemudian ke dalam sitoplasma (Bieri et al., 1975). Alfa tokoferol di dalam membran sel maupun membrane mitokondria akan menghambat aktivitas Na dan K ATPase sehingga tokoferol dapat mengganggu pertukaran ion melalui Na dan K channel. Alfa tokoferol juga telah terbukti menghambat aktivitas beberapa enzim oksidasi, diantaranya adalah enzim-enzim yang terlibat dalam proses glikolisis dan fosforilasi oksidatif ADP menjadi ATP, sehingga akan menurunkan produksi ATP dalam sel (Kawai et al., 1974). Berdasarkan penelitian Prasad et al. (1999) -tokoferol terbukti menghambat protein kinase C, meningkatkan sintesis dan transformasi growth factor B yang merupakan salah satu sinyal penghambat pertumbuhan. P. conoideus Lam. yang mengandung -tokoferol diduga dapat menghambat proliferasi sel kanker payudara
T47D. Uji doubling time dilakukan untuk mengetahui efek penghambatan proliferasi sel oleh sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning.
Uji Doubling Time Uji doubling time dilakukan dengan tiga konsentrasi perlakuan dibawah LC50. Uji doubling time digunakan untuk mengetahui kemampuan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dalam menghambat proliferasi sel T47D. Kemampuan proliferasi sel dapat diartikan sebagai kemampuan sel untuk tumbuh membelah dan berkembang (Moeljoprawiro et al., 2007).. Doubling time sendiri merupakan waktu yang diperlukan oleh sel untuk menggandakan dirinya menjadi dua kali jumlah semula. Senyawa yang mampu memperpanjang waktu doubling time menunjukkan kemampuan senyawa tersebut untuk menghambat proliferasi sel kanker melalui mekanisme cell cycle arrest (Meiyanto et al., 2007). Apabila proliferasi sel kanker dihambat melalui mekanisme cell cycle arrest maka sel akan berhenti membelah, sehingga pengaruh hambatan ini berupa kematian sel
Gambar 3. Grafik hubungan jumlah sel dan waktu inkubasi pada uji doubling time sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning konsentrasi 0,03125 µl/ml; 0,0625 µl/ml; dan 0,125 µl/ml yang dilakukan perhitungan pada waktu inkubasi 0, 24, 48, dan 72 jam.
Hasil uji doubling time selama 72 jam menunjukkan bahwa pada konsentrasi 0,03125 µl/ml sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning telah mampu menghambat proliferasi sel sebesar 17,47%. Pada konsentrasi 0,0625 µl/ml sari P. conoideus Lam. mampu menghambat proliferasi sel T47D sebesar 33,15%. Pada konsentrasi 0,125 µl/ml terjadi penghambatan proliferasi sebesar 48,79% (Gambar 3).
Tabel 2. Persamaan garis regresi dari waktu inkubasi dan jumlah sel, serta nilai doubling time Konsentrasi (µl/ml) 0,03125 0,0625 0,125 Kontrol
Persamaan garis waktu inkubasi dan jumlah sel Y=0,159x+0,911 Y=0,125x+1,182 Y=0,088x+1,258 Y=0,198x+0,562
Nilai slope
R2
0,159 0,125 0,088 0,198
0,929 0,943 0,898 0,922
Nilai doubling time (jam) 23,214 27,36 38 20,404
Nilai doubling time menunjukkan lama waktu yang diperlukan oleh sel T47D untuk mencapai jumlah dua kali lipat pada konsentrasi perlakuan sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dan kontrol. Semakin tinggi nilai slope menunjukkan semakin cepat waktu doubling time yang diperlukan. Kontrol dengan nilai slope tertinggi 0,198 memiliki waktu doubling time tercepat yaitu 20,404 jam, sedangkan konsentrasi 0,125 µl/ml memiliki nilai slope terendah 0,088 memiliki waktu doubling time terlama yaitu 38 jam. Hasil uji doubling time menunjukkan bahwa kandungan senyawa yang terdapat pada sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning dalam hal ini -tokoferol, karoten, dan betakaroten dapat menyebabkan cell cycle arrest, sehingga dapat menghambat proliferasi sel kanker. Hal ini sesuai dengan penelitian Albright et al. (2004) yang menyatakan bahwa kombinasi antara tokoferol dengan vitamin A terbukti mampu menghambat pertumbuhan dan metastasis sel kanker payudara pada mencit transgenik. Kombinasi penggunaan betakaroten dan -tokoferol juga terbukti
memiliki aktivitas kemopreventif dan penghambatan tumorigenesis secara in vivo pada kanker paru-paru (Kim et al., 2006). Sinyal tranduksi dalam cell cycle arrest ini diduga dimulai dari penghambatan kerja enzim oksidasi yang berperan dalam produksi ATP oleh -tokoferol, sehingga energi yang digunakan untuk pembelahan sel kurang tersedia (Kawai et al., 1974), selain itu juga dikarenakan adanya penghambatan protein kinase C (Prasad et al., 1999). Protein kinase C berfungsi dalam fosforilasi pRb, dimana pRb akan menjadi hipoposforilasi sehingga akan mengikat E2F dan menghambat aktivitas dari E2F yang merupakan faktor transkripsi. Penghambatan E2F ini akan menyebabkan cell cycle arrest (Guasconi et al., 2002). Penghambatan aktivitas dari E2F ini kemungkinan dapat mengatur ekspresi gen p53 tipe wild sebagai salah satu tumor suppressor gen pada fase G1/S dan menginduksi apoptosis (Braithwaite et al., 2006). Sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Carlisle et al. (2000) dimana tokoferol terbukti mampu penginduksi apoptosis dan meningkatkan ekspresi gen p53 tipe wild pada kanker paru-paru (HLF cell). Interaksi antara
-tokoferol dan betakaroten bersifat sinergis dimana,
-
tokoferol yang telah mendonorkan elektronnya pada senyawa radikal bebas akan berubah menjadi
-tokoferoksil radikal yang tidak reaktif apabila dibandingkan
dengan ROS. Alfa tokoferoksil radikal ini kemudian akan menerima elektron dari betakaroten sehingga menjadi -tokoferol kembali, selanjutnya betakaroten radikal akan dihilangkan oleh adanya aktivitas anti oksidan endogen seperti superoxside dismutase dan gluthation peroksidase dari sel (Böhm et al., 1997). KESIMPULAN Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa LC50 sari Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro adalah 0,25 µl/ml, sehingga berpotensi untuk diteliti lebih lanjut mengenai aktivitas antikankernya.
Sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada konsentrasi 0,03125 µl/ml telah mampu memperlama waktu penggandaan sel kanker payudara T47D menjadi 1,14 kali dibandingkan kontrol tanpa perlakuan. Pada konsentrasi 0,0625 µl/ml waktu penggandaan sel T47D menjadi lebih lama 1,34 kali. Konsentrasi 0,125 terbukti paling efektif dalam penghambatan proliferasi, dengan waktu penggandaan sel T47D lebih lama 1,9 kali.
DAFTAR PUSTAKA
Albright, C. D., R. I., Salganik, and T. V., Dyke. 2004. ‘Dietary Depletion of Vitamin E and Vitamin A Inhibits Mammary Tumor Growth and Metastasis in Transgenic Mice’. Journal of Nutrition 134:1139-1144 Bieri, J. G., R. P., Evart, and J. J., Gart. 1975. ‘Relative Activity of a-Tocopherol and y-Tocopherol in Preventing Oxidative Red Cell Hemolysis’. Journal of Nutrition:124-127 Böhm F., R., Edge, E. J., Land, D., McGarvey, T. G., Truscott. 1997. ‘Carotenoids Enhance Vitamin E Antioxidant Efficiency’. J Am Chem Soc. 119:621–622 Braithwaite, A. W., G. D., Sal, X., Lu. 2006. ‘Some p53-Binding Proteins That Can Function as Arbiters of Life and Death’. Cell Death and Differentiation 13:984–993 Budi, I. M., dan F. R., Paimin. 2005. Buah Merah. Seri Agrisehat. Jakarta: Penebar Swadaya. h:20-48 Carlisle, D. L., D. E., Pritchard, J., Singh, B. M., Owens, L.J., Blakenship, J. M., Orestein, and S. R., Patieno. 2000. ‘Apoptosis and p53 Induction in Human Lung Fibroblast Exposed to Chromium (VI): Effect of Ascorbate and Tocopherol’. Toxicological Science 55:55-68 Chin, Y. W.,M. J., Balunas, H. B., Chai, and A. D., Kinghorn. 2006. ‘Drug Discovery From Natural Sources’. The AAPS Journal 8(2):239-253 Davidoff, A. M., P. A., Humphrey, J. D., Iglehart. 1990. ‘Genetic Basis for p53 Overexpression in Human Breest Cancer’. Proc Natl Acad. Sci. USA. 87:8751-55
Doyle, A., and J. B., Griffith. 1988. Cell and Tissue Culture For Medical Research. Chichester: John Willey and Sons LTD. p.12-16 Freshney, R. 2000. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique 4th Edition. New York: John Wiley and Sons. Inc Gadek, J. Wesierska, V., Kotala, C. S., Kuch, and M. D., Horky. 2002. ‘Induction of Apoptosis in Human Cervik Carsinoma Cells During Therapy by Cisplatin’. Institute Cancer Research University of Vienna, Austria. Apoptosis Molecular Mechanisms Journal. p.150 Carlisle, D. L., D. E., Pritchard, J., Singh, B. M., Owens, L.J., Blakenship, J. M., Orestein, and S. R., Patieno. 2000. ‘Apoptosis and p53 Induction in Human Lung Fibroblast Exposed to Chromium (VI): Effect of Ascorbate and Tocopherol’. Toxicological Science 55:55-68 Hariani, R. 2005. Nutrisi Pada Penderita Kanker. http://www.dharmais.co.id/ new/content.php?page=article&lang=id&id=4, [20 Juli 2008] Jiang, Q., J., Wong, H., Fyrst, J. D., Saba, and B. N., Ames. 2004. . ‘ -Tocopherol or Combinations of Vitamin E Forms Induce Cell Death in Human Prostate Cancer Cells by Interrupting Sphingolipid Synthesis’. PNAS 101 (51):1782517830 Kawai, K., M., Nakao, T., Nakao, and G., Katsu. 1974. ‘Inhibition of Membrane Cell Adenosine Triphosphatase By Alpha-tokopherol and Its Derivates’. J. Clin. Nutr. 27:987 -994 Keydar, I., L., Chen, S., Karby, F. R., Weiss, J., Delarea, M., Radu, S., Chaitcik, and Brenner, H. J. 1979. ‘Establishment and Characterization of a Cell Line of Human Breast Carcinoma Origin’. Eur. J. Cancer. 15:659–670 Kim, Y., N., Chongviriyaphan, C., Liu, R. M., Russel, and X. D., Wang. 2006. ‘Combined Antioxsidan ( -Carotene, -Tocopherol, and Ascorbic Acid) Suplementation in Increase The Level of Lung Retinoic Acid and Inhibits The Activation of Mitogen-Activated Protein Kinase in The Ferret Lung Cancer Model’. Carcinogenesis 27(7):1410-1419 Meiyanto, E., R., Fitria, dan R., Sugeng. 2007. ‘Efek Sitotoksik Fraksi Semipolar Ekstrak Metanolik Kulit Batang Cangkring (Erythrina fusca Lour.) Terhadap Sel Hela’. Majalah Obat Tradisional, 11(41): 1-11 Moeljoprawiro, S., M. R., Anggelia, D., Ayuningtyas, B., Widaryanti, Y., Sari, dan I. M., Budi. 2007. ‘Pengaruh Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.)
Terhadap Pertumbuhan Sel Kanker Payudara dan Sel Kanker Usus Besar’. Berkala Ilmiah Biologi 6(2): 121-130 Mursyidi, A. 1985. Statistika Farmasi dan Biologi. Jakarta: Ghalia Prasad, K. N., A., Kumar, V., Kochupillai, and W. C., Cole. 1999. ‘High Doses of Multiple Antioxidant Vitamins: Essential Ingredients in Improving the Efficacy of Standard Cancer Therapy’. Journal of the American College of Nutrition, 18(1):13–25 Reddy, L., B., Odhav, and K. D., Bhoola,. 2003. ‘Natural Products For Cancer Prevention: A Global Perspective. Pharmacology & Therapeutics 99:1-13 Riyasa, K. T. 2001. ‘Hubungan Tingkat Depresi pada Penderita Kanker Mammae yang Menjalani Pengobatan dengan Operasi dan Kombinasi (Operasi dan Radioterapi)’. Laporan Tahunan Pusat Penelitian Pengembangan Pemberantasan Penyakit. ITB-Bandung Schafer, J. M. G, E. S., Lee, R. M., O’Regan, K., Yao, and V. C., Jordan. 2000. ‘Rapid Development of Tamoxifen Stimulated Mutant p53 Breast Tumor (T47D) in Athimyc Mice’. Regular Articles. Clinical Cancer Research vol.6. p:1-19 Sugiyanto, B., Sudarto, Edy, M., dan Agung, E. N. 2003. ‘Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa Yang Berasal Dari Tumbuhan’. Majalah Farmasi Indonesia. 14(3):132–141 Ueda, Y., Y., Tezuka, A. H., Banskota, Q. L., Tran, Q. K., Tran, Y., Harimaya, I., Saiki, and S., Kadota. 2002. ‘Antiproliferatif Activity of Vietnamese Medicinal Plants’. Biol.Pharm Bull 25 (6): 753-760 Zhu, J., O., Hirokazu, O., Shigeki, N., Shinobu, and N., Shinji. 2003. ‘Arsenic Trioride Induces Apoptosis in Leukimia and Lymphoma Cell Lines Via The CD95/CD95L System’. Oncology Reports 10: 705-709. Nora Medical University, Japan
