SINTESIS SENYAWA ANALOG UK-3A DAN UJI AKTIVITAS SECARA IN VITRO TERHADAP SEL KANKER MURINE LEUKEMIA P-388
UJIATMI DWI MARLUPI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Sintesis Senyawa Analog UK3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P388 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, 4 Desember 2007 Ujiatmi Dwi Marlupi NIM G452050061
ABSTRACT Novel antibiotics UK-3A that were elucidated as nine-membered ring dilactone derivative have been isolated from the mycelial of Streptomyces sp. 51202. UK-3A was active to inhibit bacterial and cancer cells growth. Functional groups of hydroxyl, amide, and nine-membered ring dilactone were active groups in the activity test. Analog compounds of UK-3A, i.e. 3-hydroxypicolinyl serine methyl ester, was synthesized. This methyl ester was esterified with pentanoic acid, hexanoic acid, and heptanoic acid to produce 3-hydroxypicolinyl serine methyl penthyl ester (a), 3-hydroxypicolinyl serine methyl hexyl ester (b), and 3hydroxypicolinyl serine methyl hepthyl ester (c), respectively. These compounds were confirmed with Fourier transformed infrared, liquid chromatography mass spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectrometers. In vitro test to Murine leukemia P-388 cells demonstrated that the inhibition to growth of cancer cells with IC50 for a, b, and c were 39,0; 51,0; and 82,0 µg/mL, repectively. The IC 50 values indicated that the synthesed products were sufficiently potential to be anticancer agent for Murine leukemia P-388 cells. Keywords: anticancer, UK-3A analog, Murine leukemia P-388
RINGKASAN Antibiotika baru, yaitu UK-3A, dielusidasi sebagai turunan dilakton cincin beranggota sembilan, diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 512-02 dan terbukti aktif menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker. Gugus fungsi hidroksil, amida, dan dilakton cincin beranggota sembilan merupakan gugus aktif yang terdapat dalam senyawa UK-3A. Telah dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A baru, yaitu 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Senyawa metil ester ini diesterifikasi menggunakan asam pentanoat, heksanoat, dan heptanoat berturutturut menghasilkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin heptil ester (c). Senyawa hasil sintesis dikonfirmasi menggunakan spektrofotometer inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti. Uji aktivitas senyawa dilakukan secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 dan hasilnya memperlihatkan penghambatan pada pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC 50 untuk senyawa a, b, dan c masingmasing sebesar 39,0; 51,0; dan 82,0 µg/mL. Nilai IC50 ini menunjukkan bahwa ketiga senyawa hasil sintesis cukup berpotensi sebagai antikanker terhadap sel Murine leukemia P388. Kata kunci: antikanker, analog UK-3A, Murine leukemia P-388
@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2007 Hak Cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyasunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
SINTESIS SENYAWA ANALOG UK-3A DAN UJI AKTIVITAS SECARA IN VITRO TERHADAP SEL KANKER MURINE LEUKEMIA P-388
UJIATMI DWI MARLUPI
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Zaenal A. Mas’ud, DEA
Judul Tesis Nama NIM
: Sintesis Senyawa Analog UK-3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P-388 : Ujiatmi Dwi Marlupi : G452050061
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Suminar S. Achmadi, M.Sc Ketua
Dr. Muhammad Hanafi Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Kimia
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS
Tanggal Lulus:
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS
Tanggal Ujian: 4 Desember 2007
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini berjudul “Sintesis Senyawa Analog UK-3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P-388” sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Suminar S Achmadi dan Dr. Muhammad Hanafi selaku pembimbing atas semua bimbingan, saran, dan arahannya. Ucapan terima kasih kepada Pusat Penelitian Kimia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu dan Teknologi (Puspiptek) yang telah mensponsori penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ibu, ayah, serta seluruh keluarga, atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya. Semoga tesis ini bermanfaat.
Bogor, 4 Desember 2007
Ujiatmi Dwi Marlupi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banyumas pada tanggal 4 Maret 1982 dari ayah Sumaryo Andi Wibowo, A.Ma.Pd dan ibu Rasiyati, S.Pd. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2000 penulis lulus dari SMU Negeri 5 Purwokerto dan pada tahun yang sama lulus seleksi sebagai mahasiswa Universitas Jenderal Soedirman melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri. Penulis memilih Program Sarjana Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Kimia. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Kimia Dasar pada tahun ajaran 2002/2003 serta mata kuliah Kimia Anorganik 1 pada tahun ajaran 2003/2004. Penulis lulus dari pendidikan sarjana pada tahun 2005. Tahun 2005 penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana IPB.
DAFTAR ISI Halaman ABSTRACT ..................................................................................................... iii RINGKASAN .................................................................................................. iii DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................................ x DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xi PENDAHULUAN............................................................................................ 1 Latar belakang ...................................................................................... 1 Tujuan Penelitian.................................................................................. 2 Manfaat Penelitian................................................................................ 2 TINJAUAN PUSTAKA................................................................................... 3 Senyawa UK-3A................................................................................... 3 Sintesis Senyawa Analog UK-3A ........................................................ 5 Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A................................ 7 Aktivitas Hayati Senyawa UK-3A ....................................................... 9 Leukemia .............................................................................................. 11 METODE PENELITIAN ................................................................................. 13 Waktu dan Tempat Penelitian .............................................................. 13 Alat dan Bahan ..................................................................................... 13 Prosedur ................................................................................................ 13 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 17 Senyawa Analog UK-3A ...................................................................... 17 Aktivitas Senyawa Analog UK-3A ..................................................... 31 KESIMPULAN ................................................................................................ 33 SARAN ............................................................................................................ 34 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 35 LAMPIRAN ..................................................................................................... 38
DAFTAR GAMBAR Halaman 1.
Struktur UK-2A, UK-3A, dan Antimisin A3............................................. 3
2.
Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A.................................................... 6
3.
Reaksi sintesis senyawa 1-5 ...................................................................... 8
4.
Reaksi sintesis senyawa 6-9 ...................................................................... 8
5.
Senyawa 10, 11, dan 12 ............................................................................ 9
6.
Sel kanker leukemia .................................................................................. 11
7.
Usulan mekanisme reaksi sintesis tahap 1 ................................................ 18
8. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester ........................................... 20 9. Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c ............................. 23 10. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a) ........................... 26 11. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b) .......................... 28 12. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) ........................... 29
DAFTAR TABEL Halaman 1. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3 ............... 10 2. Aktivitas sitotoksik....................................................................................... 11 3. Nilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 1 .................................................... 17 4. Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR untuk senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester (CDCl 3, 500 MHz) .............................. 21 5. Nilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 2 .................................................... 24 6. Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR untuk senyawa a (CDCl 3, 500 MHz) ....................................................................................... 27 7. Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR untuk senyawa b (CDCl 3, 500 MHz) ....................................................................................... 28 8. Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan 13C-NMR untuk senyawa c (CDCl 3, 500 MHz) ....................................................................................... 30
9. Aktivitas senyawa a, b, c, dan UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 ........................................................................................................... 32
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c ............................................................................. 39 2. Spektrum FT-IR senyawa serin metil ester hidroklorida, 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c ........................................................... 43 3. Spektrum 1H-NMR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c ..................................................................................................... 46 4. Spektrum 13C-NMR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, a, b, dan c .................................................................................................................... 48 5. Aktivitas secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 ....... 50
PENDAHULUAN Latar Belakang Senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antibiotika baru, yaitu UK-2A sebagai komponen utama dan UK-3A sebagai komponen minor, telah diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 dan dielusidasi (Ueki et al. 1996). Penelitian Ueki et al. pada tahun 1997a menyatakan bahwa senyawa UK-3A memiliki aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. UK-3A memiliki potensi sebagai antikanker, tetapi aktivitasnya masih kurang tinggi. Hal ini mendorong perlunya penelitian untuk mensintesis senyawa analog UK-3A yang lebih sederhana dan memiliki aktivitas tinggi sebagai antikanker dengan cara memodifikasi gugus aktif pada senyawa induk UK-3A. Aktivitas yang cukup tinggi pada senyawa UK-3A ditunjukkan oleh gugus hidroksi (OH) dan amida (CONH). Kedua gugus ini menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker. Aktivitas yang cukup tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang mempunyai sifat sebagai gugus hidrofobik (Hanafi 1997a). Sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilakukan dengan modifikasi pada gugus aktif yang diharapkan dapat meningkatkan aktivitas senyawa. Penelitian untuk menemukan senyawa antikanker baru dengan aktivitas yang tinggi sangat diperlukan, mengingat penyakit kanker telah semakin meluas dan menjadi penyakit yang mendunia. Kanker merupakan salah satu penyebab kematian yang paling sering dan kasus penderita kanker semakin bertambah (Abdulah et al. 2005). Kanker dapat dipicu oleh kebiasaan hidup yang tidak baik, pencemaran lingkungan, efek radiasi, dan karsinogen kimia. Semakin banyak jumlah penderita kanker yang perlu diatasi, salah satunya dengan meningkatkan pemenuhan kebutuhan akan obat-obatan. Kebutuhan obat dapat dipenuhi dari berbagai sumber di antaranya hasil sintesis kimia, semisintetik, tumbuh-tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme. Sejak abad ke-19 telah banyak digunakan bahan alami secara empirik untuk pengobatan. Bahan alami untuk obat ini mulai dikembangkan dengan cara isolasi
senyawa aktif, identifikasi struktur molekul, dan selanjutnya diupayakan untuk dibuat melalui sintesis (Siswandono & Soekardjo 1995).
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan 1. Mensintesis senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) dengan cara memodifikasi gugus aktif senyawa induk UK-3A. 2. Memperoleh senyawa antikanker yang efektif terhadap sel kanker Murine leukemia P-388.
Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan berma nfaat sebagai obat antikanker baru yang memiliki aktivitas tinggi. Senyawa yang dihasilkan diharapkan dapat digunakan sebagai calon obat antikanker yang bermanfaat untuk penyembuhan penyakit kanker yang masih sulit diatasi.
TINJAUAN PUSTAKA Senyawa UK-3A Selama tahun 1993 sampai 1997 telah berhasil dilakukan isolasi senyawa baru, yaitu benzokazol sitotoksik UK-1 dan antifungal UK-2A, B, C, dan D, dari Streptomyces sp.517-02 (Hanafi et al. 1996). Senyawa aktif juga diperoleh pada ekstrak aseton dari miselium Streptomyces sp.517-02. Senyawa aktif ini disebut UK-3A yang mempunyai aktivitas sebagai antifungal dan antibiotik. Senyawa UK-3A merupakan kristal tidak berwarna dan berbentuk jarum. Senyawa UK-3A juga menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri dan antikanker (Ueki et al. 1996). UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 1). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK2A (Ueki et al. 1997a). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu Antimisin A3 yang diisolasi dari Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005). Antimisin A3 diketahui sebagai antibiotik dan berperan dalam apoptosis melalui jalur intrinsik pada sel kanker. Antimisin A3 dapat menginduksi apoptosis sel leukemia HL-60.
N H N
O
R
H N
O OH
O O
O
NH
O OH
O H
O
O O
O
O
O
O
UK-2A : R = OMe UK-3A : R = H
O
Antimisin A3
Gambar 1 Struktur UK-2A, UK-3A, dan Antimisin A 3
Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa UK-3A. Kajian mengenai hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK-2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugus-gugus yang berperan dalam aktivitas hayati (Hanafi 1997a). Hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog dengan struktur yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa UK-3A induk. Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana menghasilkan senyawa UK-2(OMe) dan UK-2(NMe) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin pikolinat dan NH pada gugus amida merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati. Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin sembilan merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil (OH) dan amida (CONH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawasenyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus hidroksi pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi (Hanafi & Thelma 1998).
Sintesis Senyawa Anolog UK-3A Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker (Ueki et al. 1997a), seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa Antimisin A3 (Liu et al. 2003). Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A masih dipandang kurang sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 1995). Topliss telah mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer (Widodo 1998), yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien. Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugus-gugus yang bersifat lipofilik dan sterik pada posisi tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan. Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Peragaman tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al. 2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 2.
O N
N
OCH3
H N
DMAP
HCl.H2N
OH
+
OH
o
DCC/piridin,55 C, 24 jam
OH OH
OH
O
O
3-hidroksipikolinat
L-serin metil ester hidroklorida
O OCH3
3-hidroksipikolinil serin metil ester
N
O H N
RCOOH
O
R
o
DMAP, DCC/kloroform 37 C, 4 jam
OH
O O a : R = C4H9 b : R = C5H 11 c : R = C6H 13
OCH3 DCC = disikloheksilcarbodiimida DMAP = dmetil amino piridin
Gambar 2 Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A (Shimano et al. 1998)
Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. RCOOH
+
R'OH
R-COOR'
+
H2O
Agar reaksi menjadi sempurna, dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (pTsOH), karbonil diimidazol (CDI), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sunberg 1990). Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. Oleh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan disikloheksilurea (DCU) sebagai
hasil samping penggunaan DCC (March 1992). DCC secara luas juga dikenal berperan dalam pembentukan amida dan sintesis polipeptida dari asam amino (Kurzer & Zadeh 1967). Aktivator DCC umumnya digunakan untuk menggabungkan asam karboksilat dengan amina yang menghasilkan amida. DMAP (4-N,N-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sunberg 1990). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester.
Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan cara mengubah gugus dilakton cincin beranggota sembilan menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik (Usuki et al. 2006). Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b). Senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis pada tahun 1997 adalah senyawa 1-9. Asetilasi senyawa 1 (3-hidroksipikolinil metil serin ester) dengan anhidrida asetat menghasilkan senyawa 2. Sementara itu, esterifikasi senyawa 1, masing-masing dengan asam 3-fenil propionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat menghasilkan senyawa 3, 4, dan 5 (Hanafi et al. 1997b). Senyawa 7, 8, dan 9 diperoleh dengan mereaksikan senyawa 6 (3-hidroksipikolinil etil serin ester) masing-masing dengan asam 3-fenilpropionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat (Hanafi et al. 1997c). Reaksi pembentukan senyawa 1-5 dan 6-9 dapat dilihat pada Gambar 3 dan 4.
HCl.H 2N
N OH
H N
DCC/DMAP
+ O
OH
N
OH
OH
o
piridin, 55 C 24 jam
OCH 3
O
OH
O O
OCH 3
1 N
RCOOH DCC/DMAP
1
H N
CH 2Cl2, 25 oC, 2 jam *
OR OH
Ac2O, piridin, DMAP
O O
OCH 3
2 * : R = CH 3CO3 : R = PhCH2CH2CO4 : R = C5H11CO5 : R = C7H15CO-
Gambar 3 Reaksi sintesis senyawa 1-5 (Hanafi et al. 1997b)
HCl.H 2N
N OH
H N
DCC/DMAP
+ O
OH
N
OH
OH
o
piridin, 55 C 24 jam
O
O
OH
O O
O
6
6
N
RCOOH DCC/DMAP
H N OR
o
CH 2Cl 2, 25 C, 2 jam OH
O O
O
7 : R = PhCH2CH2CO8 : R = C5H11CO9 : R = C7H15CO-
Gambar 4 Reaksi sintesis senyawa 6-9 (Hanafi et al. 1997c)
Uji aktivitas antibiotika senyawa 1-5 terhadap pertumbuhan beberapa jenis spesies bakteri dan jamur dilakukan pada berbagai konsentrasi antara 100 sampai 2000 ppm dengan Antimisin A3 sebagai kontrol positif. Hasil uji aktivitas senyawa 1 menunjukkan aktivitas
dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Bacillus cereus, Arthrobacter simplex, dan Acetobacter aceti sampai konsentrasi 1000 ppm. Senyawa 2 aktif menghambat pertumbuhan bakteri A. simplex sampai konsentrasi 100 ppm. Senyawa 3 sampai dengan konsentrasi ≥ 500 ppm aktif terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, B. substilis, B. licheriformis, dan Mycobacterium
phlei. Uji aktivitas senyawa 6-9 menunjukkan bahwa
semakin panjang rantai alifatik pada gugus ester kemampuan dalam menghambat
pertumbuhan bakteri juga meningkat sampai dengan konsentrasi 100 ppm untuk senyawa 7, yaitu terhadap B. steorothermophillus. Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997d). Penelitian mengenai sintesis senyawa analog UK-3A oleh Sherley (1998), menghasilkan senyawa 10, 11, dan 12 (Gambar 5). Hasil uji aktivitas menyatakan bahwa senyawa 10 aktif menghambat pertumbuhan B. substilis, S. aereus, dan C. albicans pada konsentrasi 1000 ppmb sedangkan pada E. coli dapat dihambat pada 500 ppm. Senyawa 11 menghambat E. coli pada 250 ppm, B. substilis sampai 2000 ppm dan 1000 ppm aktif terhadap S. aereus dan C. albicans. Senyawa 12 aktif menghambat pertumbuhan E. coli dan C. albicans dengan konsentrasi 75 ppm dan 250 ppm terhadap B. substilis.
N
N
O
O H N
H N
O
O OH
OH
O O
O
10
R
O O
O
11 : R = C 6H5C 2H4 12 : R = C 7H15
Gambar 5 Senyawa 10, 11, dan 12 (Sherley 1998)
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dicoba untuk mensintesis senyawa analog UK-3A dengan memodifikasi panjang rantai alifatik pada gugus ester, yaitu dengan rantai pentil, heksil, dan heptil
kemudian melakukan uji
aktivitas senyawa hasil sintesis terhadap sel kanker Murine leukemia P-388.
Aktivitas Hayati Senyawa UK-3A Senyawa UK-3A telah diuji aktivitasnya sebagai antimikrob dan telah terbukti menghambat pertumbuhan khamir dan filamen fungi. Selain itu, sitotoksisitas senyawa UK-3A dan Antimisin A3 telah diuji secara in vitro terhadap sel murnine leukemia (P-388), mouse melanoma (B-16), human oral
epidermoid carcinomai (KB), human colon adenocarcinoma (COLO201), dan mouse fibroblast (3T3). Data hasil yang diperoleh, Antimisin A3 terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan IC 50 0,015-0,063 µg/mL, kecuali pada sel 3T3. Senyawa UK-2A dan UK-3A memperlihatkan hasil efek sitotoksisitas yang tidak signifikan dengan IC50 masing-masing 18-100 dan 17100 µg/mL (Ueki et al. 1997a). Uji aktivitas senyawa UK-3A sebagai antimikrob telah dilakukan oleh Ueki et al. (1997a). Hasil penelitian ini adalah senyawa UK-3A tidak memperlihatkan aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif sampai konsentrasi 100 µg/mL. Akan tetapi senyawa UK-3A dapat menghambat pertumbuhan beberapa jenis khamir dan filamen fungi. Data yang diperoleh merupakan perbandingan aktivitas senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3, yaitu spektrum antimikrob dari senyawa ini hampir mirip. Penelitian lain mengenai uji aktivitas senyawa UK-2A, UK-3A, dan analognya sebagai antifungal telah dilakukan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini tidak begitu memperlihatkan aktivitas antifungal yang tinggi karena baru memperlihatkan aktivitas sebagai antifungal pada konsentrasi > 100 µg/mL. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997a) mengenai fermentasi, isolasi, elusidasi struktur, dan uji aktivitas antibiotik senyawa UK-3A dari Streptomyces sp. 517-02. Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A3 (Ueki et al. 1997a) IC50 (µg/mL) Senyawa
P-388
UK-3A 38 UK-2A 100 Antimisin A 3 0,015 IC50 = Inhibition Concentration
B-16
KB
18 100 0,02
20 17 0,063
COLO201
3T3
45 35 0,018
100 100 15
Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah dilaporkan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini diujikan terhadap 3 macam sel kanker, yaitu sel human embrionic lung fibroblast (HEL), sel murine laukemia (P-388), dan sel mouse lymphoma (EL-4). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sitotoksik yang mirip dengan UK-2A, tetapi lebih rendah dari Antimisin A 3. Data hasil uji aktivitas sitotoksik dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Aktivitas sitotoksik (Shimano et al. 1998) ED50 (µg/mL) Organisme uji
UK-2A (7R)-UK-2A
HEL 74 P-388 37 EL-4 23 ED50 = Effective Dose
57 80 76
UK-3A (7R)-UK-3A Antimisin A3 38 14 7,6
51 74 > 100
12 < 0,05 < 0,05
Leukemia Leukemia merupakan salah satu jenis kanker yang terbentuk pada jaringan darah. Leukemia berasal dari bahasa Yunani, yang berarti darah putih. Leukemia pertama kali ditemukan pada tahun 1847 oleh Rudolf Virchow, seorang ahli patologi dari Jerman. Penemuan ini diawali dari adanya ketidaknormalan jaringan pada sumsum tulang belakang. Kelainan ini disebabkan oleh mutasi DNA (Princeton University 2001). Sel leukemia dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Sel kanker leukemia (Princeton University 2001)
Sel sumsum tulang belakang berfungsi untuk memproduksi sel darah merah dan sel darah putih, yang masing-masing sebagai pembawa oksigen dan melawan penyakit yang menyerang tubuh. Adanya kelainan pada sumsum tulang
belakang akan menyebabkan produksi sel darah merah dan sel darah putih mengalami kelainan Leukemia dapat dikelompokkan berdasarkan banyaknya sel yang tidak normal yang terdapat dalam darah. Pengelompokan ini terdiri atas 4, yaitu acute lymphocytic leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), dan chronic myelogenous leukemia (CML). Ciri leukemia akut dapat dilihat dari laju pertumbuhan sel darah yang belum matang dan akan lebih cepat mati, yaitu antara 1 sampai 5 bulan. Leukemia kronis dapat dibedakan berdasarkan adanya kelebihan jumlah sel darah yang telah matang, tetapi tidak normal. Sel ini akan hidup lebih lama dan jumlah sel darah putih yang terbentuk dalam darah sangat banyak (ICON Group International, 2004).
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilaksanakan selama 6 bulan, mulai bulan Februari sampai Agustus 2007 bertempat di Laboratorium Bahan Alam Pangan dan Farmasi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Puspiptek Serpong dan Laboratorium Kimia Organik, Institut Teknologi Bandung (ITB).
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spektrofotometer inframerah (FT-IR) Perkin Elmer, FT-NMR 500 MHz, kromatografi cair spektrometri massa (LC-MS), inkubator CO 2, mikroskop, freezer -80°C, laminar flow, sentrifus 1200-1300 rpm, microplate mixer, microplate reader, lampu UV, pipet multichannel. Bahan yang digunakan antara lain asam 3-hidroksipikolinat (Aldrich 15,230-7 p.a.), L-serin metil ester hidroklorida (Sigma S 5125 p.a.), ninhidrin, asam pentanoat, asam heksanoat (Sigma C 2250 p.a.), asam heptanoat, disikloheksilkarbodiimida (DCC, Sigma D3128 p.a.), dimetil amino piridin (DMAP, Sigma D5640 p.a.), pelat kromatografi lapis tipis (KLT, Merck GF254 0,25 mm), silika gel, cell line Murine leukemia P-388, media RPMI 1640, fetal bovine
serum
(FBS),
kanamisin
sulfat,
3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-
difeniltetrazolium bromida (MTT), dan natrium deodesil sulfat (SDS).
Prosedur Sintesis tahap 1: pembentukan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester Senyawa
3-hidroksipikolinil
serin
metil
ester
disintesis
dengan
menyediakan sebuah labu dua-leher, kemudian diisi dengan 0,139 g 3hidroksipikolinat (0,001 mol), 0,454 g aktivator DCC (0,0022 mol), dan 0,049 g katalis DMAP (0,0004 mol). Ke dalam labu ditambah dengan 0,311 g L-serin metil ester hidroklorida (0,002 mol). Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 mL pelarut piridin melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55°C selama 24 jam (Hanafi et al. 1997d). Selama refluks
dan setelah reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n-heksana:etil asetat (1:1) untuk mengetahui hasil senyawa yang terbentuk. Penggunaan DCC menyebabkan hasil samping berupa disikloheksil urea (DCU) yang berwujud serbuk putih dan mengganggu pada proses pemurnian. Oleh karena itu, setelah reaksi selesai tambahkan air, kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi dengan dengan diklorometana dan NAOH 1% sebanyak 3 sampai 4 kali untuk menghilangkan sisa asam. Fase organik dicuci beberapa kali untuk menghilangkan piridin yang tersisa. Pemurnian dilakukan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak nheksana:etil asetat secara bergradien. Produk yang diperoleh ditimbang dan ditentukan titik lelehnya. Senyawa hasil 3-hidroksipikolinil serin metil ester yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1H-NMR, dan 13C-NMR.
Sintesis tahap 2: pembentukan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester
(a),
3-hidroksipikolinil
serin
metil
heksil
ester
(b),
dan
3-
hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) Reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3- hidroksipikolinil serin heptil ester (c) dilakukan dengan menyediakan 3 buah labu-dua leher, kemudian masingmasing diisi dengan 0,096 g 3-hidroksipikolinil serin metil ester (0,0004 mol), 0,248 g aktivator DCC (0,0012 mol), dan 0,024 g katalis DMAP (0,0002 mol). Labu I ditambah dengan 0,065 mL asam pentanoat (0,0006 mol), labu II ditambah 0,075 mL asam heksanoat (0,0006 mol), dan labu III ditambah dengan 0,083 mL asam heptanoat (0,0006 mol). Setiap labu selanjutnya ditambah 10 mL pelarut kloroform. Labu reaksi dialiri dengan gas nitrogen yang berfungsi untuk mengusir gas oksigen yang dapat mengganggu dalam reaksi esterifikasi. Reaksi dilakukan pada suhu ruang selama 4 jam sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Produk yang terbentuk dianalisis menggunakan KLT dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat (3:1). Hasil reaksi dikeringkan dengan menggunakan
rotavapor.
Produk
yang
telah
kering
dilarutkan
dalam
diklorometana, kemudian disaring untuk memisahkan DCU sebagai hasil samping dari penggunaan DCC. Filtrat ditambah dengan Na 2CO 3 untuk menghilangkan sisa asam dengan membentuk garam, kemudian garam yang terbentuk dipisahkan dengan
penyaringan.
Filtrat
dikeringkan
dan
dimurnikan
menggunakan
kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat secara bergradien. Produk yang diperoleh ditimbang, ditentukan titik lelehnya, dan diidentifikasi menggunakan spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1HNMR, dan 13C-NMR. Rendemen hasil sintesis dapat diperoleh dengan perhitungan:
% Rendemen =
Bobot hasil sintesis × 100% Bobot teor etis
Identifikasi Spektrum FT-IR dari senyawa hasil reaksi diukur dalam bentuk pelet KBr dengan menggunakan instrumen FT-IR spektrofotometer Perkin Elmer. Spektrum NMR diukur menggunakan instrumen NMR, Unity Inova Variant, 500 MHz. Nilai geseran kimia (δ) suatu sinyal diukur dalam satuan ppm. Pengukuran pada 1
H-NMR dan
13
C-NMR menggunakan pelarut kloroform (CDCl 3) dan sebagai
standar dalam digunakan tetrametilsilana (TMS) yang memberi nilai geseran kimia pada δ 0,0 ppm. Kromatografi lapis tipis (KLT) analitik dilakukan menggunakan plat KLT silika gel Merck GF254 dengan ketebalan 0,25 mm. Identifikasi pemisahan spot KLT menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm, kemudian dideteksi menggunakan pereaksi warna ninhidrin dan dipanaskan pada suhu 100-150°C. Kromatografi kolom dilakukan menggunakan fase diam silika gel Merck dengan ukuran 70-230 mesh.
Uji aktivitas antikanker secara in vitro terhadap sel murine leukemia P-388 Sel kanker Murine leukemia P-388 dengan pertumbuhan pada fase logaritma, dilarutkan dalam tabung kultur dengan jumlah sel sekitar 3 × 103 sel/mL dalam media RPMI 1640. Sel diinokulasikan dalam microplate 96 lubang dasar rata dan dikultivasi dalam inkubator CO2 selama 24 jam untuk menumbuhkan sel. Hari kedua dilakukan penambahan sampel yang dilarutkan dalam pelarut DMSO. Sampel diencerkan dengan menambahkan larutan bufer fosfat (PBS) pH (7,30–7,65). Sampel dengan konsentrasi yang beragam ditambahkan ke dalam sel dalam microplate lalu dikocok dengan microplate mixer dan disimpan kembali dalam inkubator CO 2. Sebagai kontrol negatif digunakan DMSO dan
kontrol
positif digunakan senyawa standar cis-platin. Sel diinkubasi selama 48 jam, kemudian ditambahkan reagen MTT [3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] dan dikocok menggunakan microplate mixer. Inkubasi dilanjutkan selama 4 jam, kemudian ditambahkan stop solution (SDS) dan dikocok dengan baik tanpa meninggalkan busa yang mengganggu dalam pengamatan. Inkubasi dilanjutkan kembali selama 24 jam. Pengukuran rapatan optis (OD) dilakukan dengan microplate reader, 24 jam setelah penambahan SDS. Nilai IC 50 dilihat dari grafik hubungan antara konsentrasi senyawa bahan uji (µg/mL) dan intensitas larutan setelah perlakuan dengan bahan uji. Apabila dilihat di bawah mikroskop, sel hidup berbentuk bulat dengan warna biru, sedangkan sel mati berbentuk tidak teratur. IC 50 merupakan konsentrasi yang diperlukan untuk penghambatan pertumbuhan sel sebesar 50%. Uji aktivitas antikanker ini dilakukan dengan tiga kali ulangan (Alley et al. 1988 diacu dalam Sahidin et al. 2005).
HASIL DAN PEMBAHASAN Senyawa Analog UK-3A
Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester Rendemen sintesis senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester dari asam 3-hidroksi pikolinat dan L-serin metil ester sebagai material awal adalah 42,4%. Rendemen produk reaksi senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester yang dilakukan pada penelitian sebelumnya sebesar 68,4% (Hanafi et al. 1997b) dan 61,2% (Arifin 2007). Reaksi ini berlangsung pada kondisi optimum, yaitu pada suhu 55°C selama 24 jam menggunakan aktivator disikloheksilkarbodiimida (DCC), katalis dimetil amino piridin (DMAP), dan pelarut piridin (Hanafi et al. 1997d). Reaksi sintesis senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester dalam penelitian ini menghasilkan rendemen yang masih rendah karena reaksi belum sempurna. Hal ini dibuktikan dengan hasil analisis kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (1:1) yang memperlihatkan adanya 4 spot yang menunjukkan masih ada hasil samping reaksi dan sisa reaktan yang belum bereaksi. Nilai Rf dari keempat spot dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3. Nilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 1 Spot
Rf
Keterangan
1
0
3-hidroksipikolinat
2
0,176
3-hidroksi pikolinil serin metil ester
3
0,544
produk samping
4
0,882
produk samping
Spot produk senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester merupakan spot paling dominan dengan Rf 0,176. Spot produk ini berupa spot berwarna ungu, mirip dengan spot standar 3-hidroksi pikolinat, tetapi spot senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester ini memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dibanding spot standar 3-hidroksipikolinat karena bersifat lebih nonpolar. Spot dengan Rf 0 merupakan bahan baku 3-hidriksipikolinat yang tersisa karena tidak bereaksi. Spot
dengan Rf 0,544 dan Rf 0,882 merupakan produk samping reaksi. Produk samping reaksi dapat terbentuk karena adanya reaksi yang tidak spesifik, sehingga terjadi reaksi pada gugus aktif lain yang tidak diinginkan (Arifin 2007). Reaksi sintesis tahap 1 merupakan reaksi amidasi yang diajukan mengikuti mekanisme seperti pada Gambar 7. +
N
C6H11 N N
..
H
N
O ..
C
DMAP C6H11
N NH O N
OH
C
O C6H11
3-hidroksipikolinat
OH
O
H+
N
DCC C6H11
+
+
N
N
H O
ClH:N
N
+
C6H11
H N
H N
C
N
OH
C6H11
N
H N
O
CH3 O
DCU
O
O
L-serin metil ester hidroklorida OH
OH
+
N
+ N
(-) N
N
.. N
H N
DMAP
H N
N
OH
OH OH
O_ CH3 O
O
O
CH3 O
O
3-hidroksipikolinil serin metil ester
OH
Gambar 7 Usulan mekanisme reaksi sintesis tahap 1
Hasil reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester sebelum pemurnian berupa larutan berwarna coklat bercampur dengan padatan putih disikloheksil urea (DCU) yang merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC (March 1992). Hasil reaksi dipisahkan dari DCU dengan penyaringan. Flitrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporator. Hasil reaksi dilarutkan dalam diklorometana, kemudian ditambahkan 1% NaOH untuk menetralkan HCl yang dilepaskan dari L-setin metil ester hidroklorida. NaOH juga berfungsi mengikat asam pikolinat yang
tersisa
sehingga
membentuk
garam.
Larutan
diekstraksi
menggunakan
diklorometana dan air agar sisa pelarut piridin, DMAP, garam NaCl, dan garam pikolinat yang bersifat polar akan larut dalam air dan produk reaksi larut dalam diklorometana (Hanafi et al. 1997d). Senyawa
hasil
samping
dipisahkan
dari
produk
senyawa
3-
hidroksipikolinil serin metil ester dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat secara bergradien. Fraksifraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,176 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh 90-91°C. Kristal tersebut dapat dikatakan murni karena dalam analisis menggunakan KLT menunjukkan 1 spot. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester memiliki jarak leleh yang sempit, yaitu sebesar 1°C yang menunjukkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester hasil sintesis ini merupakan senyawa yang telah murni karena senyawa organik dikatakan murni jika jarak lelehnya sempit, yaitu antara 0,5-2°C (Cheronis 1963 diacu dalam Arsianti 1998). Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester hasil sintesis penelitian terdahulu memiliki titik leleh 90-91°C (Arifin 2007). Analisis menggunakan LC-MS terhadap senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menghasilkan 1 puncak pada kromatogram dengan area 10635 (Lampiran 1). Kemurnian senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester mendekati 100% karena tidak terdapat puncak lain yang memiliki area yang cukup berarti pada kromatogram. Puncak dominan ini muncul pada waktu retensi 4,02 menit (T4.0). Spektrum massa menghasilkan nilai bobot molekul (m/z) sebesar 240,887 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Nilai bobot molekul hasil pengukuran senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester pada penelitian sebelumnya adalah 240,270 g/mol dengan kemurnian senyawa mendekati 100 % (Arifin 2007). Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal (Lampiran 2) menunjukkan pita-pita serapan antara lain pada bilangan gelombang 3350 cm-1 yang merupakan serapan lebar dari vibrasi ulur OH, bilangan gelombang 1743 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur gugus karbonil (C=O) ester, dan 1448 cm-1 merupakan vibrasi tekuk C-O (Silverstein et al. 1986).
Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis 3-hidroksipikolinil serin metil ester menunjukkan pita serapan baru pada 1634 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari amida dan serapan ganda pada 3360-3414 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur NH dari amida (Silverstein et al.1986). Hasil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur karbonil (C=O) ester pada 1735 cm1
dan serapan pada 3186 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur OH (Lampiran 2).
Hasil analisis FT-IR ini menunjukkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester telah terbentuk karena adanya serapan-serapan baru yang menunjukkan ada gugus amida yang tidak terdapat pada spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal. Hasil analisis FT-IR ini juga sesuai dengan spektrum FT-IR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester yang pernah dilakukan sebelumnya (Hanafi et al. 1997b). Spektrum hasil analisis senyawa
3-hidroksipikolinil serin metil ester
1
menggunakan spektrometer H-NMR (Lampiran 3) dan
13
C-NMR (Lampiran 4)
dapat ditunjukkan dalam Tabel 4 dan menggunakan panduan Gambar 8. 5
6
N H N
2
4 3
3' 2'
OH
OH
1'
O O
O
1"'
Gambar 8 Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
Tabel 4 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan
13
C-NMR untuk senyawa
3-hidroksipikolinil serin metil ester (CDCl 3, 500 MHz) Pergeseran Kimia (δ, ppm) 13 H-NMR (J dalam Hz) C-NMR 3,83 (s, 3H, OCH 3) 53,16 170,48 4,83 (dt, 1H, CH, J = 3,7; 7,3) 54,37 4,06 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 63,36 4,13 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 2,55 (t,1H, 3’-OH, J = 6,1) 8,72 (d, 1H, CONH, J = 7,3) 169,14 131,08 157,99 7,31 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 4,3) 126,39 7,36 (dd, 1H, CH, J = 4,3; 1,3) 129,21 8,10 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 1,3) 140,09 11,69 (s, 1H, 3-OH) 1
C/H 1’’’ 1’ 2’ 3’ 3’-OH CONH 2 3 4 5 6 3-OH
Pembentukan amida pada hasil reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester didukung oleh data spektrum 1H-NMR (500 MHz, CDCl 3), yaitu dengan munculnya sinyal pada geseran kimia
8,72 (d, CONH, J
7,3) yang
menunjukkan proton pada gugus amida. Proton aromatik pada cincin pikolinat ditunjukkan oleh sinyal pada 7,31 (dd, 1H, H-4, J 8,6; 4,3), 7,36 (dd, 1H, H-5, J 4,3; 1,3), dan 8,10 (dd, 1H, H-6, J 8,6; 1,3). Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-5, yaitu 1,3 Hz merupakan tetapan kopling untuk proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta yang kisaran tetapan koplingnya adalah 1-5 Hz. Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-4 adalah 8,6 Hz yang ada dalam kisaran 1 sampai 9 Hz yang merupakan tetapan kopling untuk proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan para. Tetapan kopling untuk H-5 terhadap H-4 sebesar 4,3 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling untuk posisi meta dan para, yaitu 1-6 Hz (Jenie et al. 2006). Sinyal pada 4,83 (dt, 1H, CH, J 3,7; 7,3), 4,06 (dd, 1H, CH2, J 3,7; 11,6 ), 4,13 (dd, 1H, CH2, J 3,7; 11,6), 3,83 (s, 3H, OCH3), dan 2,55 (t,1H, 3’-OH, J 6,1) menunjukkan adanya serin metil ester. Spektrum
13
C-NMR yang mendukung data terbentuknya gugus amida
pada produk senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester antara lain sinyal pada 169,14 ppm yang merupakan geseran kimia untuk karbon CONH. Cincin pikolinat C2-C5 ditunjukkan oleh geseran kimia karbon pada 129,21-157,99 ppm.
Karbon-karbon pada serin metil ester memiliki nilai geseran kimia C1’-C3’ berturut-turut pada 170,48; 54,37; dan 63,36 ppm, serta C1”’ pada 53,16 ppm yang merupakan geseran kimia gugus metoksi. Nilai geseran kimia 1H-NMR dan 13
C-NMR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester ini sesuai dengan geseran
kimia senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester penelitian sebelumnya (Arifin 2007). Geseran kimia senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester ini telah dikonfirmasi strukturnya dan diestimasi 1H-NMR dan
13
C-NMR menggunakan
program ChemDraw Ultra 5.0.
Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) Reaksi sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa a, b, dan c dilakukan dengan mereaksikan senyawa hasil sintesis tahap pertama, yaitu 3-hidroksipikolinil serin metil ester dengan asam pentanoat untuk membentuk senyawa a, asam heksanoat untuk membentuk senyawa b, dan asam heptanoat untuk membentuk senyawa c. Rendemen hasil sintesis dari ketiga senyawa ini secara berturut-turut sebesar 32,2; 36,4; dan 38,8%. Rendemen sintesis tahap kedua masih rendah, hal ini disebabkan reaksi tidak berjalan sempurna dan dibuktikan dari adanya spot bahan awal, yaitu senyawa 3hidroksipikolinil serin metil ester masih tersisa. Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c dapat dilihat pada Gambar 9. Perpanjangan rantai ester pada sintesis a, b, dan c ini dilakukan untuk menggantikan cincin dilakton, sementara cincin dilakton merupakan gugus yang berperan dalam aktivitas hayati senyawa UK-3A (Hanafi 1997a). Perpanjangan rantai ini bertujuan mendapatkan senyawa yang lebih aktif dengan cara meningkatkan lipofilitas senyawa. Lipofilitas senyawa akan berpengaruh pada kemampuan senyawa dalam menembus dinding sel kanker yang tersusun dari fosfolipid yang bersifat nonpolar (Hanafi et al. 1999).
+ C6 H11
R
H
N
O
C
N
N
C6 H 11
N
DMAP
O
-
..
C6 H11 R
DCC
NH
O
..
O
C N
+
H+
C6 H 11
N
+ N
N
O
+ N
C6 H11
H N
C
H N
R
H N
H
C 6H 11
DCU
..O
N
O
H 3C
O O
R
OH
O
O
+
+
N
N
(-) N
:O .. :
-
N
N
N
R
-
O H N
DMAP
H N
O
O H 3C
O O
O
OH
OH
O
R
CH 3 O
O
a : R = C4 H9 b : R = C5H11 c : R = C6 H13
Gambar 9 Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c
Analisis KLT terhadap produk reaksi, yaitu senyawa a, b, dan c menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (3:1) menunjukkan reaksi yang belum sempurna yang dapat dilihat dari munculnya 2 spot untuk setiap hasil reaksi (Tabel 5).
Tabel 5 Nilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 2 Produk sintesis Senyawa a
Senyawa b
Senyawa c
Rf
Keterangan
Spot ke-1 = 0,088
3-hidroksipikolinil serin metil ester
Spot ke-2 = 0,440
produk senyawa a
Spot ke-1 = 0,088
3-hidroksipikolinil serin metil ester
Spot ke-2 = 0,500
produk senyawa b
Spot ke-1 = 0,088 Spot ke-2 = 0,557
3-hidroksipikolinil serin metil ester produk senyawa c
Spot senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester sebagai bahan awal ditunjukkan oleh spot dengan nilai Rf 0,088. Produk reaksi, yaitu senyawa a, b, dan c secara berturut-turut memiliki nilai Rf 0,440; 0,500; dan 0,557. Nilai Rf produk reaksi ini cenderung semakin meningkat karena kepolaran senyawa semakin menurun. Hasil analisis KLT terhadap senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1) yang dilakukan pada penelitian sebelumnya menunjukkan nilai Rf 0,175. Hasil sintesis terdahulu, yaitu senyawa β-hidroksi pikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) yang memiliki struktur mirip dengan senyawa a, b, dan c, hanya berbeda pada panjang rantai alifatik pada gugus ester memiliki nilai Rf 0,75 menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1) (Arifin 2007). Hasil reaksi sintesis senyawa a berupa larutan berwarna kuning jernih, senyawa b berupa larutan jernih, dan c berupa larutan kuning jernih. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom kromatografi dan menghasilkan senyawa a yang berupa seperti minyak (oily) berwarna kuning jernih, senyawa b berupa minyak berwarna kuning, dan c berupa minyak berwarna putih. Hasil analisis LC-MS senyawa a menunjukkan adanya 1 puncak, b muncul 2 puncak, dan c muncul 2 puncak. Puncak senyawa a muncul pada kromatogram pada waktu retensi 6,04 menit (T6.0) dengan area sebesar 17526,44 yang merupakan produk senyawa a. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 324,89 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa a, muncul pada serapan spektroskopi massa. Kemurnian senyawa hasil sintesis mendekati 100 %. Kromatogram senyawa a memperlihatkan tidak ada puncak lain yang
berarti dan hanya ada 1 puncak dominan. Kromatogram senyawa b menunjukkan adanya 2 puncak. Puncak dominan pada kromatogram senyawa b muncul pada waktu retensi 7,56 menit (T7.4) dengan area sebesar 70020,0 yang merupakan produk senyawa b. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 338,91 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa b. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 11,77 menit (T11.7) dengan area sebesar 20258,1 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa pada produk. Senyawa yang muncul pada puncak kedua ini memiliki nilai bobot molekul (m/z) sebesar 323,04 g/mol. Kemurnian senyawa hasil sintesis adalah sebesar 77,56%. Kromatogram senyawa c memperlihatkan adanya 2 puncak. Puncak dominan senyawa c muncul pada waktu retensi 8,13 menit (T8.0) dengan area sebesar 56656,2 yang merupakan produk c. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 352,96 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa c. Puncak kedua muncul pada waktu retensi retensi 14,59 menit (T14.4) dengan area 2038,6 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa pada produk. Senyawa pengotor ini memiliki bobot molekul (m/z) sebesar 337,09 g/mol. Kemurnian senyawa hasil sintesis c cukup tinggi, yaitu sebesar 96,53%. Spektrum FT-IR untuk senyawa a, b, dan c (Lampiran 2) memiliki kemiripan karena semua gugus fungsi yang terdapat dalam ketiga senyawa ini sama. Spektrum FT-IR untuk a menunjukkan pita serapan pada 1745 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari ester, 1653 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari amida, dan serapan tunggal pada 3371 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur NH dari amida sekunder. Hasil analisis juga menunjukkan adanya vibrasi ulur CH alifatik pada 2958-2870 cm-1. Spektrum FT-IR senyawa b menunjukkan pita serapan pada 1745 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) dari ester, vibrasi pada 1651 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) pada gugus amida, dan serapan tunggal pada 3327 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur NH dari amida sekunder. Hasil analisis senyawa b juga menunjukkan adanya vibrasi ulur CH alifatik pada
2933-2860cm-1 yang menunjukkan
terbentuknya rantai alifatik pada ester yang baru. Spektrum FT-IR untuk senyawa c menunjukkan pita serapan
pada 1747 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur
karbonil (C=O) dari ester, 1653 cm-1 merupakan vibrasi ulur karbonil (C=O) pada
amida, dan serapan tunggal pada 3375 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur NH dari amida sekunder. Hasil analisis juga menunjukkan adanya vibrasi ulur CH alifatik pada 2954-2858 cm-1 (Silverstein et al. 1986). Pembentukan senyawa a, b, dan c ditunjukkan oleh hilangnya serapan OH pada 3186 cm-1 pada spektrum senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester karena OH pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
telah teresterifikasi oleh asam pentanoat, heksanoat, dan
heptanoat. Spektrum hasil analisis FT-IR senyawa a, b, dan c memiliki kemiripan dengan spektrum senyawa β-hidroksipikolinil serin metil oktanoil ester (PSMOE) yang telah disintesis pada penelitian sebelumnya (Arifin 2007) dan senyawa 3 (Hanafi et al. 1999). Senyawa PSMOE dan senyawa 3 memiliki struktur yang mirip dan gugus fungsi yang sama dengan senyawa a, b, dan c. Spektrum hasil analisis senyawa produk sintesis tahap kedua, yaitu senyawa a, b, dan c menggunakan spektrometer 1H-NMR (Lampiran 3) dan
13
C-
NMR (Lampiran 4), yang membantu dalam menganalisis struktur produk reaksi yang terbentuk. Data hasil pengukuran terhadap senyawa a menggunakan NMR dapat dilihat pada Tabel 6 yang disertai dengan gambar struktur a (Gambar 10). 5 4
6
N
O H N
2 3
2'' 2'
OH
3'
O
1''
4" 3''
5"
1'
O O
O
1"'
Gambar 10 Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a)
Tabel 6 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan
13
C-NMR untuk senyawa
a (CDCl 3, 500 MHz) Pergeseran Kimia (δ, ppm) 13 H-NMR (J dalam Hz) C-NMR 168,83 2,33 (t, 2H, CH2, J = 7,3) 31,13 1,28 26,98 (m, 4H, CH 2, J = 7,3) 1,24 22,37 0,88 (t, 3H, CH3, J = 7,3) 13,76 3,82 (s, 3H, OCH 3) 53,10 169,40 5,01 (dt, 1H, CH, J = 3,7; 7,3) 51,43 4,49 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 63,54 4,56 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 8,66 (d, 1H, CONH, J = 8,5) 173,44 130,95 157,93 7,32 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 4,3) 126,24 7,37 (dd, 1H, CH, J = 4,3; 1,3) 129,11 8,12 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 1,3) 140,00 11,68 (s, 1H, 3-OH) 1
C/H 1” 2” 3” 4” 5” 1’’’ 1’ 2’ 3’ -CONH 2 3 4 5 6 3-OH
Gugus ester baru yang terbentuk pada senyawa a yang merupakan hasil reaksi esterifikasi senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan asam pentanoat didukung oleh data spektrum 1H-NMR yang ditunjukkan oleh hilangnya sinyal pada geseran kimia proton 3-OH, yaitu 2,55 (t,1H, 3’-OH, J 6,1) pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester dan munculnya sinyal baru pada geseran kimia proton alifatik C2” pada 2,33 (t, 2H, CH2, J 7,3), C3”- C4” pada 1,24-1,28 (m, 4H, CH2, J 7,3) dan C5” pada 0,88 (t, 3H, CH3, J 7,3). Tetapan kopling proton alifatik ini sebesar 7,3 Hz, sesuai tetapan proton alifatik pada umumnya yang berkisar 6,5-7,5 Hz (Jenie et al. 2006). Geseran kimia proton-proton lainnya pada senyawa a hampir sama dengan nilai geseran kimia pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester karena perubahan struktur hanya terjadi pada gugus OH pada serin menjadi gugus ester. Spektrum
13
C-NMR yang mendukung terbentuknya senyawa a adalah
adanya sinyal pada geseran kimia karbon alifatik pada gugus ester yang baru. Rantai alifatik pada gugus ester ini ditunjukkan oleh geseran kimia C1”-C5” berturut-turut pada 168,83; 31,13; 26,98; 22,37; dan 13,76 ppm. Geseran kimia
karbon-karbon yang lain pada senyawa a mirip dengan geseran kimia karbonkarbon pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Data hasil pengukuran terhadap senyawa b menggunakan NMR dapat dilihat pada Tabel 7 yang disertai dengan gambar struktur b (Gambar 11). 5
6
4
N
O H N
2 3
3' 2'
OH
O
1"
2"
3"
4"
5"
6"
1'
O O
O
1'"
Gambar 11 Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b) Tabel 7 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan
13
C-NMR untuk senyawa
b (CDCl 3, 500 MHz) C/H 1” 2” 3” 4” 5” 6” 1’’’ 1’ 2’ 3’ -CONH 2 3 4 5 6 3-OH
Pergeseran Kimia (δ, ppm) 13 H-NMR (J dalam Hz) C-NMR 168,82 2,32 (t, 2H, CH2, J = 7,4) 34,06 1,29 31,25 1,28 (m, 6H, CH 2, J = 7,4) 24,62 1,25 22,37 0,86 (t, 3H, CH3, J = 7,4) 13,93 3,82 (s, 3H, OCH 3) 51,40 169,40 5,01 (dt, 1H, CH, J = 3,7; 7,3) 53,10 4,49 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,4) 63,53 4,57 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,4) 8,66 (d, 1H, CONH, J = 7,95) 173,45 130,95 157,94 7,32 (dd, 1H, CH, J = 8,5; 4,3) 126,24 7,37 (dd, 1H, CH, J = 4,3; 1,6) 129,10 8,11 (dd, 1H, CH, J = 8,5; 1,6) 140,00 11,68 (s, 1H, 3-OH) 1
Gugus ester baru yang terbentuk pada senyawa b yang merupakan hasil reaksi esterifikasi senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan asam heksanoat didukung oleh data spektrum 1H-NMR yang ditunjukkan oleh hilangnya sinyal pada geseran kimia proton 3-OH, yaitu 2,55 (t,1H, 3’-OH, J 6,1) pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester dan munculnya sinyal baru pada geseran kimia proton alifatik C2” pada 2,32 (t, 2H, CH2, J 7,4), C3”- C5”
pada 1,25-1,29 (m, 6H, CH2, J 7,4), dan C6” pada 0,86 (t, 3H, CH3, J 7,4). Tetapan kopling proton alifatik ini sebesar 7,4 Hz sesuai dengan tetapan proton alifatik pada umumnya, yaitu berkisar 6,5-7,5 Hz (Jenie et al. 2006). Geseran kimia proton-proton lainnya pada senyawa b hampir sama dengan nilai geseran kimia pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
karena perubahan
struktur hanya terjadi pada gugus OH pada serin menjadi gugus ester. Spektrum
13
C-NMR yang mendukung terbentuknya senyawa b adalah
adanya sinyal pada geseran kimia karbon alifatik pada gugus ester yang baru. Rantai alifatik pada gugus ester ini ditunjukkan oleh geseran kimia C1”-C6” berturut-turut pada 168,82; 34,06; 31,25; 24,62; 22,37; dan 13,93 ppm. Geseran kimia karbon-karbon yang lain pada senyawa b mirip dengan geseran kimia karbon-karbon pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Data hasil pengukuran terhadap senyawa c menggunakan NMR dapat dilihat pada Tabel 8 yang disertai dengan gambar struktur c (Gambar 12). 5
6
N
O H N
2
4 3
2'' 3' 2'
OH
O
1''
4" 3''
5"
6"
7"
1'
O O
O
1"'
Gambar 12 Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c)
Tabel 8 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1H-NMR dan
13
C-NMR untuk senyawa
c (CDCl 3, 500 MHz) C/H 1” 2” 3” 4” 5” 6” 7” 1’’’ 1’ 2’ 3’ -CONH 2 3 4 5 6 3-OH
Pergeseran Kimia (δ, ppm) 13 H-NMR (J dalam Hz) C-NMR 168,86 2,32 (t, 2H, CH2, J = 7,3 ) 34,13 1,29 31,54 1,27 31,08 (m, 8H, CH 2, J = 7,3) 1,26 24,92 1,25 22,55 0,84 (t, 3H, CH3, J =7,3) 14,15 3,80 (s, 3H, OCH 3) 53,15 169,44 4,99 (dt, 1H, CH, J = 3,7; 7,3) 51,43 4,47 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 63,57 4,56 (dd, 1H, CH2, J = 3,7; 11,6) 8,65 (d, 1H, CONH, J = 8,6) 173,52 130,96 157,97 7,30 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 4,3) 126,28 7,35 (dd, 1H, CH, J = 4,3; 1,2) 129,16 8,09 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 1,2) 140,05 11,67 (s, 1H, 3-OH) 1
Gugus ester baru yang terbentuk pada senyawa c yang merupakan hasil reaksi esterifikasi senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan asam heptanoat didukung oleh data spektrum 1H-NMR yang ditunjukkan oleh hilangnya sinyal pada geseran kimia proton 3-OH, yaitu 2,55 (t,1H, 3’-OH, J 6,1) pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester dan munculnya sinyal baru pada geseran kimia proton alifatik C2” pada (t, 2H, CH2, J 7,3 ) C3”- C6” pada 1,25-1,29 (m, 8H, CH2, J 7,3) dan C7” pada 0,84 (t, 3H, CH3, J 7,3). Tetapan kopling proton alifatik ini sebesar 7,3 Hz sesuai dengan tetapan proton alifatik, yaitu berkisar 6,5-7,5 Hz (Jenie et al. 2006). Geseran kimia proton-proton lainnya pada senyawa c hampir sama dengan nilai geseran kimia pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester karena perubahan struktur hanya terjadi pada gugus OH pada serin menjadi gugus ester. Spektrun 1H-NMR memperlihatkan adanya geseran kimia pada 2,18 ppm (s, 3H) yang merupakan geseran kimia untuk proton pada aseton.
Spektrum
13
C-NMR yang mendukung terbentuknya senyawa c adalah
adanya sinyal pada geseran kimia karbon alifatik pada gugus ester yang baru. Rantai alifatik pada gugus ester ini ditunjukkan oleh geseran kimia C1”-C7” berturut-turut pada 168,86; 34,13; 31,54; 31,08; 24,92; 22,55; dan 14,15 ppm. geseran kimia karbon-karbon yang lain pada senyawa c mirip dengan geseran kimia karbon-karbon pada senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Hasil spektrum 13C-NMR senyawa c (Lampiran 4) juga memperlihatkan geseran kimia atom karbon pada 28,83 ppm dan 207,29 ppm yang masing-masing merupakan geseran kimia untuk karbon pada CH 3 dan karbonil pada pelarut aseton (Jenie et al. 2006). Pelarut aseton dalam analisis ini yang digunakan untuk membersihkan tube sampel, sehingga kemungkinan masih tersisa dan terdeteksi oleh alat. Spektrum 1H-NMR untuk senyawa a, b, dan c (Lampiran 3) juga menunjukkan geseran kimia masing-masing pada 1,61 ppm (s, 4H), 1,60 ppm (s, 8H), dan 1,60 ppm (m, 2H)
yang merupakan geseran kimia untuk proton H2O
terhadap pelarut CDCl 3. Hal ini menunjukkan masih adanya air yang terdapat dalam senyawa produk reaksi. Keberadaan air dapat menghidrolisis senyawa produk sintesis sehingga perlu dihilangkan. Pelarut CDCl 3 ditunjukkan oleh sinyal pada 7,26 (s, 1H) pada spektrum 1H-NMR dan geseran kimia pada 77,09-77,19 ppm pada spektrum 13C-NMR. Geseran kimia 1H-NMR dan
13
C-NMR pada struktur senyawa a, b, dan c
telah dikonfirmasi menggunakan program ChemDraw Ultra 5.0 dan menghasilkan data geseran kimia yang sesuai. Spektrum NMR senyawa PSMOE yang dihasilkan pada penelitian terdahulu (Arifin 2007) dan memiliki struktur yang mirip dengan senyawa a, b, dan c digunakan sebagai pembanding.
Aktivitas Senyawa Analog UK-3A Hasil uji sitotoksisitas senyawa analog UK-3A hasil sintesis sebagai antikanker dilakukan secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 dapat dilihat pada Tabel 9.
Tabel 9 Aktivitas senyawa a, b, c,
dan UK-3A terhadap sel kanker Murine
leukemia P-388 Senyawa a b c cis-platin UK-3A (Ueki et al. 1997a)
IC 50 (µg/mL) 39,0 51,0 82,0 12,0 38,0
Senyawa cis-platin sebagai kontrol positif memperlihatkan aktivitas yang cukup tinggi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P-388 jika dibandingkan dengan senyawa analog UK-3A, yaitu dengan nilai IC 50 sebesar 12 µg/mL. Senyawa analog UK-3A hasil sintesis, yaitu senyawa a memiliki aktivitas yang hampir sama dengan senyawa induk UK-3A, sedangkan senyawa b dan c menunjukkan aktivitas yang lebih rendah dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P-388 (Lampiran 5). Pembukaan cincin dilakton beranggota sembilan pada senyawa UK-3A menjadi diester pada senyawa a tidak berpengaruh terhadap aktivitasnya. Pembukaan cincin dilakton beranggota sembilan pada UK-3A menjadi senyawa b dan c menurunkan aktivitas senyawa. Penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa pembukaan cincin dilakton beranggota sembilan pada UK-2A meningkatkan aktivitas senyawa (Usuki 2006) tidak berlaku pada senyawa b dan c. Aktivitas senyawa hasil sintesis juga semakin menurun dengan penambahan panjang rantai pada gugus ester. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian sebelumnya menyatakan bahwa bertambahnya sifat hidrofobik senyawa akan meningkatkan aktivitasnya (Hanafi et al. 1999) karena berkaitan dengan kemempuan senyawa dalam menembus dinding sel. Penelitian lain menyebutkan aktivitas senyawa akan semakin tinggi jika kepolarannya mendekati kepolaran dinding sel. Apabila suatu senyawa terlalu hidrofob justru aktivitasnya akan menurun (Berger 2001).
KESIMPULAN Sintesis senyawa analog UK-3A tahap pertama, yaitu sintesis senyawa 3hidroksipikolinil serin metil ester yang merupakan reaksi amidasi menghasilkan senyawa dengan rendemen sebesar 42,4%. Reaksi sintesis tahap kedua, yaitu sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin heptil ester (c) masingmasing menghasilkan rendemen sebesar 32,2; 36,4; dan 38,8%. Reaksi sintesis tahap pertama maupun kedua menghasilkan senyawa dengan rendemen sintesis yang masih rendah. Uji aktivitas senyawa hasil sintesis dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P-388 menghasilkan nilai IC50 untuk senyawa a, b, dan c masing-masing sebesar 39,0; 51,0; dan 82,0 µg/mL. Nilai IC50 ini menunjukkan bahwa aktivitas senyawa a hampir sama, b dan c lebih rendah dari senyawa induk UK-3A dan senyawa hasil sintesis cukup berpotensi sebagai antikanker terhadap sel kanker Murine leukemia P-388, terutama senyawa a.
SARAN Perlu dilakukan penelitian sintesis senyawa analog UK-3A dengan struktur yang berbeda, yaitu dengan meragamkan gugus fungsi. Reaksi sintesis menggunakan gugus pelindung perlu dilakukan agar reaksi lebih spesifik dan menghasilkan rendemen yang tinggi. Uji aktivitas senyawa hasil sintesis, yaitu senyawa a, b, dan c perlu dilakukan terhadap sel kanker lain.
DAFTAR PUSTAKA Abdulah R, Miyazaki K, Makazawa M, Koyama H. 2005. Chemical form of selenium for cancer prevention. J of Trace Element in Medicine and Biology. Arifin S. 2007. Sintesis senyawa analog UK-3A (β-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester dan β-hidroksipikolinil metil oktanoil serin ester) serta uji sitotoksisitas terhadap sel kanker Murine leukemia P-388. [skripsi]. Purwokerto: Program Sarjana Kimia, Universitas Jenderal Soedirman. Arsianti, A. 1998. Sintesis dan uji aktivitas biologi senyawa analog antibiotika UK-3 (2-hidroksinikotinil heksil serin ester dan turunannya). [tesis]. Depok : Magister Sains Ilmu Kimia Program Pascasarjana, Universitas Indonesia. Berger JM. 2001. Isolation, characterization, and synthesis of bioactive natural products from rainforest flora. [disertasi]. Virginia: Virginia Polytechnic Institute and State University. Carey FA, Sunberg RJ. 1990. Advence Organic Chemistry. Part B, Reaction and Synthesis. Ed ke-3. New York: Plenum Press. Hanafi M, Shabata K, Ueki M, Taniguchi M. 1996. UK-2A, B, C and D Novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02. II Structure elucidation. J Antibiotics 49: 1226-1231. Hanafi M, 1997a. Studi korelasi struktur molekul dan aktivitas biologi dari antibiotika UK-2, UK-3, turunan, dan analognya. Di dalam: Kimia dalam Pembangunan. Konferensi Nasional I. Yogyakarta Hanafi M, Trisnamurti RH, Saefudin E, Thelma AB, Ngadiman. 1997b. Sintesis dan uji aktivitas biologi senyawa analog UK-3, 3-hidroksipikolinil serin metil ester dan turunannya. Prosiding Seminar Nasional Kimia II; Yogyakarta 13 Desember 1997. Yogyakarta: Jurusan Kimia Fakultas MIPA UGM. Hanafi M, Thelma AB, Saefudin E, Serenata J. 1997c. Pengaruh esterifikasi 3hidroksipikolinil serin etil ester (analog UK-3A) terhadap pertumbuhan mikrob. Di dalam: Kimia dalam Industri dan Lingkungan. Prosiding Seminar Nasional VI; Yogyakarta 16-17 Desember 1997. Yogyakarta: Jaringan Kerjasama Kimia Indonesia. Hanafi M, Trisnamurti RH, Thelma AB, Herlina. 1997d. Optimasi pembentukan senyawa analog antibiotik UK-3, 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Prosiding Seminar Nasional, Bandung, 24-27 November 1997. Bandung: Himpunan Kimia Indonesia Cabang Jawa Barat. hlm 69-74.
Hanafi M, Thelma. 1998. Sintesis senyawa analog UK-3, pengaruh gugus hidroksi terhadap aktivitas biologi. Di dalam: Kimia dalam Pembangunan. Prosiding Seminar Nasional II; Yogyakarta, 5-6 Mei 1998. Yogyakarta: Jaringan Kerjasama Kimia Indonesia. Hanafi M, Thelma AB, Saefudin E, Arini P. 1999. Pengaruh sifat lipofilik terhadap aktivitas biologi 3-hidroksipikolinil serin oktil ester dan turunannya. Di dalam: Pemaparan Hasil Litbang IPTEK; Bandung, 2-3 Maret 1999. Bandung: Ilmu Pengetahuan Teknik LIPI. hlm 218-224. ICON Group International. 2004. http--ad2004_com-Biblecodes-matimagesleukemia_gif_files\leukemia.htm [11 Februari 2007] Jenie UA, Kardono LBS, Hanafi M, Rumampuk RJ, Darmawan A. 2006. Teknik Modern Spektroskopi NMR: Teori dan Aplikasi dalam Elusidasi Struktur Molekul Organik dan Biomolekul. Jakarta: LIPI Press. Kurzer F, Zadeh KD. 1967. Advenced in the chemical of carbodiimides. Chemical Review 67: 107-140. Liu W et al.2003. Medical Chemistry Anticancer Agent. J Medicinial 3: 217-23 March J. 1992. Advenced Organic Chemistry, reaction, mechanism and structure. Ed ke-4. New York: A Wiley Interscience Princeton University. 2001. www.WordNet 1.7.1.com [11 Februari 2007] Sahidin et al. 2005. Cytotoxic Properties of Oligostilbenoids from the tree barks of Hopea dryobalanoides. J Naturforsch 60: 723-727. Sherley. 1998. Sintesis dan uji aktivitas biologi senyawa analog antibiotika UK-3, 3-hidroksinikotinil heksil serin ester dan turunannya [tesis]. Depok: Program Pascasarjana Kimia. Universitas Indonesia. Shimano K et al. 1998. Total synthesis of the antifungal dilactones UK-2A and UK-3A: The determination of their relative and absolute configuration, analog synthesis and antifungal activities. Tetrahedron 54: 12745-12774. Shiomi K et al. 2005. A new antibiotic, antimycin A9, Produced by Streptomyces sp. K01-0031. J Antibiotics 58: 74-78. Silverstein RM, Bassler GC, Morrill TC. 1986. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Ed ke-4. Hartomo AJ, Purba AV, penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Spectrometric Identification of Organic Compounds. Siswandono, Soekardjo B. 1995. Kimia Medisinial. Surabaya: Airlangga University Press.
Ueki M et al. 1996. UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, and biological properties. J Antibiotics 49: 639-644. Ueki M et al. 1997a. UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp. 517-02, fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties. J Antibiotics 50: 551-555. Ueki M et al. 1997b. The mode of action of UK-2A and UK-3A novel antifungal from Streptomyces sp. 517-02. J Antibiotics 50: 1052-1057. Usuki Y et al. 2006. Structure activity relationship studies on UK-2A, a novel antifungal antibiotic from Streptomyces sp. 517-02. Part 5: Roles of the 9membered dilactone-ring moiety in respiratory inhibition. J Bioorganic and Medicinial Chemistry Letter 16: 3319-3322. Widodo W. 1998. Sintesis senyawa analog antibiotika UK-3 (3-hidroksipikolinil serin isobutil ester dan turunannya [skripsi]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmub Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.
LAMPIRAN
Lampiran 1
Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester XIC 240.8873±0.1000 =>SM7 T4.0
100
1.1E+4
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30 20 10 0
0
3.2
Index Time 1 4.022117
6.4 Retention Time (Min)
Lower Bound 3.407733
9.6
12.8
0 16.0
Upper Bound Height Area 5.746084 10635 165343.17
Mariner Spec /103:112 (T /3.91:4.25) ASC[BP = 240.9, 2122] 240.8873
100
2122.1
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30 20
241.8895 10 0 99.0
162.9928 113.9869 184.9602
262.8561
502.7783
390.9910
313.9320 279.2
459.4
639.6
819.8
Mass (m/z)
5
6
N H N
2
4 3
3' 2'
OH
OH
1'
O O
O
1"'
3-hidroksipikolinil serin metil ester
0 1000.0
Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa a
BPI=>NR(3.00)=>SM9 T6.0
100
982.6
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30 20 10 0
0
2.4
Index Time 1 5.966750
4.8 Retention Time (Min)
7.2
0 12.0
9.6
Lower Bound Upper Bound Height Area 5.316484 7.382117 983 17526.44
Mariner Spec /153:161 (T /5.81:6.12) -129:142 (T -5.81:6.12) ASC[BP = 324.9, 2055] 324.8946
100
2055.4
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30
325.8895 20 10 0 99.0
326.8736 347.8503
225.0204 279.2
670.7871 459.4
639.6
819.8
Mass (m/z)
5
6
N
O H N
2
4 3
2'' 2'
OH
3'
O
1''
4" 3''
5"
1'
O O
O
1"'
3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a)
0 1000.0
Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa b
BPI=>NR(2.00)=>SM7 T7.4
100
679.0
90 80
% Intensity
70 60 T11.7
50 40 30 20 10 0 1.0
6.6
12.2
17.8
0 29.0
23.4
Retention Time (Min)
Mariner Spec /192:196 (T /7.29:7.45) -172:180 (T -7.29:7.45) ASC[BP = 338.9, 1203] 338.9070
100
1202.9
90 80
% Intensity
70 60 50 40 30
339.8986 20
222.9003
10
340.8910 223.9002
0 185.0
298.6
412.2
525.8
0 753.0
639.4
Mass (m/z)
5
6
4
N
O H N
2 3
3' 2'
OH
O
1"
2"
3"
4"
5"
1'
O O
O
1'"
3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b)
Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa c
6"
BPI =>NF0.7 T8.0
100
3089.7
90 80 70 % Intensity
60 50 40 30 20 T14.4
10 0
0
5
10 Retention Time (Min)
Index Time 1 7.978967 2 14.436933
15
0 25
20
Lower Bound Upper Bound Height Area 7.214034 10.659667 3090 56656.24 13.865434 15.009417 265 2038.61
% Intensity
Mariner Spec /207:214 (T /7.86:8.13) -149:182 (T -7.86:8.13) ASC[BP = 353.0, 5551] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 320
352.9561
5550.5
353.9488 354.9471
726.9397
426.0165 414
508
602
0 790
696
Mass (m/z)
% Intensity
Mariner Spec /376:383 (T /14.32:14.59) -345:358 (T -14.32:14.59) ASC[BP = 337.1, 243] 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 304.0874 0 301
337.0912
338.0838 337.5492 339.0392
243.0
375.0324
410.1451
458.0998
393
506.1341
560.9060
485
604.1829
695.2299
646.1669
577
669
Mass (m/z)
5
6
N
O H N
2
4 3
2'' 3' 2'
OH
O
1''
4" 3''
5"
1'
O O
O
1"'
3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) Lampiran 2
6"
7"
0 761
Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester
Spektrum FT-IR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
Spektrum FT-IR senyawa a
Spektrum FT-IR senyawa b
Spektrum FT-IR senyawa c
Lampiran 3
Spektrum 1H-NMR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
Spektrum 1H-NMR senyawa a
Spektrum 1H-NMR senyawa b
Spektrum 1H-NMR senyawa c
Lampiran 4
Spektrum 13C-NMR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester
Spektrum 13C-NMR senyawa a
Spektrum 13C-NMR senyawa b
Spektrum 13C-NMR senyawa c
Lampiran 5
Aktivitas secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 1. Hasil uji aktivitas senyawa cis-platina (kontrol positif) Konsentrasi (µg/mL)
Rapatan optis
0,0
0,170
0,1
0,253
0,3
0,211
1
0,159
3
0,111
10
0,087
30
0,074
100
0,016
Kurva Aktivitas cis- platin 0.3 Rapatan optis
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
20
40 60 80 Konsentrasi (ppm)
100
120
Perhitungan IC50 cis-platin: y = a + bx, dimana y =
1 x rapatan optis kontrol negatif 2
y = 0,1672 - 0,0328 ln (x)
0,085 = 0,1672 − 0,0328 ln ( x ) ln ( x ) =
0,0850 − 0,1672 = 2, 4849 , x = 12,0 µg/mL − 0,0328
2. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinat serin metil pentil ester (a)
Konsentrasi (µg/mL)
Rapatan optis
0,0
0,170
0,1
0,165
0,3
0,176
1
0,153
3
0,157
10
0,142
30
0,107
100
-0,001
Kurva Aktivitas Senyawa a 0.2 Rapatan optis
0.15 0.1 0.05 0 -0.05
0
20
40
60
80
100
120
Konsentrasi (ppm)
Perhitungan IC50 senyawa a: y = a + bx, dimana y =
1 x rapatan optis kontrol negatif 2
y = 0,1645 – 0,0024 x
0,085 = 0,1645 − 0,002 x x=
0,0850 − 0,1645 = 39,0 µg/mL − 0,002
3. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinat serin metil heksil ester (b)
Konsentrasi (µg/mL)
Rapatan optis
0,0
0,170
0,1
0,214
0,3
0,233
1
0,244
3
0,224
10
0,215
30
0,142
100
0,007
Kurva Aktivitas Senyawa b 0.3 Rapatan optis
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0
20
40
60 80 Konsentrasi (ppm)
100
120
Perhitungan IC50 senyawa b: y = a + bx, dimana y =
1 x rapatan optis kontrol negatif 2
y = 0,2337 – 0,0029 x
0,085 = 0,2337 − 0,0029 x x=
0,0850 − 0,2337 = 51,0 µg/mL − 0,0029
4. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinat serin metil heptil ester (c)
Konsentrasi (µg/mL)
Rapatan optis
0,0
0,130
0,1
0,146
0,3
0,139
1
0,140
3
0,162
10
0,137
30
0,090
100
0,059
Kurva Aktivitas Senyawa c 0.16
Rapatan optis
0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0
20
40
60
80
Konsentrasi (ppm)
Perhitungan IC50 senyawa c: y = a + bx, dimana y =
1 x rapatan optis kontrol negatif 2
y = 0,1388 – 0,0009x
0,065 = 0,1388 − 0,0009 x x=
0,0650 − 0,1388 = 82,0 µg/mL − 0,0009
100
120
