EFEK ASAM ASKORBAT TERHADAP SEL KANKER HEPATOMA AH109A DAN SEL ERITROSIT MANUSIA SECARA IN VITRO

i

SKRIPSI

EFEK ASAM ASKORBAT TERHADAP SEL KANKER HEPATOMA AH109A DAN SEL ERITROSIT MANUSIA SECARA IN VITRO

Oleh : NOVI INDRIANA DEWI F24103055

2008 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

ii

EFEK ASAM ASKORBAT TERHADAP SEL KANKER HEPATOMA AH109A DAN SEL ERITROSIT MANUSIA SECARA IN VITRO

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh : NOVI INDRIANA DEWI F24103055

2008 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

iii

INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

EFEK ASAM ASKORBAT TERHADAP SEL KANKER HEPATOMA AH109A DAN SEL ERITROSIT MANUSIA SECARA IN VITRO

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh : NOVI INDRIANA DEWI F24103055

Dilahirkan pada tanggal 25 November 1985 di Karanganyar, Jawa Tengah Tanggal lulus: 23 Mei 2008

Menyetujui: Bogor, Mei 2008

Prof. Dr. Ir. Fransiska Rungkat Zakaria, MSc. Dosen Pembimbing Mengetahui,

Dr.Ir. Dahrul Syah Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

iv

Novi Indriana Dewi. F24103055. THE EFFECT OF ASCORBIC ACID ON CANCER CELLS HEPATOMA AH109A AND HUMAN ERYTHROCYTES IN VITRO. Under direction of: Fransiska Rungkat Zakaria and Yagasaki Kazumi . ABSTRACT Cancer is a group of diseases characterized by uncontrolled growth and spread of abnormal cells. Nowadays it is a leading cause of death worldwide. According to World Health Organization, in 2005 around 7.6 million people died of cancer, about 13% of the 58 million deaths worldwide. More than 70% of all cancer deaths occur in low and middle-income countries. The World Cancer Research Fund and The American Institute of Cancer Research in 1997 has proved that cancer is a preventable disease. Balance nutrition, extra antioxidant from food and vegetables contains in diet will provide a barrier against cancer. Ascorbic acid, one of a water soluble vitamin, is a well known biologically important antioxidant found widely in plants. The antioxidative activity of ascorbic acid is believed to have a role in reducing the risk of cancer in a large majority of epidemiological study as well as in vitro and in vivo study. Ascorbic acid functions as a free radical scavenger, which scavenge free radicals to inhibit the radical attack and or break the chain oxidation. The aim of the present experiment is to examine the ability of ascorbic acid on preventing cancer growth and to compare the effect on normal cells in vitro. The effect of ascorbic acid on the proliferation and invasion of rat ascites hepatoma AH109A cells was investigated by measuring amount of formazan produced by cellular mitochondrial dehydrogenases of the cells using WST-8 assay, and by co-culturing the hepatoma cells with rat mesentery-derived mesothelial cells. Effect of ascorbic acid on normal human erythrocytes cells was investigated by measuring the hemolysis rate of erythrocytes in vitro. The effect of ascorbic acid on invasion and proliferation of AH109A cells showed then. Ascorbic acid at 100 until 400 µM dose-dependently inhibited AH109A cells proliferation. Ascorbic acid starts to inhibit the proliferation significantly at concentration 100 µM with 81.12% proliferation rate. At 200 µM ascorbic acid also inhibit the proliferation of AH109A cell significantly at proliferation rate 40.52%. The inhibition effect of ascorbic acid was kept up to 400 µM. At this concentration, the proliferation of AH109A cell is only 15.71%. As for invasion assay, we found using our assay system that ascorbic acid also significantly inhibit the invasion of AH109A cell in a dose dependent manner in vitro. At concentration up to 100 µM ascorbic acid only slightly inhibit the invasive activity of AH109A cells in vitro with only 79.26% invasion rate. Ascorbic acid began to significantly inhibit the invasion of the tumor cells at 200 µM (57.82%) and thereafter continue to reduce it up to 400 µM (52.00%). The effect of ascorbic acid on preventing oxidator-induced hemolysis was assessed. From the methods verification we found that the centrifugation method with 33 mM H2O2 gave the best result. This method could provide a positif correlation between the hemolysis rate of erythrocytes measured by red color formation of hemoglobin and the number of viable cells measured by tryphan blue exclusion technique. We found using our assay system that ascorbic acid could

v

significantly inhibit the hemolysis of erythrocytes at 100 µM both with single centrifugation method and multiple centrifugation method. Using single centrifugation method, we found that at 100 µM, the hemolysis inhibition rate was 69.32% with 53.00% viable cells. At 200 µM the hemolysis inhibition rate was increase until 69.90% with 66.50 % viable cells. The inhibition activity was kept up until 400 µM without significant different with 75.10% and 90.50% viable cells. Using multiple centrifugation method we found that at 100 µM, the hemolysis inhibition rate was 66.56%with 72.19% viable cells. At 200 µM the hemolysis inhibition rate was increase until 73.10% with 88.13 % viable cells. The inhibition activity was kept up until 400 µM without significant different with 73.86% and 97.50% viable cells. The increasing concentration of ascorbic acid up to 200 µM gave significant different on the prevention of erythrocytes hemolysis in vitro, but the increasing concentration of ascorbic acid up to 400µM did not give significant different. However, the number of viable cells was found higher in the suspension containing higher concentration of ascorbic acid. These results suggest that the effect of ascorbic acid on preventing hemolysis has a dose-dependent pattern. There was no significant different noticed on the hemolysis of erythrocytes between single centrifugation method and multiple centrifugation method. In summary, we showed using our assay system that ascorbic acid significantly inhibits the proliferation and invasion of AH109A cells, and in vitro in a dose-dependent manner. Ascorbic acid also proved to significantly inhibits oxidative hemolysis of erythrocytes. It is hope that this study will provide useful informations and data on the effect of ascorbic acid on cancer cells as well as normal cells.

vi

Novi Indriana Dewi. F24103055. EFEK ASAM ASKORBAT TERHADAP SEL KANKER HEPATOMA AH109A DAN SEL ERITROSIT MANUSIA SECARA IN VITRO. Di bawah bimbingan: Fransiska Rungkat Zakaria dan Yagasaki Kazumi . RINGKASAN Kanker adalah pertumbuhan dan penyebaran yang tidak terkontrol dari sel abnormal. Menurut World Health Organization, pada tahun 2005 sebanyak 7.6 juta orang meninggal karena kanker atau 13% dari total 58 juta kematian di seluruh dunia pada tahun itu. Di Amerika Serikat kanker menduduki peringkat kedua penyebab kematian, yaitu tercatat sebanyak 25% dari seluruh kematian pada tahun itu. The World Cancer Research Fund dan The American Institute of Cancer Research di tahun 1997 sampai pada kesimpulan bahwa kanker adalah penyakit yang dapat dicegah. Perbaikan status gizi tubuh melalui makanan dan minuman dan ditambahkan dengan ekstra antioksidan dari sayuran dan buahbuahan merupakan benteng strategis dalam perang melawan kanker Asam askorbat, salah satu vitamin larut air, adalah antioksidan yang banyak ditemukan di tanaman. Aktivitas antioksidan asam askorbat dipercaya memiliki peran dalam menurunkan resiko kanker pada berbagai studi epidemiologi, begitu pula pada studi in vitro dan in vivo. Tujuan dari penelitian kali ini adalah untuk meneliti kemampuan asam askorbat dalam menghambat pertumbuhan kanker dan membandingkan aktivitasnya dengan sel normal. Kemampuan asam askorbat dalam menghambat proliferasi dan invasi sel kanker hepatoma AH109A diteliti dengan menghitung jumlah formazan yang diproduksi oleh enzim suksinat dehidrogenase pada mitokondria sel hidup dengan metode WST-8 dan dengan mengkultur sel AH109A dengan sel mesothelial dari mesenteri tikus. Efek asam askorbat terhadap hemolisis eritrosit dilakukan dengan menghitung persen pencegahan hemolisis eritrosit secara in vitro. Nilai proliferasi dan invasi 100% diperoleh dari cawan dengan perlakuan asam askorbat 0 µM. Asam askorbat pada konsentrasi 100 µM hingga 400 µM mampu menghambat proliferasi sel AH109A. Asam askorbat mulai menghambat proliferasi secara signifikan pada konsentrasi 100 µM dengan 81.12% proliferasi. Pada konsentrasi 200 µM asam askorbat menghambat proliferasi sel secara signifikan dengan 40.52% proliferasi. Aktivitas penghambatan proliferasi oleh asam askorbat terus meningkat hingga 400 µM dengan 15.71% proliferasi. Untuk uji invasi, pada konsentrasi 100 µM asam askorbat hanya sedikit menghambat invasi sel AH109A dengan 79.26% kemampuan invasi. Asam askorbat mulai menghambat invasi sel AH109A secara signifikan pada konsentrasi 200 µM (57.82%) dan aktivitas penghambatannya terus meningkat hingga konsentrasi 400 µM (52.00%) dengan tingkat penghambatan yang bergantung pada konsentrasi. Pengaruh asam askorbat dalam pencegahan hemolisis kemudian dilakukan. Metode yang digunakan adalah metode sentrifugasi dengan menggunakan oksidator H2O2 33 mM. Persen pencegahan hemolisis dihitung dengan mengukur warna merah yang disebabkan oleh hemoglobin akibat hemolisis dan dengan

vii

menghitung jumlah sel hidup menggunakan metode pewarnaan biru trifan pada jam ke-5 inkubasi. Dengan menggunakan metode sentrifugasi tunggal, pada konsentrasi 100 µM, persen pencegahan hemolisis oleh asam askorbat sebesar 69.32% dan jumlah sel hidup sebesar 53.00%. Pada konsentrasi 200 µM, persen pencegahan hemolisis meningkat hingga 69.90% dengan jumlah sel hidup 66.50 %. Nilai pencegahan hemolisis ini terus meningkat hingga konsentrasi 400 µM dengan persen pencegahan hemolisis sebesar 75.10% dan 90.50% sel hidup. Dengan metode sentrifugasi berulang, pada konsentrasi 100 µM diperoleh nilai pencegahan hemolisis oleh asam askorbat sebesar 66.56% dengan 72.19% sel hidup. Pada konsentrasi 200 µM nilai pencegahan hemolisis sebesar 73.10% dengan 88.13 % sel hidup. Nilai pencegahan hemolisis ini terus meningkat hingga 400 µM dengan nilai pencegahan sebesar 73.86% dan jumlah sel hidup sebesar 97.50%. Data ini menunjukkan bahwa asam askorbat mampu mencegah hemolisis sel eritrosit manusia secara signifikan pada konsentrasi 100 hingga 400 µM dengan kemampuan pencegahan yang tergantung pada konsentrasi. Berdasarkan data ini pula, tidak ditemukan adanya perbedaan besar antara metode sentrifugasi tunggal dan sentrifugasi berulang. Sebagai kesimpulan, diketahui bahwa asam askorbat mampu menghambat proliferasi dan invasi sel hepatoma AH109A dan hemolisis eritrosit pada konsentrasi 100 hingga 400 µM, dengan kemampuan yang tergantung pada konsentrasi. Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi berharga dan data mengenai efek asam askorbat terhadap sel kanker dan sel normal secara in vitro.

viii

BIODATA PENULIS Penulis dilahirkan di Karanganyar, 25 November 1985 yang merupakan anak pertama dari pasangan Joko Suwardo dan Tri Hardiani. Penulis mengawali pendidikan formal di TK Dharma Wanita II, kemudian dilanjutkan di SD Karangasem II, SLTP N 1, dan SMUN 1 Surakarta. Pendidikan terakhir yang ditempuh oleh penulis adalah pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada tingkat akhir pendidikannya penulis mendapatkan kesempatan untuk mengikuti program pertukaran pelajar di Tokyo University of Agriculture and Technology di Tokyo, Jepang selama satu tahun dengan beasiswa JASSO. Selain aktif dalam bidang akademik, penulis juga aktif dalam berbagai kegiatan intra kampus, antara lain sebagai anggota pada Himpunan Mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan (HIMITEPA), PPI Jepang, dan menjadi pengurus BEM FATETA. Berbagai pengalaman kerja juga telah diperoleh penulis, baik sebagai asisten praktikum Kimia Dasar untuk mahasiswa TPB, asisten praktikum Analisis Pangan, dan juga sebagai teaching assistant pada mata kuliah International Communication. Selain itu penulis juga mengajar pada salah satu bimbingan belajar swasta di Bogor, dan menjadi guru privat materi eksak untuk tingkat sekolah menengah. Pada akhir masa kuliahnya, penulis memilih untuk mengundurkan diri dari kegiatan organisasi dan menyibukkan diri dengan kegiatan kerohanian bersama Qismul Muslimah M.T. Al Furqan. Penulis menyelesaikan tugas akhirnya dengan melakukan penelitian yang berjudul “Efek Asam Askorbat Terhadap Sel Kanker Hepatoma AH109A dan Sel Eritrosit Manusia”. Penelitian ini penulis awali di Tokyo University of Agriculture and Technology kemudian dilanjutkan di IPB. Sebagian dari penelitian ini telah penulis presentasikan pada The 16th Indonesian Scientific Conference 2007 di Kyoto, Jepang pada bulan Agustus 2007 dan dipublikasikan dalam prosiding seminar tersebut. Sebagian dari penelitian ini juga telah menghantarkan penulis sebagai Juara I pada The 7th National Student Paper Competition di Bogor pada bulan Desember 2007.

ix

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahi Robbil’alamin, puji syukur kehadirat Allah SWT karena atas segala limpahan karunia, rahmat, dan kasih sayangNya penulis dapat menyelesaikan tugas akhir yang berjudul ”Efek Asam Askorbat terhadap Sel Kanker Hepatoma AH109A dan Sel Eritrosit Manusia Secara In Vitro”. Dalam penyusunan tugas akhir ini penulis tidak terlepas dari dukungan dari beberapa pihak baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1.

Prof. Dr. Ir. Fransiska Rungkat Zakaria, M.Sc. selaku dosen pembimbing akademik atas pengarahan, masukan serta kesabarannya untuk membimbing penulis selama kuliah hingga penyelesaian skripsi.

2.

Prof. Yagasaki Kazumi, Ph.D. dan Associate Professor Miura Yutaka, Ph.D. yang telah membimbing dan memberi banyak masukan kepada penulis selama penulis melakukan studi di Jepang

3.

Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si. dan Ir. Subarna, M.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan banyak masukan berarti demi perbaikan skripsi ini.

4.

Keluargaku: Ibu, Bapak, dan adikku Tina atas segala dukungan yang tidak ternilai harganya baik secara fisik dan moril, kasih sayang, cinta yang begitu besar, dan keceriaan, serta untuk keluarga besar yang telah memberi semangat bagi penulis.

5.

Seluruh dosen departemen ITP yang banyak memberikan ilmu dan nasehat berharga kepada penulis selama berkuliah dan staf departemen yang telah banyak membantu penulis.

6.

Anggota Lab. of Nutritional Physiochemistry di TUAT yang telah memberikan banyak kenangan manis dan pengalaman berharga akan indahnya persahabatan. Miho chan dan Nakaba chan yang selalu memberikan semangat kepada penulis untuk terus maju. Ashida san, sang translator, juga kepada Manami san, Yuu san, dan Arai san yang telah mengajarkan dan membimbing penulis dalam teknik kultur sel.

x

7.

Teman satu bimbinganku: Agnes, Meiko, Ofa, Hans, Kamlit, Kalis Kenchi, dan Umam. Terima kasih atas segala kebersamaan yang telah kita lalui.

8.

Noor Fauziah yang telah banyak berbagi dan memberi semangat kepada penulis selama menjalani studi, Lala, Mona, dan Intan atas kesediaan mereka untuk memberikan begitu banyak perhatian, kegembiraan, dan cerita pada penulis.

9.

Teman-teman angkatan 40, Hanifah, Irma, Aan, Nunu, Idham, teman abadiku selama praktikum dari tingkat 1. Serta teman-teman lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Adik-adik kelasku angkatan 41 dan 42 yang selama satu tahun terakhir banyak berinteraksi dengan penulis.

10. Warga Wisma Hikmatun Nissa: Ana, Sella, Mila, Tri, Mbak Novi, dan tidak lupa pula si kecil Khaula, serta akhwat-akhwat yang lain. Terima kasih atas segala dorongan, masukan, pengertian, dan berbagai pertolongan yang selama ini penulis terima. Jazakumullahu khairan.... 11. Para laboran yang telah dengan sabar dan telaten membantu dan membimbing penulis melakukan penelitian : Pak Gatot, Pak Wahid, Pak Iyas, Pak Nur, Pak Koko, Bu Rubiyah, Pak Sidik, Bu Antin, Mas Edi, Teh Ida, Pak Sobirin, dan Bu Ari. 12. Pihak-pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis baik secara langsung maupun tidak langsung dalam penyusunan skripsi ini. Akhir kata penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh sempurna dan perlu banyak masukan serta saran. Penulis juga berharap agar skripsi ini dapat bermanfaat bagi seluruh pihak yang membutuhkan dan terhadap pengembangan ilmu dan teknologi khususnya dalam bidang Ilmu dan Teknologi Pangan.

Bogor, Mei 2008

Penulis