Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
1
Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak dan Fraksi Daun Kuhung-Kuhung (Crotalaria pallida Aiton) terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 Erlays Melindah Rumondor, Moelyono M.W, dan Melisa I. Barliana Abstrak Daun kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton) merupakan tumbuhan yang digunakan secara tradisional oleh etnis bolaang mongondow sebagai antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiproliferasi dari ekstrak maupun fraksi daun kuhungkuhung pada sel kanker payudara MCF-7. Pengujian aktivitas antiproliferasi dilakukan dengan metode WST assay menggunakan sel line MCF-7. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun C. pallida Ait memiliki nilai IC50 terkecil yakni 29,67 µg/mL. Berdasarkan hasil tersebut, maka fraksi etil asetat daun kuhung-kuhung terbukti bersifat antiproliferasi dan bisa dijadikan dasar pengembangan tumbuhan antikanker Keyword : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7 Abstract Kuhung-kuhung leaf (Crotalaria pallida Aiton) is medicinal traditionally used by ethnic Bolaang Mongondow as anticancer. The purpose of this study was to showed antiproliferation activity from extract and fraction to human breast cancer cell line MCF-7. The research using WST-assay method with mammary adenocarcinoma cell line MCF-7. These results indicate that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf has lower IC50 29,67 value. Because of the fact that ethyl acetate fraction of kuhung-kuhung leaf contribute to development anticancer agent. Keyword : Crotalaria pallida, WST assay, cell line MCF-7
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
2
Kanker merupakan suatu penyakit
PENDAHULUAN Penduduk indonesia terdiri atas
yang hingga saat ini dapat menjadi
berbagai suku bangsa yang memiliki
ancaman baik dalam bidang kesehatan di
keanekaragaman budaya kearifan lokal
dunia maupun Indonesia karena dapat
dan tradisional mengenai pengetahuan
menyebabkan kematian. Berdasarkan data
tumbuhan obat serta cara penggunaan
statistik, kanker payudara dan kanker
dalam menyembuhkan penyakit sehingga
serviks menjadi jenis kanker yang paling
menjadi cikal bakal penemuan obat baru
sering terjadi pada wanita (Tjindarbumi
yang berasal dari alam (Moelyono, 2014).
and Mangunkusumo 2002).
Kahung-kahung
merupakan
BAHAN
tumbuhan anggota keluarga Leguminosae
Bahan
yang
digunakan
dalam
marga Crotalaria yang secara empiris
penelitian ini adalah simplisia daun dan
digunakan oleh penduduk Sulawesi Utara
biji kuhung-kuhung (Crotalaria pallida
sebagai
obat
Leguminosae
kanker.
Keluarga
Ait. ), etanol 96%, etil asetat, n-heksana,
dilaporkan
memiliki
aquadest, kloroform, ammonia, Dimetil
aktivitas sitotoksik (Khalighi, et al., 2012).
Sulfoxide
Selanjutnya untuk spesies yang termasuk
pereaksi Dragendorff, peraksi besi (III)
pada
mengandung
klorida, eter, vanilin, asam sulfat pekat,
berpotensi
asam asetat anhidrat, toluen, kalium
sitotoksik terhadap sel kanker (Maioli, et
hidroksida, larutan gelatin. Sel uji yang
al.,
digunakan
marga
metabolit
2011)
Crotalaria
sekunder
didukung
yang
pada
penelitian
(DMSO),
untuk
pereaksi
pengujian
Mayer,
aktivitas
sebelumnya terhadap beberapa spesies
adalah sel kanker serviks HeLa dan sel
yang memiliki marga Crotalaria (Srinivas,
kanker payudara MCF-7 (Laboratorium
2012).
Kultur
Sel
dan
Sitogenetik
RSP
Universitas Padjadjaran), medium kultur
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
Roswell
Park
Memorial
3
(RPMI-160)
polar seperti n-heksan, pelarut semi polar
(Sigma), Fetal Bovine Serum (FBS)
etil asetat dan pelarut polar yaitu air.
(Gibco), Phospate buffer saline (PBS)
Sejumlah ekstrak ditimbang dan dilarutkan
(Gibco), antibiotik (100 U/mL penisilin
dalam pelarut n-heksan dalam corong
dan 100 µg/mL streptomisin), larutan
pisah
pewarna
Soluble
pemisahan dan dilakukan secara berulang
Tetrazolium (WST-8) (Dojindo), Sodium
hingga mendapatkan lapisan n-heksan
Dodecil Sulphate (SDS).
yang bening. Fraksi n-heksan kemudian
MTT,
kit
Water
lalu
didiamkan
hingga
terjadi
diambil dan dikumpulkan. Residu yang METODE EKSTRAKSI
dihasilkan
disimpan
Bahan segar dikeringkan menjadi simplisia
fraksinasi
untuk
kemudian dirajang dan dihaluskan hingga
Sejumlah residu ditambahkan etil asetat
menjadi serbuk simplisa. Simplisia halus
dan didiamkan untuk didapatkan lapisan
ditempatkan pada wadah untuk diekstraksi
etil asetat selanjutnya dilakukan berulang
menggunakan
yaitu
hingga di dapatkan lapisan etil asetat yang
dengan etanol 96% selama 3 hari (3x24
bening kemudian dipisahkan. Residu yang
jam). Selanjutnya maserat ditampung dan
dihasilkan digunakan untuk fraksinasi
pelarutnya
rotary
pelarut polar yakni air. Residu dikocok dan
evaporator sehingga dihasilkan ekstrak
didiamkan hingga didapatkan lapisan air
kental.
bening.
FRAKSINASI
PENAPISAN FITOKIMIA
metode
diuapkan
Ekstrak kuhung-kuhung
etanol
maserasi
dengan
daun
difraksinasi
dan
biji
untuk
pelarut
dilakukan etil
asetat.
a. Pengujian Golongan Senyawa Alkaloid
cair-cair
Masing-masing bahan simplisia dan
menggunakan pelarut dengan kepolaran
ekstrak dibasahkan dengan menambahkan
yang berbeda yaitu dengan pelarut non
sedikit ammonia, kemudian dimasukkan
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
4
dalam mortar lalu digerus dengan stamper
senyawa
sambil
1966).
ditambahkan
kloroform.
Selanjutnya lapisan kloroform diambil
alkaloid
(Farnsworth,
b. Pengujian Senyawa Flavonoid
dengan cara dipipet sambil disaring dan
Bahan berupa simplisia dan ekstrak
dipindahkan ke dalam tabung reaksi.
masing-masing dimasukkan dalam tabung
Setelah itu, pada tabung reaksi yang berisi
reaksi
filtrat ditambahkan asam klorida 2 N.
magnesium dan asam klorida 2 N.
Campuran dikocok dengan kuat hingga
campuran dipanaskan di atas penangas air,
terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam dipipet
lalu
dan dipisahkan menjadi 3 bagian.
dimasukkan
1. Bagian pertama digunakan sebagai blanko 2. Bagian
lalu
dicampur
disaring.
Filtrat ke
dengan
yang
tabung
serbuk
diperoleh
reaksi
lalu
ditambahkan amil alkohol, lalu dikocok kuat-kuat. Apabila terbentuk warna jingga,
kedua
ditambahkan
merah atau kuning maka menunjukkan
pereaksi Mayer, amati perubahan
bahwa positif terdapat senyawa flavonoid
yang terjadi. Apabila terbentuk
(Farnsworth, 1966).
kekeruhan atau endapan putih,
c. Pengujian Senyawa Polifenol
menunjukkan
adanya
senyawa
golongan alkaloid. 3. Bagian
ketiga
pereaksi
Sejumlah kecil bahan simplisia dan ekstrak
ditambahkan
dimasukan
ke
dalam tabung reaksi lalu dipanaskan diatas
amati
penangas air, lalu disaring. Filtrat yang
Bila
diperoleh ditambahkan larutan pereaksi
terbentuk kekeruhan atau endapan
besi (III) klorida. Terbentuknya senyawa
berwarna
kuning
jingga
hijau-biru hitam menunjukkan adanya
menandakan
adanya
golongan
perubahan
Dragendorff,
masing-masing
yang
terjadi.
senyawa
polifenol
(Farnsworth, 1966).
dalam
sampel
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
5
d. Pengujian Senyawa Kuinon
vanillin 10% dalam asam sulfat pekat.
Sejumlah kecil bahan dimasukkan kedalam
tabung
menunjukkan
adanya
dipanaskan di atas tangas air, lalu disaring.
monoterpenoid
dan
Tambahkan larutan kalium hidroksida 5%.
(Farnsworth, 1966).
Adanya
g. Pengujian Senyawa Triterpenoid dan
senyawa
reaksi,
selanjutnya
Adanya warna warna yang terbentuk
kuinon
ditunjukkan
dengan terbentuknya warna kuning hingga
Sejumlah
Bahan
ekstrak
dan
simplisia
dimassukkan masing-masing ke tabung berupa
reaksi, lalu ditambahkan sedikit eter dan
ekstrak maupun simplisia masing-masing
dikocok, lalu larutan eter dipipet dan
dalam tabung reaksi dipanaskan di atas
ditambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrat
tangas air, lalu disaring. Kedalam filtrat
dan 0,5 mL kloroform lalu dikocok.
ditambahkan larutan gelatin 1%. Jika
Larutan tersebut dimasukkan ke dalam
terbentuk endapan putih menunjukkan
tabung yang kering. Kemudian melalui
bahwa
dinding tabung diteteskan 1 mL asam
bahan
kecil
seskuiterpenoid
Steroid
merah (Farnsworth, 1966). e. Pengujian Senyawa Tanin
nyawa
bahan
mengandung
golongan
senyawa tanin (Farnsworth, 1966).
sulfat pekat. Apabila terbentuk cincin
f. Pengujian Senyawa Monoterpenoid dan
merah kecoklatan atau ungu pada batas
Seskuiterpenoid
kedua larutan dan larutan pada bagian atas
Bahan masing-masing
simplisia digerus
dan dengan
ekstrak eter,
menjadi hijau atau ungu menunjukkan positif
steroid
atau
triterpenoid
selanjutnya dipipet sambil disaring. Filtrat
(Farnsworth, 1966).
ditempatkan dalam cawan penguap, lalu
h. Pengujian Senyawa Saponin
dibiarkan menguap hingga kering. Hasil pengeringannya
tambahkan
larutan
Bahan
ekstrak
dan
simplisia
dimasukkan masing-masing ke tabung
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
6
reaksi, lalu dicampur dengan air dan
dalam
dipanaskan
kemudian
diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37oC.
disaring. Setelah dingin filtrat dalam
Reaksi dihentikan dengan penambahan
tabung reaksi reaksi dikocok kuat selama
reagen stopper SDS (100 µl) dan akan
lebih kurang 30 detik. Apabila terbentuk
terlihat reaksi antara sel yang hidup
busa setinggi lebih kurang 1 cm tinggi dan
dengan MTT sehingga akan menjadi
persisten selama beberapa menit serta
warna kuning. Kemudian laju proliferasi
tidak hilang pada saat penambahan 1tetes
sel ditentukan dengan membaca microtiter
asam klorida encer menunjukkan adanya
plate reader dan mengukur absorbansi
golongan senyawa saponin (Farnsworth,
pada panjang gelombang 450 nnm.
beberapa
saat,
1966).
masing-masing
lubang
dan
. Selanjutnya, penentuan tingkat inhibisi proliferasi sel dtentukan dengan rumus :
PENGUJIANAKTIVITAS ANTIPROLIFFERASI
% inhibisi =
TERHADAP
Absorban blanko−Absorban sampel
SEL KANKER PAYUDARA
absorban blanko
X 100 %
Pengujian antiproliferasi terhadap sel kanker serviks Hela maupun sel kanker payudara
MCF-7
dilakukan
dengan
penambahan beberapa variasi konsentrasi ekstrak
maupun
fraksi
HASIL DAN PEMBAHASAN EKSTRAKSI, FRAKSINASI DAN PENAPISAN FITOKIMIA
menggunakan
metode MTT assay dengan menempatkan prosedur Sel (5 x 104- 5 x 105) dalam 96 lubang plate well. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya, 10 µL WST-8 cell counting solution ditambahkan ke
Simplisia daun dan biji kuhungkuhung diperoleh
(Crotalaria dari
pallida
Aiton)
Langowan
Timur
Kabupaten Minahasa, Sulawesi Utara. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
7
ini adalah Crotalaria pallida Aiton, marga
polar. Proses maserasi dilakukan selama
Crotalaria, suku Fabaceae dan memiliki
3x24
sinonim Crotalaria striata DC.
kemudian ditampung dan diuapkan dengan
Sebanyak 1.195,45 gram daun
jam.
Maserat
yang
diperoleh
menggunakan rotary vaporator untuk
kuhung-kuhung dan 2.449,93 gram biji
menguapkan
kuhung-kuhung
dirajang
didihnya sehingga zat yang terkandung di
menggunakan
dalam pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi
pelarut etanol 96%. Dalam penelitian ini
agar mendapatkan ekstrak kental. Berat
digunakan pelarut etanol, karena etanol
ekstrak kental total daun kuhung-kuhung
merupakan pelarut universal yang dapat
diperoleh sebanyak 57 gram dan untuk biji
menarik metabolit sekunder baik yang
kuhung-kuhung
kemudian
yang
dimaserasi
sudah
bersifat polar, semi polar maupun non
pelarut
dibawah
42
titik
gram.
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
8
Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak dan Fraksi C. pallida Ait. Sampel Fraksi
Fraksi Daun
Ekstrak Ekstrak
No Gol Senyawa Biji n-h ea air n-h ea
Ket :
Biji
Daun
air
1
Alkaloid-Dragendorf -
+
+
+
+
+
+
+
2
Flavonoid
-
+
-
-
-
+
+
-
3
Saponin
+
+
+
+
+
+
+
+
4
Triterpenoid
+
+
-
+
+
-
+
-
5
Steroid
+
+
-
+
+
-
-
+
6
Fenol
-
+
+
-
+
+
+
+
7
Monoterpen
-
+ +
-
+
+
+
-
8
Seskuiterpen
-
+
-
+
+
n-h
: n-heksana
ea
: etil asetat
+
Hasil uji antiproliperasi ekstrak dan fraksi C. pallida Ait. Zat uji
Konsentrasi
IC50
8
16 31 63 125 250 500 1000 (µg/mL)
Ekstrak etanol daun kuhung-kuhung
0
8
33 54 86 85 84
80
56.7
Fraksi N- heksan daun kuhung-kuhung
0
6
27 44 53 77 86
84
107.1
Fraksi Etil asetat daun kuhung-kuhung
0
16 54 79 89 86 83
77
29,67
Fraksi air daun kuhung-kuhung
0
0
18 65 85
82
>200
Ekstrak etanol biji kuhung-kuhung
12 18 29 46 28 35 57
84
>200
Fraksi N- heksan biji kuhung-kuhung
0
0
49 57 84 89 88
89
35.71
Fraksi Etil asetat biji kuhung-kuhung
1
22 40 65 52 68 86
88
44.25
0
0
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
9
Fraksi air biji kuhung-kuhung
0
0
0
0
0
0
0
0
-
Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air daun kuhung-kuhung
% Penghambatan Proliferasi Sel
terhadap sel kanker payudara MCF-7
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
200
400
600
800
1000
1200
Konsentrasi (µg/ml) ekstrak etanol
etil asetat
n-heksan
air
Antiproliferasi ekstrak etanol, fraksi etil asetat, n-heksan dan air biji kuhung-kuhung terhadap
% Penghambatan Proliferasi Sel
sel kanker payudara MCF-7.
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
200
400
600
Konsentrasi (µg/ml Ekstrak etanol etil asetat
800 n-heksan
1000 air
1200
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
10
Telah dilakukan pengujian aktivitas
biji, fraksi air daun dan biji tidak dapat
antiproliferasi ekstrak dan fraksi dari daun
memberikan
kuhung-kuhung (Crotalaria pallida Aiton)
terhadap sel kanker payudara MCF-7.
dengan metode MTT assay terhadap sel
KESIMPULAN
kanker payudara MCF-7. Kanker
penghambatan
proliferasi
Berdasarkan penelitian yang telah
payudara
dan
kanker
dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai
serviks merupakan 2 jenis kanker yang
berikut :
paling sering menyebabkan kematian pada
1.
wanita. Pada penelitian ini dilakukan uji
mempunyai
antiproliferasi dari daun maupun biji
terhadap sel kanker payudara MCF-7.
kuhung-kuhung (Crotalaria paliida Aiton)
2. Fraksi etil asetat daun, fraksi n-heksan
terhadap sel kanker payudara MCF-7.
biji, fraksi etil asetat biji dan ekstrak etanol
Hasil WST assay menunjukkan bahwa
daun berpotensi kuat dalam menghambat
ekstrak maupun fraksi C. pallida Ait
proliferasi sel kanker payudara MCF-7
menghambat sel kanker payudara MCF-7
dengan nilai IC50 berturut-turut
dengan nilai IC50 terkecil 29,67 µg/mL
µg/mL, 32.1 µg/mL, 44.25 µg/mL dan
oleh fraksi etil asetat daun diikuti oleh
56.7 µg/mL. Fraksi n heksan daun, fraksi
fraksi n-heksan biji, fraksi etil asetat biji
etil asetat daun dan biji berpotensi sedang
dan ekstrak etanol daun yang memiliki
dengan IC50 107,14 µg/mL terhadap MCF-
IC50 berturut-turut 32.1 µg/mL, 44.25
7, sedangkan ekstrak etanol biji, fraksi air
µg/mL dan 56.7 µg/mL. Fraksi n heksan
daun
daun, fraksi etil asetat daun dan biji
antiproliferatif baik terhadap MCF-7.
memiliki
nilai
IC50
107,14
µg/mL
terhadap sel kanker payudara MCF-7, 170,83 µg/mL sedangkan ekstrak etanol
Daun
dan
dan
biji
C.
aktivitas
biji
pallida
Ait.
antiproliferatif
tidak
29,67
berpotensi
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
11
Maioli, M. A., Alves, L. C., Perandin, D.,
DAFTAR PUSTAKA Boldrin, P. K., Resende, F. A., Höhne, A.
Garcia, A. F., Pereira, F. T., and
P., de Camargo, M. S., Espanha, L.
Mingatto,
G., Nogueira, C. H., and Varanda,
Cytotoxicity of monocrotaline in
E.
isolated rat hepatocytes: Effects of
A.
2013.
Estrogenic
and
F.
E.
mutagenic activities of Crotalaria
dithiothreitol
pallida measured by recombinant
fructose. Toxicon, 57(7),
yeast assay and Ames test. BMC
1064.
complementary
and
(2011).
and 1057-
alternative
medicine, 13(1):216.
Moelyono,
MW.
2014.
Etnofarmasi.
Yogyakarta : Deepublish.208-213 Farnsworth, N.R. 1966. Biological and Phytochemical Screening of Plants. J. pharm Sci (3): 243-269
Srinivas, N., Sandeep, K. S., Anusha, Y., and Devendra, B. N. 2014. In vitro Cytotoxic
Khalighi-Sigaroodi,
F.,
Hadjiakhoondi, M.,
Yazdani,
Ahvazi,
A., D.,
M.,
Taghizadeh, Khalighi-
Evaluation
Detoxification of Monocrotaline (Mct)
Alkaloid:
An
approach. International
silico
Invention
Journal
Cytotoxicity
Bioinformatics, 2(3), 20-29.
antioxidant
of
in
Sigaroodi, S., and Bidel, S. 2012. and
and
Biochemistry
and
activity of 23 plant species of Leguminosae family. IJPR, 11(1) : 295-302
Subarnas, A., Diantini A, Abdullah R, Zuhrotun A, et al 2015. Apoptosis induced in MCF-7 Human breast cancer cells by 2,4-dihydroxy-6-
Farmaka Vol. 14 No. 2 2016
methoxy-3,5-dimethylchalcone isolated from Eugenia aquea Burn F. Leaves. Oncology Letters
Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future. Jpn J Clin Oncol 32:17-21
12
