Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
SEMI SINTESIS SENYAWA 2,4,6-TRINITROFENILHIDRAZON KALANON DAN UJI AKTIVITAS TERHADAP SEL LEUKIMIA L1210 Mochammad Chasani1)*, Ponco Iswanto1), Eva Vaulina1), Winkanda Satria Putra1), M. Hanafi2) 1)
Program Studi Kimia MIPA Fakultas Sains dan Teknik, Universitas Jenderal Soedirman 2) Kimia LIPI, PUSPIPTEK, Serpong email:
[email protected]
ABSTRAK Kalanon adalah senyawa antikanker yang diisolasi dari Calophyllum biflorum Hends dan Ws. Aktivitas kalanon terhadap sel leukemia L1210 masih rendah yakni dengan niali IC50 = 59,4 ug/mL. Suatu senyawa dikatakan aktif sebagai antikanker jjika memiliki nilai IC50 di bawah 10 ug/mL. Penelitian ini ditujukan untuk mensintesis senyawa turunan kalanon dan diharapkan diperoleh senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi dibandingkan senyawa asal kalanon. Senyawa turunan kalanon diperoleh melalui reaksi antara kalanon dengan 2,4,6trinitrofenilhidrazin. Reaksi dilakukan pada suhu 78 oC selama delapan jam. Analisis pendahuluan senyawa hasil sintesis dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan eluen n-heksana dan etil asetat (2:1, v/v). Pemurnian senyawa hasil sintesis menggunakan teknik rekristalisasi dengan pelarut n-heksana dan diklorometan (3:1, v/v). Senyawa hasil sintesis diperoleh dengan Rf = 0,6609 dan rendemen 5,125 % ( b/b) serta berupa kristal berwarna coklat. Identifikasi senyawa hasil sintesis dilakukan dengan spektrometer massa dan spektrofotometer IR. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis yang diharapkan telah terbentuk. Data spektrometer massa diperoleh ion molekul M+ = 647 dengan lepasnya molekul H2. Fragmen-fragmen yang terbentuk adalah pada m/e = 504, m/e = 479, m/e = 451, m/e = 429, m/e = 405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316, m/e = 281, m/e = 253, m/e = 233, m/e = 207, m/e = 177, m/e = 156, m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73, dan m/e = 41. Hasil spektrofotometer IR menunjukkan pita serapan pada 1654.8 cm-1 yang merupakan daerah regang ikatan rangkap C=N, pita serapan pada 3000 cm-1 – 3400 cm-1 adalah pita getaran OH fenol dan pita pada 1380 cm-1 menunjukkan rentangan simetri gugus nitro (NO2). Hasil uji sitotoksik terhadap sel leukemia L1210 menghasilkan nilai IC50 sebesr 47.69 μg/ml. Kata kunci: Kalanon, sel leukemia L1210, 2,4,6-trinitrofenilhidrazin kalanon
SEMISYNTESIZED OF 2,4,6-TRINITROPHENILHIDRAZONE CALANONE AND ACTIVITY TEST TOWARDS LEUKEMIA CELL L1210
ABSTRACT Calanone is kind of anticancer compound that was isolated from Calophyllum biflorum Hends dan Ws. The biological activity of calanone towards leukemia cell L1210 is relatively low, it is by IC50 value at 59.4 μg/ml. A compound have a 66
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
high biological activity if it’s value of under 10 μg/ml. The aim of the research to synthesize the derivative calanone compound and hoped that there would be obtained such a new compound that has a higher activity than calanone. Derivate calanone compound is got through with react calanone and 2,4,6trinitrophenilhidrazine. The reaction was conducted at 78 ºC for 8 hours. Initial analysis for the compound that sintesized product is done within layer cromatrography (TLC) using n-heksan and etil acetate 2:1 (v/v) eluent. Recrystalization was used to pure the compound that synthesized product with n-heksan and methilen chloride 3:1 (v/v) solvent. The product synthesized give Rf= 0.609 and rendement 5.125 % (b/b), forming brown crystal. Identify of compound product was done by mass spectrophotometer and IR spectrophotometer. The result mass spectrophotometer showed that the compound that synthesized is 2,4,6-trinitrophenilhidrazone calanone. Mass spectra give molecular ion M+ 647, after loss H2 as molecule. The fragments done as: m/e = 504, m/e = 479, m/e = 451, m/e = 429, m/e = 405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316, m/e = 281, m/e = 253, m/e = 233, m/e = 207, m/e = 177, m/e = 156, m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73, and m/e = 41. Spectrophotometer IR vibration show spectra at: vibration at 1654.8 cm-1 as split double bonding range, 3000 cm-1 – 3400 cm-1 as vibration OH fenol that have hydrogen bonding and at 1380 cm-1 as stretching form nitro symetry (NO2). Cytotoxic test to leukemia cell L1210 yield the value IC50 equal to 47.69 μg/ml. Key words: Calanone, leukemia cell L1210, 2,4,6-trinitrophenilhidrazone calanone PENDAHULUAN Kanker merupakan penyakit pembunuh nomor satu di dunia setelah kardiovaskuler dan penyakit infeksi seperti tuberkolosa dan malaria. Tahun 2002 terdiagnosa lebih dari 10 juta kasus kanker baru di seluruh dunia dan 6 juta penderita meninggal (Sanofi-afentis, 2006). Kanker disebabkan karena pola hidup yang kurang sehat seperti kebiasaan merokok dan mengkonsumsi lemak dalam jumlah yang berlebih. Saat ini kanker menjadi penyebab kematian tertinggi bagi umat manusia. Kemungkinan sembuh pengidap pernyakit kanker jarang melampaui 20%. Berbagai usaha menanggulangi kanker terus berkembang diantaranya dilakukan pencarian senyawa aktif sebagai obat anti kanker. Senyawa aktif anti kanker diisolasi dari hasil alam dan dimodifikasi menjadi senyawa baru yang memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Saat ini banyak dikembangkan pencarian senyawa bioaktif dari tanaman yang mempunyai khasiat sitotoksik atau
antikanker yang potensial atau selektif. Lebih dari 400 spesies dalam 315 genus dan 97 famili mempunyai aktifitas sebagai penghambat kanker dan leukemia. Kalanon merupakan derifat kumarin yang dapat diisolasi dari getah Callophilum biflorum Hands & Ws. Potensi anti leukimia kalanon pertama kali dilaporkan oleh Swee Hock Goh dari Chemistry Department, National University of Singapore pada tahun 1999 (Hanafi, 2006). Aktifitas kalanon dalam menghambat pertumbuhan sel kanker belum diketahui secara pasti, tetapi salah satu kemungkinannya adalah dengan menghambat pembentukan fibrin pada permukaan sel tumor yang bermigrasi (Wibisono, 1997). Penelitian Harjono (2005) melalui perhitungan komputasi menggunakan teknik analisis PCR dan pendekatan model persamaan HKSA terbaik berhasil memprediksikan tiga senyawa turunan kalanon yang memiliki aktivitas anti leukemia lebih tinggi dibanding senyawa
67
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
asal kalanon (IC50 59,4 µg/ ml) (Chasani, 2002). Aktivitas prediksi tiga senyawa turunan kalanon tersebut adalah: Senyawa prediksi 1 (gem-diol kalanon): 57, 811 µg/ ml; senyawa prediksi 2 (2,4-dinitrofenilhidrazon kalanon): 30,935 µg/ ml dan senyawa prediksi 3 (2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon): 18, 964 µg/ ml. Suatu senyawa dikatakan berpotensi aktif sebagai anti leukemia bila daya hambatnya terhadap sel leukemia L1210 dibawah 10 µg/ ml. Berdasar latar belakang di atas, maka penelitian ini akan mensintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon. Produk semi sintesis yang diharapkan adalah suatu imina (2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon). Analisis pendahuluan produk 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dilakukan dengan metode kromatrografi lapis tipis, sedangkan pemurniannya dilakukan dengan kromatrografi kolom dan rekristalisasi. Identifikasi senyawa produk (2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon) dilakukan dengan spektrofotometer FT-IR dan spektrometer massa. Senyawa produk semi sintesis kemudian diuji aktivitas anti leukemia terhadap sel leukemia L1210.
METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Alat-alat yang akan digunakan pada penelitian adalah timbangan analitik, labu alas Bulat, corong pisah, erlemeyer, beaker glass, pipet ukur, pipet tetes, hot plate, alat ukur melting point, Spektrometer massa, spektrometer FT-IR 8201PC, bejana KLT, lampu UV 254 nm dan 366 nm dan rotari evaporator Buchii. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian adalah Kalanon (LIPI Kimia Puspitek, Serpong-Banten), 2,4,6-trinitrofenilhidrazin, Etanol, Asam Asetat Glasial, Heksana, Etil Asetat, HCl 5%, Natrium Sulfat Anhidrat,
68
Diklerometan, Silika Gel G60, Asam Sulfat pekat, Asam Nitrat pekat, Amonium Hidroksida, Aseton, Plat KLT dan Aquades. Prosedur Penelitian 1. Sintesis 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon Kalanon (424,1283 mg, 1 mmol) ditambah 2,4,6-trinitrofenilhidrazin (328,768 mg, 1,2 mmol) dilarutkan dalam etanol 20 ml dan ditambahkan asam asetat glasial 1 ml dimasukkan ke dalam labu alas bulat, kemudian direflux pada suhu 78 oC selama 8 jam. Produk hasil reaksi dianalisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 1). Penampakan noda dilakukan dibawah lampu UV pada panjang gelombang (λ) 254 nm dan 366 nm. Noda produk hasil sintesis dibandingkan dengan noda senyawa asal kalanon. Selanjutnya produk reaksi diekstrak menggunakan pelarut etilasetat : n-heksana (3 : 2). Ditambahkan natrium sulfat anhidrat pada fase etilasetat untuk menarik air yang masih terdapat pada fasa etilasetat ini dan kemudian disaring. Produk hasil sintesis diuapkan menggunakan rotari evaporator Buchii pada temperatur di bawah 78 oC agar etanol teruapkan dari produk sehingga didapatkan larutan pekat. Larutan pekat didiamkan sampai terbentuk padatan. Produk hasil sintesis (padatan) dimurnikan menggunakan kromatografi kolom dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (7 : 2,5), kemudian direkristalisasi menggunakan kloroform : n-heksana (2 : 1) dan sedikit metanol. Produk hasil rekristalisasi selanjutnya ditimbang. 2. Pemurnian senyawa hasil sintesis a. Kromatografi Kolom Kromatografi kolom dilakukan berdasar hasil uji KLT. Campuran reaksi diuapkan pelarutnya dan dihomogenkan dengan sedikit silica gel. Kolom diisi
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
dengan silica gel sampai ketinggian 6 cm dengan dibasahi eluen. Eluen yang digunakan adalah n-heksan : etil asetat (7 : 2,5). Kecepatan tetesan diatur hingga 40 tetes/ menit. Setiap fraksi hasil reaksi ditampung dan dianalisis dengan KLT untuk mengetahui produk yang diharapkan. b.Rekristalisasi Pemurnian senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon dilakukan dengan metode rekristalisasi. Kristal yang diperoleh dilarutkan dalam n-heksana dan diklorometan (3 : 1, v/v), kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai semua kristal larut. Larutan kemudian didekantasi dalam keadaan panas dan didiamkan pada suhu kamar sampai terbentuk kristal. Kristal kemudian dipisahkan dari larutannya dan dikeringkan dengan cara diuapkan di udara terbuka (Pasto et al. 1992) yang selanjutnya diuji kemurniannya menggunakan KLT fasa gerak n-heksana : etil asetat (2 : 1), dan diuji titik lelehnya. 3. Uji Sitotoksisitas terhadap Sel Leukimia L1210 (Sumatra, 1998) Bioasai dilakukan dalam multiwell plate tissue culture. Sel leukemia L1210 dipipet dan dimasukkan ke dalam lubang multiwell plate tissue culture (1ml sel leukemia L1210 /lubang yang mengandung 20 x 105 sel leukemia L1210 /ml). Ke dalam sel tersebut kemudian dimasukkan 10 µl larutan yang mengandung sampel kristal dalam metanol dengan variasi dosis 60, 30, 10 dan 5 µg/ml medium. Sebagai kontrol/blanko digunakan 10 µl metanol (harus sesuai dengan pelarut sampel). Sel selanjutnya diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 pada suhu 37 oC. Setelah masa inkubasi selesai, jumlah sel dihitung di bawah mikroskop menggunakan haemocytometer Fuch Rosental (0,200mm x 0.0625 mm2). Persentase inhibisi (penghambatan
pertumbuhan) sel oleh dihitung dengan rumus : % inhibisi = (1-
sampel
uji
) x 100% sel α = Jumlah sel hidup dalam medium yang mengandung sampel yang akan diuji ∑ = Jumlah sel hidup dalam kontrol Aktivitas inhibisi dinyatakan dengan nilai IC50 yaitu konsentrasi ekstrak dalam mg/ml medium yang dapat menghambat perkembangbiakan sel sebanyak 50 % setelah masa inkubasi 48 jam (Chasani, 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN Sintesis senyawa 2,4,6Trinitrofenilhidrazon Kalanon Senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon diperoleh melalui reaksi antara 2,4,6trinitrofenilhidrazin dan kalanon. Gugus Amina pada 2,4,6-trinitrofenilhidrazin berperan sebagai nukleofil yang menyerang gugus karbonil keton dari kalanon dengan membebaskan sejumlah molekul air. Pembentukan 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon dari 2,4,6trinitrofenilhidrazin dan kalanon ditunjukkan pada Gambar 1. Pemurnian senyawa hasil sintesis Senyawa produk reaksi dimurnikan dengan metode kromatografi kolom dan rekristalisasi. Kromatografi kolom dilakukan berdasarkan hasil KLT dengan perbandingan eluen n-heksan : etil asetat (7 : 2,5 ) v/v. Produk didapat pada fraksi ke-16 sampai fraksi ke-26. Uji KLT produk hasil pemurnian menggunakan perbandingan eluen nheksan : etil asetat (3 : 1) v/v, menghasilkan satu spot pada Rf = 0,467, perbandingan eluen n-heksan : etil asetat (2 : 1) v/v, menghasilkan satu spot pada Rf = 0,609 dan perbandingan eluen nheksan : etil asetat (1 : 1) v/v, menghasilkan satu spot pada Rf = 0,703.
69
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
Rendemen produk pemurnian metode kromatografi kolom sebesar 20% (b/b), dengan total perolehan massa produk murni sebesar 143 mg. Rekristalisasi dilakukan dengan menggunakan perbandingan eluen n-heksana dan diklorometan (3 : 1, v/v). Hasil rekristalisasi diperoleh senyawa produk berupa kristal berwarna coklat tua, dengan perolehan total massa produk metode rekristalisasi 37,5 mg. Rendemen pemurnian metode rekristalisasi sebesar 27% (b/b). Rendemen akhir metode pemurnian total sebesar 5,125 % (b/b) dari perolehan massa produk pemurnian sebesar 37,5 mg. Uji kemurnian senyawa hasil sintesis Uji titik leleh dilakukan untuk mengetahui kemurnian produk semisintesis. Kristal 2,4,6-
trinitrofenilhidrazon kalanon yang dihasilkan diuji titik lelehnya dengan menggunakan alat melting point. Senyawa meleleh pada suhu 245-247 ○C. Sedangkan titik leleh senyawa asal kalanon 172 ○C. Identifikasi struktur dengan FT-IR Hasil analisis FT-IR senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon menunjukan puncak-puncak pergeseran yang kemudian dibandingkan dengan puncak-puncak pergeseran senyawa kalanon. Spektrum IR senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon ditampilkan pada Gambar 2 dan kalanon pada Gambar 3. Puncak-puncak pergeseran senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dan kalanon ditampilkan pada Tabel 1.
Gambar 1. Reaksi pembentukan 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dari 2,4,6-trinitrofenilhidrazin dan kalanon
70
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
Gambar 2. Spektrum IR senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon
Gambar 3. Spektrum FT-IR senyawa Kalanon (Chasani, 2003)
Tabel 1. Data puncak-puncak pergeseran spektrum IR Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dan senyawa kalanon. Gugus Karakteristik Gugus Hidroksil Gugus Amina Ikatan C-H Sp3 Ikatan C-H Sp2 Ikatan C-C gugus metil Ikatan C=C Aromatic Gugus Nitro
Ikatan C=N imin Gugus Karbonil
Jenis Vibrasi Vibrasi ulur –OH
Bilangan Gelombang (cm-1) 2,4,6-Trinitro fenilhidrazon Kalanon Kalanon 3435 cm-1 3355,9 cm-1
Virasi ulur –N-H simetrik Vibrasi rentangan C-H Vibrasi rentangan C-H Vibrasi rentangan C-C Vibrasi rentangan C=C
-
3500 -3100 cm-1
2979 cm-1
2893 cm-1
3065 cm-1
2974 cm-1
1442 cm-1
1419,5 cm-1
1607 cm-1 1597 cm-
1454,2 cm-1
Vibrasi rentangan asimetri dan simetri (-N=O) Vibrasi tekuk (-N=O) Rentangan C=N
-
1380,8 cm-1
-
1654,8 cm-1
Vibrasi ulur – C=O ester Vibrasi gugus C-O ester Vibrasi ulur
1738 cm-1
1720,4 cm-1
1270 cm-1
1276,8 cm-1
Keterangan Serapan lebar Serapan sedang Serapan sedang Serapan sedang Serapan kuat Serapan kuat dan tajam Serapan tajam
756,0 cm-1
Serapan kuat Serapan kuat
71
Molekul, Vol. 6. No. 2. Nopember, 2011: 66 - 73
–C=O keton
Gambar 4. Spektrum MS senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon
Gambar 5. Pola fragmentasi dari spektrum massa senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon Identifikasi menggunakan Spektrometer Massa Berdasarkan data hasil analisis spektrometer massa (CG-MS) diperoleh M+ = 647. Spektrum CG-MS senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon ditampilkan pada Gambar 4. Selain fragmen M+ = 647 muncul fragmen-fragmen lain yaitu: m/e = 504, m/e = 479, m/e = 451, m/e = 429, m/e = 72
405, m/e = 377, m/e = 341, m/e = 316, m/e = 316, m/e = 281, m/e = 253, m/e = 233, m/e = 270, m/e = 177, m/e = 156, m/e = 135, m/e = 96, m/e = 73, dan m/e = 41. Fragmen-fragmen ini diperkirakan mengikuti pola fragmentasi seperti ditunjukkan pada Gambar 5. Uji sitotoksik terhadap sel leukimia L1210
Semi sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon... (Mochammad Chasani, dkk)
Hasil uji sitotoksisitas 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon terhadap sel leukimia L1210 memberikan harga IC50 sebesar 47,69 µg/mL sedangkan kalanon memiliki daya hambat (IC50) terhadap sel leukemia L1210 sebesar 59,4 µg/mL. Hal ini menunjukkan senyawa hasil modifikasi memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan sel leukemia L1210 yang lebih besar bila dibandingkan dengan senyawa asal kalanon. Modifikasi yang dilakukan terhadap senyawa kalanon pada situs aktif karbonil (posisi C-19) menghasilkan produk semisintesis senyawa 2,4,6trinitrofenilhidrazon kalanon telah berhasil meningkatkan aktivitas anti leukemia terhadap sel leukemia L1210.
KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian ini diperoleh kesimpulan sebagai berikut : 1. Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon dapat disintesis dari senyawa kalanon dan 2,4,6trinitrofenilhidrazin. 2. Produk hasil sintesis senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon menghasilkan rendemen sebesar 5,125 % (b/b). 3. Senyawa 2,4,6-trinitrofenilhidrazon kalanon memiliki daya hambat terhadap sel Leukimia L1210 sebesar 47,69 µg/mL.
DAFTAR PUSTAKA Chasani, M., 2002, Sintesis Senyawa Benzoilfenilalanin Ester Kalanon dan Uji Aktivitasnya Terhadap Larva Udang A. Salina, Leach, Tesis, Universitas Indonesia, Jakarta. Harjono, 2005, Kajian Hubungan Kuantitatif Struktur- Aktivitas Antikanker Senyawa Turunan Kalanon dengan Pendekatan PGR
(Principal Componen Regression), Sripsi, Program Sarjana MIPA Universias Jenderal Soedirman, Purwokerto. Kompas, 2004, Jakarta terancam Kanker Darah, www.kompas.com /kesehatan/news/0406/07/082726. htm, Diakses tanggal 1 april 2007. Made, S., 1998, Bioasai In Vitro dengan sel Leukemia L1210, Sebuah Metode Skrining Zat Antitumor dari Bahan Alam, Prosiding Seminar Bioteknologi Kelautan Indonesia, Jakarta. Siswono, 2004, Leukemia Peringkat Pertama Penyakit Kanker Pada Anak, www.en.wikipedia /leukemia/leukemia%20peringkat %20pertama.htm, Diakses tanggal 1 April 2007. Sukardiman, 2007, Efek Anti Kanker Isolat Flavonoid dari Herba Benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). www.kalbefarma.com., Diakses tanggal 4 Mei 2007. Sumatra, M., 1998, Bioasai In Vitro dengan Sel Leukemia L1210, Sebuah Metode Skrining Zat Antitumor dari Bahan Alam, Proseding Seminar Bioteknologi Kelautan Indonesia, Jakarta. Wibisono, L.K., 1997, Penentuan struktur Molekul Derivat kumarin dari Kulit Batang C. biflorum Hends dan Pengaruhnya Terhadap Pertumbuhan In Vivo Tumor kelenjas Susu Mencit C3H, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia Universitas Indonesia, Jakarta. Yuliati, 2007, Diagnosis dan Penatalaksanaan Leukemia Nonlimfoblastik Akut Pada Anak, www.society.com, Diakses tanggal 1 April 2007.
73
