PEMURNIAN SENYAWA AKTIF DARI DAUN KECAPI YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIKANKER SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MURINE LEUKEMIA P-388
FEBRIA ELVY SUSANTI
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Pemurnian Senyawa Aktif dari Daun Kecapi yang Berpotensi sebagai Antikanker Secara in Vitro terhadap Sel Murine Leukemia P-388 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, 18 April 2016 Febria Elvy Susanti NIM G451140301
RINGKASAN FEBRIA ELVY SUSANTI. Pemurnian Senyawa Aktif dari Daun Kecapi yang Berpotensi sebagai Antikanker Secara in Vitro terhadap Sel Murine Leukemia P388. Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan LAKSMI AMBARSARI. Kanker merupakan suatu penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Kanker yang terjadi akibat adanya peningkatan sel darah putih (leukosit) yang berlebihan disebut dengan leukemia, umumnya banyak menyerang anak-anak. Penumpukan sel darah putih tersebut dapat dicegah dengan menggunakan tanaman herbal. Tanaman herbal diduga memiliki senyawa yang berperan dalam membunuh sel kanker. Kecapi adalah tanaman herbal Indonesia yang diduga memiliki aktivitas antikanker untuk menghambat pertumbuhan kanker darah putih. Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi senyawa aktif dari daun kecapi melalui pemurnian yaitu kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom gravitasi (KKG), kromatografi radial (KR), dan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP), penentuan struktur molekul senyawa, dan pengujian aktivitas senyawa dalam mencegah pertumbuhan leukemia pada sel murine P-388. Penelitian menggunakan serbuk daun kecapi. Sebanyak 4000 g dimaserasi dengan metanol kemudian diperoleh ekstrak kasar metanol. Klorofil dipisahkan dengan metanol:air (1:1), sedangkan tanin dipisahkan dengan etil asetat. Ekstrak bebas klorofil-tanin dimurnikan dengan KCV dan diperoleh 7 fraksi (A Sampai G). Uji toksisitas terhadap setiap fraksi menggunakan uji kematian larva udang (Brine Shrimp Lethality Test) dan diperoleh fraksi E yang merupakan fraksi paling aktif dengan nilai % kematian sebesar 29.17%. Selanjutnya, pemurnian dengan KKG dilakukan terhadap fraksi E dan diperoleh 8 fraksi (E1 Sampai E8). Setiap fraksi dianalisis dengan menggunakan KLT kemudian dipilih fraksi E6 (noda pendar biru dengan intensitas lebih kuat) untuk pemurnian lebih lanjut dengan KR. Hasilnya diperoleh 2 fraksi. Fraksi E61 memiliki jumlah bobot lebih banyak dari fraksi E62, sehingga fraksi E61 dilanjutkan ke tahap pemurnian akhir menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Hasil yang diperoleh dari pemurnian ini adalah senyawa E611 sebanyak 104.80 mg dengan rendemen sebesar 35.31% (Rf = 0.58). Pencirian senyawa E611 menggunakan spektroskopi resonansi magnetik inti proton (RMI proton) dan spektroskopi massa menunjukkan senyawa E611 diduga mengandung (-)-loliolide. Uji sitotoksik terhadap sel murine leukemia P388 dilakukan pada ekstrak metanol bebas klorofil-tanin, fraksi E hasil KCV dan senyawa E611. Aktivitas fraksi E meningkat sebanyak 9.74 kali sedangkan senyawa E611 menurun 2 kali. Senyawa hasil isolasi diduga memiliki aktivitas antikanker leukemia. Kata kunci: (-)-loliolide, antikanker, kecapi, leukemia
SUMMARY FEBRIA ELVY SUSANTI. Active Compound Refinement from Kecapi Leaves that are Potential as Anticancer in Vitro Towards Leukemia Murine Cell P-388. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and LAKSMI AMBARSARI. Cancer is a disease that can cause death. Cancer can occur due to the abundant increase of white blood cells (leukocyte) called leukemia which generally attacks children. The accumulation of white blood cells can be prevented by using herbal plant. Herbal plant is thought to have compound which can kill cancer cells. Kecapi is one of Indonesian herbal plants which is thought to have an ability to prevent the growth of white blood cancer. The aims of this research were to isolate the active compound from kecapi plants through purification, i.e., vacuum liquid chromatography, gravity column chromatography, radial chromatography, and preparative thin layer, to determine the compound molecular structure, and compound activity test in order to avoid the growth of leukimia in murine cells P-388. This research used kecapi leaf powder. As many as 4000 g that were macerated with methanol can be obtained methanol crude extract. The chlorophyll was separated from the methanol:water (1:1), while the tannin was separated with ethyl acetate The free extract of chloropyll-tannin was purified with vacuum liquid chromatography, so 7 fractions (A to G) could be obtained. The test of toxicity towards each fraction used the test of Brine Shrimp Lethality. Thus E fraction could be yielded. This is the most active fraction with the inhibition grade of 29.17%. Next, the purification of gravity column chromatography was performed towards E fraction and then 8 fractions were obtained (E1 to E8). Each fraction was analyzed by using thin layer chromatography and then E6 was chosen (blue fluorescent stain with stronger intensity) to purify further with radial chromatography. As a result, there were 2 fractions that could be obtained. E61 fraction had more amount of weight compared to E62 fraction; therefore, E61 fraction could be continued to the level of final purification that used preparative thin layer of chromatography. The result obtained from the purtification was the compound of E611 as much as 104.80 mg with the yield of 35.31% (Rf = 0.58). Compound characterization of E611 used spectroscopy of proton nuclear magnetic resonace (RMI proton) and mass spectroscopy showed that E611 compund was suspected to contain (-)-loliolide. Cytotoxic test towards leukemia murine cells P-388 was performed in methanol extract of chlorophyll-tannin, E fraction as the resulf of vacuum liquid chromatography, and E611 compound. E fraction activity increased by 9.74 times, while E611 compound decreased by 2 times. Isolated compound was thought to have an activity of leukemia anticancer. Keywords: (-)-loliolide, anticancer, kecapi, leukemia
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PEMURNIAN SENYAWA AKTIF DARI DAUN KECAPI YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIKANKER SECARA IN VITRO TERHADAP SEL MURINE LEUKEMIA P-388
FEBRIA ELVY SUSANTI
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Ir Suminar S Achmadi Ph.D
Judul Tesis : Pemurnian Senyawa Aktif dari Daun Kecapi yang Berpotensi sebagai Antikanker secara in Vitro terhadap Sel Murine Leukemia P-388 Nama : Febria Elvy Susanti NIM : G451140301
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS Ketua
Dr Laksmi Ambarsari, MS Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Kimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof Dr Dyah Iswantini Pradono, MScAgr
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 18 April 2016
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2015 ini ialah pemurnian metabolit sekunder, dengan judul Pemurnian Senyawa Aktif dari Daun Kecapi yang Berpotensi sebagai Antikanker secara in Vitro terhadap Sel Murine Leukemia P-388. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Purwantiningsih Sugita, MS selaku pembimbing pertama dan Dr Laksmi Ambarsari, MS selaku pembimbing kedua yang telah banyak memberi arahan, semangat, dan do’a sehingga penulis menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis juga ucapkan terima kasih kepada Prof Ir Suminar S Achmadi Ph.D, Dr Eti Rohaeti, MS, Dr Mai Efdi, Dyah Utami Cahyaning Rahayu, M.Si, dan Betty Alfirizky Kustiana yang telah memberi saran. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, Bang Benny, Tria, Andeska Laboratory, dan teman-teman, atas segala doa dan kasih sayang serta dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, 18 April 2016 Febria Elvy Susanti
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
xii
DAFTAR GAMBAR
xii
DAFTAR LAMPIRAN
xii
PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian
1 1 2 2 2 2
METODE Bahan Alat Prosedur
3 3 3 3
HASIL 6 Simplisia dan Kadar Air 6 Kandungan Fitokimia Ekstrak Kecapi 6 Rendemen Ekstrak Daun Kecapi 7 Pemurnian Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin 7 Kemurnian Senyawa E611 10 Identifikasi Senyawa E611 11 Aktivitas Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin, Fraksi E Hasil Pemurnian Menggunakan KCV, dan Senyawa E611 sebagai Antikanker 12 PEMBAHASAN Ekstrak Daun Kecapi Kandungan Fitokimia Kecapi Kemurnian Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin Identifikasi Senyawa E611 Aktivitas Ekstrak Daun Kecapi
13 13 15 15 18 20
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
21 21 21
DAFTAR PUSTAKA
21
LAMPIRAN
26
RIWAYAT HIDUP
33
DAFTAR TABEL 1 2 3 4
Kandungan fitokimia tanaman kecapi Rendemen ekstrak daun kecapi Jumlah bobot fraksi hasil pemurnian ekstrak metanol bebas klorofil-tanin menggunakan KCV Jumlah bobot fraksi hasil pemurnian fraksi E menggunakan KKG
7 7 9 9
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Bentuk daun kecapi Profil KLT hasil pemisahan komponen serbuk daun kecapi Profil KLT fraksi hasil pemurnian EMBKT dengan KCV Profil KLT fraksi hasil pemurnian fraksi E dengan KKG Profil KLT (5.1) fraksi hasil pemurnian fraksi E6 dengan KR dan (5.2) senyawa E611 hasil pemurnian fraksi E61 dengan KLTP Profil KLT uji kemurnian senyawa E611 menggunakan tiga eluen berbeda Bentuk (a) kromatogram senyawa E611 dan (b) spektrum massa senyawa E611dengan waktu retensi 14.02 menit. Spektrum RMI proton senyawa E611 Kurva aktivitas ekstrak Pola fragmentasi senyawa E611
6 8 8 9 10 10 11 12 13 19
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4
Bagan alir penelitian Kadar air daun kecapi Data uji toksisitas fraksi dari ekstrak metanol bebas klorofil-tanin hasil pemurnian menggunakan KCV Data uji aktivitas antikanker ekstrak terhadap sel murine leukemia P388
27 29 30 32
PENDAHULUAN Latar Belakang Kanker merupakan suatu penyakit yang dapat menyebabkan kematian di seluruh dunia baik di negara maju maupun berkembang. Kanker rahim, otak, payudara, kulit, paru-paru, mulut, dan darah adalah penyebab tertinggi kematian akibat kanker (Badan Litbangkes Kementerian Kesehatan RI 2013). Leukemia merupakan bagian dari kanker darah yang paling banyak terjadi (Ravindranath 2015). Penderita leukemia mengalami peningkatan sel darah putih (leukosit) yang berlebihan sehingga sel-sel darah yang sehat akan berkurang. Penumpukan sel tersebut dapat dicegah dengan menggunakan tanaman herbal (Senthilkumar et al. 2014). Salah satu senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam tanaman herbal yang memiliki aktivitas biologi yang potensial dalam membunuh sel kanker adalah senyawa golongan saponin (Tung et al. 2010; Hu et al. 2010; Man et al. 2010) yang terdapat di dalam tumbuhan kecapi (Efdi et al. 2012). Kecapi merupakan salah satu tanaman herbal Indonesia yang memiliki potensi dalam menghambat pertumbuhan kanker darah putih. Kecapi (Sandoricum koetjape) berasal dari famili Meliaceae. Tanaman tersebut memiliki banyak manfaat dalam kehidupan sehari-hari. Akar dapat digunakan sebagai antiseptik, penghilang sakit pinggang, dan penguat tubuh wanita setelah melahirkan. Kulit batang kecapi bermanfaat sebagai obat kurap, antiangiogenik (Aisha et al. 2009a; Nassar et al. 2011), antibakteri (Susanti 2014), dan antikanker (Efdi et al. 2012) sedangkan daun digunakan untuk obat infeksi kulit, menurunkan panas, obat diare, dan sakit kepala. Uji kandungan metabolit sekunder (fitokimia) menunjukkan bahwa ekstrak kasar kulit batang kecapi mengandung senyawa golongan triterpenoid, saponin, alkaloid, fenol, dan flavonoid (Susanti 2014). Beberapa peneliti telah mengidentifikasi sejumlah senyawa metabolit sekunder pada kecapi dengan uji fitokimia dan kromatografi. Senyawa limonoid yang diisolasi dari daun kecapi adalah [2α-(2-metilbutanoil)oksi]-sandorisin dan [2α-(2-metilpropanoil)oksi]-sandorisin (Pancharoen et al. 2006), sedangkan Pancharoen et al. (2009) mengisolasi senyawa sandoripin-A dan -B. Selain senyawa limonoid, ada juga senyawa sanjekumin-A dan -B dan sandrapin-A dan B yang diisolasi dari daun kecapi (Nagakura et al. 2013). Hasil uji aktivitas terhadap sel J774.1 menunjukkan bahwa sandrapin-A dan -B dapat menghambat produksi nitrogen monoksida (NO) dengan nilai IC50 berturut-turut sebesar 16.4 dan 30.4 μM. Berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Efdi et al. 2012, peneliti mengisolasi senyawa metabolit sekunder dari kulit batang kecapi. Senyawa asam sentulat dan asam 3-oksoolean-12-en-27-oat dari hasil isolasi memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel leukemia HL-60. Aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara ditunjukkan oleh ekstrak kasar kulit batang kecapi (Aisha et al. 2009b) namun, asam kecapi bersifat non sitotoksik terhadap pertumbuhan pembuluh darah baru (Nassar et al. 2011). Utama et al. (2013) dan Famaidi (2013) juga mengisolasi senyawa golongan triterpenoid dari kulit batang kecapi. Senyawa tersebut bersifat sitotoksik sedangkan senyawa golongan kumarin bersifat sebagai antibakteri (Susanti 2014). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder pada kecapi dapat
2 digunakan sebagai obat-obatan. Berdasarkan uji pendahuluan yang telah dilakukan, daun kecapi memiliki kadar senyawa metabolit sekunder lebih banyak dibandingkan kulit batang. Berbagai senyawa telah diisolasi dari tanaman kecapi, namun pemurnian senyawa aktif yang berpotensi sebagai antikanker dilaporkan masih sedikit. Oleh sebab itu, pada penelitian ini dilakukan pemurnian senyawa aktif dari daun kecapi yang berpotensi sebagai antikanker secara in vitro terhadap sel murine leukemia P-388. Perumusan Masalah Berbagai senyawa metabolit sekunder telah banyak diisolasi dari kecapi, baik pada bagian kulit batang maupun daun. Senyawa ini berpotensi sebagai antiinflamasi (Rasadah et al. 2004), antibakteri (Susanti 2014), antiangiogenik (Aisha et al. 2009a; Nassar et al. 2011), dan sitotoksik (Efdi et al. 2012). Bioaktivitas dilaporkan menggunakan ekstrak kasar, sedangkan kajian bioaktivitas antikanker dari ekstrak kasar dan senyawa murni pada kecapi belum ada yang dilaporkan terhadap sel murine leukemia P-388. Hasil uji kandungan metabolit sekunder yang telah dilakukan Susanti (2014) menunjukkan bahwa senyawa metabolit sekunder di dalam daun kecapi memiliki kadar lebih banyak. Berdasarkan hal diatas, dilakukanlah pemurnian senyawa aktif dari daun kecapi yang memiliki aktivitas antikanker secara in vitro terhadap sel murine leukemia P388. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini memperoleh senyawa aktif dari daun kecapi yang berpotensi sebagai antikanker leukemia P-388, melalui empat tahap pemurnian yaitu kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom gravitasi (KKG), kromatografi radial (KR), dan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP). Manfaat Penelitian Penelitian bermanfaat terhadap perkembangan ilmu kimia organik bahan alam, dalam hal memberikan informasi metabolit sekunder pada tanaman kecapi yang memiliki potensi sebagai antikanker. Ruang Lingkup Penelitian Penelitian terdiri atas empat tahap, yaitu penyiapan simplisia daun kecapi, isolasi metabolit sekunder, pencirian senyawa aktif hasil isolasi, dan uji bioaktivitas sebagai antikanker terhadap sel murine leukemia P-388. Bagan alir penelitian disajikan pada Lampiran 1.
3
METODE Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2015 sampai Januari 2016 di Laboratorium Kimia Organik (Institut Pertanian Bogor) IPB, Laboratorium Teknologi Hasil Hutan IPB, Laboratorium Forensik Markas Besar Polisi Republik Indonesia, dan Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam, Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung (ITB). Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun kecapi yang diambil dari Dusun Ladang Laweh Sawahlunto, Sumatera Barat (ukuran 60 mesh), metanol (PT BRATACO), etil asetat (PT BRATACO), dan dimetilsulfoksida (DMSO) pro analis (EMSURE® ACS). Silika gel yang digunakan untuk pemurnian yaitu silika gel Merck 60 G untuk KCV, silika gel Merck 60 (0,063-0,2 mm) untuk KKG, silika gel Merck 60 (0,2-0,5 mm) untuk adsorpsi sampel, silika gel Merck 60 PF254 untuk KR, silika gel Merck 60 Kiesel GF254 untuk KLTP, dan silika gel Merck 60 F254 ukuran 20 × 20 cm untuk pelat KLT. Pelarut yang digunakan untuk pencirian senyawa murni adalah aseton-d6 (spektroskopi resonansi magnetik inti proton (RMI proton) Agilent 500 MHz) dan aseton pro analis (spektroskopi massa Agilent 6890). Alat Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah peralatan kaca yang umum digunakan di laboratorium organik, penguap putar R-114, dan detektor sinar tampak Heraeus W-Germany Ser No. 9311017. Jenis kromatografi yang digunakan untuk pemurnian adalah KLT, KCV, KKG, KR, dan KLTP. Pencirian senyawa murni menggunakan spektrometer RMI (Agilent 500 MHz, ITB) dan spektrometer massa (Agilent 6890, LabFor MABES). Prosedur Persiapan Simplisia Spesimen dari simplisia telah diidentifikasi oleh Susanti (2014) di Jurusan Biologi Universitas Andalas Padang, Sumatera Barat. Simplisia daun yang telah dikumpulkan kemudian dipotong kecil, dikeringkan pada suhu ruang dan diperoleh daun kering. Daun kering digiling menjadi ukuran 60 mesh di laboratorium Teknologi Hasil Hutan IPB. Penentuan Kadar Air Cawan porselen dipanaskan di dalam oven pada suhu 103±2 ºC selama 30 menit sampai bobotnya konstan. Sebanyak 1 g serbuk daun kecapi ukuran 60 mesh dimasukkan ke dalam cawan tersebut kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 103±2 ºC selama 3 jam. Setelah itu, cawan didinginkan di dalam desikator. Cawan yang telah dingin ditimbang dan dipanaskan hingga diperoleh bobot konstan (AOAC 2006). Kadar air contoh dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
4 % Kadar air =
A- B × 100% A
Keterangan: A : bobot sampel basah (g) B : bobot sampel kering (g) Uji Fitokimia Pengujian kandungan fitokimia mengikuti prosedur Harborne (1987). Pengujian meliputi uji flavonoid, fenol, saponin, tanin, triterpenoid, steroid, dan alkaloid. a. Uji flavonoid dan fenol Sebanyak 0.1 g ekstrak kasar metanol dilarutkan dengan kloroform-air (1:1), kemudian dikocok dan diamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan atas dibagi 2 yaitu satu untuk uji flavonoid dan satu lagi untuk uji fenol. Uji flavonoid dilakukan dengan menambahkan 0.1 g logam magnesium, 1 mL asam klorida pekat, dan 1 mL n-amil alkohol. Uji positif flavonoid apabila terbentuk warna kuning atau jingga. Uji fenol dilakukan dengan menambahkan besi(III) klorida 1%. Positif fenol ditandai dengan terbentuk warna hijau atau ungu. b. Uji saponin dan tanin Sebanyak 0.1 g ekstrak kasar metanol dilarutkan dengan kloroform-air (1:1), kemudian dikocok dan diamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah disaring. Residu dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 5 mL akuades. Larutan dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, lalu dimasukkan ke dalam 2 tabung reaksi. Larutan pada tabung pertama dikocok secara vertikal sampai terbentuk buih, kemudian didiamkan selama 10 menit. Larutan didiamkan setelah penambahan asam klorida 2N. Apabila buih tidak berubah maka positif terdapat saponin. Larutan pada tabung kedua ditambahkan besi(III) klorida 1%. Apabila warna menjadi biru atau hitam kehijauan maka positif terdapat tanin. c. Uji triterpenoid dan steroid Sebanyak 0.1 g ekstrak kasar metanol dilarutkan dengan kloroform-air (1:1), kemudian dikocok dan diamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan bawah disaring, filtratnya diteteskan ke lempeng tetes, dikeringkan, dan ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard. Jika terbentuk warna merah atau ungu maka positif mengandung triterpenoid dan jika terbentuk warna hijau atau biru maka positif mengandung steroid. d. Uji alkaloid Sebanyak 0.1 g ekstrak kasar metanol ditambahkan 10 mL kloroformamonia10% dan larutan disaring. Filtrat ditetesi dengan asam sulfat 2M, dikocok, kemudian ditambahkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (lapisan atas yang tidak berwarna) diteteskan ke lempeng tetes dan ditambahkan beberapa tetes pereaksi Wagner dan Dragendorff. Uji positif alkaloid berturut-turut menghasilkan endapan berwarna cokelat dan jingga. Isolasi Metabolit Sekunder Serbuk daun kecapi ukuran 60 mesh sebanyak 4000 g dimaserasi dengan metanol selama 24 jam pada suhu ruang dengan empat kali pengulangan. Hasil penyaringan dari maserasi diperoleh filtrat dan residu. Semua filtrat dipekatkan dengan penguap putar dan diperoleh ekstrak kasar metanol. Ekstrak dihitung
5 rendemennya dan diuji kandungan metabolit sekunder (fitokimia). Setelah itu, ekstrak kasar metanol dihilangkan klorofil dengan menambahkan metanol:air (1:1). Filtrat dan endapan dipisahkan. Endapan merupakan klorofil sedangkan filtrat ditambahkan etil asetat untuk memisahkan tanin. Ekstrak kasar metanol, ekstrak bebas klorofil, ekstrak bebas tanin, dan ekstrak bebas klorofil-tanin dilihat pola pemisahan nodanya dengan KLT (Galal et al. 2015). Ekstrak bebas klorofiltanin dimurnikan dengan KCV. Fraksi hasil KCV di-KLT kemudian fraksi dengan pola pemisahan noda yang sama digabung menjadi satu fraksi. Selanjutnya, pemurnian dilakukan dengan KKG, KR, dan terakhir dengan KLTP. Hasil akhir dari tahapan pemurnian ini adalah senyawa murni kemudian dilakukan verifikasi awal. Verifikasi menggunakan sistem 3 eluen, jika senyawa yang dihasilkan murni maka akan memberikan spot noda tunggal. Uji Toksisitas Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) Sebanyak 100 mg telur Artemia salina dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut. Telur tersebut ditetaskan di bawah pencahayaan lampu dengan dialiri udara menggunakan aerator. Setelah 48 jam, telur menetas menjadi larva kemudian digunakan untuk uji toksisitas dari ekstrak sampel. Ekstrak dibuat dengan beberapa variasi konsentrasi. Larutan stok (konsentrasi 1000 μg mL-1) dibuat dengan melarutkan ekstrak menggunakan air laut kemudian untuk membantu proses pelarutan ditambahkan 30 μL dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ekor larva ke dalam pelat mikro 96 lubang, kemudian ditambahkan ekstrak. Variasi konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 0, 50, 100, 200, dan 400 μg mL-1 dan setiap konsentrasi ulangan 3 kali. Air laut yang berisi 10 ekor larva kemudian ditambahkan 30 μL DMSO digunakan sebagai blangko (0 μg mL-1). Hasil dari pengujian dapat diketahui jumlah larva yang mati, kemudian dihitung % kematian menggunakan persamaan di bawah ini : Kematian larva % =
(Larva mati sampel-blangko ) × 100% Jumlah larva uji
Uji Kemurnian dan Pencirian Metabolit Sekunder Uji kemurnian senyawa hasil isolasi menggunakan 3 eluen yang berbeda. Pencirian senyawa hasil isolasi menggunakan spektroskopi RMI dan spektroskopi massa. Uji Bioaktivitas Antikanker Secara in Vitro Terhadap Sel Murine Leukemia P-388 Sel yang dijadikan target uji bioaktivitas adalah sel murine leukemia mencit. Uji tersebut merupakan langkah awal yang disarankan oleh Lembaga Kanker Nasional untuk mencari senyawa target yang memiliki aktivitas antikanker. Aktivitas sitotoksik
sampel dinyatakan sebagai nilai IC50. Nilai IC50 menunjukkan konsentrasi sampel yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker sebanyak 50% melalui pewarnaan pereaksi 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) (Alley et al. 1988). Uji dilakukan dengan menambahkan sampel (ekstrak metanol bebas klorofil-tanin, fraksi E hasil pemurnian dan senyawa murni E611 dari daun kecapi) dengan berbagai konsentrasi ke dalam biakan sel
6 murine leukemia P-388. Setelah diinkubasi selama 48 jam, perekasi warna MTT ditambahkan ke dalam sampel kemudian diinkubasi kembali selama 4 jam. Serapan yang terukur setelah penambahan larutan penghenti pertumbuhan menggunakan alat pembaca pelat mikro pada λ = 540 nm menunjukkan jumlah sel kanker leukemia P-388 yang terinhibisi oleh sampel. Artonin E digunakan sebagai senyawa standar. Persen inhibisi sampel diperoleh berdasarkan persamaan berikut: % inhibisi =
(A-B) × 100% A
Keterangan: A : serapan blanko B : serapan sampel Analisis Data Analisis statistik pada uji kematian larva udang dan bioaktivitas antikanker terhadap sel murine leukemia P-388 menggunakan program Microsoft Office Excel 2007.
HASIL Simplisia dan Kadar Air Penelitian ini menggunakan simplisia daun kecapi. Jumlah serbuk yang diperoleh dari hasil penyiapan simplisia adalah sebanyak 4000 g dengan ukuran 60 mesh (Gambar 1). Pengukuran kadar air dilakukan terhadap serbuk dengan menggunakan metode oven (suhu 105 ºC). Hasil pengukuran kadar air dapat dilihat pada Lampiran 2. Persen kadar air dari sampel adalah sebesar 3.32%.
Gambar 1 Bentuk daun kecapi Keterangan: (A) simplisia, (B) daun kering, (C) serbuk daun ukuran 60 mesh, (1) proses pengeringan pada suhu kamar, dan (2) proses penghalusan. Kandungan Fitokimia Ekstrak Kecapi Hasil uji fitokimia ekstrak kasar metanol daun kecapi dapat dilihat pada Tabel 1. Golongan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalam sampel adalah fenol, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid, sedangkan kandungan senyawa pada kulit batang menurut Susanti (2014) adalah fenol, flavonoid, triterpenoid, dan kumarin. Peneliti pada penelitian sebelumnya hanya melaporkan
7 adanya golongan senyawa triterpenoid pada daun (Pancharoen et al. 2009; Nagakura et al. 2013) dan kulit batang (Efdi et al. 2012). Tabel 1 Kandungan fitokimia tanaman kecapi Hasil penelitian
Pancharoen et al. 2009
Fenol
++
Flavonoid
++
~ ~
Saponin Tanin
+ ++ -
Golongan
Triterpenoid Steroid
++
Alkaloid Kumarin
×
Literatur Efdi et al. Nagakura et 2012 al. 2013 ~ ~
Susanti 2014 +
~
~
+
~
~
~
-
~
~
~
++ ~
++ ~
++ ~
× +
~
~
~
-
~
~
~
+
-
Tanda +/- menunjukkan ada atau tidak kandungan golongan senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak. ++ ada (kadarnya banyak), + ada (kadarnya sedikit), - tidak ada, × tidak dilakukan pengujian, dan ~ tidak dilaporkan.
Rendemen Ekstrak Daun Kecapi Hasil rendemen ekstrak daun kecapi dapat dilihat pada Tabel 2. Ekstrak kasar metanol diperoleh dari hasil maserasi 4000 g serbuk daun kecapi. Ekstrak klorofil dan ekstrak tanin masing-masing sebanyak 115.69 dan 50.06 g dihasilkan dari hasil pemisahan klorofil dan tanin terhadap 250.31 g ekstrak kasar metanol. Fraksinasi dilakukan pada filtrat yang mengandung tanin dengan menggunakan etil asetat sebanyak 6 kali ulangan, sehingga diperoleh ekstrak bebas klorofil-tanin sebanyak 73.54 g. Tingginya nilai rendemen menunjukkan semakin banyak senyawa yang terekstrak di dalam ekstrak tersebut. Tabel 2 Rendemen ekstrak daun kecapi Ekstrak Ekstrak kasar metanol Ekstrak klorofil Ekstrak tanin Ekstrak metanol bebas klorofil dan tanin
Rendemen (%) 7.50 46.22 19.20 29.38
Bentuk Gummy Endapan Gummy Gummy
Warna Cokelat kehitaman Cokelat kehitaman Cokelat tua Cokelat kehitaman
Pemurnian Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin Analisis selanjutnya adalah mengamati profil KLT dari masing-masing ekstrak dengan menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm (Gambar 2). Hasil KLT menunjukkan bahwa pada ekstrak kasar metanol terdapat 5 spot noda (1 noda biru dan 4 noda merah), sedangkan pada ekstrak metanol bebas klorofil dan tanin memiliki 3 spot noda (1 noda biru dan 2 noda merah). Pemurnian pada penelitian ini hanya difokuskan pada noda biru, karena noda merah diduga banyak mengandung senyawa yang tidak diinginkan, yaitu klorofil dan tanin. Spot noda biru memiliki intensitas lebih kuat dibandingkan spot
8 noda merah. Intensitas semakin kuat menandakan kandungan senyawa lebih banyak di dalam ekstrak.
Gambar 2 Profil KLT hasil pemisahan komponen serbuk daun kecapi Keterangan: (EKM) ekstrak kasar metanol, (EK) ekstrak klorofil, (ET) ekstrak tanin, dan (EMBKT) ekstrak metanol bebas klorofil dan tanin menggunakan lampu UV (a) λ = 254 nm, (b) λ = 366 nm. Pemurnian pada penelitian ini dilakukan melalui empat tahap pemurnian yaitu KCV, KKG, KR, dan KLTP. Hasil pemurnian ekstrak metanol bebas klorofil-tanin menggunakan KCV diperoleh 8 fraksi. Semua fraksi dianalisis pola noda pemisahan dengan KLT menggunakan eluen diklorometana:metanol (19:1) dapat dilihat pada Gambar 3. Fraksi D, E, F, dan G memiliki noda biru dengan intensitas kuat, sedangkan fraksi E dan F digabung menjadi 1 fraksi karena pola nodanya sama.
Gambar 3 Profil KLT fraksi hasil pemurnian EMBKT dengan KCV Keterangan: (a) lampu UV λ = 254 nm, (b) lampu UV λ = 366 nm, (*) ekstrak metanol bebas klorofil-tanin. Hasil penggabungan dan uji toksisitas fraksi dari pemurnian ekstrak metanol bebas klorofil-tanin dapat dilihat pada Tabel 3. Jumlah total fraksi diperoleh sebanyak 7 fraksi, yaitu fraksi A sampai G. Besarnya jumlah bobot fraksi menjadi dasar untuk dilakukannya pemurnian lebih lanjut. Persen kematian tertinggi menunjukkan fraksi bersifat sangat toksik sehingga memiliki potensi sebagai antikanker leukemia. Pemurnian lebih lanjut dilakukan terhadap fraksi E menggunakan KKG. Hasil pemurnian fraksi E diperoleh 8 fraksi, yaitu fraksi E1 sampai E8. Pemisahan pola noda fraksi dianalisis dengan KLT menggunakan eluen diklorometana: metanol (19:1) dapat dilihat pada Gambar 4. Fraksi E6 memiliki intensitas noda
9 biru lebih kuat, sehingga diduga kandungan senyawa lebih banyak di dalam fraksi tersebut. Tabel 3 Jumlah bobot fraksi hasil pemurnian ekstrak metanol bebas klorofil-tanin menggunakan KCV Fraksi
Jumlah Bobot (mg)a
Rendemen (%)
Kematian (%)
A
0.1
0.0005
Tidak dilakukan pengujian
B C D
118.1 521.7 2946.8
0.59 2.61 14.73
35.83 17.50 28.33
E F G
2107.5 2294.5 11123.6
10.54 11.47 55.62
29.17 49.17 26.67
a
Tanda menunjukkan jumlah bobot setelah penggabungan fraksi pola noda yang sama.
Gambar 4 Profil KLT fraksi hasil pemurnian fraksi E dengan KKG Keterangan: (a) lampu UV λ = 254 nm dan (b) lampu UV λ = 366 nm. Hasil jumlah bobot setiap fraksi dari pemurnian fraksi E menggunakan KKG disajikan pada Tabel 4. Fraksi E6 memiliki jumlah bobot kedua terbanyak yaitu sebanyak 438 mg. Banyaknya jumlah bobot menunjukkan kandungan senyawa banyak di dalam fraksi. Tabel 4 Jumlah bobot fraksi hasil pemurnian fraksi E menggunakan KKG Fraksi E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
Jumlah Bobot (mg) 143.5 45.0 98.3 166.8 154.4 438.0 474.4 224.4
Rendemen (%) 7.18 2.25 4.92 8.34 7.72 21.9 23.72 11.22
Pemurnian tahap ketiga dilakukan pada fraksi E6 menggunakan KR. Profil KLT fraksi hasil pemurnian fraksi E6 disajikan pada Gambar 5.1. Hasil pemurnian diperoleh 2 fraksi, yaitu E61 sebanyak 296.8 mg dengan rendemen
10 sebesar 69.02% dan E62 sebanyak 21.9 mg (5.09%). Besarnya nilai rendemen menunjukkan semakin banyak senyawa di dalam fraksi. Hasil profil KLT menunjukkan bahwa fraksi E62 tidak dilakukan pemurnian lebih lanjut karena jumlah bobot yang sedikit. Fraksi E61 terdapat 3 noda yang berdekatan dengan nilai Rf berturut-turut sebesar 0.78, 0.51, dan 0.41. Satu noda dengan nilai Rf = 0.78 memberikan noda pendar biru berpotensi sehingga pemurnian tahap ketiga difokuskan pada noda dengan Rf = 0.78. Pemurnian dilakukan menggunakan KLTP dan diperoleh senyawa E611 (Gambar 5.2). Senyawa E611 memiliki noda biru tunggal dengan intensitas kuat. Senyawa yang dihasilkan sebanyak 104.80 mg berwarna hijau kekuningan dan berbentuk gummy dengan rendemen sebesar 35.31% (Rf = 0.58).
Gambar 5 Profil KLT (5.1) fraksi hasil pemurnian fraksi E6 dengan KR dan (5.2) senyawa E611 hasil pemurnian fraksi E61 dengan KLTP Keterangan: (a) lampu UV λ = 254 nm dan (b) lampu UV λ = 366 nm. Kemurnian Senyawa E611 Uji kemurnian dilakukan terhadap senyawa E611 menggunakan 3 eluen berbeda dapat dilihat pada Gambar 6. Profil hasil KLT menunjukkan senyawa E611 merupakan senyawa murni karena masing-masing eluen menghasilkan spot noda biru yang tunggal.
Gambar 6 Profil KLT uji kemurnian senyawa E611 menggunakan tiga eluen berbeda Keterangan: (1) diklorometana:metanol = 19:1, (2) diklorometana:etil asetat = 9:1, (3) n-heksana:etil asetat = 3:7, (a) lampu UV λ = 254 nm, dan (b) lampu UV λ = 366 nm.
11 Identifikasi Senyawa E611 Analisis spektroskopi massa dilakukan dengan Agilent 6890 Gas Chromatograph disajikan pada Gambar 7. Hasil dari pencirian menunjukkan kromatogram spektroskopi massa senyawa E611 dihasilkan 5 puncak dengan waktu retensi 14.02, 14.12, 14.58, 14.81, dan 15.78 menit. Namun, hanya ada 2 puncak yang memiliki kelimpahan tertinggi yaitu 14.02 dan 14.12 menit (Gambar 7a). Senyawa E611 dengan waktu retensi 14.12 menit memiliki kemiripan yang sangat rendah dengan database WILLEY09TH. Sebaliknya, senyawa dengan waktu retensi 14.02 menit memiliki kemiripan 96% dengan database sehingga diduga senyawa E611 merupakan suatu senyawa (-)-Loliolide dengan bobot molekul 196 g mol-1 dan spektrum massanya dapat dilihat pada Gambar 7b.
Kelimpahan
(a)
s
14.12
2900000 2800000 2700000 2600000 2500000 2400000 2300000 2200000 2100000 2000000 1900000 1800000 1700000 1600000 1500000 1400000 1300000 1200000 1100000 1000000 900000 800000 700000 600000 500000 400000
14.02
13.85 13.90 13.95 14.00 14.05 14.10 14.15 14.20 14.25 Waktu retensi (menit) (b) HO
8000
O
Kelimpahan
O
6000 H
4000
(-)-loliolide m/z = 196 g mol-1
2000
0 0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
m z
Gambar 7 Bentuk (a) kromatogram senyawa E611 dan (b) spektrum massa senyawa E611dengan waktu retensi 14.02 menit. Dugaan senyawa E611 didukung oleh data spektrum Resonansi Magnetik Inti proton (RMI proton) yang disajikan pada Gambar 8. Hasil menunjukkan
12 bahwa dalam senyawa E611 terdapat 5 sinyal proton sedangkan dari struktur senyawa ada 7 sinyal. *1.60
HO 3.30
Aseton-d6
O O
*1.40
1.29
9.0 8.0
H 1.26
7.0
4.22
6.0 5.0 4.0
Kelimpahan
1.92
*1.68
3.0 2.0 1.0 0 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6
Geseran Geseran kimia kimia (δ) (ppm) ppm Gambar 8 Spektrum RMI proton senyawa E611 Aktivitas Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin, Fraksi E Hasil Pemurnian Menggunakan KCV, dan Senyawa E611 sebagai Antikanker Pengujian aktivitas pada penelitian ini menggunakan uji kematian larva udang dan antikanker sel darah putih. Nilai IC50 tidak bisa dihitung karena data tidak mewakili inhibisi. Pengujian BSLT merupakan screening awal untuk menentukan bioaktivitas suatu bahan (Meyer et al. 1982). Aktivitas toksisitas fraksi hasil pemurnian menggunakan KCV melalui analisis persen kematian (Lampiran 3). Kurva persen kematian dari semua fraksi disajikan pada Gambar 9a. Hasil uji menunjukkan bahwa persen kematian fraksi F lebih tinggi dibandingkan fraksi E, sedangkan hasil analisis KLT fraksi E memiliki intensitas spot noda biru yang lebih kuat. Pemurnian senyawa antikanker pada penelitian ini dilakukan pada fraksi E. Pengujian aktivitas antikanker ekstrak metanol bebas klorofil-tanin, fraksi E hasil pemurnian menggunakan KCV, dan senyawa E611 dilakukan terhadap sel murine leukemia P-388 dengan menggunakan sel target adalah sel murine leukemia mencit. Pengujian sitotoksik disarankan oleh NCI (National Cancer Institutei) sebagai langkah awal untuk mencari senyawa yang berpotensi sebagai antikanker. Gambar 9b menunjukkan aktivitas ekstrak terhadap sel murine leukemia P-388 melalui analisis persen inhibisi seperti Lampiran 4. Hasil uji fraksi E hasil KCV saat konsentrasi 30 µg mL-1 memiliki nilai inhibisi tertinggi yaitu sebesar 111.38%, sedangkan nilai inhibisi terendah pada senyawa E611 dengan nilai sebesar -51.38%. Fraksi E hasil KCV memiliki daya hambat lebih tinggi terhadap sel murine leukemia P-388, dibandingkan ekstrak metanol bebas klorofil-tanin dan senyawa E611.
13 9a
60
49.17
Kematian (%)
50 40
35.83
30
28.33
29.17
D
E
26.67
17.5
20 10
0
0
A
B
C
F
G
Fraksi
Inhibisi (%)
9b
120 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60
111.38 109.34
0.1
0.3
1
3
10
30
100
Konsentrasi (µg mL-1)
Gambar 9 Kurva aktivitas ekstrak Keterangan: (a) toksisitas terhadap larva udang (b) inhibisi terhadap sel murine leukemia P-388, % inhibisi ekstrak metanol bebas klorofiltanin, % inhibisi fraksi E hasil pemurnian dengan KCV, dan % inhibisi senyawa E611. PEMBAHASAN Ekstrak Daun Kecapi Simplisia daun kecapi merupakan salah satu sediaan herbal Indonesia. Penggunaan daun kecapi sebagai tanaman obat perlu penanganan yang baik agar kandungan dan kualitas senyawa bioaktif yang terdapat di dalamnya tetap baik. Pengeringan menyebabkan hilangnya air yang terikat secara fisik pada simplisia
14 sehingga sampel tidak mengadung air (Rahayu et al. 1994). Hasil pengukuran kadar air serbuk daun kecapi diperoleh kurang dari 10%. Kadar air yang baik dari suatu bahan yang telah dikeringkan adalah kurang dari 10%, karena pada tingkat tersebut sampel terhindar dari kontaminasi mikroorganisme (Kusnandar 2011). Ukuran partikel sampel dapat mempengaruhi laju ekstraksi. Semakin kecil ukuran partikel akan meningkatkan luas permukaan antara sampel dan pelarut untuk terekstrak sempurna (Azwanida 2015). Metode ekstraksi yang digunakan untuk mengekstrak senyawa yang memiliki potensi sebagai antikanker dari simplisia serbuk daun kecapi adalah maserasi. Metode maserasi merupakan teknik tradisional (Cujic et al. 2016) untuk mengekstraksi sampel yang belum diketahui daya tahan kandungan senyawanya terhadap panas. Simplisia serbuk daun kecapi diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol pada suhu ruang selama 24 jam dengan empat kali pengulangan. Metanol merupakan pelarut yang dapat mengekstrak senyawa yang terkandung di dalam daun kecapi (Ismail et al. 2003). Metanol memiliki struktur molekul yang kecil dan tetapan dielektrik yang tinggi sehingga dapat mengekstrak senyawa organik dengan sempurna (Harborne 1987). Senyawa-senyawa organik yang bersifat non polar, semipolar, dan polar dalam sampel akan terektrak ke dalam metanol. Ekstrak metanol terdapat banyak senyawa yaitu klorofil, tanin, dan senyawa yang akan dimurnikan. Menurut Gopi (2014) menyatakan bahwa klorofil memiliki aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker darah putih. Selain itu, tanin juga berfungsi sebagai antikanker. Kandungan senyawa klorofil dan tanin di dalam ekstrak dipisahkan menggunakan metanol:air (1:1) (Rahayu 2012). Klorofil akan terpisah dengan membentuk endapan ketika larutan sudah lewat jenuh, sedangkan tanin membentuk koloid dengan pelarut air. Fraksinasi bertujuan memisahkan fase air yang mengandung tanin dengan fase etil asetat berisi senyawa yang akan dimurnikan. Tanin merupakan suatu senyawa yang dapat larut di dalam air dan memiliki sifat sebagai antiangiogenik (Bawadi et al. 20015; Shahat et al. 2013). Nilai rendemen ekstrak dapat dihitung dengan menggunakan nilai kadar air sebagai faktor koreksi (Harborne 1987). Nilai rendemen ekstrak metanol bebas klorofil-tanin adalah sebesar 29.38%. Angka rendemen ekstrak yang dihasilkan jauh lebih besar dibandingkan nilai rendemen yang dilaporkan oleh Ismail et al. 2003 yaitu sebesar 2.7%. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terekstrak dari dalam sampel lebih banyak pada penelitian ini. Analisis selanjutnya adalah mengamati profil KLT dari masing-masing ekstrak. Ekstrak kasar metanol, ekstrak klorofil, ekstrak tanin, dan ekstrak metanol bebas klorofil-tanin dari serbuk daun kecapi dilihat pola pemisahan komponen dengan eluen diklorometana:metanol (19:1) menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Sistem eluen untuk KLT dicari terlebih dahulu menggunakan eluen tunggal dengan n-heksana, kloroform, etil asetat, aseton, dan metanol. Eluen dikombinasikan dengan menaikkan atau menurunkan kepolaran, sehingga diperoleh eluen terbaik (Moghadamtousi et al. 2014). Eluen terbaik diindikasi dengan pola noda terbanyak dan jarak antar noda tidak berdekatan. Hasil profil KLT pada Gambar 2 menunjukkan bahwa ekstrak metanol sebelum pemisahan memiliki 5 spot noda (4 noda merah dan 1 noda biru) menggunakan lampu UV 366 nm. Setelah pemisahan, spot noda yang dihasilkan
15 menjadi 3 noda (2 noda merah dan 1 noda biru). Hal ini disebabkan karena ekstrak kehilangan komponen yaitu klorofil dan tanin. Analisis profil KLT menunjukkan fluoresensi spot noda lebih kuat pada UV 366 nm, sedangkan pada penampak lampu UV 254 nm spot noda tidak muncul. Adanya gugus atom yang menyebabkan pergeseran pita absorbsi ke daerah panjang gelombang yang lebih besar sehingga intensitas menjadi naik (Ningrum et al. c2009). Senyawa hasil isolasi diduga berfluoresensi sangat kuat pada panjang gelombang 366 nm. Ekstrak bebas klorofil-tanin diuji fitokimia dan dimurnikan melalui empat tahap pemurnian meliputi KCV, KKG, KR, dan KLTP. Selama pemurnian, spot noda biru menjadi fokus karena memiliki intensitas yang kuat daripada spot noda merah. Intensitas spot noda yang kuat menunjukkan semakin banyak kandungan senyawa di dalam ekstrak. Kandungan Fitokimia Kecapi Penapisan fitokimia digunakan untuk memperoleh informasi awal mengenai kandungan senyawa metabolit sekunder yang berkhasiat di dalam daun kecapi (Harborne 1987). Hasil uji fitokimia pada Tabel 1 menunjukkan bahwa pada tanaman kecapi telah banyak diisolasi senyawa metabolit sekunder. Senyawa golongan triterpenoid telah berhasil diisolasi dari ekstrak metanol daun kecapi yaitu sandrapin-A dan -B (Ismail et al. 2003). Selain itu, metanol juga digunakan untuk mengisolasi senyawa golongan triterpenoid (sanjekumin-A dan -B) yang terdapat dalam daun kecapi (Nagakura et al. 2013). Senyawa golongan triterpenoid juga telah berhasil diisolasi Pancharoen et al. (2009) dan Efdi et al. (2012), namun mereka mengisolasi senyawa dari ekstrak etil asetat kulit batang kecapi. Menurut Susanti (2014), kadar senyawa pada daun kecapi lebih banyak dibandingkan kulit batang sehingga pada penelitian ini sampel yang digunakan adalah daun kecapi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa daun kecapi mengandung senyawa golongan fenol, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid. Kemurnian Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin Pemurnian bertujuan memperoleh suatu senyawa murni yang terdapat dalam ekstrak metanol bebas klorofil-tanin daun kecapi. Pada penelitian ini, senyawa murni yang diisolasi adalah senyawa yang memiliki aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia. Adapun tahapan-tahapan dari pemurnian yaitu: a. Kromatografi Cair Vakum (KCV) KCV digunakan sebagai langkah awal dalam pemurnian golongan senyawa metabolit sekunder ekstrak metanol bebas klorofil-tanin. Proses pemurnian didasarkan pada adsorbsi dan partisi yang dipercepat dengan bantuan pompa vakum untuk memudahkan penarikan eluen (Hostettmann et al.1995). Campuran eluen yang digunakan dalam proses pemurnian adalah n-heksana 100% (1 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 8:2 (2 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 7:3 (2 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 5:5 (4 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 3:7 (2 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 2:8 (2 kali elusi), etil asetat 100% (2 kali elusi), dan metanol 100% (5 kali elusi), dengan masing-masing 200 mL eluen per elusi. Elusi berdasarkan sistem kepolaran bertingkat bertujuan memisahkan noda target
16 pendar biru yang bersifat dari nonpolar, semipolar, dan polar. Fraksi dianalisis pola noda pemisahan dengan KLT menggunakan eluen diklorometana:metanol (19:1) serta diuji toksisitas menggunakan metode BSLT. Hasil analisis KLT menunjukkan ekstrak metanol bebas klorofil-tanin memiliki tiga spot noda. Jumlah spot noda mengindikasikan jenis senyawa yang berbeda. Senyawa terpisah menjadi beberapa fraksi sesuai dengan kepolaran eluen yang digunakan saat pemurnian dengan KCV. Fraksi E dan F memiliki pola noda dan intensitas noda biru yang sama sehingga digabung menjadi satu fraksi. Intensitas spot noda biru fraksi A sampai C dihasilkan sangat lemah. Spot noda terelusi sampai garis batas elusi karena bersifat sangat polar untuk dielusi dengan eluen diklorometana:metanol (19:1). Fraksi H menghasilkan noda yang berekor 1/2 dari garis batas elusi, namun spot noda biru tidak muncul. Sehingga fraksi H diduga mengandung senyawa pengotor saja. Hasil yang berbeda pada fraksi D sampai G, intensitas spot noda biru yang dihasilkan lebih kuat dibandingkan noda ekstrak sebelum pemurnian. Spot noda fraksi D sampai G berekor sampai batas elusi. Fraksi G merupakan fraksi yang memiliki bobot paling banyak dan diduga banyak mengandung senyawa hasil pemurnian. Hasil elusi fraksi G menghasilkan spot noda yang berekor sampai batas elusi. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi mengandung senyawa pengotor seperti lemak. Fraksi E memiliki bobot lebih sedikit dibandingkan fraksi G, sedangkan persen kematian fraksi E lebih tinggi dibandingkan fraksi G. Nilai persen kematian yang tinggi menandakan fraksi E memiliki aktivitas yang potensial untuk uji antikanker terhadap sel murine leukemia P-388. Fraksi A tidak dilakukan uji toksisitas karena jumlah bobot sangat sedikit. Dilihat dari urutan persen kematian fraksi dari yang tinggi sampai rendah, maka fraksi F > B > E > D > G > C. Jumlah bobot dari banyak sampai sedikit, fraksi G > D > F > E > C > B > A. Profil KLT dari intensitas spot noda biru yang lebih kuat sampai lemah, fraksi E > F > D > C > A > B > G. Pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG) dilakukan pada fraksi D, E, dan F. Namun, pada penelitian ini pemurnian hanya dilakukan terhadap fraksi E karena fraksi E merupakan fraksi aktif ketiga, jumlah bobot banyak, memiliki noda pendar biru yang lebih terang, dan pola pemisahan noda lebih bagus dibandingkan dengan fraksi D dan F. Noda pendar biru pada fraksi E menandakan adanya senyawa golongan keton di dalam sampel (Dewi 2008). b. Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG) KKG digunakan untuk memurnikan komponen dari suatu campuran. Pemurnian didasarkan pada daya adsorbsi suatu adsorben terhadap senyawa pengotor dan senyawa hasil isolasi. Campuran eluen yang digunakan dalam proses pemurnian adalah n-heksana 100% (1 ka li elusi), n-heksana:etil asetat = 7:3 (1 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 6:4 (2 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 5:5 (5 kali elusi), n-heksana:etil asetat = 4:6 (4 kali elusi), etil asetat 100% (3 kali elusi) dan metanol 100% (12 kali elusi), dengan masing-masing 100 mL eluen per elusi. Eluen (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom, karena adanya aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau dorongan dari tekanan (Sastrohamidjojo 1991). Fraksi hasil pemurnian dianalisis dengan KLT untuk melihat pola noda pemisahan. Hasil pemurnian menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam fraksi E terpisah berdasarkan kepolaran eluen yang digunakan. Fraksi E1 tidak
17 memiliki spot noda karena diduga mengadung pelarut dari eluen, sedangkan senyawa hasil pemurnian belum terpisah dengan eluen tersebut. Fraksi E2 sampai E5 menghasilkan spot noda biru dengan intensitas yang sangat lemah dan bersifat polar untuk dielusi dengan eluen diklorometana:metanol (19:1). Spot noda terelusi hingga garis batas elusi, sedangkan fraksi E3 dihasilkan noda yang berekor sepanjang garis elusi. Namun, fraksi E6 sampai E8 tidak polar untuk dielusi dengan eluen diklorometana:metanol (19:1). Spot noda biru intensitas sangat kuat hanya dihasilkan fraksi E6, sedangkan noda berekor sepanjang garis elusi. Hasil yang berbeda ditunjukkan pada fraksi E7, fraksi memiliki intensitas spot noda biru yang lemah. Fraksi E7 memiliki jumlah bobot yang paling banyak, namun fraksi masih mengandung senyawa pengotor. Hal ini ditunjukkan dari spot noda biru yang terelusi dengan noda yang berekor 1/2 dari garis batas elusi. Sebaliknya, intensitas spot noda biru pada fraksi E6 lebih kuat dibandingkan fraksi E7. Spot noda biru dari fraksi E6 terelusi dengan noda yang berekor sampai garis batas elusi. Dilihat dari urutan jumlah bobot fraksi dari yang banyak sampai sedikit, fraksi E7 > E6 > E8 > E4 > E5 > E1 > E3 > E2. Profil KLT dari intensitas spot noda biru yang lebih kuat sampai lemah, fraksi E6 > E7 > E4 > E3 > E5 > E8 > E2 > E1. Fraksi E6 merupakan fraksi yang memiliki jumlah bobot kedua banyak dan pola hasil pemisahan memberikan noda pendar biru yang lebih kuat. Oleh karena itu, pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatografi radial (KR) dilakukan pada fraksi E6. c. Kromatografi Radial (KR) KR digunakan untuk pemurnian komponen kimia dalam suatu sampel dengan bantuan gaya sentrifugal. Teknik ini memiliki rotor dengan kecepatan tertentu (Kulkarni et al. 2011). Komponen kimia bergerak berdasarkan perbedaan kepolaran dan kelarutan tiap komponen di dalam sampel. Pemisahan berdasarkan pada pendaran yang terbentuk dengan pengamatan di bawah sinar UV 366 nm, karena fraksi polar dari sampel memiliki bercak yang dapat berfluoresensi. Fraksi E6 sebanyak 430 mg dimurnikan menggunakan pelarut n-heksana, diklorometana dan metanol. Pertama-tama, fraksi E6 dilarutkan dengan aseton kemudian dielusi menggunakan n-heksana (20 mL) sampai noda pertama terelusi sempurna. Noda kedua dielusi dengan n-heksana:diklorometana:metanol (19:1:15) dan nheksana:diklorometana:metanol (19:1:10). Fraksi hasil pemurnian dianalisis pola noda pemisahan dengan KLT menggunakan eluen diklorometana:metanol (19:1). Hasil pemurnian menunjukkan bahwa fraksi E61 memiliki jumlah bobot lebih banyak dibandingkan fraksi E62. Hal ini disebabkan karena fraksi E61 mengandung senyawa pengotor ditandai dengan spot noda biru yang berekor. Fraksi E62 diduga merupakan senyawa murni, namun karena jumlah bobot yang sangat sedikit tidak dilakukan pencirian untuk mengetahui struktur kimia dan uji bioaktivitas antikanker terhadap sel murine leukemia P-388. Analisis profil KLT fraksi E61 terdapat 3 spot noda yang berdekatan (2 noda merah dan 1 noda biru) dengan nilai Rf berturut-turut sebesar 0.78, 0.51 dan 0.41. Dua noda merah dengan Rf = 0.51, dan 0.41 diduga senyawa pengotor, sedangkan noda pendar biru (Rf = 0.78) memiliki intensitas warna yang kuat. Intensitas kuat menunjukkan jumlah bobot senyawa dalam fraksi lebih banyak, sehingga pemurnian difokuskan pada noda pendar biru. Pemurnian lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dilakukan terhadap fraksi E61 dengan noda Rf = 0.78.
18 d. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) KLTP digunakan pada tahap akhir pemurnian untuk memurnikan noda pendar biru pada fraksi E61 (Rf = 0.78). Pemurnian menggunakan KLTP didasarkan pada adsorbsi dan partisi. Teknik ini berguna memisahkan campuran beberapa senyawa sehingga diperoleh senyawa murni (Gritter et al. 1991). Ekstrak fraksi E61 dilarutkan terlebih dahulu dengan aseton, sehingga dihasilkan larutan yang larut sempurna. Pelat KLT ukuran 20 cm x 20 cm dibuat menggunakan silika gel dan aquadest. Aquadest digunakan sebagai pencampur silika gel karena sifatnya tidak mudah menguap dibandingkan pelarut lain, seperti aseton dan metanol. Larutan fraksi E61 ditotolkan pada pelat kaca kemudian dielusi menggunakan eluen diklorometana:metanol (19:1). Eluen ini akan memisahkan 2 spot noda (Rf = 0.51 dan 0.41) yang berada dalam fraksi E61. Spot noda biru hasil elusi dikerok dari pelat KLTP kemudian dipisahkan dari silika gel menggunakan aseton. Filtrat spot noda biru dipekatkan dengan penguap putar sehingga diperoleh senyawa E611. Hasil uji kemurnian senyawa E611 menunjukkan bahwa senyawa telah murni karena masing-masing eluen menghasilkan spot noda biru yang tunggal. Noda yang dihasilkan berpendar kuat di bawah lampu UV 254 dan 366 nm, artinya keberadaan senyawa E611 lebih dominan pada sampel. Senyawa E611 dilakukan pencirian untuk mengetahui stuktur kimia menggunakan spektroskopi RMI proton dan spektroskopi massa. Identifikasi Senyawa E611 Hasil analisis spektroskopi massa menunjukkan bahwa kromatogram senyawa E611 dihasilkan 2 puncak. Hal ini menunjukkan senyawa hasil isolasi bukan senyawa tunggal karena terdapat senyawa asam lemak. Diduga pada senyawa mengandung senyawa pengotor yang menyebabkan puncak menjadi lebar. Loliolide pertama kali diisolasi dari famili Poaceae oleh Hodges & Porte pada tahun 1964. Pada tahun berikutnya, peneliti juga berhasil mengisolasi dari famili Apocynaceae senyawa tersebut namun, rendemen yang dihasilkan sangat kecil yaitu sebesar 8.3 × 10-4% (Geng & Liu 2008). Menurut Grabarczyk et al. (2015) menyatakan bahwa senyawa (-)-loliolide memiliki banyak aktivitas biologi yang menarik. Senyawa (-)-loliolide memiliki rumus molekul C11H16O3 sehingga dikenal sebagai monoterpen hidroksilakton. Aktivitas (-)-loliolide dari famili Ceramiaceae dilaporkan sebagai tripanosidal dan antifungal dengan rendemen senyawa yaitu sebesar 0.5% (Rocha et al. 2011). Pada penelitian ini, senyawa (-)-loliolide merupakan senyawa yang pertama kali diisolasi dari tanaman kecapi (famili Meliaceae), khususnya bagian daun. Nilai rendemen senyawa yang diperoleh adalah sebesar 35.31%. Angka tersebut jauh lebih besar dibandingkan penelitian sebelumnya. Penentuan struktur molekul dapat dilakukan berdasarkan pola fragmentasi yang disajikan pada Gambar 10. Ion-ion fragmen EI menunjukkan fragmenfragmen dari mana molekul tersusun dan bagaimana fragmen tersebut berkaitan satu dengan lainnya sehingga sesuai dengan molekul asalnya. Fragmentasi pertama adalah molekul H2O dengan bobot molekul 18 g mol-1 sehingga diperoleh molekul yang membawa muatan positif (m/z = 178 g mol-1). Reaksi pemindahan muatan memilih spesies yang elektronegatif dan molekul-molekul jenuh kecil
19 dengan energi ionisasi besar seperti H2O (McLafferty 1980). Fragmentasi selanjutnya terjadi pelepasan molekul dengan bobot molekul 15 g mol-1 yaitu molekul -CH3. Hasil fragmentasi merupakan suatu molekul yang memiliki bobot molekul 163 g mol-1. Fragmentasi yang disarankan hanya molekul-molekul yang memiliki kelimpahan tertinggi pada spektrum massa senyawa E611 (Gambar 7b). HO
HO
O
O
EI O
O
m/z = 196 g mol-1 -H2O H
H O
O
-CH3
H O
m/z = 163 g mol-1
O
m/z = 178 g mol-1
Gambar 10 Pola fragmentasi senyawa E611 Dugaan struktur molekul senyawa E611, didukung oleh data spektrum RMI proton (Gambar 8). Ada dua sinyal proton dari dua gugus metil pada geseran kimia 1.26 dan 1.29 ppm dan multiplisitas berupa singlet. Proton ini memiliki lingkungan kimia yang sama seharusnya muncul sebagai satu sinyal proton. Geseran kimia 1.29 ppm diduga merupakan proton pada karbon metilen dengan sinyal multiplet. Satu sinyal proton pada geseran kimia 1.92 ppm untuk gugus hidroksil dengan multiplisitas singlet. Berdasarkan literatur, sinyal proton gugus hidroksil muncul pada geseran kimia 2.00 ppm. Perbedaan geseran kimia pada proton disebabkan karena senyawa masih mengandung senyawa pengotor seperti lemak. Proton karbon metin muncul pada geseran kimia 3.30 ppm dengan sinyal triplet, sedangkan sinyal proton karbon metin senyawa dugaan muncul sebagai multiplet. Adanya geseran kimia 4.22 ppm menandakan proton pada cincin furanon dengan multiplisitas triplet, sedangkan multiplisitas sinyal proton cincin furanon senyawa dugaan singlet. Perbedaan juga disebabkan karena adanya senyawa pengotor di dalam senyawa hasil isolasi. Geseran kimia ke daerah lebih besar menyebabkan sinyal proton menjadi tidak terlindungi (deshielding) karena keelektronegatifan atom atau gugus tetangganya meningkat (Lambert et al. 2004). Berdasarkan data spektrum RMI proton, ada 2 sinyal yang tidak muncul yaitu proton pada karbon metil (singlet) dan metilen (multiplet) pada geseran kimia 1.60
20 dan 1.68 ppm. Ketidaksesuaian munculnya sinyal proton disebabkan senyawa E611 banyak mengandung senyawa asam lemak. Aktivitas Ekstrak Daun Kecapi a. Toksisitas Fraksi Hasil KCV Pengujian toksisitas dilakukan terhadap fraksi hasil pemurnian KCV menggunakan metode uji kematian larva udang (Brine Shrimp Lethality Test). Metode BSLT merupakan salah satu metode uji toksisitas yang paling sederhana dan banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bahan alam (Pisutthanan et al. 2004). Menurut Meyer et al. (1982) menyebutkan bahwa beberapa senyawa bahan alam yang berhasil diisolasi menunjukkan adanya korelasi antara uji antikanker dengan metode BSLT. Kelebihan uji BSLT adalah biaya murah, pengerjaan sederhana dan waktu analisis cepat. Uji aktivitas dengan metode BSLT memiliki hubungan yang konsisten antara kematian larva A. salina dengan berbagai konsentrasi ekstrak bahan alam (Carballo et al. 2002). Hasil uji toksisitas menunjukkan bahwa fraksi hasil pemurnian memiliki mortalitas yang beragam (Gambar 9a). Pengujian toksisitas tidak dilakukan pada fraksi A karena fraksi memiliki jumlah bobot yang sedikit dan tidak mencukupi untuk dilakukan uji. Fraksi F memiliki nilai persen kematian tertinggi dibandingkan fraksi lainnya. Hasil yang berbeda pada fraksi E, persen kematian fraksi lebih rendah. Menurut Famaidi (2013), nilai persen kematian fraksi tertinggi adalah sebesar 53.33%. Angka tersebut berada diluar kisaran nilai persen kematian yang dihasilkan pada penelitian ini yaitu sebesar 17.50-49.17%. Rendahnya nilai persen kematian disebabkan karena masih ada senyawa pengotor yang terdapat dalam fraksi. Saat fraksi C dilarutkan dengan air laut kemudian ditambahkan DMSO membentuk 2 fase. Senyawa pengotor terpisah dari fraksi dan menggangu proses pengujian. Akibatnya, persen kematian yang dihasilkan sangat rendah. Hal yang sama juga terjadi pada fraksi D, E dan G. Sebaliknya, fraksi B dan F proses pelarutan lebih sempurna akibatnya fraksi memiliki persen kematian lebih tinggi. b. Aktivitas Antikanker Ekstrak Metanol Bebas Klorofil-Tanin, Fraksi E hasil KCV, dan Senyawa E611 terhadap Sel Murine Leukemia P-388 Pengujian aktivitas ekstrak terhadap sel murine leukemia P-388 menunjukkan nilai inhibisi tertinggi yaitu sebesar 111.38%. Menurut Seftiana 2015 menyatakan bahwa inhibisi fraksi tertinggi terjadi pada nilai sebesar 95.96%. Adanya kerangka ikatan rangkap (Muhtadi et al. 2007) dan cincin-A (Efdi et al. 2012) pada struktur sangat penting dalam aktivitas sitotoksik. Fraksi E menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi, maka inhibisinya semakin tinggi. Sedangkan senyawa E611 semakin besar konsentrasi tidak menunjukkan adanya penghambatan, namun pada konsentrasi 100 µg mL-1 terlihat adanya penghambatan. Persen penghambatan tersebut lebih rendah dibandingkan fraksi E. Untuk melihat penghambatan dari senyawa E611 dapat dilakukan pengujian dengan konsentrasi yang lebih tinggi. Hasil dari penelitian ini diperoleh fraksi yang terbaik adalah fraksi E. Fraksi tersebut sesuai dengan hasil BSLT dan analisis KLT. Hasil BSLT menunjukkan nilai persen kematian fraksi E adalah sebesar 29.17%. Dilihat dari profil hasil
21 KLT fraksi E terdapat 5 komponen sedangkan senyawa E611 hanya memiliki 1 komponen. Ketika ekstrak dilakukan pemurnian melalui empat tahap pemurnian yaitu KCV, KKG, KR, dan KLTP maka akan ada komponen yang hilang. Akibatnya terjadi penurunan nilai inhibisi pada sampel. Diduga komponen yang hilang tersebut ikut berperan dalam proses penghambatan pertumbuhan sel kanker darah putih.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Daun kecapi mengandung senyawa bahan alam yang berpotensi sebagai antikanker leukemia. Senyawa yang berhasil diisolasi dari fraksi aktif ekstrak metanol daun kecapi diduga mirip dengan (-)-loliolide. Uji toksisitas fraksi hasil pemurnian dengan KCV menunjukkan bahwa fraksi E merupakan fraksi ketiga yang memiliki % inhibisi terbesar yaitu 29.17%. Besarnya rendemen fraksi yang dihasilkan dari setiap proses pemurnian adalah 10.54% (KCV), 21.9% (KKG), 69.02% (KR), dan 35.31% (KLTP). Fraksi E hasil pemurnian tahap pertama menggunakan KCV memiliki nilai inhibisi terbesar dari uji aktivitas antikanker terhadap sel murine leukemia P-388, aktivitas fraksinya meningkat sebanyak 9.74 kali. Artonin E digunakan sebagai standar dengan nilai inhibisi yang besar adalah 78.99%. Saran Perlu ditambahkan konsentrasi senyawa E611 yang lebih tinggi pada uji toksisitas. Perlu dilakukan uji aktivitas fraksi lain hasil pemurnian terhadap sel murine leukemia P-388 yaitu fraksi E, fraksi E6 hasil pemurnian dari fraksi E menggunakan KKG, serta fraksi E61 dan E621 hasil pemurnian dari fraksi E6 menggunakan KR. Perlu dilakukan pemurnian lebih lanjut pada fraksi F karena memiliki toksisitas yang tinggi.
DAFTAR PUSTAKA Aisha AFA, Sahib HB, Abu SKM, Darwis Y, Abdul MAMS. 2009a. Cytotoxic and anti-angiogenic properties of the stem bark extract of Sandoricum koetjape. Intern J Cancer Res. 5:105-114. Aisha AFA, Alrokayan SA, Abu SKM, Darwis Y, Abdul MAMS. 2009b. In vitro cytotoxic and apoptotic properties of the stem bark extract of Sandoricum koetjape on breast cancer cells. Intern J Cancer Res. 5:123-129. Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, Abbott BJ, Mayo JG, Shoemaker RH, Boyd MR. 1988. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetazolium assay. Intern J Cancer Res. 48:589-601.
22 [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2006. Official Methods Anal. Ed ke-14. Arlington. Azwanida NN. 2015. A review on the extraction methods use in medicinal plants, principle, strength, and limitation [ulasan]. Med Aromatic Plants. 4:196. doi:10.4172/2167-0412.100196. Badan Litbangkes Kementerian Kesehatan RI dan Data Penduduk Sasaran, Pusdatin Kementerian Kesehatan RI. 2013. Riset Kesehatan Dasar [Internet]. [Waktu dan tempat pertemuan tidak diketahui]. Bogor (ID): Dramaga. hlm 1-6; [diunduh 2015 Mai 19]. Tersedia pada: http://www.depkes.go.id/download.php?file=download/pusdatin/infodatin/ infodatin-kanker.pdf Bawadi HA, Bansode RR, Trappey II A, Truax RE, Losso JN. 2005. Inhibition of Caco-2 colon, MCF-7, and Hs578T breast, and DU 145 prostatic cancer cell proliferation by water-soluble black bean condensed tannins. Cancer Lett. 218(2):153-162. doi:10.1016/j.canlet.2004.06021. Carballo JL, Hernandez ZL, Perez P, Garcia MD. 2002. Comparison between two Brine Shrimp Assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. Biomed Central Biotechnol. 2:1472-6570. Cujic N, Katarina S, Teodora J, Dejan P, Gordana Z, Svetlana I. 2016. Optimization of polyphenols extraction from dried chokeberry using maceration as traditional technique. Food Chem. 194:135-142. doi:10.1016/j.foodchem.2015.08.008 Daood
HG. 2003. Chlorophyl. doi:10/1016/BO-12-22705.
Encyclop
Food
Sci
Nut.
1196-1205.
Efdi M, Masayuki N, Erma S, Kaori T, Sanusi I, Kunitomo W, Mamoru K. 2012. Sentulic acid: a cytotoxic ring a-seco triterpenoid from Sandoricum koetjape Merr. Bioorg Med Chem. 4242-4245. Famaidi M. 2013. Isolasi dan karakterisasi senyawa metabolit sekunder dari fraksi aktif terhadap “Brine Shrimps Lethality Bioassay”dari kulit batang kecapi (Sandoricum koetjape) [skripsi]. Padang (ID): Universitas Andalas. Galal AM, Avula B, Ikhlas AK. 2015. Utility of thin-layer chromatography in the assessment of the quality of botanicals. Instrum Thin-Layer Chroma. 479504. doi.org/10.1016/B978-0-12-417223-4.00018-2. Geng C, Liu X. 2008. New macrocyclic diamide from Rauvolfia Yunnanensis Tsiang. Chem Res in Chines Univ. 24:303-305. Gopi S, Karthik V, Robin G. 2014. A short review on the medicinal properties of chlorophyll juice [ulasan]. Asian J Pharm Techno Innov. 2:9. Grabarczyk M, Katarzyna W, Wanda M, Bartlomiej P, Miroslaw A. 2015. Loliolide - the most ubiquitous lactone. Folia Bio et Oeco. 11:1-8. doi:10.1515/fobio-2015-0001. Gritter RJ, Bobbit JM, Schwarting AE. 1991. Pengantar Kromatografi. Kokasih P, penerjemah. Bandung (ID): ITB. Terjemahan dari: Introduction to Chromatography. Ed ke-2:115,160-169.
23 Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochem Methods. Ed ke-2. Hodges R, Porte AL. 1964. The structure of loliolide : a terpene from Lolium perenne. Tetrahedron. 20:1463-1467. Hostettmann K, Hostettmann M, Marston A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Kokasih P, penerjemah. Bandung (ID): ITB. Terjemahan dari: Preparative Chromatography Techniques . Ed ke-33:9-11. Hu K, Saideh B, […], Bror M. 2010. Nanoparticulate Quillaja saponin induces apoptosis in human leukemia cell lines with a high therapeutix index. Intern J Nanomed. 5:51-52. Ismail IS, Hideyuki I, Tsutomu H, Shoko T, Takashi Y. 2003. Modified limonoids from the leaves of Sandoricum koetjape. Phytochem. 64:1345-1349. Januar SE, Purwantiningsih S, Budi A. 2015. Identification of trans-cinnamic acid in sinyo nakal (Duranta repens) fruits’ methanol extract. Intern Res J Pure App Chem. 8(2):73-80. doi:10.9734/IRJPAC/2015/17616. Kulkarni, Naval,.... 2011. Centrifugal thin layer chromatography. Asian J. Pharm Life Sci. 1:3. Lambert JB, Eugene PM. 2004. An Introduction to Principles, Applications and Experimental Methods. New Jersey (USA): Upper Saddle River. Kusnandar F. 2011. Kimia Pangan: Komponen Makro. Jakarta: Dian Rakyat. Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C. 2010. Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents. Fitoterapia. 81(7);703-14. doi:10.1016/j.fitote.2010.06.004. McLafferty FW. 1988. Interpretasi Spektra Massa. Hardjono S, penerjemah; Chairil A, editor. Jakarta (ID): Penerbit Gadjah Mada University Press. Terjemahan dari: Interpretation of Mass Spectra. Ed ke-3. Meyer BN, Ferigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, David EN. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituent. J Med Plant Res. 45:31-34. Moghadamtousi SZ, Karimian H, Rouhollahi E, Paydar M, Fadaeinasab M, Kadir HA. 2014. Annona muricata leaves induce G1 cell cycle arrest and apoptosis through mitochondria-mediated pathway in human HCT-116 and HT-29 colon cancer cells. Ethnopharmacol. 156:277-289. Muhtadi, Euis HH, Yana MS, Lia DJ, Laily BD, Jalifah L. 2007. Senyawa oligomer resveratrol dari kulit kayu Dipterocarpus retusus blume dan efek sitotoksiknya terhadap sel murin leukemia p-388. Pharmacon. 8(1):6-12. Nagakura Y, Alfarius EN, Yusuke H, Takahiro H, Abdul R, Idha K, Noor CZ, Hiroshi M. 2013. Sanjecumins A and B : new limonoids from Sandoricum koetjape. J Natur Med. 67:381-385.
24 Nassar ZD, Abdalrahim FAA, Zhari IKMAS, Salman AA, Amin MSAM. 2011. Antiangiogenic properties of Koetjapic acid, a natural triterpene isolated from Sandoricum koetjape Merr. Cancer Cell Intern. 1-9. Ningrum LP, Retno AL, Rahmad N. c2009. Dekolorisasi Remazol Brilliant Blue dengan menggunakan karbon aktif. Kim UNDIP. Pancharoen O, Haboonmee P, Taylor WC, Jaree B, penghimpun. 2006. Chemical Constituents from the Leaves of Sandoricum koetjape [bibliografi]. Chiang Mai (Thai): Natural Product Chemistry. 17 acuan dari database ISHS Acta Holticulturae 677 1 Februari 2005. doi:10.17660/ActaHortic.2005.677.6 Pancharoen A, Pipatana P. 2009. Two New Limonoids From the Leaves of Sandoricum koetjape. Natural Product Res. 23(1): 10-16. doi: 10.1080/14786410601133426 Pisutthanan S, Pinyupa P, Nisit P, Siriluk R, Onrudee M. 2004. Brine shrimp lethality activity of thai medicinal plants in the family Meliaceae. Naresuan Univ J. 12(2):13-18. Rahayu WP, Suryana P, Mety S. 1994. Pengaruh kadar air dan lama penyimpanan laru campuran Rhizopus oligosporus dengan Klebsiella pneumoniae terhadap kadar vitamin B-12 tempe. Bul Tek dan Indus Pangan. 5(3):54-59. Rahayu DUC. 2012. Kajian fitokimia daun bunga matahari (Helianthus annuus) dan bioaktivitasnya sebagai antimalaria dan sitotoksik terhadap sel murin leukemia p-388 [skripsi]. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Rasadah MA, Khozirah S, Aznie AA, Nik MM. 2004. Anti-inflammatory agents from Sandoricum koetjape Merr. Phytomed. 11:54-59. Ravindranath Y. 2015. Evaluation of modern treatment of childhood acute leukemia and cancer. Pediatr Clin N Am. 62:1-10. doi:10.1016/j.pcl.2014.09.005. Rocha OP, Rafael DF, Ana HBR, Daniela LA, Regina MBC, Sergio DA, Maria CMY, Nair SY, Hosana MD. 2011. Chemical profile and biological potential of non-polar fractions from Centroceras clavulatum (C. Agardh) montagne (ceramiales, rhodophyta). Molecules. 16:7105-7114. doi:10.3390/molecules16087105. Santos AF, Guevera BQ, Mascardo AM, Estrada CQ. 1978. Phytochemical, microbiological, and pharmacological, screening of medical plants. Manila: Research Center University of Santo Thomas. Sastrohamidjojo H. 1991. Kromatografi. Edisi ke-1. Yogyakarta (ID): Liberty. Seftiana H. 2015. Sitotoksisitas fraksi teraktif kemedangan pohon penghasil gaharu jenis Aquilaria microcarpa pada sel kanker payudara MCF-7 [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Senthilkumar R, Bao-An CHEN, Xiao-Hui CAI, Rong FU. 2014. Anticancer and multidrug-resistance reversing potential of traditional medicinal plants and their bioactive compounds in leukemia cell lines. Chinese J Natur Med. 12(12):881-894. doi:10.1016/S1875-5364(14)60131-X.
25 Shahat AA, Mohamed SM. 2013. Tannins and related compounds from medicinal plants of Africa. Med Plant Res in Afric. 479-555. doi:10.1016/B978-0-12405927-6.00013-8. Susanti FE. 2014. Isolasi dan karakterisasi senyawa kumarin dari ekstrak aktif etil asetat kulit batang kecapi (Sandoricum koetjape) sebagai antibakteri [skripsi]. Padang (ID): Universitas Andalas. Tung NH, Gyu YS, Jeong-Ah K, Jae-Hee H, Hee-Kyoung K, Young HK. 2010. Dammarane-type saponins from the flower buds of Panax ginseng and their effects on human leukemia cells. Bioorg Med Chem Letters. 20(1):309-314. doi:10.1016/j.bmcl.2009.10.110. Utama WA, Mai E, Adlis S. 2013. Isolasi senyawa triterpenoid dari fraksi aktif kulit batang kecapi dan uji bioaktifitas “Brine Shrimps Lethality Bioassay”. Kim UNAND. 2(1): 1-5. Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia.
26
LAMPIRAN
27 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Daun kecapi - dipotong kecil dan dikeringkan pada suhu kamar - digiling Serbuk daun kecapi 60 mesh (4000 g)
Penentuan kadar air
- dimaserasi dengan metanol Residu metanol
Filtrat metanol - dipekatkan dengan penguap putar Ekstrak kental metanol (7.50%) - diuji fitokimia - dihilangkan klorofil dan tanin
Ekstrak klorofil (46.22%)
Ekstrak tanin (19.20%)
Fraksi KCV
A B C D E F G
Ekstrak metanol bebas klorofil-tanin (29.38%) - diuji antikanker secara in vitro terhadap sel murine P-388 - ditentukan eluen terbaik - dimurnikan dengan KCV
(0.0005%) (0.59%) (2.61%) (14.73%) (10.54%) (11.47%) (55.62%)
- diuji kematian larva udang (Brine Shrimp Lethality Test) Fraksi aktif (fraksi E)
28 Lampiran 1 Bagan alir penelitian Fraksi aktif (fraksi E) - diuji antikanker secara in vitro terhadap sel murine P-388 - ditentukan eluen terbaik - dimurnikan dengan KKG E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
(7.18%) (2.25%) (4.92%) (8.34%) (7.72%) (21.9%) (23.72%) (11.22%)
- ditentukan eluen terbaik - dimurnikan dengan KR
E62 E61 (5.09%) (69.02% ) - ditentukan eluen terbaik - dimurnikan dengan KLTP Senyawa murni E611 (35.31%) - diuji antikanker secara in vitro terhadap sel murine P-388 - diuji kemurnian - dilakukan pencirian senyawa menggunakan spektroskopi RMI proton dan spektroskopi massa
Struktur molekul senyawa E611
29 Lampiran 2 Kadar air daun kecapi No
Berat cawan kosong (g)
Ulangan ke- (N)
Berat cawan terisi (g)
1
2
3
1
2
3
1
1
28.5365
27.4041
27.5373
29.454
28.3218
28.4554
2
2
28.5341
27.4022
27.5338
29.4526
28.3214
28.4563
3
3
28.5352
27.4024
27.5353
29.4549
28.3218
28.4562
Total
85.6058
82.2087
82.6064
88.3615
84.9650
85.3679
Total/N Sampel Berat awal (A)
28.5353 1.0006 28.5307
27.4029 1.0011 27.4012
27.5355 1.0018 27.5315
29.4538 1.0006 28.5307
28.3217 1.0011 27.4012
28.4560 1.0018 27.5315
% Kadar air =
A-B × 100% A
% Kadar air (1) =
28.5307 - 29.4538 × 100% = 3.23 % 28.5307
% Kadar air (2) =
27.4012 – 28.3217 × 100% = 3.36 % 27.4012
% Kadar air (3) =
27.5315 – 28.4560 × 100% = 3.36 % 27.5315
Rerata % kadar air =
3.2355 % + 3.3593 % + 3.3580 % = 3.32 % 3
30 Lampiran 3 Data uji toksisitas fraksi dari ekstrak metanol bebas klorofil-tanin hasil pemurnian menggunakan KCV
Sampel Fraksi A
Konsentrasi (µg mL-1)
Larva mati 1 2 3
Kematian larva (%) 1 2 3
Rerata
Tidak dilakukan pengujian
Fraksi B
0 0 0 0 50 3 1 2 30 100 5 1 2 50 200 7 5 1 70 400 10 3 3 100 0 0 0 0 Fraksi C 50 3 2 0 30 100 3 0 1 30 200 1 1 2 10 400 5 1 2 50 0 0 0 0 Fraksi D 50 0 6 0 0 100 1 3 2 10 200 4 4 2 40 400 2 6 4 20 0 0 0 0 Fraksi E 50 3 3 1 30 100 2 7 2 20 200 4 4 2 40 400 3 2 2 30 0 0 0 0 Fraksi F 50 5 0 2 50 100 4 8 5 40 200 3 4 5 30 400 7 7 9 70 0 0 0 0 b) Penentuan nilai LC50 dengan metode analisis probit Fraksi G 50 2 1 2 20 100 5 6 3 50 Contoh perhitungan: 200 fraksi A4-A5 2 2 1 20 Persamaan regresi 400 3 1 5 30 y = a + bx y = 12.29ln(x) - 1.380
10 10 50 30 20 0 10 10 60 30 40 60 30 70 40 20 0 80 40 70 10 60 20 10
20 20 10 30 0 10 20 20 0 20 20 40 10 20 20 20 20 50 50 90 20 30 10 50
0 20 26.67 43.33 53.33 0 16.67 13.33 13.33 26.67 0 20 20 33.33 40 0 23.33 36.67 33.33 23.33 0 23.33 56.67 40 76.67 0 13.33 46.67 16.67 30
31 Contoh perhitungan fraksi E; konsentrasi 50 µg mL-1 Kematian larva % =
(Larva mati sampel-blangko ) × 100% Jumlah larva uji
(3-0) × 100% 10 Kematian larva % = 30% =
32 Lampiran 4 Data uji aktivitas antikanker ekstrak terhadap sel murine leukemia P388
Keterangan: absorbansi 1 (A1), absorbansi 2 (A2), dan absorbansi 3 (A3).
Keterangan: absorbansi 1 (A1), absorbansi 2 (A2), dan absorbansi 3(A3).
Contoh perhitungan fraksi E hasil KCV; konsentrasi 30 µg mL-1 % inhibisi =
(Absorbansi (blanko-sampel) × 100% Absorbansi blanko
(0.5567-(-0.0633)) × 100% 0.5567 % inhibisi = 111.3706% =
33
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Solok (Sumatera Barat) tanggal 14 Februari 1992 sebagai anak kedua dari pasangan Nurmal dan Sitramaidawati. Penulis lulus SMA Negeri 2 Kota Solok pada tahun 2010. Penulis menyelesaikan pendidikan Program Sarjana di Departemen Kimia Universitas Andalas pada tahun 2014 dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) pada Program Pascasarjana di Departemen Kimia dengan sponsor Beasiswa BPPDN Fresh Graduate dari DIKTI. Jurnal tentang Pemurnian Senyawa Aktif dari Daun Kecapi yang Berpotensi sebagai Antikanker secara in Vitro terhadap Sel Murine Leukemia P-388 sedang dalam proses penerbitan pada International Journal of Chemical Sciences.
