Senyawa-senyawa Oligomer Resveratrol dari Kulit Batang Shorea brunnescens (Dipterocarpaceae) Haryoto1,3), Yana Maolana Syah1), Lia Dewi Juliawaty1), Sjamsul Arifin Achmad1), Jalifah Latip2), Euis Holisotan Hakim1 1) Kelompok Keahlian Kimia Organik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Bandung, Bandung 2) School of Chemical Science & Food Technology, Faculty of Science and Technology, Universiti Kebangsaan Malaysia, Malaysia 3) Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta e-mail:
[email protected] Diterima Desember 2005, disetujui untuk dipublikasi September 2006 Abstrak Enam senyawa oligomer resveratrol, yaitu (-)-ε-viniferin (1), (-)-laevifonol (2), (-)-vatikanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)-isohopeafenol (5) dan (-)-hopeafenol (6), telah diisolasi dari ekstrak aseton kulit batang Shorea brunnescens. Penentuan struktur senyawa-senyawa tersebut dilakukan berdasarkan data spektroskopi (UV, IR, 1H NMR) dan pembandingan dengan data literatur. Sitotoksisitas dari senyawa-senyawa yang diisolasi tersebut terhadap sel murin leukemia P-388 menunjukkan nilai IC50, berturut-turut 18,1; 23,2; 41,9; 12,3; 39,7; dan 5,5 µM. Kata kunci: Oligomer resveratrol, Sel murin leukemia P-388, Dipterocarpaceae, Shorea brunnescens Abstract Six resveratrol oligomers, namely (-)-ε-viniferin (1), (-)-laevifonol (2), (-)-vaticanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)isohopeaphenol (5), and (-)-hopeaphenol (6) have been isolated from the acetone extract of the stem bark of Shorea brunnescens. The structure determination of these compounds were based on spectroscopic data (UV, IR, 1H NMR), and compared with literature data. The cytotoxicity of isolated compounds against murine leukemia P-388 cells showed the IC50 values as 18.1, 23.2, 41.9, 12.3, 39.7, and 5.5µM, respectively. Keywords: Resveratrol oligomers, Murine leukemia P-388 cell, Dipterocarpaceae, Shorea brunnescens al., 2003; Ohyama et al., 1999), dan sebagai inhibitor 5α-reduktase (Hirano et al., 2001). Dalam artikel ini dilaporkan hasil isolasi enam senyawa oligomer resveratrol dari ekstrak aseton kulit batang S. brunnescens yaitu (-)-ε-viniferin (1), (-)laevifonol (2), (-)-vatikanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)-isohopeafenol (5), (-)-hopeafenol (6). Selain itu, dikemukakan pula sifat sitotoksik senyawasenyawa tersebut terhadap sel murin leukemia P-388. Kajian fitokimia dan sifat sitotoksik senyawa-senyawa oligomer resveratrol dari tumbuhan S. brunnescens ini merupakan hasil penelitian yang belum pernah dilaporkan sebelumnya.
1. Pendahuluan Shorea (163 spesies) merupakan genus utama dari tumbuhan famili Dipterocarpaceae selain Hopea (100 spesies) dan Dipterocarpus (75 spesies). Di Indonesia terdapat sekitar 79 spesies Shorea dan 56 spesies tersebut tersebar di Kalimantan. Selain itu, 27 spesies diantaranya merupakan tumbuhan endemik Indonesia. Salah satu spesies dari Shorea adalah S. brunnescens yang tersebar luas di Kalimantan, Sumatera, Malaya, dan Thailand. Genus ini dikenal dengan nama lokal yaitu meranti sarang punai, meranti bunga, meranti samak, meranti daun halus (Malaya), meranti sabut (Sumatera), atau selangan batu tinteng (Kalimantan) (Ashton, 1983; Cronquist, 1981; Heyne, 1987; Sotheeswaran et al., 1993). Penelitian fitokimia yang telah dilakukan terhadap Shorea menunjukkan bahwa kandungan kimia utama genus ini adalah oligomer resveratrol. Beberapa senyawa oligomer resveratrol tersebut diketahui memiliki aktivitas sebagai antifungi (Bokel et al., 1988; Pryce et al., 1977), anti HIV (Dai et al., 1988), antibakteri (Nitta et al., 2003), antiinflamasi (Kitanaka et al., 1990), antitumor (Ito et
2. Metode 2.1 Alat dan bahan Kromatografi vakum cair (KVC) dan kromatografi radial yang masing-masing menggunakan silika gel 60 GF254 dan 60 PF254, serta kromatografi lapis tipis (KLT) dengan plat aluminium berlapiskan silika gel Merck Kieselgel 60 F254 setebal 0,25 mm, digunakan untuk fraksinasi dan pemurnian. Untuk 89
90 JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, SEPTEMBER 2006, VOL. 11 NO. 3
penentuan struktur digunakan Spektrofotometer Varian Cary 100 Conc, spektrofotometer FTIR Perkin Elmer SPECTRUM ONE; NMR JEOL ECP 400 yang beroperasi pada 400 MHz (1H) dan 100 MHz (13C) dengan residu pelarut aseton-d6 (δH 2,04 ppm) dan pelarut terdeuterasi (δC 29,8 ppm) sebagai standar. Pelarut organik yang digunakan berkualitas teknis yang didestilasi terlebih dahulu sebelum digunakan, kecuali CHCl3 yang berkualitas p.a. Kulit batang S. brunnescens dikumpulkan dari wilayah HPH PT Aya Yayang Indonesia Camp 63, Tanjung, Tabalong, Kalimantan Selatan, pada bulan Juli 2004. Identitas tumbuhan S. brunnescens ditentukan di Herbarium Bogoriense, Balai Penelitian dan Pengembangan Biologi, LIPI, Bogor, dengan nomor determinasi 809/IPH.1.02/If.8/2004. 2.2 Ekstraksi, isolasi dan penentuan struktur Sebanyak 3,0 kg serbuk kering kulit batang S. brunnescens dimaserasi dengan aseton selama 24 jam (3 kali). Ekstrak aseton pekat (550 g) ditambahkan eter untuk mengendapkan tanin. Filtrat yang didapat diuapkan dengan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kering berwarna coklat (325 g). Sebagian dari ekstrak tersebut (60 g) yang difraksinasi dengan KVC dengan eluen yang ditingkatkan kepolarannya (nheksana-EtOAc, EtOAc, EtOAc-MeOH) menghasilkan fraksi A (190 mg), B (590 mg), C (34,30 g), D (529 mg), dan E (440 mg). Pemisahan lebih lanjut fraksi C (4 g) menggunakan kromatografi radial (eluen CHCl3MeOH) dan kemudian dengan KVC (eluen n-heksanaEtOAc) menghasilkan lima fraksi, yaitu C1 (830 mg), C2 (270 mg), C3 (490 mg), C4 (2, 60 g) dan C5 (80 mg). Selanjutnya, fraksi C3 (490 mg) dimurnikan dengan kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) sehingga menghasilkan senyawa 1 (34 mg), sedangkan fraksi C4 dipisahkan menggunakan kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) menghasilkan delapan fraksi, yaitu C4.1-C4.8. Fraksi C4.2 difraksinasi menggunakan kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) dan diperoleh dua fraksi utama, yaitu C4.2.1 dan C4.2.2. Selanjutnya, fraksi C4.2.1 (290 mg) dimurnikan dengan
kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) menghasilkan senyawa 2 (116 mg). Fraksi C4.2.2 (320 mg) yang juga dimurnikan dengan cara yang sama menghasilkan senyawa 3 (71 mg). Setelah itu, fraksi D (529 mg) difraksinasi dengan kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) menghasilkan tiga fraksi, yaitu D1-D3. Pemurnian fraksi D1 (70 mg) dengan kromatografi radial (eluen CHCl3-MeOH) sehingga menghasilkan senyawa 6 (15 mg). Dengan cara yang sama, dari fraksi E (440 mg) diperoleh senyawa 5 (9 mg). Struktur dari senyawa-senyawa yang diisolasi ditentukan berdasarkan spektrum UV, IR, dan spektrum 1 H NMR. 2.3 Penentuan sifat sitotoksik Aktivitas sitotoksik senyawa 1-6 diuji terhadap sel tumor murin leukemia P-388 (Alley, 1988). Jumlah sel tumor P-388 yang hidup ditentukan berdasarkan serapan pada panjang gelombang 540 nm dengan menggunakan Elisa microplate reader. Aktivitas sitotoksik senyawa 1 - 6 dinyatakan dalam IC50, yaitu konsentrasi senyawa hasil isolasi yang dibutuhkan untuk menginhibisi 50% pertumbuhan sel murin leukemia P-388. Nilai IC50 ditentukan berdasarkan ekstrapolasi garis 50% serapan pada kurva serapan terhadap konsentrasi senyawa yang diuji. 3. Hasil dan Pembahasan Enam senyawa oligomer resveratrol (Gambar 1) berhasil diisolasi dari kulit batang S. brunnescens, yaitu dua dimer resveratrol (-)-ε-viniferin (1), dan (-)laevifonol (2) serta empat tetramer resveratrol, yaitu (-)-vatikanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)isohopeafenol (5), dan (-)-hopeafenol (6). Dalam artikel ini hanya dilaporkan penentuan struktur satu senyawa yang telah diisolasi dari S. brunnescens, yaitu (+)isohopeafenol (5).
91 JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, SEPTEMBER 2006, VOL. 11 NO. 3
OH
HO H O
OH
OH HO H
H
H
HO OH
O O
OH HO
HO
H
(1)
HO
HO
H O
H OH
H
H
4' 7'
O 1'
6'
H
OH HH
HO
OH H
H
5'
(2)
OH O
2'
3'
7b
O
H
OHO
8b
H
O
OH H
H
HO
H
OH OH
H OH
HO
OH
H
OH
OH
HO
OH OH
OH
(3)
H
H O
H OH
(4)
HO
HO 4a
A1
HO
14a
1a
H
A2 12a
OH
H
H
O
OH
7a
B2
8a
O HO
C2
H
H
B1
4d
H
H
H 10d
H O
OH
H OH
OH
O HO
H
HO
OH
D2 7c 1c
12d
OH
OH
H
H
H H
OH
C1
4b
OH
8d 8c
7b
H
D1
7d
8b
1b
1d
OH
4c
(5)
OH
OH
(6)
OH
Gambar 1. Struktur molekul (-)-ε-viniferin (1), (-)-laevifonol (2), (-)-vatikanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)isohopeafenol (5), dan (-)-hopeafenol (6) hasil isolasi dari kulit batang S. brunnescens.
92 JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, SEPTEMBER 2006, VOL. 11 NO. 3
(+)-Isohopeafenol (5), diisolasi dalam bentuk serbuk coklat, t.l. 225-227oC (terurai), [α]D20 +25o (c=0,1 dalam MeOH). UV (MeOH) λmaks 203, 226 (bahu), 284 nm. UV (MeOH+NaOH) λmaks 207, 249 (bahu), 289 nm IR (KBr) νmaks 3369, 1612, 1511, 1451, 835 cm-1. Spektrum 1H-NMR (aseton-d6) δ ppm ditampilkan pada (Tabel 1). Tabel 1. Data 1H NMR (+)-isohopeafenol (5) dalam aseton-d6 δH (mult., J dalam Hz) ppm 6 6* 2/6a 7,52 (d, 8,4) 7,52 (d, 8,8) 3/5a 6,99 (d, 8,4) 6,98 (d, 8,8) 7a 5,65 (d, 10,3) 5,63 (d, 10,3) 8a 5,44 (d, 10,3) 5,42 (d, 10,3) 12a 6,33 (d, 2,2) 6,36 (d, 2,2) 14a 6,28 (d, 2,2) 6,28 (d, 2,2) 2/6b 6,38 (d, 8,8) 6,37 (d, 8,8) 3/5b 6,32 (d, 8,8) 6,32 (d, 8,8) 7b 5,15 (brs) 5,15 (brs) 8b 3,44 (brs) 3,44 (brs) 12b 5,83 (d, 2,2) 5,82 (d, 2,2) 14b 5,50 (d, 2,2) 5,50 (d, 2,2) OH-11a 7,45 (s) OH-13a 7,81 (s) OH-13b 8,03 (s) OH-4a 8,17 (s) OH-4b 8,71 (s) *Tukiran et al., 2003 No
Spektrum UV senyawa 5 dalam MeOH memperlihatkan serapan maksimum pada panjang gelombang 284 nm yang mengalami pergeseran batokromik sebesar 15 nm pada penambahan NaOH menjadi 289 nm. Karakteristik spektrum UV tersebut menunjukkan adanya kromofor fenol. Sementara itu, spektrum IR senyawa 5 menunjukkan adanya pita serapan untuk gugus hidroksil pada 3468 cm-1, C=C aromatik pada 1625, 1515 dan 1488 cm-1, dan gugus para-disubstitusi benzena pada 837 cm-1. Data dari spektrum UV dan IR senyawa 5 tersebut, terutama adanya serapan dari turunan 1,4-disubstitusibenzena merupakan ciri dari senyawa kelompok oligomer resveratrol. Hasil tersebut didukung oleh data spektrum 1H-NMR (Tabel 1) yang menunjukkan adanya dua unit p-hidroksifenil pada δH 7,52 (H-2/6a) dan 6,99 (H-3/5a) ppm (2H, d, J=8,4 Hz) serta 6,38 (H-2/6b) dan 6,32 (H-3/5b) ppm (2H, d, J=8,8 Hz). Spektrum 1H-NMR juga memperlihatkan adanya dua pasang proton berkopling meta yang khas untuk dua cincin benzena-1,2,3,5-tetrasubstitusi, yaitu pada δH 6,33 (H-12a) dan 6,28 (H-14a) ppm (1H, d, J=2,2 Hz) serta 5,83 (H-12b) dan 5,50 (H-14b) ppm (1H, d, J=2,2 Hz). Selain itu, juga terdapat dua sinyal proton
alifatik yang khas untuk cincin 2,3-diaril-2,3dihidrobenzofuran dengan konfigurasi trans, yaitu pada δH 5,65 (d, J=10,3 Hz, H-7a) dan 5,44 (d, J=10,3 Hz, H-8a) ppm, serta dua sinyal proton alifatik yang merupakan bagian dari unit cincin heptabenzosiklik, yaitu pada δH 5,15 (H-7b) dan 3,44 (H-8b) ppm, masing-masing 1H (brs). Karakteristik unit-unit struktur tersebut menunjukkan bahwa senyawa 5 memiliki struktur molekul yang sesuai dengan (+)isohopeafenol (Tukiran et al., 2003). Perbandingan data 1H-NMR (Tabel 1) senyawa 5 dengan data (+)isohopeafenol dari literatur memperlihatkan kesesuaian yang tinggi. Dengan demikian senyawa 5 diidentifikasi sebagai (+)-isohopeafenol, yang untuk pertama kalinya ditemukan pada S. brunnescens. Hasil uji sitotoksisitas terhadap sel murin leukemia P-388 menunjukkan bahwa senyawa (-)-hopeafenol (6) mempunyai aktivitas sitotoksik yang paling kuat dengan nilai IC50 sebesar 5,5 µM, sedangkan (-)-hemsleyanol D (4), dan (-)-ε-viniferin (1) menunjukkan aktivitas sitotoksik sedang dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 12,3 dan 18,1 µM. Selain itu, (-)-laevifonol (2), (+)-isohopeafenol (5), serta (-)-vatikanol B (3) memiliki aktivitas sitotoksik rendah dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 23,2; 39,7; dan 41,9 µM. Berdasarkan penelusuran pustaka, penemuan enam senyawa oligomer resveratrol dalam S. Brunnescens ini merupakan yang pertama kali dilaporkan. Walaupun demikian, senyawa-senyawa tersebut sebelumnya telah diperoleh pada spesies lain dari Shorea. Laevifonol (2) dilaporkan telah ditemukan pada S. laeviforia (Hirano, et al., 2001), S. balangeran, dan S. selanica (Tukiran et al., 2003). Sementara itu, (+)-isohopeafenol (5) telah diperolah pula pada S. hemsleyana (Ito et al., 2003), S. javanica (Surya, 2001), S. laeviforia (Hirano, et al., 2001), dan S. balangeran (Tukiran et al., 2003). Sedangkan (-)hemsleyanol D (4) telah diisolasi pada S. hemsleyana (Ito et al., 2000), dan S. leprosula (Winata et al., 2003). Ternyata senyawa-senyawa tersebut tidak hanya ditemukan pada genus Shorea saja, tetapi ditemukan pula pada genus lain dari famili Dipterocarpaceae, yaitu Dipterocarpus. Senyawa (-)laevifonol (2), dan (-)-vatikanol B (3) dilaporkan telah diperoleh pula pada Dipterocarpus hasseltii (Muhtadi et al., 2006). Keberadaan senyawa-senyawa pada dua genus famili Dipterocarpaceae ini, menggambarkan adanya kedekatan hubungan kekerabatan antara genus Shorea dan Dipterocarpus. Hal ini mendukung pendapat yang yang telah dikemukakan oleh Ashton (1983). Selain itu, senyawa (-)-ε-viniferin (1) dan (-)-hopeafenol (6) ternyata ditemukan pada hampir semua spesies tumbuhan famili Dipterocarpaceae yang telah dikaji
93 JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, SEPTEMBER 2006, VOL. 11 NO. 3
aspek fitokimianya, dan senyawa (-)-ε-viniferin (1) adalah prekursor utama pembentukan senyawasenyawa oligomer resveratrol dalam famili Dipterocarpaceae (Muhtadi et al., 2003). 4. Kesimpulan Enam senyawa oligomer resveratrol, yaitu (-)-(ε)-viniferin (1), (-)-laevifonol (2), (-)-vatikanol B (3), (-)-hemsleyanol D (4), (+)-isohopeafenol (5), dan (-)-hopeafenol (6) telah berhasil diisolasi untuk pertama kalinya dari kulit batang S. brunnescens. Uji senyawa-senyawa tersebut terhadap sel murin leukemia P-388, menunjukkan bahwa hanya senyawa 6 yang memperlihatkan aktivitas sitotoksik yang paling kuat dengan IC50 5,5 µM. Ucapan terima kasih Ucapan terima kasih disampaikan kepada Dirjen DIKTI Departemen Pendidikan Nasional dan Rektor UMS (bantuan beasiswa), staf Herbarium Bogoriense (identifikasi tumbuhan), serta Bapak Drs. Lukman Makmur atas bantuan dalam pelaksanaan penelitian ini. Daftar pustaka Alley, M.C., Scudiero, D. A., Monks, A., Hursey, M. L., Czerwinski, M. J., Fine, D. L., Abbott, B. J., Mayo, J. G., Shoemaker, R. H., and Boyd, M. R., 1988, Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculturetetrazolium assay, Cancer Research, 48, 589-601. Ashton, P. S., 1983, Dipterocarpaceae, in van Steenis, C.G.G.J., (ed), Flora Malesiana, Series 1. Spermatophyta, Vol. 9, Martinus Nijhoff/Dr. W., Junk Publ., The Hague, 445–552. Bokel, M., Diyasena, M. N. C., Gunatilaka,A.A.L., Kraus, W. and Sotheeswaran S., 1988, Caliculatol, an Antifungal Resveratrol Trimer from Stemonoporus canaliculatus, Phytochem., 27, 377-380. Cronquist, A., 1981, An Integrated System of Classification of Flowering Plant, Columbia University Press, New York. Dai, J. R., . Hallock, Y. F, Cardellina, J. H. H., and Boyd, M. R., 1988, HIV-Inhibitory and Cytotoxicity Oligostilbenes from Leaves of Hopea malibato, J. Nat. Prod., 61, 351-353. Hakim, E. H., 2002, Oligostilbenoid dari Tumbuhtumbuhan Dipterocarpaceae, Bull. Soc. Nat. Prod. Chem., 2, 1-9. Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Badan Litbang Kehutanan, Jakarta. Hirano, Y., Kondo, R.. and Sakai, K., 2001, Compounds Inhibitory to Rat Liver 5αReductase from Tropical Commercial Wood
Species: Resveratrol Trimers from Melapi (Shorea. sp) Heartwood, Japan Wood Science, 47, 308-312. Ito, T., Akao,Y., Hong Y., Ohguchi, K., Matsumoto, K.,. Tanaka, T., Iinuma, M., and Nozawa, Y., 2003, Antitumor Effect of Resveratrol Oligomers Against Human Cancer Cell Lines and the Molecular Mechanism of Apoptosis Induced by Vaticanol C, Carcinogenesis, 24:9, 1489-1497. Ito, T., Tanaka, T., Ido, Y., Nakaya, K., Iinuma, M.,.and Riswan, S., 2000, Stilbenoids Isolated from Stem Bark of Shorea hemsleyana, Chem. Pharm. Bull., 48:12, 1001-1005. Kitanaka, S., Ikezawa, T., Yasukawa, K., Yamanauchi, S.,. Takido, M., Sung, H. K., and Kim, I. H., 1990, (+)-(α)-Viniferin, an Anti-inflammatory Compound from Caragana chamlagu Root, Chem. Pharm. Bull., 38, 432-435. Muhtadi, Hakim, E. H., Juliawaty, L. D., Syah,Y. M., Achmad, S. A. Latif,. J., and Ghisalberti, E. L.,. 2006, Cytotoxic Resveratrol Oligomers from the Tree Bark of Dipterocarpus hasselti, Fitoterapia, 77, 550-555. Nitta, T., Arai, T. Takamatsu, H., Inatomi, Y., Murata, H., Iimuna, M., Tanaka, T., Ito, T., Asai, F., Ibrahim, L., Nakanishi, T., and Watabe, K.., 2003, Antimicrobacterial Activity of Extract Prepared from Tropical and Subtropical Plants on Methicillinresistant Staphylococcus aureus, J. Health Science, 48:3, 273-276. Ohyama, M., Tanaka, T., . Ito, T., Iinuma, M., Bastow, K. F., and Lee, K. H., 1999, Antitumor Agents Cytotoxicity of Naturally Occurring Resveratrol Oligomers and Their Acetate Derivatives, Bioorg. Med. Chem. Lett., 9, 3057-3060. Oshima, Y., Kamijou, A., Ohizumi, Y., Niwa, M., Ito, J., Hishamichi, K., and Takeshita, M., 1995, Novel Oligostilbenes from Vitis coignetise, Tetrahedron, 51, 11979-11986. Pryce, R. J. and Langcake, P.,1977, α-Viniferin: An Antifungal Resveratrol Trimer from Grapevine, Phytochem., 16, 1452-1454. Rusdiah, F., 2005, Senyawa Oligomer Resveratrol dari Kulit Batang Shorea mecistopteryx Ridl. (Dipterocarpaceae). Tesis, Institut Teknologi Bandung, Bandung. Surya, R. M. D., 2001, Oligomer Stilbenoid dari Kayu Akar Shorea javanica Koord. & Valeton. Skripsi, Institut Teknologi Bandung, Bandung
94 JURNAL MATEMATIKA DAN SAINS, SEPTEMBER 2006, VOL. 11 NO. 3
Sotheeswaran, S., and Pasupati, V. 1993, Distribution of Resveratrol Oligomers in Plants, Phytochem., 32, 1083-1092. Tukiran, Achmad, S. A., Hakim, E. H., Syah,Y. M., Juliawaty L.D., and Sakai. K., 2003, Oligostil-benoids from Shorea balangeran Burck (Dipterocarpaceae), Bull. Soc. Nat. Prod. Chem., 3, 24-31.
Winata, I. N. A., Syah.Y. M., Achmad, S. A., Hakim, E. H.,. Juliawaty, L.D., Aimi, N., Choudhary, M. I., 2003, Hemsleyanol D, suatu Tetramer Stilbenoid dari Kulit Batang Shorea leprosula Miq., Bull. Soc. Nat. Prod. Chem., 3, 39-44.
