14
PURIFIKASI PROTEASE DARI EKSKRETORI/SEKRETORI STADIUM L3 Ascaridia galli
ABSTRAK Enzim proteolitik yang disekresikan oleh parasit memainkan peran pada proses penetrasi dan migrasi jaringan inang. Penelitian ini bertujuan untuk memurnikan protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. L3 diperoleh dari usus halus 100 ekor ayam petelur HySex Brown tujuh hari setelah pemberian dosis 6000 L2 melalui oesofagus ayam. Sebanyak 5 – 10 ekor L3 dikultur secara in vitro dalam setiap ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640), pH 6,8, tanpa merah fenol dalam inkubator pada temperatur 37oC dan 5% CO2 selama 3 hari. Ekskretori/sekretori dipreparasi dari produk metabolisme L3 yang dilepaskan ke dalam medium kultur. Protease dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel matriks sephadex G-100 dan anion exchange matriks DEAE sephadex A-50. Aktivitas protease diuji terhadap kasein. Konsentrasi protein dihitung mengikuti metode Bradford. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel lebih tinggi dibandingkan dengan anion exchange. Protease yang disekresikan oleh stadium L3 A. galli dapat dimurnikan berdasarkan berat molekulnya. Kata kunci: Ascaridia galli, nematoda, ekskretori/sekretori, protease, kromatografi ABSTRACT Proteolytic enzymes secreted by parasites are thought to play a key role in the processes of penetration and migration trough the host tissue. The research was carried out to purify protease from exretory/secretory of A. galli L3 stage. A. galli L3 were recovered from intestines of 100 HySex Brown heads chickens 7 days after oesophagus inoculation with 6000 L2. L3 recovered in this manner were cultured (5 – 10 ml-1) in flasks containing rosswell park memorial institute (RPMI) 1640 media, pH 6.8, without phenol red. Cultures were incubated at 370C in 5% CO2 and culture fluid was collected after 3 days in culture. Excretory/secretory was prepared from metabolic product of L3 released in culture medium. Protease purified using anion exchange matrix DEAE sephadex A-50 and gel filtration matrix sephadex G-100 chromatography. The protease activity was assayed against casein. Protein concentration were counted as described in Bradford method. The result showed that enzyme activity on chromatography gel filtration more highly compared anion exchange. These result indicate that the protease secreted by A. galli L3 stage could purify based on molecular weight. Key words: Ascaridia galli, nematode, excretory/secretory, protease, chromatography
15
PENDAHULUAN
Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori dari berbagai stadium kehidupan cacing parasitik telah menarik perhatian para ilmuan karena peranannya yang penting dalam reaksi biologi, termasuk metabolisme protein, reaksi imun, nutrisi parasit, penetrasi ke jaringan inang, dan patogenesis helmintosis. Telah dibuktikan bahwa peningkatan konsentrasi protease yang dilepaskan cacing parasitik pada peristiwa invasi ke jaringan inang definitif (Cock et al. 1993; Hadas dan Stankiewicz 1997; Todorova 2000; dan Iglesias et al. 2005). Ascaridia galli adalah cacing parasitik nematoda yang dapat menginfeksi berbagai jenis unggas, termasuk ayam petelur. Siklus hidup A. galli secara lengkap telah dijelaskan oleh Permin dan Hansen (1998), dimana telur yang dihasilkan oleh A. galli dewasa di dalam lumen inang definitif akan mengalami maturasi di lingkungan manakala dikeluarkan bersama tinja. Siklus hidup sebagai parasit dimulai ketika inang definitif menelan telur infektif (L2) sampai menjadi dewasa dan bereproduksi menghasilkan telur. Sebelum menjadi dewasa, A. galli mengalami dua fase kehidupan di dalam tubuh inang definitif, yaitu fase lumen dan fase jaringan. Mekanisme invasi ke jaringan oleh L3 A. galli untuk menjalani fase histotrofik belum banyak diketahui. Diduga bahwa L3 melepaskan protease ekstraseluler untuk menembus pertahanan mukosa saluran cerna inang definitif sehingga larva dapat establish di dalam jaringan. Peneliti terdahulu melaporkan bahwa enzim proteolitik ditemukan pada ekstrak somatis dan ekskretori/sekretori stadium L3, L4 dan dewasa Ostertagia ostertagi (Cock et al. 1993). Hadas dan Stankiewicz (1997) menyatakan bahwa cacing nematoda Trichostrongylus colubriformis dan Haemonchus contortus melepaskan enzim proteolitik pada stadium L3. Hasil penelitian Todorova (2000) merefeksikan bahwa protease serin, sistein dan metal hadir pada kultur in vitro stadium L1 Trichinella spiralis. Ford et al. (2005) membuktikan bahwa stadium L3 Onchocerca volvulus menghasilkan protease serin. Namun, informasi tentang keberadaan protease pada stadium L3 A. galli belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, fokus penelitian ini adalah memurnikan protease dari produk ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. Tujuan
16
penelitian ini adalah untuk mendapatkan protease murni yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli.
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Helmintologi, Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, dan Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor. Waktu Penelitian berlangsung dari bulan Mei 2005 sampai Mei 2006.
Rancangan Penelitian Cacing A. galli betina dewasa diperoleh dari dalam lumen usus halus ayam kampung yang terinfeksi secara alami. L1 diambil langsung dari uterus A. galli betina dewasa. L1 diinkubasi secara in vitro selama 20 – 30 hari pada temperatur ruangan untuk mendapatkan L2. L2 dikultur secara in vivo untuk mendapatkan L3 pada 100 ekor ayam Isa Brown umur 12 minggu yang telah diperiksa telur cacing dalam tiap gram tinjanya (TTGT), dipelihara secara individual dalam kandang baterei, diberi pakan komersial dan air minum secara ad libitum sebagai ayam donor (Tiuria et al. 2003). Ayam dinekropsi tujuh hari setelah pemberian L2 dan jumlah L3 yang ditemukan dihitung. Larva A. galli diinkubasi dalam sumur cell culture plate, masing-masing sumur diisi 25 – 50 larva dalam 5 ml medium Rosswell Park Memorial Institute (RPMI 1640, Sigma-Aldrich), pH 6,8, tanpa merah fenol yang ditambahkan 100 unit/ml penisilin G, 100 µg/ml streptomisin, 5 µg/ml gentamisin, dan 0,25 µg/ml kanamisin dalam inkubator CO2 selama 3 hari. Campuran medium dengan ekskretori/sekretori L3 A. galli disentrifus pada 12.000 g dengan temperatur 4oC selama 5 menit. Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori L3 A. galli dipurifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan anion exchange (Cock et al. 1993).
17
Preparasi Ekskretori/Sekretori Stadium L3 A. galli Telur cacing A. galli diambil dari uterus cacing betina dewasa. Telur cacing tersebut diinkubasi dalam cawan petri plastik berisi aquadestilata steril hingga terbentuk larva infektif (L2) selama 21 – 30 hari pada suhu kamar (Tiuria 1991; Athaillah 1999 Darmawi 2003; Balqis 2004; dan Balqis et al. 2005). L2 A. galli yang berkembang diberikan secara oral kepada ayam petelur HySex Brown umur 12 minggu dengan dosis 6000 L2, dan 7 hari kemudian dipotong untuk diambil isi lumen dan kerokan mukosa usus halus. Isi lumen dibersihkan dengan NaCl fisiologis dan disaring dengan saringan larva. L3 A. galli dihitung di bawah mikroskop stereo (Bauer 2001; dan Balqis et al. 2005). Sebanyak 25 – 50 ekor L3 dikultur dalam cawan petri berisi 5 ml medium RPMI1640 pH 6,8 (tanpa phenol red). Media diberi suplemen 100 unit/ml penicillin G, 100 µg/ml streptomisin, 0,25 µg/ml amphotericin B, dan 5 µg/ml gentamisin. Larva dikultur selama 3 hari pada temperatur 370C dan tekanan CO2 5%. Cairan kultur dikoleksi, disentrifugasi (12.000 g) dan disaring dengan membran filter (0,2 µm), serta didialisa dengan phosphate-buffered saline (PBS) untuk mendapatkan ekskretori/sekretori A. galli (Rhoads et al. 1997; dan Balqis et al. 2005).
Uji Konsentrasi Protein Sepuluh mg Bovine Serum Albumin (BSA) dilarutkan dengan 10 ml aquadest dan dibuat 10 tingkatan konsentrasi sebagai standar. Sebanyak 100 µl dari masing-masing tingkatan ditempatkan dalam tabung reaksi steril lainnya dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebagai blanko digunakan 3 tabung reaksi steril masing-masing diisi dengan 100 µl aquadest dan ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Sebanyak 100 µl sampel substansi bioaktif asal larva stadium L3 A. galli diisikan ke dalam tabung reaksi steril dan masing-masing ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Standar, blanko, dan sampel masing-masing dimasukkan kedalam tabung kuvet untuk dilihat hasil absorbansinya dengan menggunakan Spectrophotometer pada panjang gelombang (λ) 578 nm (Rukayadi dan Suhartono 1999).
18
Uji Aktivitas Enzim Aktivitas proteinase diuji terhadap casein. Campuran 250 µl 0,2% casein Hamarstain dalam Tris mM (pH 7,0) dan 50 µl enzim diinkubasi selama 10 menit pada temperatur 70oC. Reaksi dihentikan dengan penambahan 500 µl asam trichloroacetic 0,1 M dan diinkubasikan pada 37oC selama 10 menit. Setelah pemusingan, 375 µl supernatan dicampur dengan 1,25 ml sodium carbonate dan 50 µl reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasikan pada 37oC selama 20 menit. Jumlah degradasi ditentukan dari absorbansi pada λ 578 nm (Kong et al. 2000). Aktivitas 1 unit enzim ditetapkan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menguraikan 1µg tyrosine dan casein di dalam 1 ml volume reaksi per menit (Chung et al. 1997).
Pemurnian Protease Stadium L3 A. galli Tahapan ekstraksi dan pemurnian protease A. galli meliputi pengendapan protein, proses dialisis, penggunaan filtrasi gel dengan matriks sephadex G-100, dan anion exchange dengan matriks DEAE-Sephadex A-50. Untuk menggumpalkan protein, sebanyak 500 ml supernatan hasil sentrifugasi yang mengandung enzim ekstrak kasar ditambahkan dengan 40% (b/v) ammonium sulfat teknis, sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetik stirer hingga larut dan dibiarkan selama satu malam pada suhu rendah. Filtrat protease dipisahkan dengan sentrifugasi 12.000 g selama 40 menit lalu dilarutkan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH 8. Setelah itu dilakukan pengujian aktivitas dengan metode Walker (1984) pada substrat musin dan penentuan kadar protein menurut metode Bradford (1976). Ammonium sulfat yang ada dalam enzim dipisahkan dengan cara dialisis. Kantong dialisis (cut-off 12 kD) dengan lebar 25 mm, diametar 16 mm dipotong sepanjang 15 cm, disiapkan dengan cara berikut: kantong direndam dengan air mengalir selama 3-4 jam guna menghilangkan glisin. Selanjutnya kantong dialisis diberi perlakuan dengan 0,3% (w/v) larutan Na2S dengan suhu 80°C selama 1 menit untuk menghilangkan sulfur. Kemudian dicuci dengan air panas (suhu 60°C) selama 2 menit. Selanjutnya direndam dalam H2SO4 0,2% (v/v). Terakhir dicuci dengan air panas sampai
19
bau asamnya hilang. Saat akan digunakan, salah satu ujung kantong diikat dengan benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim dan ujung yang lain diikat dengan benang jahit pula. Kantong dimasukkan dalam larutan buffer Tris-Cl 20 mm, pH 8 dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada suhu 4°C selama 4 jam. Larutan Protease dimasukkan dengan menggunakan pipet dengan volume sebesar 5 % dari 27,5 (void volume) yaitu 1,375 ml. Setelah semua sampel dimasukkan dalam kolom, gradien pengelusi dan fraction colector (Pharmacia, Biotech) dioperasikan. Buffer yang digunakan untuk elusi ialah Tris-HCl 10 mM pH 8,0. Ukuran fraksi yang digunakan sebesar 2 ml per tabung, seluruhnya ada 20 fraksi. Setiap fraksi diukur aktivitasnya pada substrat musin menurut Metode Walter (1984) dan penghitungan kadar proteinnya menggunakan metode Bradford (1976).
Kromatografi Sebelum aktivitas enzim diuji, terlebih dahulu dilakukan optimasi pada buffer boraks, buffer universal, dan buffer Tris-HCl (pH 6 - 10), asam fosfat (pH 6 - 8), dan asam asetat (pH 5 - 10). Protease yang dilepaskan melalui ekskretori/sekretori L3 A. galli dipurifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan anion exchange. Supernatan kultur diendapkan dengan ammonium sulfat 40% selama 1 malam pada temperatur 4oC dan disentrifus pada 10.000 rpm selama 10 menit. Pellet dilarutkan ke dalam buffer Tris-HCl (pH 7) dan didialisa dengan buffer yang sama pada 4oC selama 24 jam. Larutan terdialisa digunakan pada kolom gel filtrasi matriks Sephadex G-100 (Sigma, USA) dan anion exchange matriks DEAE-Sephadex A-50 (Sigma, USA), disetimbangkan dengan buffer Tris-HCl (pH 7) dan dielusi pada gradien NaCl 0 – 0,1 M dalam 0,01 mM TrisHCL (pH 7) pada nilai volume fraksi 0,5 ml/min dan 3 ml. Masing-masing fraksi diuji konsentrasi protein dan aktivitas enzimatisnya (Kong et al. 2000; dan Balqis et al. 2006).
20
HASIL PENELITIAN
Pengaruh beberapa jenis dan pH buffer dilakukan dengan memberikan perlakuan 0,1 M Tris-HCl (pH 6 - 10), 0,05 M asam fosfat (pH 6 - 8), dan 0.05 M asam asetat (pH 5 - 10) disajikan pada Gambar 1. Aktivitas enzim diuji pada crude ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. Hasil optimasi diketahui bahwa buffer Tris mempunyai aktivitas enzim yang tinggi dibandingkan dengan kedua jenis buffer lainnya, dimana aktivitas enzim mulai terlihat pada pH 6 yang mencapai optimum pada pH 7 tetapi aktivitas enzim rendah pada pH 8 dan semakin menurun pada suasana basa. Aktivitas enzim pada buffer fosfat mulai terlihat pada pH 5 yang dapat dipertahankan pada pH 6, tetapi aktivitasnya menurun pada pH 7 dan 8. Aktivitas enzim meningkat pH 9 dan dipertahankan sampai pH 10. Aktivitas enzim juga terlihat dalam buffer asetat pada pH 6 dan aktivitasnya semakin meningkat sampai pada pH 8. Namun, nilai aktivitas enzim yang dicapai pada buffer fosfat atau asetat masih berada di bawah nilai aktivitas enzim pada buffer Tris-HCl. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa buffer TrisHCl adalah buffer yang paling sesuai untuk optimasi aktivitas enzim dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli sehingga untuk pengujian selanjutnya pada penelitian ini digunakan buffer 0,1 M Tris-HCl pada pH 7. 0.014
Aktivitas enzim (u/ml)
0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 4
5
6
7
8
9
10
11
pH 0,1 M tris HCl
0,05 M fosfat
0,05 M asetat
Gambar 1. Aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli pada buffer dan pH yang berbeda
21
Untuk mendapatkan enzim protease yang bebas dari molekul lainnya, dilakukan pengendapan protein dengan menggunakan ammunium sulfat pada konsentrasi 20-70%. Hasil optimasi aktivitas enzim dengan ammunium sulfat disajikan pada Gambar 2. Aktivitas enzim terdeteksi pada konsentrasi 20% dan menurun pada konsentrasi 30%. Aktivitas enzim meningkat sebesar 14 kali pada konsentrasi 40%, tetapi aktivitas enzim menurun pada konsentrasi 50% dan terus menurun pada konsentrasi 60%, sedangkan pada konsentrasi 70% aktivitasnya terlihat sedikit meningkat. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa konsentrasi ammunium sulfat yang paling sesuai untuk pengendapan protein dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli adalah ammunium sulfat dengan konsentrasi 40%.
Aktivitas enzim (U/ml)
0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
Konsentrasi (%)
Gambar 2. Optimasi aktivitas enzim crude ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli dengan pengendapan ammunium sulfat Aktivitas enzim pada pengendapan protein dan dialisis terjadi peningkatan masing-masing sebesar 359,20% dan 362,05% dibandingkan dengan crude. Protein total yang merupakan perkalian antara kadar protein dan volume pada pengendapan protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 3,09% dan 3,51% dibandingkan dengan crude. Aktivitas total yang merupakan perkalian antara aktivitas enzim dan volume pada pengendapan protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 78,16% dan 65,84%
22
dibandingkan dengan crude. Aktivitas spesifik yang merupakan pembagian antara aktivitas enzim dan kadar protein pada pengendapan protein dan dialisis terjadi peningkatan sebesar 2666,67% dan 1960,67% dibandingkan dengan crude. Tingkat kemurnian pada pengendapan protein dan dialisis meningkat sebesar 2524% dan 1868% dibandingkan dengan crude. Hasil yang merupakan pembagian antara aktivitas total dan volume pada pengendapan protein dan dialisis terjadi penurunan sebesar 78,9% dan 65,59% dibandingkan dengan crude. Hasil uji konsentrasi protein, aktivitas enzim, aktivitas spesifik enzim, tingkat kemurnian dan hasil dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli pada tiap-tiap tahap purifikasi disajikan pada Tabel 1. Tabel 1.Tahapan purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L3 A. galli Protein Total (mg) 4485
Aktivitas Total (U) 2,84
Akt. Spesifik(U/mg) 0,0006
Tingkat Hasil Kemurnian (%) 1,0 100,0
Am. sulfat 40%
138,75
2,22
0,0160
25,24
78,9
Dialisis
157,5
1,87
0,0118
18,68
65,59
Tahap Crude (supernatan) Pengendapan-
Aktivitas enzim terlihat pada dua peak (puncak) yang dielusi dari gel filtrasi yaitu fraksi 8 dan 31 dengan aktivitas enzim masing-masing 0,10 U/ml dan 0.625 U/ml. Kadar protein terlihat pada 2 puncak, yaitu fraksi gabungan 4 dan 5, dan fraksi 11 dengan konsentrasi protein 0,88 mg/ml dan 0,46 mg/ml. Hasil kromatografi gel filtrasi disajikan dalam Gambar 3. Aktivitas enzimatik terlihat pada empat puncak yang dielusi dari anion exchange yaitu fraksi gabungan 25 dan 30, fraksi 45, fraksi gabungan 55, 60, 65, dan 70, dan fraksi 95. Konsentrasi protein terlihat pada lima puncak, yaitu fraksi gabungan 20, 25,30,dan 35, fraksi 45, fraksi gabungan 60 dan 65, 75 dan 80, dan fraksi 90. Fraksi 45 merupakan puncak gabungan antara aktivitas enzim dan konsentrasi protein tertinggi yaitu 0.003 U/ml dan 37,33 mg/ml (Gambar 4). Berdasarkan hasil yang diperoleh dari kromatografi anion exchange dan gel filtrasi terlihat fraksi 31 mempunyai aktivitas enzim tertinggi, sehingga fraksi 31 akan dipakai untuk imunisasi ayam petelur.
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Aktivitas enzime (U/ml)
Konsentrasi protein (mg/ml)
23
0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 Nomor fraksi Protein
Enzim
40
0.0035
35
0.003
30
0.0025
25
0.002
20 0.0015
15 10
0.001
5
0.0005
0
0
Aktivitas Enzim e (U/m l)
Konsentrasi protein (m g/m l)
Gambar 3. Kromatogram gel filtrasi matriks sephadex G-100
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 Nomor Fraksi Protein
Enzim
Gambar 4. Kromatogram anion exchange matriks DEAE sephadex A-50
24
Protein total, aktivitas total aktivitas spesifik tingkat kemurnian dan haril dari kromatografi gel filtrasi lebih tinggi dibandingkan dengan kromatografi anion exchange. Masing-masing uji terjadi peningkatan sebesar 1,07 kali, 19 kali, 18,83 kali, 18,81 kali dan 19,97 kali (Tabel 2). Berdasarkan hasil yang diperoleh terlahat bahwa hasil kromatografi gel filtrasi matriks sephadeks G-100 lebih baik bila dibandingkan dengan kromatografi anion exchange matriks DEAE sephadeks A-50.
Tabel 2. Purifikasi protease dari ekskretori/sekretori L3 A. galli dengan kromatografi Kromatografi
Protein Total (mg)
Aktivitas Total (U)
Akt. Spesifik(U/mg)
Tingkat Hasil Kemurnian (%)
Gel filtrasi
1,2
0.19
0,1563
246,42
6,59
Anion exchange
1.12
0.01
0,0083
13,10
0,33
PEMBAHASAN
Optimasi enzim dilakukan dengan memberikan perlakuan larutan penyangga buffer Tris-HCl (pH 6 - 10), asam fosfat (pH 6 - 8), dan asam asetat (pH 5 - 10) pada reaksi hidrolisis. Aktivitas enzim tertinggi pada penyangga asam fosfat adalah 0,003 U/ml, pada penyangga asam asetat adalah 0,006 U/ml, sedangkan pada penyangga TrisHCl adalah 0,012 U/ml. Hasil optimasi jenis larutan penyangga dengan beberapa pH menunjukkan bahwa larutan penyangga Tris-HCl pH 7 memberikan aktivitas terbaik bagi aktivitas enzim (Gambar 1). Aktivitas enzim meningkat sebesar 14 kali pada konsentrasi 40% ammunium sulfat (Gambar 2). Suhartono (1989) menyatakan bahwa optimasi buffer pada purifikasi protein diperlukan untuk menjaga konsentrasi ion hidrogen pada larutan protein. Pemilihan buffer yang sesuai
sangat penting untuk
menjaga protein pada pH yang diinginkan dan untuk memastikan hasil penelitian yang konstan. Buffer anion mempengaruhi konformasi enzim dan efek tidak langsung pada muatan sisi aktif enzim.
25
Pengendapan (pemekatan) protein dengan amonium sulfat adalah metode yang sering digunakan karena memiliki daya larut tinggi di dalam air, relatif murah, dan kestabilan protein di dalam larutan amonium sulfat (2 M – 3 M) tahan bertahun-tahun. Pemilihan amonium sulfat didasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH dan temperatur tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ionion garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan kemudian mengendap (Harris 1989). Pada tahap dialisis, garam yang berlebih di dalam sampel dapat dihilangkan dengan cara menempatkan sampel di dalam kantung (membran) dialisis semipermeabel yang direndam di dalam larutan buffer. Molekul yang berukuran kecil akan keluar melalui membran sedangkan molekul yang besar akan tertahan di dalam membran dialisis. Ukuran pori kantung dialisis yang terbuat dari bahan selulosa asetat ini berdiameter 1 – 20 nm yang menunjukkan berat molekul minimum yang dapat tertahan di dalam membran (Harris 1989). Pemurnian protease yang biasa dilakukan adalah dengan menggunakan kromatografi kolom. Ada beberapa cara kromatografi kolom, diantaranya adalah kromatografi gel filtrasi dan kromatografi anion exchange. Berdasarkan hasil yang diperoleh dari kromatografi gel filtrasi (Gambar 3) dan anion exchange (Gambar 4) terlihat fraksi 31 mempunyai aktivitas enzim tertinggi. Kromatografi gel filtrasi merupakan teknik pemisahan protein dan makromolekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul. Matriks gel filtrasi merupakan gel berpori yang dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair-mobil. Pori-pori matriks dapat menampung molekul yang berukuran lebih kecil dan memisahkannya dari molekul yang berukuran molekul tinggi. Kromatografi gel filtrasi dapat pula digunakan untuk estimasi berat molekul. Kromatografi penukar ion memanfaatkan perbedaan afinitas antara molekul bermuatan
26
di dalam larutan dengan senyawa yang tidak reaktif yang bermuatan berlawanan sebagai pengisi kolom. Permukaan protein terdiri dari muatan positif dan negatif tergantung dari rantai samping asam amino asam dan basa (Amersham 2003). Konsentrasi protein ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli pada tiap-tiap tahapan purifikasi mulai dari tahap crude sampai pada tahap kromatografi menunjukkan penurunan seperti disajikan pada Tabel 1 dan Tabel 2. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa-senyawa pengotor dan protein-protein lain
sudah terpisahkan. Penelitian
tentang konsentrasi protein yang dilepaskan oleh cacing dilaporkan Satrija et al. (2004) bahwa kadar protein antigen cacing pita Raillietina echinobothrida sebelum dipekatkan berkisar antara 0,286 – 0,361 mg/ml, sedangkan setelah dipekatkan dengan vivaspin mengandung protein antigen 0,691 mg/ml. Darmawi et al. (2006b) membuktikan bahwa keberadaan
protein
L3
cacing nematoda
A. galli
dapat
dimonitor melalui
spektrofotometer setelah tiga hari dikultur dalam medium RPMI 1640. Ekskretori/sekretori cacing nematoda seperti Ascaris suum, Toxocara canis, Brugia malayi, Loa loa, Dictyocaulus viviparus, Dirofilaria immitis, dan Ostertagia ostertagi mengandung enzim. Enzim yang dilepaskan cacing selama establish dapat berperan sebagai substansi biologik aktif untuk perkembangan parasit. Protease dapat dideteksi keberadaannya pada ekstrak tubuh dan ekskretori/sekretori larva (L3) dan (L4) cacing nematoda O. ostertagi pada sapi. Aktivitas proteolitik terlihat pada produk ekskretori/sekretori L4 (Cock et al. 1993). Cacing Clonorchis sinensis dilaporkan Nagano et al. (2004) secara molekular mengekspresikan protease sistein. Protease sistein juga diekspresikan oleh cacing dewasa Paragonimus westermani (Kim et al. 2000), dan H. contortus (Ruiz et al. 2004). Darmawi et al. (2006a) membuktikan bahwa cairan kultur larva A. galli memiliki aktivitas enzimatis yang ditandai dengan sifatnya yang mampu mendegradasi casein. Cacing nematoda gastrointestinal ruminansia juga mengandung enzim proteolitik (Knox dan Jones 1990). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli memiliki aktivitas protease dan berhasil dipurifikasi melalui kromatografi filtrasi gel. Hal ini membuktikan bahwa stadium L3 A. galli membutuhkan enzim ekstraseluler untuk survive menjalani fase histotrofik. Hasil penelitian ini mendukung hasil penelitian
27
peneliti terdahulu bahwa aminopeptidase yang ditemukan oleh Rhoads et al. (1997) pada stadium L3 – L4 nematoda A. suum berkenaan dengan proses molting. Rhoads et al. (2001) membuktikan juga bahwa pada stadium L3 – L4 A. suum pada babi melepaskan hyaluronidase dengan kadar tertinggi hyaluronidase ditemukan pada hari keempat dan keenam di dalam medium kultur. Proses perkembangan L3 menjadi L4 dan proses migrasi larva A. suum ke jaringan difasilitasi dan tergantung pada hyaluronidase. Ford et al. (2005) melaporkan bahwa protease yang disekresikan melalui ekskretori/sekretori Onchocerca volvulus berperan multifungsi untuk perkembangan parasit, termasuk molting, establishment, embriogenesis, dan reproduksi. Berdasarkan temuan para peneliti terdahulu (Cock et al. 1993; Rhoads et al. 1997; Harnett et al. 1997; Kim et al. 2000; Todorova 2000; Rhoads et al. 2001; Satrija et al. 2004; Nagano et al. 2004; Ford et al. 2005; dan Darmawi et al. 2006ab) maka protease yang telah berhasil dipurifikasi dari ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli pada penelitian ini sangat mungkin berperan multifungsi bagi kelangsungan hidup parasit dan sebagai perantara interaksi parasit dengan inang definitifnya.
KESIMPULAN
1. Stadium L3 A. galli melepaskan protease yang mempunyai aktivitas enzim 0,19 U/ml dengan aktivitas spesifik 0,15 U/mg. 2. Aktivitas enzim yang terdapat pada fraksi 31 kromatogram filtrasi gel lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas enzim pada anion exchange.
Saran Dari hasil penelitian disarankan bahwa perlu dilakukan penelitian selanjutnya untuk mengetahui karakter dan jenis enzim yang dilepaskan oleh stadium L3 A. galli.
