Artikel Penelitian
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal Melalui Pengukuran Fosforilasi Extracellular Signal Regulated Kinase Endang Purwaningsih,* Sri Kadarsih Soejono,** Djaswadi Dasuki,*** Edy Meiyanto**** *Bagian Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Yarsi, Jakarta **Bagian Fisiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta ***Bagian Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta ****Bagian Biologi Molekuler, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Abstrak Pendahuluan: Pentagamavunon-0 (PGV-0), suatu senyawa analog kurkumin, dapat menghambat steroidogenesis kultur sel luteal dengan menghambat sekresi progesteron. Letak kerja PGV-0 pada steroidogenesis kultur sel luteal belum diketahui. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui pengaruh PGV-0 terhadap fosforilasi Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK) pada steroidogenesis kultur sel luteal. Metode: Penelitian ini menggunakan korpus luteum tikus Sprague Dawley yang diinduksi dengan Pregnant Mares Serum Gonadotropine (PMSG). Pentagamavunon-0 diberikan sesaat setelah stimulasi Luteinizing Hormone (LH) dan/atau Prostagladin F2α (PGF2α) dengan dan tanpa penambahan forskolin. Fosforilasi ERK diukur dengan metode immunohistochemistry (IHC). Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa fosforilasi ERK meningkat secara bermakna akibat stimulasi LH. Sedangkan pemberian PGF2α mengurangi fosforilasi ERK secara bermakna. Forskolin meningkatkan fosforilasi ERK secara bermakna dan hampir sama dengan yang terstimulasi LH. Pentagamavunon-0 menghambat fosforilasi ERK pada sel yang terstimulasi LH maupun forskolin. Kesimpulan: Pentagamavunon-0 (PGV-0) dapat menghambat fosforilasi ERK pada kultur sel luteal dengan cara menghambat sinyal transduksi di upstream ERK. J Indon Med Assoc. 2013;63:52-7 Kata kunci: sel luteal, ERK, imunohistokimic, forskolin
Korespondensi: Endang Purwaningsih, Email:
[email protected]
52
J Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal
The Action Target of Pentagamavunon-0 on the Luteal Cell Steroidogenesis Through Phosphorylation Measurement of Extracellular Signal Regulated Kinase Endang Purwaningsih,* Sri Kadarsih Soejono,** Djaswadi Dasuki,*** Edy Meiyanto**** *Department of Anatomy, Faculty of Medicine, YARSI University, Jakarta **Department of Physiology, Faculty of Medicine, Gadjah Mada University, Yogyakarta ***Department of Obstetric and Gynecology, Faculty of Medicine, Gadjah Mada University, Yogyakarta,, ****Department of Molecular Biology, Faculty of Pharmacy, Gadjah Mada University, Yogyakarta
Abstract Introduction: Pentagamavunon-0 (PGV-0) compound, a curcumin analog, can inhibit steroidogenesis of luteal cell culture by inhibiting the production of progesterone. The action site of PGV0 on steroidogenesis of luteal cells is still unknown. The objective of this study is to analyze the effect of PGV-0 on the Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK) phosphorylation in steroidogenesis of luteal cell culture. Methods: This study used corpus luteum of rat Sprague Dawley strain that was induced with Pregnant Mares Serum Gonadotropine (PMSG). Pentagamavunon-0 was given shortly after the stimulation of LH and or PGF2α with or without forskoline. The phosphorylation of ERK was assessed by IHC method. Results: The result showed that LH stimulation increased ERK phosphorylation significantly. However, PGF2α decreased ERK phosphorylation significantly. Forskoline increased ERK phosphotylation significantly but no significant effect was found with LH stimulation. PGV-0 inhibited ERK by either LH or forskoline stimulation. Conclusion: Pentagamavunon-0/PGV-0 can inhibits signal transduction of steroidogenesis luteal cells by acting on the up stream to ERK. J Indon Med Assoc. 2013;63:52-7 Keywords: luteal cell, ERK, immunohistochemisty, forskolin
Pendahuluan Steroidogenesis pada sel luteal diatur oleh mekanisme yang sangat kompleks. Komponen utama yang dihasilkan oleh steroidogenesis adalah progesteron (P4). Sekresi progesteron oleh korpus luteum dirangsang oleh sekresi LH secara berkelanjutan.1 Luteinizing Hormone menstimulasi sekresi progesteron dengan melibatkan transduksi sinyal melalui aktivitas enzim adenilat siklase yang berada dalam membran sel luteal, pembentukan Cyclic Adenosine 3’, 5’ Monophosphate (cAMP) dan aktivasi protein kinase A (PKA) serta enzim-enzim steroidogenik, seperti sitokrom P450 side chain cleavage (P450scc) dan 3β-hidroksisteroid dehidrogenase (3β-HSD).2 Peran PGF2α sebagai antigonadotropik antara lain mengganggu ikatan LH dengan reseptor LH (R-LH) dan mengurangi jumlah R-LH, meng-hambat aktivitas enzim adenilat siklase dan akumulasi cAMP, mereduksi transkripsi enzim sitokrom P450scc dan 3β-HSD, menurunkan sekresi progesteron melalui jalur protein kinase C (PKC) dan menghambat fosforilasi Mitogen Activated Protein Kinase Extracellular Signal Regulated Kinase (MAPKinase ERK).3 J Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
Kepekaan sel luteal terhadap LH dan PGF2α berubah sesuai dengan jumlah reseptor R-LH dan R-PGF2α yang sejalan dengan tahap pertumbuhan dan perkembangan korpus luteum. Mekanisme ini akan mencapai puncaknya pada fase mid luteal. Protein Kinase A terlibat dalam pengaturan transkripsi gen Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) dan ekspresi enzim sitokrom P-450 scc melalui peningkatan fosforilasi cAMP Response Element Binding Protein (CREB) dan ERK.4 Steroidogenic Acute Regulatory berperan dalam transportasi kolesterol dari sitosol ke membran luar mitokondria sedangkan enzim sitokrom P450scc yang berada di mitokondria akan mengkonversi kolesterol menjadi pregnenolon. Pregnenolon akan dikonversi menjadi progesteron di dalam smooth endoplasmic reticulum oleh enzim 3β-HSD. Luteinizing hormone dapat meningkatkan ekspresi cyclooxygenase-2 (COX-2), suatu enzim yang mengkatalisis pembentukan PGF2α.5 Hasil isolasi dari ekstrak rimpang kunyit telah dapat disintesis secara laboratorik dan menghasilkan senyawa kurkumin. Kini bahkan dapat dibuat senyawa analognya dengan melakukan modifikasi pada gugus aromatik terminal
53
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal dan metilen aktif. Salah satu senyawa analog kurkumin yang telah mendapat hak paten sebagai antiinflamasi dan diperkenalkan sebagai Molekul Nasional (Molnas) adalah PGV-0 ((2,5 bis (4’-hidroksi-3’-metoksi benzilidin) siklopentanon)). Senyawa ini diketahui memiliki potensi lebih baik sebagai antioksidan dan antiinflamasi dibanding senyawa analog kurkumin lainnya serta memiliki toksisitas lebih rendah.6 Peran PGV-0 sebagai analog kurkumin pada sistem reproduksi belum banyak diketahui. Senyawa ini dapat mempengaruhi produksi progesteron dengan dan tanpa pemberian teofilin, suatu senyawa penghambat fosfodiesterase.7 Hastati et al.8 melaporkan bahwa PGV-0 dapat menyebabkan rupturnya folikel ovarium secara abnormal. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek PGV-0 terhadap fosforilasi ERK pada steroidogenesis sel luteal serta untuk mengetahui letak kerja (sasaran aksi) PGV-0 pada steroidogenesis sel luteal. Metode Penelitian ini dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Penelitian ini telah mendapatkan izin dari Komisi Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan Bagian Fisiologi FK UGM, Laboratorium Biologi Molekuler FK UGM, dan laboratorium Patologi anatomi RSUP Dr. Sarjito, Yogyakarta Bahan Penelitian Sel luteal yang digunakan sebagai obyek penelitian diambil dari korpus luteum (umur korpus luteum 4 hari) tikus (Rattus norvegicus, L) betina premature galur Sprague Dawley (UPHP UGM) yang diinduksi superovulasi dengan Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin (PMSG) [Gestyl, Organon]. Sel luteal diperoleh dengan cara mekanik dan enzimatik dari korpus luteum. Pembuatan kultur sel luteal menggunakan Minimum Essential Medium (MEM), Fungizone, Phosphate Buffer Saline (PBS), Kolagenase, Tripan Blue, Fetal Bovine Serum (FBS), Penisilin–Streptomisin (PenStrep) (semua reagen berasal dari Gibco, BRL, Life Technologies, Rockville, MD). Untuk pengukuran fosforilasi ERK digunakan forskolin (Sigma Aldrich Inc, St.Louise, MO), antibodi fosforilated ERK ½ pAb Rabbit (Promega, UK), streptavidinbiotin, dan deaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB). Zat kimia yang digunakan untuk kelompok perlakuan, kelompok kontrol dan uji adalah LH, PGF2α, forskolin (Sigma Chemical Co, St. Louis) dan pentagamavunon-0 (Laboratorium Molnas, Fakultas Farmasi UGM) Rancangan Penelitian Penelitian ini untuk mengkaji sasaran aksi PGV-0 dengan mengukur fosforilasi ERK pada kultur sel luteal (KSL) dengan diberi LH dan atau PGF2α. Penelitian terdiri atas 16 54
Tabel 1. Desain Penelitian Kelompok
Pelarut (kontrol) Pelarut + PGV-0 LH LH + PGV-0 PGF2α PGF2α + PGV-0 LH + PGF2α LH + PGF2α + PGV-0
Pengukuran Fosforilasi ERK dengan IHC Tanpa forskolin Dengan forskolin 4 4 4 4 4 4 4 4
ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan
4 4 4 4 4 4 4 4
ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan ulangan
kelompok dengan dan tanpa diberi forskolin. Kelompokkelompok tersebut adalah 1, KSL + pelarut metanol 1% (sebagai kontrol), 2, KSL + PGV-0; 3, KSL + LH ; 4, KSL + PGF2α ; 5 , KSL + LH + PGF2α; 6, KSL + LH + PGV-0; 7, KSL+ PGF2α + PGV-O; 8, KSL +LH + PGF2α + PGV-0 dan kelompok 9 s/d 16 sama dengan kelompok 1 s/d 8 yang masing-masing ditambahkan forskolin. Masing-masing kelompok terdiri atas 4 ulangan, seperti yang tersaji pada Tabel 1. Pembuatan Kultur Sel Luteal (KSL) Sel luteal (korpus luteum) diambil dari ovarium tikus Sprague Dawley dan dilakukan di dalam ruang Laminair Air Flow (LF) menggunakan forcep gunting dan pinset steril dalam keadaan dingin. Korpus luteum yang diperoleh kemudian dibersihkan dan didispersi secara enzimatik dalam medium yang mengandung kolagenase 1 mg/ml dan 5% penisilin-streptomisin (penstrep). Medium ini selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO2 5%, 370C selama 90 menit (3x30 menit). Setiap 30 menit inkubasi, medium didispersi secara mekanik dengan cara divorteks dan dikocok selama 3 menit. Selanjutnya medium diinkubasi lagi dan divorteks serta dikocok sebanyak 3 kali. Prosedur ini diulangi sebanyak tiga kali. Suspensi sel disaring dengan kasa steril untuk selanjutnya disentrifugasi menggunakan supersentrifus (Sorvall super T21) dengan kecepatan 720 g (2 000 rpm) pada suhu 4oC selama 10 menit dalam MEM pencuci yang mengandung FBS 10% (Gibco). Pencucian tersebut diulang sebanyak tiga kali. Pada pencucian terakhir supernatan dibuang dan ke dalamnya ditambahkan MEM penumbuh yang mengandung FBS 10%, Fungizone 0,7% dan Pen-strep 5%. Jumlah sel luteal dihitung terlebih dahulu, baru kemudian ditanam. Perhitungan sel yang hidup dilakukan dengan hemositometer setelah ditambahkan Tripan blue. Dilakukan pengenceran dengan media penumbuh sampai diperoleh konsentrasi sel luteal antara 105-106 sel/ml. Kemudian sel luteal ditanam dalam cawan kultur 24 sumur dengan volume 0,5 ml atau pada cawan kultur 96 sumur dengan volume masing-masing 0,1 ml untuk selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator 37oC, CO2 5% selama 72 jam. Media kultur diganti setiap 24 jam dan dilakukan pemeriksaan menggunakan mikroskop inverted. Sel hidup akan menempel pada dasar cawan kultur sedangkan yang mati akan mengambang dalam J Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal media dan terbuang pada saat penggantian media. Setelah jumlah sel mencapai konsentrasi yang diinginkan, kemudian dilakukan pemberian perlakuan dengan PGV-0 dosis tunggal yaitu 100 µM/l sesuai dengan desain penelitian. Pembuatan Media Kultur Minimum Essential Medium Untuk pembuatan media kultur, serbuk MEM dalam sachet dilarutkan dalam satu liter aquabides steril menggunakan pengaduk magnetic stirer. Kemudian ditambahkan 2,2 gram sodium bikarbonat sehingga warnanya menjadi merah. PH medium kemudian diukur dengan menggunakan pH meter elektrik. Untuk memperoleh pH 7,4, dilakukan penambahkan NaOH (0,1M) bila pH kurang dari 7,4 atau HCl (0,1M) bila lebih dari 7,4. larutan medium MEM disaring dengan pompa peristaltik dalam ruang steril. Dari dalam tabung Erlenmeyer, medium dilewatkan melalui pipa plastik ke dalam pompa yang pada ujungnya dipasang milipor steril dengan lubang 0,22 mikrometer. Hasil saringan ditampung dalam botol medium steril untuk selanjutnya disimpan dalam lemari es pada suhu 2-8o C. Untuk membuat medium dispersi, ke dalam medium MEM ditambahkan antibiotika Pen-strep 5%, Fungizone 1% dan kolagenase 1mg/mL. Untuk membuat medium penumbuh kedalam medium MEM ditambahkan Penstrep 5%, Fungizone 0,7% dan FBS 10%; sedangkan untuk membuat medium pencuci, ke dalam medium MEM ditambahkan serum 10%. Determinasi Fosforilasi Extracelluler Signal Regulated Kinase Kultur sel luteal pada kelompok kontrol maupun yang mendapat perlakuan setelah diinkubasi selama 24 jam akan melekat pada coverslip. Kemudian dilakukan pengecatan pada kultur sel luteal tersebut menggunakan teknik IHC di laboratorium Patologi Anatomi RSUP Dr. Sardjito, Yogyakarta. Prosedur pengukuran fosforilasi ERK pada penelitian ini mengacu pada metode IHC modifikasi menurut Cicero and Herrup9 sebagai berikut: kultur sel dalam coverslip yang telah diberi perlakuan dan diinkubasi pada inkubator dengan temperatur temperatur 37oC, 5% CO2 selama 24 jam diambil dan diletakkan diatas gelas obyek (poly-l-lysine slide). Selanjutnya coverslip difiksasi dengan aseton atau methanol 100% dalam suhu -200 C selama 10 menit. Kemudian dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak 3 kali, masingmasing 5 menit (3x5 menit) dan selanjutnya diteteskan H2O2 0,3% selama 20 menit, normal mouse serum (1:50) selama 15 menit. Cairan dibuang (tanpa dicuci), kemudian ditetesi dengan antibodi primer untuk ERK (fosforilated ERK1/2 pAb Rabbit) dengan pengenceran 1:200 dan diinkubasi selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan PBS 3x5 menit, diinkubasi dengan antibodi sekunder biotin (biotinylated secondary antibody) selama 5-10 menit. Kemudian dilakukan pencucian kembali dengan PBS 3x5 menit. Kultur sel diinkubasi dalam enzim streptavidinperoksidase selama 5-10 menit, dicuci dengan PBS sebanyak J Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
3x5 menit. Sampel selanjutnya diinkubasi dengan kromogen deaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) selama 5-10 menit dengan perbandingan kromogen substrat 1:20, lalu dicuci dengan akuades. Preparat direndam dalam hematoksilin selama 3-5 menit untuk counterstain, lalu dicuci dengan akuades. Setelah itu dilakukan pengeringan dengan menggunakan etanol 95% selama 10 menit dan dilanjutkan dengan xylen selama 10 menit. Preparat kemudian ditetesi Canada balsem dan ditutup dengan gelas penutup. Pengamatan terhadap fosforilasi ERK dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang menunjukkan fosforilasi akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan sel yang tidak menunjukkan fosforilasi akan memberikan warna ungu. Hasil perhitungan dinyatakan dalam persen dari 200 sel luteal yang diamati. Data hasil fosforilasi ERK adalah berupa data rasio (dalam persen). Selanjutnya data diuji secara statistik dengan Anova satu arah untuk mengetahui perbedaan antar kelompok, dilanjutkan dengan uji perbandingam berganda Least Significant Difference (LSD). Perbedaan dianggap bermakna jika nilai p<0,05. Hasil Perhitungan didasarkan pada persentase fosforilasi positif dari hasil IHC. Nilai fosforilasi yang dianggap positif adalah ERK1/2 yang terdeteksi pada analisis IHC. Hasil positif akan memberikan gambaran berwarna coklat di bagian inti dan sitoplasma setelah pengecatan dengan kromogen DAB (Gambar 1). Fosforilasi ERK1/2 pada semua kelompok akibat pemberian PGV-0 tersaji pada Tabel 2. Uji statistik menunjukkan nilai F=206,504 dengan p<0,05, sehingga menunjukkan adanya perbedaan bermakna antara kelompok-kelompok perlakuan. Forskolin adalah suatu aktivator adenilat siklase yang meningkatkan fosforilasi ERK1/2. Pemberian forskolin pada KSL kelompok pelarut meningkatkan fosforilasi ERK1/2 secara bermakna (p<0,05) dibandingkan pelarut saja. Tanpa penambahan forskolin, pemberian PGV-0 pada KSL kelompok pelarut dan KSL yang mendapat LH, PGF2α maupun LH + PGF2α menyebabkan fosforilasi ERK1 lebih rendah secara
Gambar 1. Hasil IHC Fosforilasi ERK pada Kelompok Kontrol dan Perlakuan Menggunakan Mikroskop Cahaya dengan Pembesaran 400x. Keterangan: Tanda panah warna coklat di inti dan sitoplasma menunmenunjukkan fosforilasi ERK positif. Pengukuran setiap kelompok dilakukan dengan menghitung persentase fosforilasi positif.
55
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal Tabel 2. Efek PGV-0 Terhadap Fosforilasi ERK dari Setiap Kelompok dengan dan tanpa Forskolin Kelompok Perlakuan
Pelarut (kontrol) tanpa forskolin Pelarut + PGV-0 tanpa forskolin LH tanpa forskolin LH + PGV-0 tanpa forskolin PGF2α tanpa forskolin PGF2α + PGV-0 tanpa forskolin LH + PGF2α tanpa forskolin LH + PGF2α + PGV-0 tanpa forskolin Pelarut (kontrol) dengan forskolin Pelarut + PGV-0 dengan forskolin LH dengan forskolin LH + PGV-0 dengan forskolin PGF2α dengan forskolin PGF2α + PGV-0 dengan forskolin LH + PGF2α dengan forskolin LH + PGF2α + PGV-0dengan forskolin
Fosforilasi ERK % (Mean ± SD) 37.25 35.50 41.25 39.25 34.50 32.12 40.75 34.75 40.75 38.50 42.50 41.75 36.00 35.50 42.00 35.50
± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±
0.50 0.58 0.50* 0.50* 0.58 0.50 0.50* 0.50* 0.50* 0.58* 0.58* 0.50 0.82 * 0.58 0.82* 0.58*
*p<0,05 menggunakan uji One way Anova
bermakna (p<0,05) dibandingkan KSL yang tidak diberi PGV0. Dengan menambahkan forskolin, pemberian PGV-0 pada KSL kelompok pelarut dan KSL yang distimulasi LH saja dan LH + PGF2á memperlihatkan fosforilasi ERK1/2 berkurang secara bermakna (p<0,05) dibandingkan kelompok tanpa ditambahkan forskolin. Sedangkan pada KSL yang distimulasi PGF2α, penambahan forskolin tidak menyebabkan fosforilasi ERK berbeda bermakna jika ditambahkan PGV-0 (p >0,05) Diskusi Fosforilasi ERK meningkat secara bermakna dengan adanya stimulasi LH. Hal ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya.10 Penambahan forskolin juga dapat meningkatkan fosforilasi ERK, karena forkolin dapat meningkatkan aktivitas enzim adenilat siklase.11,12 Pada penelitian ini, penambahan forskolin meningkatkan fosforilasi ERK1/2 hampir sama dengan peningkatan fosforilasi ERK1/ 2 akibat stimulasi LH saja. Sebagaimana diketahui, bahwa LH dapat mengaktivasi MAP Kinase ERK langsung dari GPCR.9 Peningkatan fosforilasi ERK1/2 oleh LH dapat juga disebabkan oleh peningkatan kadar cAMP melalui aktivasi PKA. Luteinizing hormone dan cAMP (yang dibentuk dari ATP oleh enzim adenilat siklase) dapat mengaktivasi fosforilasi MAP-Kinase ERK. Forskolin mempunyai efek peningkatan fosforilasi ERK seperti LH karena keduanya dapat meningkatkan aktivitas adenilat siklase.13 Pada kultur sel yang diberi PGF2α, fosforilasi ERK akan terhambat, karena PGF2α bersifat antigonadotropik. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian sebelumnya.3 Menurut Stocco et al.,14 PGF2α pada sel luteal dapat mempengaruhi fosforilasi ERK dengan cara menginduksi ekspresi gen Nur 77 melalui jalur Ca2+/calmodulin.
56
Pemberian PGV-0 menyebabkan fosforilasi ERK berkurang secara bermakna dibandingkan fosforilasi ERK pada kelompok pelarut. Pentagamavunon-0 juga menunjukkan aktivitas antigonadotropik terhadap LH seperti halnya PGF2α dengan menghambat peningkatan fosforilasi ERK oleh LH. Terjadinya hambatan fosforilasi ERK oleh PGV-0 dimungkinkan karena PGV-0 mempunyai kemiripan struktur dengan PGF2α. Prostaglandin F2α dapat menghambat MAP Kinase ERK langsung dari kompleks G-Protein Coupled Receptor (GPCR), melalui hambatan di up stream ERK jalur sinyal transduksi cAMP/PKA dan atau jalur sinyal transduksi PLC/ PKC/Ras/Raf, karena MAP Kinase ERK dapat diaktivasi melalui ketiga jalur tersebut.13,14 Prostaglandin F2α menunjukkan efek antigonadotropik terhadap fosforilasi ERK dan diperkuat oleh pemberian PGV0. Hasil penelitian menunjukkan bahwa PGV-0 menghambat fosforilasi ERK baik pada kelompok pelarut maupun kelompok yang terstimulasi LH dan atau PGF2α. Dengan demikian, PGV0 menghambat sinyal transduksi steroidogenesis sel luteal dengan sasaran aksi di up stream MAP-Kinase ERK. Pentagamavunon-0 diduga dapat menghambat forforilasi ERK melalui dua jalur up stream ERK, yaitu melalui sinyal transduksi dari kompleks GPCR dan dari down stream cAMP/PKA. Apakah PGV-0 dapat menghambat ekspresi protein seperti α-arrestin sebagai protein yang dapat menyebabkan desensitisasi reseptor,15 belum diketahui. Beta (β) arrestin merupakan protein yang berperan dalam sinyal transduksi langsung dari GPCR ke MAP-Kinase ERK. Hasil penelitian sebelumnya melaporkan bahwa PGV-0 tidak menghambat sinyal transduksi di-up stream cAMP, karena pemberian PGV-0 tidak menghambat akumulasi cAMP baik pada kultur sel kelompok kontrol maupun kelompok yang terstimulasi LH.16 Hal tersebut mengindikasikan bahwa PGV0 bekerja tidak di up stream cAMP, tetapi di-down stream cAMP. Dari hasil di atas, PGV-0 memperlihatkan adanya efek antigonadotropik dalam steroidogenesis KSL, khususnya terhadap fosforilasi ERK. Aktivitas PGV-0 dari hasil penelitian ini dapat dikembangkan sebagai bahan antifertilitas, yaitu sebagai antiimplantasi dengan menghambat produksi progesteron. Mekanisme ini disebabkan oleh hambatan sinyal transduksi pada steroidogenesis sel luteal. Selain itu PGV-0 juga dapat dikembangkan sebagai terapi antiovulasi. Penelitian ini belum mengkaji faktor-faktor yang berperan dalam sinyal transduksi melalui upstream ERK khususnya melalui jalur sinyal transduksi protein kinase C (PKC) atau jalur sinyal langsung melalui Guanine Nucleotide Exchange Factor (GEF), seperti ekspresi protein αarrestin. Diperlukan penelitian lebih lanjut tentang efek PGV0 pada steroidogenesis sel luteal, yaitu terhadap ekspresi protein di jalur up stream ERK, seperti misalnya protein G, PKC atau α-arrestin. Kesimpulan Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa PGVJ Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
Sasaran Aksi Pentagamavunon-0 pada Steroidogenesis Sel Luteal 0 menghambat sinyal transduksi pada steroidogenesis sel luteal dengan sasaran aksi di up stream MAP-Kinase ERK. Ucapan Terima Kasih Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Ketua Badan Pengurus Harian (BPH) Yayasan Yarsi Prof. Dr. H. Jurnalis Uddin, PAK dan Ketua BPPS Dirjen DIKTI atas bantuan biaya untuk terselenggaranya penelitian ini. Daftar Pustaka 1.
2.
3.
4. 5. 6.
7.
Stauffer RI. Progesterone as mediator of Gonadotropin Action in the Corpus Luteum: Beyond Steroidogenesis. Human Reprod Update. 2003;9(2):94-117. Chin EC, Harris TE, Abayasekara DRE. Changes in cAMP dependent Protein Kinase (PKA) and Progesteron secretion in Luteinizing human granulose cells. J Endocrinol. 2004;183:3950. Wiltbank MC, Diskin, MG, Flores JA, Niswender GD. Regulation of The Corpus Luteum by Protein Kinase C. II. Inhibition of Lipoprotein - Stimulated Steroidogenegenesis by Prostaglandin F2a. Biol Reprod. 1990;42:239-45. Wettschureek N, Offermanns S. Mammalian G Protein and Their Cell Type Specific Functions. Physiol Rev. 2005; 85:1159-204. Niswender GD. Molecular Control of Luteal secretion of Progesterone. Reproduction. 2002;123:333-9. Supardjan AM, Tim Molnas. Recent Development on Curcumin. Pharmaco-chemistry. One day seminar on Recent Development of Natural Product for Pharmaceutical Purposes.” Tribute to the retirement of Prof. Dr. HM. Moch Samhoedi, 12 July 2001. Nurcahyo H, Soejono SK. Effect of curcumin and pentagamavunon-0 on the steroidogenesis, proliferation activity and apoptosis in cultured porcine granulose cells at varying stages of follicular growth. In: Pudjono GIG, Sismindari, Riyanto S, Meiyanto E, Susidarti RA, kawati, Nugroho AK, Ritmaleni, editors. Recent development in curcumin pharmacochemistry. Proceeding of the International Symposium on Recent Progress in Curcumin Research; 2007, 11-12 September 2006, Yogyakarta. Faculty of Pharmacy Gadjah Mada University; 2007. p. 227-41.
J Indon Med Assoc, Volum: 63, Nomor: 2, Februari 2013
8.
Hastati S, Istriyati, Soejono SK. The Position of Follicle Rupture of Pentagamavunon- 0 (PGV-0) Treated Rattus norvegicus Strain Wistar. In: Pudjo GIG, Sismindari, Riyanto S, Meiyanto E, Susidarti RA, Ikawati, Nugroho AK, Ritmaleni, editors. Recent development in curcumin pharmacochemistry. Proceeding of the International Symposium on Recent Progress in Curcumin Research; 2007, 11-12 September 2006, Yogyakarta. Faculty of Pharmacy Gadjah Mada University; p. 243-56. 9. Cicero S, Herrup K. Cyclin dependent kinase-5 is essential for neuronal cell cycle arrest and differentiation. J Neurosci. 2005; 25:9658-68. 10. Shiraishi K, Ascoli M. Activation of the Lutropin / Choriogonadotropin Receptor in MA-10 Cells Stimulates Tyrosine Kinase Cascades that Activated Ras and the Extracellular Signal Regulated Kinase (ERK1/2). Endocrinology. 2006;147(7):3419-27. 11. Dewi DA, Abayasekara DRE, Wheeler-Jones PD. Requirement for ERK1/2f Activation in the regulation of Progesteron production in Human Granulosa-Lutein Cells Is Stimulus specific. Endocrinology. 2002;143(3):877-88. 12. Tajima K, Yoshii K, Fukuda S, Orisaka M, Miyamoto K, Amsterdam A, et al. LH-induced ERK Activation Differently Modulates Progesterone and Androstenedione Production in Bovine Theca Cells. Endocrinology. 2005;146(7):2903-10. 13. Salvador LM, Maizels E, Hales DB, Miyamoto E, Yamamoto H, Hunzicker-Dunn M. Acute Signaling by the LH Receptor is Independent of Protein Kinase C Activation.Endocrinology. 2002;143(8):2986-94. 14. Stocco CO, Lau, LF, Gibori G A Calcium/Calmodulin - dependent Activationof ERK ½ Mediates JunD Phosphorylation and Induction of nur77 and 20α-hsd Genes by Prostaglandin F2α in Ovarian Cells. J Biol Chem. 2002;27(5):3293-302. 15. Manna PR, Jo Y, Stocco DM., Regulation of Leidig Cell Steroidogenesis by Extracellular Signal Regulated Kinase 1/2: Role of Protein kinase A and Protein Kinase C Signaling. J Endocrinol. 2007;193:53-63. 16. Purwaningsih E, Soejono SK, Dasuki Dj, Meiyanto E. Efek Pentagamavunon-0 terhadap konsentrasi cAMP dan Progesteron pada Kultur Sel Luteal yang mengandung Teofilin. J Kedok YARSI. 2009;17(2):93-100.
57
