Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd MFW

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Samenvatting Moleculaire Biologie & Medische Biologie

Rots college 1 - GENETICS Alberts: Gene= sequences that acts as a functional unit for production of a protein, structural RNA, catalytic or regulatory RNA Prokaryoten Model organismen • Bacterie: E(scherichia) coli – mitochondria, chloroplasten Eukaryoten (celkern) • Gist: S(accharomyces) cerevisiae S(chizosaccharomyces) pompe meercelligen • Plant: Arabidopsis • Worm: C(aenorhabditis) elegans • Vlieg: Drosophila melanogaster • Muis: Mus musculus Genoomgroote is niet het aantal genen ( door Junk DNA)

Humaan DNA • Slechts 1,5% is coderend voor eiwitten • 98,5% “junk”?? >40% of “junk” unique: – 2/3: introns (genexpressie-regulatie) – codeert non-coding RNAs (genexpressie-regulatie) – genexpressie-regulatie (“promoters”)

1

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. 1. Genomics: studie van nucleotide sequentie van het gehele (humane) DNA 2. Epigenomics:

studie van epigenetische factoren over het gehele humane genoom van 1 celtype

3. Transcriptomics: studie van alle (eiwitcoderende) RNA transcripten van 1 celtype Micro-arrays: overzicht van gen-expressienivo’s in - verschillende weefsels - verschillende patienten - verschillende stimuli 4. Proteomics: studie van alle eiwitten van 1 celtype op een bepaald moment Meer info dan 1,2,3: alternative splicing, posttranslationele modificaties

GENEXPRESSIE REGULATIE. Ook de toegankelijkheid van het DNA: DNA- methylatie Histon modificaties.

Van Fenotype naar Gen

2

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW.

3


linkage analyse: positie van gen in het genoom bepalen a.h.v. ander gen of bekende markers (SNPs)

Haplotype block=gebieden in hetgenoom welkesteeds als clusterzijn doorgegeven: weinig genetische veranderingen hoe groter het block, des te recenter het ‘’disfunctionele’’ gen.

GWAS Genome-wide association studies: vinden van genetische variatie die geassocieerd is met een ziekte voor detectie, behandeling, preventie

Functie bepalen door gen-additie • Gain-of-function: - nieuwe activiteit - verhoogde expressie sterke promoter/ meerdere kopieen - misexpressie verkeerd moment, verkeerde plek • Loss-of-function: dominant negatief : extra gen codeert voor gemuteerd eiwit welke complexen vormt met wildtype eiwit. Normale eiwitten worden hierdoor belemmerd

Site-directed mutagenesis Het aanbrengen van mutaties op locaties van interesse - subtiele verschillen - welke onderdelen van eiwit zijn van belang

Genoom editing Genspecifieke DNA bindende domeinen= Engineered Zinc Finger Proteins, TALEs, CRISPR

RNA interference: repressie van target gen RISC= RNA induced silencing complex versus RITS= RNA induced transcriptional silencing (also centromeric chromatin!)

Artificiële Transcriptie Factoren (ATF’s)

4

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Functie bepaling van gen X Functie van gen X kan dus bepaald worden door: - uitknocken van gen X - inbrengen van siRNA/ transcriptie-repressoren (ATFs) - overexpressie van gen X extra kopieen gen X sterke promoter voor gen X transcriptie-activatoren (ATFs) -misexpressie van gen X Of: -omics analyse en clusteren met bekende genen =>

Dus, … DNA: “conserved” gebieden (bacteriën-> mensen) Genoom: zelfde in iedere cel (nier, lever, neuron, lymfocyt, ..) Andere -omics: celtype, omstandigheid afhankelijk (cDNA arrays, cluster analyse, biological noise) Genfunctie: Klassiek= fenotype-> gen (random mutagenesis, tempartuur gevoelig, linkage analyse) Reversed = gen-> fenotype (genadditie, site-directed mutagenesis, transgenes, RNA interference)

5


Rots College 2 – EPIGENETICS epigenetische kenmerken: 1. DNA methylation 2. post-translationele histon modificaties 3. histon varianten 1,2,3 bepalen de bereikbaarheid van het chromatine (non-protein-coding RNAs, nucleaire organisatie, …) Heterochromatine: inactieve genen Euchromatine: actieve genen

DNA ORGANISATIE Histonen= H2A, H2B, H3, H4 => ook histonvarianten (bv H3.3); => post-translationele modificaties Nucleosoom= octameer van histonen (2x (H2A, H2B, H3, H4)) + 147 bp DNA + 1x linker DNA Chromatine= DNA+ histonen+ niet-histon eiwitten

minimale onderdelen van een chromosoom: Telomeren (n=2/chromosoom): replicatie van de uiteindes bescherming tegen reparatie Replicatie origens (multiple): startpunt duplicatie van DNA Centromeer (1/chromosoom): bij elkaar houden van 2 dochter chr in mitose Het Histon gebruikt: ATP-onafhankelijk (“breathing”) dat betekent dat het 4x per seconde open is voor 10-50msec.

Chromatine remodelling: Wordt gekatalyseerd door ATP hydrolyse:

6


Dus… • Chromosoom bevat minimaal: 2 telomeren, 1 centromeer en meerdere replicatiestartpunten • DNA is georganiseerd in nucleosomen • Nucleosomen vormen chromatine fibers • Chromatine is dynamisch (+/- ATP) => chromatine types kunnen worden doorgegeven aan volgende generatie => chromatine types bepalen genexpressie niveaus

7

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Chromatine: meer dan verpakking chromatine=> dynamische regulering • Chromatine= DNA, RNA, histonen, non-histon eiwitten • Non-histon eiwitten: bv transcriptiefactoren; gelijke hoeveelheid histon eiwitten vs niet-histon eiwitten • Zeer geconserveerd: bv histon 4 (102 aa) -> erwt vs mens: slechts 2aa anders • Chromatine structuur kan genen “uitzetten” (silencing) Heterochromatine: compact bv centromeren, telomeren >10% van genoom verschillende typen: relatief resistent voor genexpressie

position effect variegation (PEV) Meest voorkomende histon aminozuur modificaties - Acetylatie (HATs, HDACs) - Methylatie (HMTs) - Phosphorylatie - ADP-ribosylatie - Ubiquitinilatie, sumoylatie, biotinilatie Methylatie blokeerd acetylatie.

8


Lezen van histonstaart modificaties: - Positie afhankelijk - Mono vs di vs tri-methylatie

9


Zo worden histonmodificatiepatronen doorgeveven: HIERBOVEN^^ Histon varianten: bv centric heterochromatine In gist: simpel- centromeric DNA sequentie 125 nt paar= 1 nucleosoom met CENP-A ipv H3 ca 12 andere eiwitten gebonden

Lokale chromatine structure Gen activatoren: initiatie van transciptie (=recruiteren van transcriptie factoren, Mediator, RNA pol. II)

10


Start transcriptie = accessibility and availability - gen bereikbaar? (DNA methylatie, histonen) 11

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. - juiste TF aanwezig? (complexvorming) CpG = Cytosine-phosphate-Guanine in plaats van Cytosine-Guanine in normale base-paring.^ DNA methylatiepatronen worden gehandhaafd en doorgegeven door onderhouds methylases.

Imprinting: bepaald allel van een gen alleen tot expressie komt van specefieke ouder.

ROTS College 3 - Celcyclus en Kanker (ontbreken van) controle

Prophase – promethaphase – metaphase – anaphase – telophase M fase= - mitose (kerndeling) - cytokinese (celdeling) * gedupliceerde chromosoom paren condenseren * kernenvelope breekt-> chromatiden aan spoelfig * zusters allignen in metafaseplaat * zusters worden uitelkaar getrokken * verpakt in 2 afzonderlijke kernen 12

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Controlesysteem – 3 checkpoints.

Check? = OK -> Cdk-cycline complex.

Cdk-cycline complex activatie 1. Cdk + cycline -> gedeeltelijke activatie 2. + CAK -> volledige activatie Cdk-cycline complex inactivatie (blokkade actieve site of ATP) inhiberende fosforylatie of Cdk-inhibitors (CKIs) Cycline afbraak door ubiquitilatie: APC/C ( Anaphase Promoting Complex ) CdC20 + APC/C + Ubiquitin -> M-cycline degradatie in proteasoom. Cycline en CKI afbraak door ubiquitilatie: SCF SCF herkent de gefosforyleerde doeleiwitten + Ubiquitin -> CKI degradatie

13


Dus… Controlesysteem van celcyclus: timing, volgorde, 1 fase/cyclus

Componenten: cyclines, Cdks, complexen

Activiteit: (de)fosforylatie van Cdks binding van CKIs proteolysis van cyclines & CKIs transcriptie afbraak (SCF, APC/C cruciaal )

REGULERING S PHASE

14

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Checkpoint Start = Environment favorable? Gebeurtenissen tijdens interfase (12-24 hrs) G1- S- G2: voorbereiding M-fase Replicatie van DNA Duplicatie van het centrosoom (microtubuli organising center) -> 2 polen centrosoom bestaat uit pericentriolar matrix en centriolen paar, centrosoom cyclus: Geinitieerd door G1/S CdK Net als DNA: 2 helften fungeren als template voor dochtercentride Groei van cytoplasma, organellen.

REGULERING M PHASE Controlesysteem – vb M-Cdks (M cyclines gereguleerd door genexpressie) (Late G2: activatie van Cdc25 door polokinases) Positieve feedback: M-Cdk remt eigen inhibitor (Wee1) M-Cdk stimuleert eigen activator (cdc25) 

Prometafase:afbraak kernenvelope. M-cdk phosphoryleert nuclear lamina nuclear envelope breekt: chromsomen komen “vrij” Chromosoom condensatie: - 2 zuster chromatiden (cohesine: bij elkaar) - chromosoom condensatie (condensine) – gefosforyleerd door M-Cdk.

15

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Spindle attachement checkpoint = M-A Checkpoint • Alle chromosomen gebonden aan beide polen van het spoelfiguur= geen negatieve signalen meer • Negatieve signalen van niet correct of ongebonden kinetochoren (en/of geen spanning) • Geen negatieve signalen= APC/C upregulatie.

Telofase 2 dochter interfase kernen • Afbraak mitotische spoelfiguur • hervorming van 2 nuclear envelops door fusie van kern envelop fragmenten – Om chromosoom clusters heen – Fusie van de pakketjes Begin mitose-> fosfolylatie van effector-eiwitten Einde mitose-> defosforylatie: met name tgv inactivatie van CdKs door afbraak cyclines, maar kan ook door activatie van fosfatases

Cytokinese • Begint in anafase en eindigt in telofase • Gemedieerd door “contractile ring” • Stadia: 1. Initiatie (juiste tijd, juiste plek!) 2.Contractie 3.Membraan insertie: intracellulaire vesicles 4.Completie 16


Kanker. Ongecontroleerde Celproliferatie. versnelde celgroei = Oncogenen te actief verminderde apoptose = Tumor supressor genen Inactief. virus-geinduceerde kankers:

17


College Linskens Hfdst 22 – Ontwikkeling van multicellulaire organismen

Kernvragen: Hoe worden cellen van een organisme verschillend, als alle cellen hetzelfde genoom bevatten? Hoe worden deze veranderingen iedere keer weer nauwkeurig uitgevoerd in tijd en ruimte?

Vrijwel alle multicellulaire organismen ondergaan gastrulatie: Tijdens de gastrulatie wordt uit de tweelagige structuur die het embryo nu heeft een drielagig kiemblad gevormd

18

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Voor bouw van ieder multicellulair organisme is nodig: - Cel Proliferatie - Cel Specialisatie - Cel-Cel Interacties - Cel migratie Essentieel verschil tussen enkele- en multicellulaire organismen: - Cel adhesie en signaling - Transcriptie factoren 50% van de genen hebben homologen in andere species, veel van deze genen coderen voor bouwstenen. Dus, bouwstenen zijn vaak hetzelfde, wanneer ze gebruikt worden verschilt.

Experimentele embryologie = interactie tussen cellen en weefsels in relatie tot ontwikkeling Transplantatie, lineage tracing

Ontwikkelingsgenetica = rol van genen in in relatie tot ontwikkeling Cell Fate: het lot van een cel ( klassieke embryologie, intrinsieke karakter totaal onbekend) Specified, comitted: Cel is op weg een hersencel te worden maar kan nog veranderen. Determination: bepalt welke type cel een bepaalde cel zal worden

Stappen in de ontwikkeling van een cel tijden embryogenese Inductie  Specificatie  Determinatie  Differentiatie. Regional determination: Positie-specifieke eigenschappen van een cel ( bijvoorbeeld ledematen) Voordat determinatie en differentiatie van een individuele cel plaatsvindt.

Hoe worden cellen verschillend?

-

Asymetrische deling -Concentratie Gradient (inducer/Inhibitor) -Externe factoren na geboorte van nieuwe cel Laterale inhibitie: onderdrukking van nabijgelegen cellen m.b.t. expressie. Inductieve interactie dichtbij (cel-cel) leiden tot complexe patronen. ver weg (morphogenetic field) Sequentiele inductie

19


Ontwikkeling Drosophila: Eerste organisatie in de eicel: interne gradienten. Anterior-Posterior: gelocalizeerde maternale mRNA’s Dorsal-Ventral: receptors geinduceerd door nabijgelegen cellen. Morphogens: verfijnen verdere patroonvorming onder de D-V gradient.  Overeenkomst en verschil insecten en vertebraten.

De D-V as is omgekeerd, maar opbouw is hetzelfde. A-P segmentatie wordt door opeenvolgende groepen van regulatie genen steeds verder verfijnd

“Eve’’ komt tot expressie in 7 baden: het regulatoire DNA van het eve-gen wordt geregguleerd door verschillende combinaties van transcriptiefactoren, bv: Bicoid en Hunchback maar geen Giant of Krupel. Enzovoort.

20


Homeobox genen(Hox Genes): DNA sequentie die voor homeodomein codeert. Zorgen voor identiteit van de segmenten De (epigenetische) regulatie van de Hox genen zorgt voor ‘long term memory’ in cellen van een segment

Homeotische selector genen: Gen-regulatoire eiwitten met 60 aminozuur groot DNA-bindend domein (Homeodomein) Bijvoorbeeld: Bithorax complex (abdomen, Thorax) , Antennapedia complex (thorax, hoofd) Sequentiele expressie van homeotische selector genen gaat volgens de volgorde in het Hox complex, het Hox complex heeft een langdurig positioneel geheugen dat bewaard blijft in structuren in de volwassen vlieg. Gemeenschappelijke voorouder: D.melanogaster: splitsing in antennapedia en bithorax complexen, Zoogdieren: Herhaalde duplicatie van gehele complex, 4 Hox complexen. Ontwikkeling van organen en ledematen is een verdere verfijning van patroon formatie, waarbij compartimenen van cellen worden gevormd. De cellen specialiseren volgens het ‘programma’ van dat compartiment. Regulatoire genen en morphogen gradienten spelen ook hier een belangrijke rol. Voorbeelden: Vleugel formatie bij Drosophila, en ledemaat formatie bij vertebraten 

Regulatie van compartiment grootte: De grootte van organismen, organen, ledematen en compartimenten, is strak gereguleerd, maar het is niet goed bekend waardoor. Cel-aantal lijkt een rol te spelen, of factoren die van oorsprong de aanwezigheid van nutrienten registreerden. Andere experimenten wijzen op fysieke afstand metingen, door stijlheid van een morphogen gradient. De vorming van compartimenten in de ledematen van vertebraten: worden door engrailed en apterous, en door wingless, hedgehog, Dpp en Notch gereguleerd, analoog aan de ontwikkeling van de vleugel in Drosophila.

Tast-haar ontwikkeling(4 cellen ontwikkeling, mechanisme ): eerst Laterale inhibitie(notch), daarna assymetrische deling.

Ontwikkeling: Principes, patronen en regulatie mechanismen worden in tijd en ruimte, en in verschillende soorten, een aantal keer herhaald waardoor uiteindelijk het lot van ieder cel in het organisme wordt bepaald. Kleine veranderingen in expressie patronen van regulerende genen hebben grote invloed op de vorming van het uiteindelijke organisme. 21

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Ontwikkeling van de klauwpad Xenopus laevis. - Assymetrische verdeling van mRNA en eiwit in cel (polariteit) - ‘sperm entry point’ is marker voor polariteit in bevruchte eicel - Eerste 7 uur, celdeling(klieving), geen groei

-

Signalen die de organisatie van de gastrulatie besturen zijn van maternale afkomst.

Mus musculus Pluripotente embryonale stamcellen : Embryonale Stamcellen (Es) : intrinsiek onsterfelijk en pluripotent. Potentiele bron voor transplantaties/weefsel repair. Precieze genetische modificatie mogelijk. Teratoma: ontstaat na transplantatie van embryo in nier/testis van volwassen dier. Bevat ongeorganiseerde verzameling weefsels, in deze teratomas zitten stam cellen afkomstig van de Inner Cell Mass cellen (EC cellen = Enterochromaffin cell)

22


College Linskens Hfdst 23 – Leven en dood van cellen in weefsels. Ectoderm Ectoderm: Huid - Elastisch en sterk: extracellulaire matrix. - Bloedvoorziening via bloedvaten, gevormd door endotheel cellen, aanvoor nutrienten O2 en afvoer CO2 - Cellen van het immuun systeem bereiken de huid via bloedvaten (macrofagen, dendritische cellen en lymfocyten) - Zenuwvezels: sensorische en motorische informatie (contractie, secretie)

Ectoderm: epidermis -

-

Meerlagig epitheel met name bestaande uit keratinocyten Granulaire laag, waterdicht Basale lamina, basale cellen Continue vernieuwing, basale cel deelt, verliest kern en organellen en valt eraf (1 maand)

23


Stam cellen: -

Niet terminaal gedifferentieerd Kan oneindig delen Na deling kunnen dochtercellen kiezen:  Differentiatie versus zelfvernieuwing (BV Herstel)

Basale laag: Stam cellen: hoge expressie integrine B1 Tijdelijke amplificerende cellen: minder Itegrine B1 Contact met basale lamina is nodig voor handhaven stamcel eigenschappen.  Regulatie: Snelheid stam cel deling, selr-renewal ja/nee, aantal delingen T.A. cel, tid van vertrek van basale lamina en tijdsduur van differentiatie en vervellen. Psoriasis: Verhoogde proliferatiesnelheid basale cellen, van deling tot vervellen: 1 week. Sommige stamcellen behouden originele DNA, Immortal tagged.

Ectoderm: Melk-klieren Rustende klier: groei alveolie cellen vanuit stamcellen. Stoppen met zogen: melk accumulatie: inductie apoptose: terugkeer rustende klier

24

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Ectoderm, zintuigcellen, gehoor: Geen vervanging, moet hele leven mee. Mechanische beweging wordt vertaald in membraan depolarisatie

Ectoderm, zintuigcellen, zien: Geen vervanging. Lichtgevoelige rodopsins vertalen licht in potentiaal. Rodopsins wordt continu vernieuwd.

Endoderm. Endoderm, long; alveoli cellen type 1 en 2 zorgen voor structuur en oppervlaktespannings-verlagers. Capillairen en endotheel zijn van oorsprong mesodermale cellen. Hoger in longen dik epitheel. Slijm cellen in cilia zorgen vor bescherming tegen stof en voor transport van macrofagen vanuit de alveoli. Basale stamcellen zorgen voor cel vernieuwing. Endoderm, Darm: Extreme condities, continue vernieuwing van cellen (turnover < 7 dagen)  Vier celtypen ontstaan vanuit de darmcellen: Absorptive cells ( opname ) Goblet cells (slijmbekercellen) Enteroendocrine cells (peptiden neurotransmitter Paneth cells (specefieke antibiotica )

‘wnt-signaling’reguleert groei, ‘notch’ reguleert differentiatie

25

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. ‘EphB-signaling’ bepaalt migratie van darm-epitheel-cellen. Vanuit de crypt naar het lumen. Signaal moleculen bepalen de stamcel-niche (crypt) - Crypt  Hedgehog & Wnt  BMP4 expression in villus core  BMP4 blocks Hedgehog and Wnt in villus  Villus cells do not proliferate.

Endoderm, lever: Één celtype, vele funcites, Hepatocyten zorgen voor absorptive synthese van vetten en productie van gal. Hepatocyten zijn gedifferentieerde cellen die kunnen blijven delen en zorgen voor herstel van de beschadigde lever. Er is een nog slecht begrepen mechanisme waardoor de lever een bepaalde grootte houdt.

Mesoderm Mesoderm, bloedvaten: Endotheelcellen vormen de binnenwand van arteries en capillairen Deling van endotheelcellen herstelt schade aan bloedvaten en zorgt voor nieuwe capillairen (angiogenese) Angiogenese: Is gereguleerd door groeifactoren. - VEDF = Weefselschade - HIF-1 = Zuurstofgebrek (low O2  High HIF  VEGF secreted angiogenese. Mesoderm, bloed: Witte bloedlichaampjes - Monocyten, granulocyten, macrophagen, lymphocyten. Rode bloedlichaampjes Bloedplaatjes – afgescheiden van megakaryocyten in het beenmerg Bloed ontstaat in het beenmerg vanuit multipotente stamcellen onder CSF’s invloed ( Colony Stimulating Factors ) Ieder celtype kan, afhankelijk van signalen, apart worden gemaakt in het beenmerg Stamcellen hebben signalen van stomale ( basale ) cellen nodig om stamcel eigenschappen te behouden.  CFS’s delen vaak subunits van receptoren voor verdere signaaltransductie. CFS’s kunnen invloed hebben op alle aspecten van de hemapoiese (vorming van bloedcellen uit stamcellen) (beneden)

26


Stam cel ‘enginering’:  Embryonale stamcellen (pluripotent, onsterfelijk) Humane embryonale stamcellen (embryos, ovara, testes) Problemen: afstoting door immunsysteem. Oplossing: therapeutisch kloneren

Neurale stamcellen: Neurogenese in de hersenen. Hippocampale stamcellen, na isolatie, kweken in vitro en transplanatie, differentieren zich tot cellen passend bij die nieuwe locatie. Transdifferentiatie: niet-stamcellen die zich ontwikkelen tot andere celtypen. Bv. Beenmercellen differentieren tot hercencellen.

27


College Scheffers Hfdst 24 – Ziekteverwekkers, infectiemechanismen, aangeboren immuunsysteem. College 1 1) Wat voor ziekteverwekkers zijn er? Eiwitten, virussen, bacteriën, schimmels en protozoa Bacteriën – virulentiegenen/-factoren Schillems/protozoa/parasieten – complexe levenscyclus Virussen – Totaal afhankelijk van gastheer Prionen – Infectieuze eiwitten Pathogen spelen een rol bij de onwikkeling van kanker en chronische ziektes.

Kenmerken van pathogenen.

-

Primaire pathogenen – Lichaamsvreemd. Opportunische pathogenen – onderdeel van flora, of bij verwonding/immuunsuppressie Bacteriën: Obligaat= , Facultatief, Opportunistisch************* Pathogenen zijn in staat tot: Kolonisatie Vinden van niche Vermijden, ontwrichten of ontduiken van de aangeboren en adaptieve immuunrespons. Vermenigvuldigen door gebruik te maken van de gastheer (voedsel ) replicatie genetisch materiaal/eiwitten) Verspreiding door de gastheer te verlaten en nieuwe gastheer te vinden. Symptomen van de infectie worden veroorzaakt door de pathogeen en/of de respons van de gastheer.

Bacterien: Eencellig, verschillende vormen  Klein genoom. Celenvelop: Flagel en pili, voortbeweging, pili ook aanhechting gastheer en uitwisseling Gen. Mat. Wat maakt een bacterie pathogeen? Meerderheid is niet pathogeen ( 99,5%) Verschil in kiskeurigheid Grote verschillen tussen pathogeen en niet-pathogeen: Virulentie Genen die coderen voor Virulentie Factoren. 1) Dit zijn vaak eiwitten die een directe interactie aangaan met gastheercel, kolonisatie replicatie. 2) Toxines (geen contact) 3) Type III secretie systemen (T3SS) – Injectiespuit voor eiwitten (contact) 4) Type IV secretie systemen (T4SS)- Injectiespuit voor DNA en eiwitten (contact) Vibrio Cholerae: is niet pathogeen, behalve als de CTXf- bacteriofaag aanwezig is. (cholera toxins) & het VPI gen (darm kolonisatie)

28

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Fungi / Protozoa Fungi – Gisten en schimmels Twee verschijningsvormen – Multicellulair ‘schimmeldraden’ vs unicellulair ‘gistachtig’ Protozoa – Eencellige eukaryoten Voorbeeld: Plasmodium – Malaria Vaak meer dan 1 gastheer Verschillende levensfases – verschillende vorm van cel en transcriptie van genen.

Virussen Geen cellen Klein genoom, verpakt in eiwitmantel met eventuele lipide envelop Grote variatie Genoom DNA, RNA, enkel/dubbelstrengs, lineair, circulair(DNA) Gebruiken gastheermembraan voor envelop: 1) Budding, virus envelop eiwitten geinserteerd in ER, via Golgi. ( of meerdere malen ) Enveloped viussen Envelop niet afgeleid van plasmamembraan Geen lysis gastheercel. Virusziekten zijn moeilijk te bestrijden Gebruikt gastheercel voor replicatie, blokkeren van virusreplicatie is toxisch voor gastheer Vaccinatie is de beste strategie ( inbrengen verzwakte ziekteverwekker)

Prionen – infectieuze eiwitten

Virale en bacteriële infecties: Raus sarcoma virus – Kanker in kippen HPV ( humaan papillomavirus ) – Baarmoederhalskanker Eppstein-Barrvirus ( Pfeiffer) – Remming apoptose geinfecteerde cellen. Helicobacter pylori – Maagzweren en maagkanker

29

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. 2) Hoe komen pathogenen gastheercellen binnen en wat doen ze? • •

• •

Kolonisatie van gastheer door aanhechting aan celoppervlak, soms gevolgd door invasie van de cel. Invasiemechanismen: – receptor-mediated endocytosis (virussen) – aanhechtings- en fagocytotische routes (bacteriën) – protozoa: actieve invasie vinden van gunstige niche (celorganel) verstoring van membraantransport ’routes’

Huid als verdedegingslinie Dik, hard, gekoloniseerd door andere flora ( bacteriën ) Andere delen toegankelijker, Toegang in huid door wondjes. Of via een Vector – Insect (arthropod) Kolonisatie: steriele oppervlakken dus: Adhesins, herkenning oppervlaktemoleculen o.a. op de Pili, specificiteit adhesin bepaalt welke gastheercel. Epitheel kolonisatie zonder adhesins 1) Type 3 injectie EIGEN receptor eiwit in gastheer. 2) Fosforylering van Tir door Tyrkinase  Rho GTPase recrutering  recrutering actine filamenten  vorming pedestal voor bacterie Intracellulaire pathogenen (virussen e.d. ) Mechanismen om binnen te komen te overleven, repliceren en te ontsnappen. Virussen binden aan het celoppervlak mbv : Enveloped: Membraanfusie plasma of endosomaal membraan Non-Enveloped: Pore in plasma membraan of lysis van het endosoom.

30

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Bacteriën – Fagocytose Fagocytose in macrofagen ( gastheercel = macrofaag ) Geïnduceerde fagocytose – zippers en triggers Receptor normaal voor cel-cel of cel-matric adhesie; gastheer denkt dat cel-cel contact moet worrden gemaakt ( adhesins ) Bacteriele effectors stimuleren vorming van ‘membaarn ruffles’- (vorming endocytotisch vesicle ‘macropinosoom’

Eukaryote parasieten – actieve invasie 1 Gebruikt eigen cytoskelet om zich naar binnen te duwen Verwijdert membraaneiwitten gastheermembraan, om fusie met lysosoom te voorkomen

Actieve invasie 2 (1. bij survival technieken)

Actieve invasie 3

31

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Na endocytose:

veel pathogenen in endosoom → fusie met lysosoom → vorming fagolysosoom

→ pathogeen†

Survival techniek 1: Ontsnapping uit fagosoom. Zie Trypanosoom) Survival techniek 2: voorkomen van fusie – verandering endosoom of ander gastheercelmembraan.

Survival techniek 3 Overleven in phagolysosoom.

Samenvatting: Kolonisatie van gastheer door aanhechting aan celoppervlak, soms gevolgd door invasie van de cel. Invasiemechanismen: 1) Receprot-mediatet endocytosis/porevorming (virussen) 2) Aanhechtings- en fagocytotische routes (bacteriën) 3) Protozoa: actieve ivasie Voorkomen van fagocytose (Ontsnapping/aanpassing fagosoom) Verstoring van membraantransport ‘routes’ Nog TOEVOEGEN: ZIPPER, MEER PLAATJES(Specefieke eiwitten worden gevraagd) Rood: 5 – facultatief (kenmerk andere niche; opportunistisch is lichaamsgeassocieerd maar nu op andere plek/immunocompromised; obligaat replicatie alleen maar in gastheer)

32


College 2 Bacterien die repliceren in het cytosol gebruiken het cytoskelet voor transport  (Listeria)

Nucleatie van actine polymerisatie: Verschillende eiwitten worden gebruikt bij verschillende organismen om ARP(actin related protein) te recruteren.

ARP nucleatie van actine:

Transport zonder actine: GFP-gelabeld alpha herpesvirus beweegd door een axon Virus gebruikt twee vershillende motoreiwitten: 1) Op weg naar nucleus, voor replicatie: Dynein. 2) Op weg naar uiteinde axon, na replicatie: Kinesin Wolbachia (insectenpathogeen) - Bindt microtubuli aan spindle pole, infectie wordt dus doorgegeven tijdens chromosoom segregatie en dus deling.

33

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Virussen gebruiken gastheercel niet alleen voor voedingsstoffen.(retrovirus)

Overname metabolisme door virussen: • • • • • •

knippen TATA binding factor van TranscriptieFactor IID – stopt gastheer DNA→RNA transcriptie blok RNA modificatie – mRNA blijft ‘gevangen’ in kern (influenza) verwijderen 5’-cap van gastheer mRNA – geen herkenning door translation initiation factors of… verwijderen 5’-cap en gebruiken als primer voor virus-RNA synthese: ‘cap-snatching’. afbraak translation initiation factors door virale proteases verstoring celcyclus om te zorgen voor hoge productie DNA polymerase (in S-fase); adenovirus.

Verandering gedrag gastheer Trypanosomen – tse-tse vlieg/ vlooien blijven bijten Diarrhee/hoesten/niesen – verspreiding pathogenen Hondsdolheid – Rabies virus in speeksel, gastheer wordt aggressief en bijtgraag.

Pathogeen vs gastheer – antigen variatie Adaptieve immuunrespons; aanmaak antilichamen tegen oppervlakte moleculen pathogeen. Pathogeen – verandering oppervlakte gedurende infectie – Trypanosoma brucei ( slaapziekte) Variant-specific glycoprotein (VSGa,VSGb,VSGc,VSGd etc.)

Bacteriele oppervlakte verandering Neisseria sp (gonorrhoea) - Recombinatie cell-survace pili - Variatie in expressie van oppervlakte eiwitten - Natuurlijk competent (opname DNA uit milieu) - Weinig DNA-herstel mechanismen – grote kans op mutaties Horizontal gene transfer – overdracht van grote stukken DNA dmv plasmiden/fagen – snelle evolutie.

34

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Virussen – error-prone replicatie •

•

retrovirus – gemiddeld één puntmutatie/replicatie – veranderend gedrag in gastheer – snelle respons op anti-virale geneesmiddelen – te hoge mutatie-snelheid is niet goed – ophoping nadelige mutaties – door ontwikkeling mogelijk beperking in gastheerkeuze uitzondering – influenza (griep)

Spaanse en andere griepsoorten – oorsprong • • •

Influenza – genoom bestaat uit 8 RNA moleculen recombinatie van voor mensen infectieuze vormen met andere vormen leidt tot nieuwe, zeer virulente griepvirussen oversteken ‘species barrier’ / overdracht mens-mens

Antibiotica – beperkte ‘targets’ eiwitten die verschillen van humane eiwitten pathways die niet voorkomen in eukaryoten (bijv. peptidoglycan synthese

Resistentie ontstaat door: spontane mutaties Horizontal gene transfer. Meeste antibiotica zijn natuurlijke producten, dus de resistentie is al aanwezig in de natuur

35


Verdedeging tegen pathogenen. -

Huid/andere epitheeloppervlakken huid/epitheel – fysieke barriere. slijm/mucus – beschermt tegen adhesie, verwijdering pathogenen, bevat defensins Defensins – vormen gaten in de bacteriële membraan. (nisine L. Lactis )

Onderscheiden zelf/niet-zelf • •

• •

micro-organismen die binnenkomen – herkenning door adaptive en innate immuunsysteem innate immuunsysteem: – herkenning pathogen-associated immunostimulants (PAMPs): • geformyleerde Methionine • oppervlakte moleculen (PG, TA, LPS, mannan, glucan, chitin) • DNA (CpG motief) onderscheid pathogenen vs normale flora – concentratie of op vreemde plek. respons: – ontsteking (inflammatory) – phagocytose door professionele phagocyten en dendritische cellen (met als gevolg T cel activatie) Lipopolysaccharide (bacterie membraan) – zorgt voor een sterke immunostimulans.

Patern Recognition Receptors – Toll (TLR) en Nod.

Complement system •

complement – ongeveer 20 oplosbare eiwitten in bloed en extracellulaire vloeistof – aanmaak vnl in lever – normaal inactief – ‘pro-enzymen’ – activatie door proteolyse – versterkend effect – proteolytische cascade (sneeuwbal) (C1 – C2 – C4 – C3) – Complement eiwitten vallen uit elkaar in a en b fragment: • a: signalling • b: proteolytisch actief, membraan-gebonden aan cel waar reactie startte 36

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Complement systeem heeft 3 routes:

Complement – Membraan attack complexes: C5b gebonden aan pathogeen oppervlak recruteert C6,7,8,9

Complement – zelfbescherming •

•

gastheercel – oppervlakte voorkomt complement binding – sialic acid in oppervlakte glyco-proteins en glycolipiden. – Neisseria gonorrhoeae kan dit overnemen, net als Trypanosoma cruzi (college vrijdag) reactie wordt gestopt door: – remmer-eiwitten in bloed en aan gastheercellen die geactiveerde complement eiwitten binden – intrinsieke instabiliteit geactiveerde complement eiwitten

Macrofagen / neutrofiele granulocyten • • • • •

macrofagen – lange levensduur, in weefsel neutrofielen – korte levensduur, in bloed, niet in weefsel. receptors op cel-oppervlak: PRR (TLRs), C3b receptors, antilichaam receptors. binding pathogeen – lokale actine polymerisatie, engulfment in fagosoom vermijden phagocytose: capsule (oa Strep. pneumo) toxine (T3SS, Yersinia 37

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Phagocytose • •

• •

Fusie fagosoom met lysosoom – vrijkomen lysozym (celwand afbraak), acid hydrolases, defensins NADPH-oxidase in membraan fagolysosoom: – zuurstofradicalen (O2-, HOCl, H2O2, OH•) – pH omhoog – activatie neutrale proteases Neutrofiel overleeft dit niet – pus Macrofaag overleeft meestal – presentatiefragmenten pathogeen aan oppervlak als antigeen

Eosinophils groep van fagocytotische cellen rond binnendringer, uitscheiden eiwitten en zuurstofradicalen uit granules door exocytose – soms zelfs DNA.

Antigen presentatie en activatie T-cellen door fagocytotische cellen

Speciale fagocytose: Dendritische cellen verbinden aangeboren en adaptieve immuniteit.

38


Ontsteking – Inflammatory response • • • •

• •

verwijding bloedvaten, ophoping complement, stollingseiwitten, aanwezigheid neutrofielen en macrofagen signaalafgifte– cytokines, prostaglandines koorts – hitte slecht voor pathogeen, goed voor adaptieve immuunrespons overreactie – bij verspreide infectie in bloed - septic shock – lokaal: asthma, reuma sommige pathogenen overleven in macrofaag en gebruiken deze voor verspreiding (Salmonella enterica v Typhi) sommige pathogenen remmen respons – cytokine antagonists

Bescherming tegen virussen • • •

‘patronen’ op oppervlakte virus bevatten geen ‘ongewone’ modificaties: zijn door gastheer gemaakt virus genoom bevat vreemde elementen – bv dsRNA dsRNA – twee effecten – afbraak door Dicer – vervolgens afbraak ssRNA met virale code

–

• •

activeert productie Interferonen a en b: • signaal voor geïnfecteerde en omliggende cellen • stimulering transcriptie via Jak-STAT (ong 300 genen) Interferon respons ook getriggerd door andere virale componenten zoogdieren – APOBEC (RNA editing) – introductie mutaties in viraal cDNA

39

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Virus-geïnfecteerde cellen aangezet tot zelfmoord: Natural Killer Cells en Cytotoxic T cells.

Virussen vechten terug • • • •

Influenza – eiwit dat dsRNA herkenning door Dicer voorkomt HIV – ubiquitinatie en afbraak APOBEC complex blokkeren Interferon productie/signalering remmen apoptose – kan kanker tot gevolg hebben (Epstein-Barr virus – Burkitt’s lymphoma)

College 3 - Microbioom Microbioom = naam voor de verzamelde microflora die je meedraagt – huid, mond, darmen – 10x zoveel cellen; 100x zoveel genen als jijzelf.

Enterotypes – 3 ‘wereld’wijd • • • • -

3 clusters van microbiële communities, niet land- of continent-specifiek (Europa, USA, Japan, NIET Afrika) Bacteroides/Prevotella/Ruminococcus niet specifiek voor leeftijd, geslacht, lichaamsgewicht wel verschil op gen(cluster)niveau: ouderen: meer afbraak zetmeel, minder stress response (link met minder actief immuunsysteem) ‘kleine’ verschillen in vitamineproductie enterotypes variëren over tijd in zelfde gastheer microbioom dieet afhankelijk – Bacteroides eiwit- en vetrijk, Prevotella zetmeel, koolhydraatrijk. microbioom co-evolueert met gastheer

40

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Ontstaan Microbioom • •

• •

•

baarmoeder is steriel ‘starter’culture van moeder tijdens geboorte: – vaginaal – Lactobacillus(melk), Prevotella, of Sneathia spp. van moeder – keizersnee - Staphylococcus, Corynebacterium, and Propionibacterium spp (huid, maar NIET ALLEEN van moeder) geen variatie huid/maag-darm/mond in eerste 24 uur keizersnee: kans op MRSA infectie verhoogd, mogelijk hogere kans op allergie (te verminderen mbv probiotica), mogelijk latere ‘vestiging’ normale darmflora, mogelijk iets minder vermogen om moedermelk te verteren. nog weinig duidelijkheid over hoe microbioom zich ontwikkelt.

Microbioom ontwikkeld zich met de voeding • •

• • •

Moedermelk – meer dan 200 verschillende soorten oligosacchariden – decoy voor pathogenen, voedsel voor Bifidobacteria ssp infantis vergelijkende studies tussen kinderen in Europa en Afrika laten verschillen zien die op dieet (vnl planten vs westers dieet) zijn terug te voeren Zeewiereters: (sushi) Porphyran (en agar) – polymeer uit zeewier – afbraak door bacteriële eiwitten porphyranases/agarases homology search: mariene bacteriën – maar ook Bacteroides plebeius – darmbacterie B. plebeius uit metagenoom samples JAPANSE proefpersonen – niet in metagenoom Amerikaanse proefpersonen.

‘obese’ microbioom is beter in energie onttrekken aan voedsel: meer fermentatieproducten (blinde darm) minder energie in faeces

Microbioom invloed op gedrag: • • • • •

• • • •

fruitvliegen – paarvoorkeur gebaseerd op dieet rondje antibiotica – voorkeur weg! toevoegen Lactobacillus plantarum (uit microflora) aan steriel voedsel - zetmeelvoorkeur terug! microbioom beïnvloedt feromoonproductie transplantatie microbioom naar GF-muis: • baby: zelfde gedrag als muis met microbioom • volwassen: gedrag blijft als GF groot verschil in genexpressie in hersenen muis met probiotics (L. rhamnosus): hogere GABA niveaus (lage niveaus oa gelinkt aan depressie) – ook in volwassen muizen! doorsnijden nervus vagus – effect probiotica weg clinical trials: hoopvolle resultaten pre-/probiotica IBS, chronische vermoeidheid.

Probiotics: • •

geen noemenswaardige verschillen in samenstelling microbioom wél verschillen in meta-transciptoom (RNA analyse faeces en MassSpec urine) – meer activiteit in genen betrokken bij afbraak plantaardige koolhydraten

41

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Faeces-transplantatie bij: •

Clostridium difficile associated diarrhea (CDAD) – grootste oorzaak antibioticum geïnduceerde diarrhee en colitis • C. difficile – deel darmflora – probleem bij verstoring evenwicht door antibioticumgebruik na transplantatie microbioom gelijk aan donor en patiënt genezen - ~90% succes.

Gut microbiome – woonplaats - enterocyte – epitheelcel, microvilli voor voedselopname - enterochromaffin cells (ECCs) – hormoonsecretie (serotonine) oa in respons op toxines - Paneth cells – secretie defensins, lysozym, phospholipase A2, TNF - Goblet cells – secretie mucus - M cells – transport bacteriën en MAMPs naar immuuncellen - mucus: binnenste laag steriel, buitenste laag commensalen (microbioom)

Competitie microbioom en pathogenen: – – –

productie anti-bacteriële toxines door microbioom (remming Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia) competitie voor voeding (rationale voor pre-biotica) microbioom conditioneert immuunrespons

Microbioom en Imuunsysteem evolueren volgens Co-evolutie. •

alleen GF muizen met muis-microbioom ontwikkelen gezonde immuunrespons

42


Obesitas / metabool syndroom • • • •

ligt het aan samenstelling microbioom – capaciteit voedselopname? ligt het aan een verstoorde interactie aangeboren immuunsysteem – microbioom? inflammatory bowel disease – overexpressie TLRs blootstelling aan antibiotica leidt tot aanmaak vet (oa in landbouw – toevoegen antibiotica aan veevoer om vee sneller te laten groeien) – mechanisme onbekend maar wrschl. verandering in microbiota die tot grotere hoveelheid SCFA(short chain fatty acids) in darm leiden (Cho et al., Nature 2012).

De darm – grootste productieantilichamen • • •

Activatie TLRs en antigen presentatie via dendritische cellen – productie van sIgA (soluble of secretory IgA) secretory IgA bindt bacteriën en houdt ze in mucus pathogeen – specifieke high-affinity sIgA

43


Microbioom en antibiotica 44


mogelijke secundaire effecten – doden micro-organismen die afhankelijk zijn van door antibiotica gedode bacteriën – geen verwijdering giftige fermentatieproducten infectie door opportunistische pathogenen oa Clostridium difficile mogelijkheden voor pro- en prebiotics – maar ook uitkijken geblazen (Utrecht 2008)

Microbioom • • • •

spannend nieuw onderzoeksgebied – combinatie microbiële ecologie, moleculaire biologie, immunologie etc… nieuwe inzichten over obesitas, inflammatory bowel disease en andere aandoeningen homeostase darm – microflora: permanente lichte infectie relatie microflora en immuunsysteem stopt niet bij darmepitheel.

45


College Eggen 1- Hfdst 21- Sexual Reproduction Sexuele voorplanting en meiose. Mitose 1) G2 of interfase  2) Profase 

Paren van homologe chromosomen, verdubbeling vindt plaats. Vorming spoelfiguur, verdwijnen kernmembraan, spiralisatie en aanhechting van de chromosomen. 3) Prometafase  Microtubuli integreren met de chromosomen, chromosomen komen in het equatorvlak van de cel te liggen. 4) Metafase  Het centromeer deelt zich in tweeën. De twee chromatiden vormen een zelfstandig chromosoom. 5) Anafase  Spoeldraden verkorten, chromosomen bewegen naar de polen, kernen worden gevormd. 6) Telofase en cytokinese De chromosomen despiraliseren, vroming twee complete kernen wordt voltooid. Nu ontstaan twee identieke dochtercellen.

Meiose 1) Profase 1 

Chromosomen bewegen zich naar het evenaarsvlak toe tussen de twee centriolenparen. 2) Metafase 1  Chromosomen liggen per paar in het evenaarsvlak. 3) Anafase 1  De homologe chromosomen worden, elk met hun twee zusterchromatiden, van elkaar weggetrokken. Het aantal chromosomen wordt gehalveerd. 4) Telofase 1  Cel snoert zich in, er onstaan twee dochtercellen met elk een diploïde hoeveelheid DNA. Het aantal chromosomen is haploïd. 5) Deze twee cellen zullen zich verder delen door een deling gelijkend op mitose, het resultaat is twee haploïde dochtercellen per moedercel.

crossover - chiasma meiotische recombinatie uitwisseling segment paternale/maternale chromatiden crossovers nodig voor stabiele “pairing” eerst DNA sequentie daarna recombinatie gemiddeld 2-3 per humaan chromosoom recombinatie hot spots recombinatie treedt zelden op in heterochromatine/telomeren op hotspots breekt het DNA (Spo 11: endonuclease) interference: 1ste crossover remt kans op 2e recombinatie Genetische variatie door meiose: Onafhankelijke verdeling homologen over dochtercellen 2n Crossing-over. 46

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. HET SYNAPTONEMALE COMPLEX Profase meiose 1 leptoteen: homologen condenseren en pairing begint zygoteen: vorming synaptonemale complex pachyteen: ladderachtige eiwitten houden beide homologe zusterchromatiden bij elkaar diploteen: afbraak synaptonemale complex, diakinese: overgang naar metafase 1

Verschillen meiose man – vrouw Vrouw 1) foetale ovaria bevatten oocyten (eicel precursor cellen) 2) oocyten beginnen meiose, arresteren in diploteen (na afbraak synaptonemale complex) na meiose 1 3) meiose 1 wordt afgemaakt bij sexueel rijpe vrouw gedurende ovulatie mensen: meiose 1 arrest > 40 jaar, nondisjunction stijgt dramatisch in oudere vrouwen

Man 1) meiose in spermatocyten (zaadcel precursor cellen) in de testis 2) continu vanaf pubertijd, zonder stop and start mechanismen zoals bij vrouwen 3) cel cyclus checkpoint tijdens meiose

consequenties van deze verschillen eicellen: geen checkpoints: verhoogde kans aneuploïdy (20%, spermatozoa 3-4%) spermatozoa: meer mitotische cel delingen: verhoogde bijdrage aan nieuwe mutaties 25% humane foetusen zijn aneuploïd

47


Promordiale kiemcellen en geslachtsbepaling primordiale kiemcellen: vroeg tijdens ontwikkeling “apart” gezet migreren door embryo naar ontwikkelende gonaden mitotische proliferatie: geslachtsbepaling meiose: daar oocyten en spermatocyten eicellen: totipotent primordiale kiemcellen: pluripotent (kunnen geen placenta vormen)

SrY en geslachtsbepaling Sry bepaalt ontwikkeling gonaden: vrouwen XX; mannen XY XO: vrouwelijke ontwikkeling XY met mutant Sry: vrouwelijk ontwikkeling XXY: mannelijke ontwikkeling XX muis met Sry gen: testis (maar geen zaadcellen) Sry’s: 1 stimuleren PGCs (primordial germ cells) tot spermatogenese 2 maken anti-Müllerian hormoon 3 testiculaire ontwikkeling 4 aanmaak Leydig cellen (maken testosteron) cellen die Sry tot expressie brengen worden Sertoli cellen: geen testosteron: - Mülleriaans duct: oviduct, uterus, deel vagina, follikel cellen en theca cellen, estradiol - regressie Wolffian duct ontwikkeling genitalia onafhankelijk van sexhormoon, differentiatie wel testosteron: - Wolffian duct: prostaat, seminal vesicles - regressie Mülleriaans duct Oogenese: ontwikkeling van eicellen. 1) oogonia proliferatie – mitose 2) meiose 1, primaire oocyte diploteen/profase 1 arrest 3) oocyt maturatie (uitrijpen) hormoon afhankelijk 4) secundaire oocyte polar body na meiose 1 5) matuur ei/ovum polar body na meiose 2

48

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Opbouw follikel. groei tijdens profase: dubbel genoom (4n), dooier : lipiden sachariden en proteïnen Nurse&follikel cellen. follikel: granulosa en theca cellen cellen

Hormoonhuishouding

-

hypofyse maandelijks piek in FSH follikels maken oestrogeen, 1 dominant, endometrium verdikt halverwege cyclus: hypofyse pieken in FSH en LH (luteiniserend hormoon) ovulatie, corpus luteum, maakt progesteron geen conceptie: luteolyse, menstruatie de pil: progestogeen of progestogeen en oestrogeen

progestogeen: remt FSH/LH productie hypofyse (geen ovulatie) oestrogeen: normale cyclus endometrium

zaadcellen: klein gemaakt voor snelheid minimale cellen: geen ER, golgi, ribosomen wel veel mitochondria: ATP productie voor flagellum kop: gecondenseerde kern acrosomale vesikel: hydrolytische enzymen Spermatogenese: cellen van leydig o.i.v. LH  Testosteron.

49

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Spermatozoa ontwikkelen als Syncytium Na meiose II geen cytokinese!! grote aantallen cellen blijven verbonden door cytoplasmatische contacten rijping vindt plaats na de meiose gebruiken diploid genoom voor rijping: haploide cellen met het Y chromosoom krijgen nog steeds essentiele producten Van het X chromosoom alleen aan het eind van de differentiatie ontstaan individuele spermatozoa

Fertilisatie ZP3 veroorzaakt Ca2+ instroom in spermatozoïde: exocytose: acrosomale reactie

veel spermacellen binden: slechts één penetreert na penetratie snelle depolarizatie corticale reactie: penetratie: calcium oscillaties spermatozoïde brengt PLCζ in ovum

exocytose van corticale granules enzymatische verandering zona pellucida (proteolytische splitsing van ZP2 & 3)

50

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Spermatozoïde levert haploide genoom en centriole combinatie haploiden: zygote spermatozoïde: centriole, centrosoom, verdubbelt

College Eggen -2 Hfdst 22- Development of Multicellular Organisms (Neurale Ontwikkeling) Drie fasen van neural ontwkkeling:

Spemann’s organizer: signaalmoleculen  transcriptiefactoren Neurale inductie van ‘’naïef’’ ectoderm door organizer region Cellen in het ectoderm secreteren BMPs, deze remmen neurale differentiatie Organizer secreteert: follistatin/noggin/chordin Dorsaal ectoderm: neurale plaat, zenuwweefsel Ventraal ectoderm: huid.

51

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Oorsprong van het zenuwstelsel Neurale buis: centraal zenuwstelsel, ruggemerg, retina telencephalon: cerebrale cortex, basale ganglia, hippocampus diencephalon: thalamus, hypothalamus, retina mesencephalon: Midbrain metencephalon: cerebellum, pons myelencephalon: medulla caudal neural tube: ruggemerg

specificatie door notch-delta onbalans: support OR neural precursor

Asymetrische gradient.

Dorsoventrale patterning van de neurale buis: Dorsaal(roof plate): sensorische functie (Bone Morphogenetic protein (BMP))

Ventraal(floor plate): Motorische functie (Sonic Hedgehog (SHH))(precursor)

52

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Morphogen signaal transductie:

Productie neuronen in de Cortex: Deling neurale progenitors, migratie neuronen, geboortedatum bepaalt eigenschappen.

Axonale sturing dmv: groei conus - groeiconus heeft een substraat nodig extracellulaire matrix bundles/fiber tracts cel-cel adhesie (N-CAM’s en N-Cadherine) mens: 100 cadherines laminine: stimuleren axonale uitgroei chrondroitine sulfaat proteoglycanen: remmen axonale uitgroei axonen lopen in bundels Adhesi guidance factors Chemoattractanten Chemorepulsanten.

53

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Sturing van kruisende axonen:

Motorneuronen regenereren hetzelfde als hoe ze waren:

Bouw groei conus:

p= peripheral, t= transition, c= central core.

54

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. De conus gebruikt de filopodia om zich voort te bewegen:

Strategieën voor groei conus pathfinding:

55

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Neurotrophins(NGF) : dubbele werking Neuronale overleving Regulatie uitgroei axonen en dendrieten De retinotectale kaart verfijnt zichzelf door remodeling door de synaptische activiteit: ‘’what fires together wires together’’(plaatje)

Gedefinieerd door eliminatie van synapsen. Jonge dieren, kaart is onnauwkeurig. Synaptische plasticiteit: Synaptische plasticiteit staat voor het vermogen van de verbinding (de synaps) tussen twee zenuwcellen om van sterkte te veranderen.

DUS:

56


College Eggen -3 Hfdst 23- Specialized Tissues, Stem cells and Tissue Renewal. Stamcel principe  Totipotent: cel kan alle celtypen die het individu bezit vormen dmv deling. Inclusief extraembryonaal weefsel Pluripotent: kan alle celtypen vormen exclusief extra embryonaal weefsel Multipotent: deze cel is in staat alle cellen te vormen binnen een kiemlaag.

Gene targeting in embryonale stamcellen

57

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Humane Embryonale Stamcellen (ES) Pluripotent Toxiciteit screens Cellen/weefsels voor transplantatie: probeem, zeer weinig hES lijnen.  oplossing SCNT.

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT)

Kern overdracht in andere diersoorten

-

Reproductieve cloning: kikker, karper, muis schaap. Therapeutisch clonen: Rhesus aap (2008) niet succesvol bij mens. Problemen: Incomplete nucleaire repgrogrammering Methylering DNA afwijkend Large offspring syndrome, imprinting defecten?

Reprogrammeren door cel fusie. Fusie somatische cel met pluripotente cel (bv. ES cel) Reactivatie ES genen door (Nanog, oct4) 58

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Somatisch Reprogrammeren iPS cellen, induced pluripotent stem cell: ES cel bevat pluripotentie-inducerende factoren. Karakteristieke iPS cellen: - Genexpressie profiel lijkt erg op ES cellen - Reactivatie ES genen (methylatie) - Pluripotent: differentieren in alle celtypene in teratomen, dragen bij aan alle weefsels.

Ontwikkelingen iPS cellen -

Niet integrerende constructen Adenovirus Niet integrerende DNA constructen piggyBac transposon Reprogrammeren m.b.v. RNA coderend voor Oct/sox2/c-Myc/Klf4 Ontwikkelen van moleculen die Oct3/4, Sox2, c-Myc en KLF-4 kunnen vervangen.

Resultaten met iPS cellen. Herstel muis model met sikkelcel anemie. sikkelcel anemie: puntmutatie in b globine gen sikkelcelanemie model: muis met humane mutatie reprogrammeren  iPS  gen reparatie m.b.v. homologe recombinatie differentiëren  transplanteren Deels herstel in rat met Parkinson-achtige verschijnselen

iPS cellen: Modelsysteem voor ziektebeelden Patient-specifieke pluripotente cellen.

59


60


Gastcolleges Harmsen – Molecular Mechanisms of Endothelial to Mesenchymal transition (EndMT) Alle ziekten hebben een vorm van endothele (dys)functie.

61


Bindweefsel: Sterk en stug Bijna geen functionele cellen - Tussencelstof - Elastische vezel - Collagene vezel - Bindweefselcel (fibroblast)

62


63

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd. 2013 MFW. Neointima formation after blood vessel injury. Mesenchymal cells: varations on a theme.

Fibroblast: celtype gevonden in bindweefself, secreteerd ECM met collageen en andere ECM moleculen. Migreerd en prolifereerd in verwond weefsel en in een weefsel cultuur( Granuloom ) Damage can lead to dysregulaton e.g. Fibrose. Mesenchymale transitive onder invloed f=van TGF-B TGF-B signalling  recruits type-1 receptor + phosphorylate  phosphoryates Smad2 OR Smad3 ( these are transcription mediating factors ) ALK1 – activating Smad 1/5/8 (high on normal EC) ALK5 – Activating Smad 2/3 (low on normal EC) Endotheliale mesenchymale gertansisteerde endotheel cellen act as myofibroblasts. De balans tussen ALK1 en ALK5 bepaald de switch.

Gastcollege nog doornemen…. Fuck it.

64

Samenvatting Medische & Moleculaire Biologie Rijksuniversiteit Groningen. Door: Sander de Weerd MFW

Recommend Documents