Samenvatting Dankwoord

SSaam meennvvaattttiinngg

Azospirillum brasilense behoort tot een groep bacteriën die de plantengroei bevorderen. Ze leven in associatie met de wortels van hogere planten.. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria. Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. Tijdens dit thesisonderzoek onderzochten we deze associatie tussen bacterie en plant. We gingen na in welke mate de bacterie d.m.v. de productie van fytohormonen een rol speelt in de bevordering van de wortelgroei van granen, meer bepaald tarwe en mais. Dit deden we aan de hand van zaaien inoculatie proeven en door het kwantificeren van de auxine en cytokinine productie van Azospirillum in vloeibare culturen. We vonden niet echt statistisch significante gegevens m.b.t. de promotie van wortelgroei, maar stelden vast dat Azospirillum brasilense een auxine effect kan hebben op plantenwortels.

D Daannkkw woooorrdd Nu het hier eindelijk zo wat naar het einde toe gaat bedank ik iedereen. Iedereen die met mij mee gewerkt heeft, tegengewerkt heeft, iedereen waarmee ik goed heb gelachen. Iedereen die mijn studietijd gemaakt heeft tot wat het was. Els, dank u voor het vertrouwen, ik heb mijn best gedaan om het niet te beschamen. Stijn, ik ben hier in het begin wel wat slecht gezind rond gelopen maar uiteindelijk is het toch nog iets geworden. Je hebt me goed geholpen en je was ook een toffe gast om mee samen te werken. Nog veel succes en ook jij dan: bedankt. Tom, die berg zand was wel het minste wat ik kon doen voor al die wiskunde en fysica. Krisje moet ik ongeveer voor alles bedanken, Joris voor de goede cursussen en de goeie Geuze en een aantal proffen misschien nog voor hun geduld.

1

IInnhhoouuddssttaaffeell

I. Inleiding 1. Woord vooraf 1 2. Azospirillum 2 2.1 taxonomie 2.1.1 classificatie 2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum 3 2.3 Hormonen 5 2.3.1 auxines 2.3.1.1 auxine en wortelontwikkeling 6 2.3.1.2 bacteriële IAA biosynthese 6 2.3.2 cytokinines 7 Doelstellingen van dit thesisonderzoek 8 II. Materialen en methoden Groeimedia 1 Het aantal bacteriën en de optische densiteit van een vloeibare cultuur 3 1. Zaai en inoculatie experimenten 4 1.1 Triticum aviculare 1.2 Zea mais 6 222... W 888 W Wooorrrttteeellleeexxxuuudddaaattteeennn 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Materialen en methoden 8 2.1.1.1 Bereiding van de tryptofaan stockoplossing 8 2.1.1.2 Overenten van bacteriën in de erlemeyers 8 2.1.1.3 Staalname 8 2.1.1.4 Zuivering van IAA en IAA–precursoren 8 2.1.1.5 Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren 9 2.1.1.5.1 Massa spectrometrie 9 LC-MS/MS 11 2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën 12 2.2.1. Verkrijgen van wortelexudaten 12 2.2.2 Analyse van de Indoolcomponenten 12 2.2.3 Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur 2.2.3.1 Overenten van bacteriën in de erlemeyers 13 2.2.3.2 Staalname 13 2.2.3.3 Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA–precursoren 2.3 Het tryptofaangehalte van wortels 14 2.3.1 Materialen en methoden 14 333... C 111444 C A m Cyyytttoookkkiiinnniiinnneeeppprrroooddduuukkktttiiieee dddoooooorrr A Azzzooossspppiiirrriiilllllluuum m 3.1 Zuiveren van cytokinines 14 3.2 Detectie en kwantificatie van cytokinines 15 444... C 111555 C m m w Chhheeem moootttaaaxxxiiisss eeennn aaassssssoooccciiiaaatttiiieee m meeettt dddeee ppplllaaannnttteeennnw wooorrrttteeelll Materialen en methode 15 Chemotaxis 15 De associatie met de wortels 15 IIIIIIIII... R 111 R B Reeesssuuullltttaaattteeennn eeennn B Beeesssppprrreeekkkiiinnnggg 1 Zaai- en Inoculatieëxperimenten 1 1.1 Triticum aviculare 1 1.1.1 Het eerste experiment 1 1.1.2 Tweede experiment 3

1.1.3 Inoculatie experiment 4 1.2 Zea mais 8 1.2.1 Het effect van bacteriën 10 1.2.2 Het effect van auxine en auxine-precursoren 10 2 Wortelexudaten 10 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Aantal bacteriën 10 2.1.2 IAA productie 11 2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA productie van bacteriën 12 2.2.1 Aantal bacteriën 12 2.2.2 IAA productie 13 2.3 Mogelijke Tryptofaanbronnen in de natuur 14 2.4 Het tryptofaangehalte van wortels 14 3 Productie van Fytohormonen door Azospirillum brasilense 15 3.1 Indool-3-azijnzuur 15 3.1.1 De verschillende metabolische IAA-synthesewegen in A. brasilense 3.1.2 Meting van de verschillende intermediairen in de IAA biosynthese (§ 2.1) 3.1.3 Bespreking van de verschillende biosynthesewegen 21 3.1.4 De synthesewegen bij natuurlijke tryptofaanconcentraties 23 3.2 cytokinines 25 3.2.1 Cytokinine excretie in het medium door Azospirillum 25 3.2.2 Cytokininegehalte van Azospirillum cellen 27 3.2.3.1 De auxine/cytokinine balans 27 444... C 222888 C m m w Chhheeem moootttaaaxxxiiisss eeennn aaassssssoooccciiiaaatttiiieee m meeettt dddeee ppplllaaannnttteeennnw wooorrrttteeelll

Azospirillum-Plant interactie Een Symbiose ? II.. IInnlleeiiddiinngg 11.. W Woooorrdd V Voooorraaff Microben komen overal in de biosfeer voor; eigenlijk hebben deze opportunistische organismen vrijwel iedere in de natuur beschikbare ecologische niche gekoloniseerd. Vanwege die alomtegenwoordigheid is het niet verwonderlijk dat ze vaak en veel in contact komen met hogere planten. Gezien de vele verschiIlende levenswijzen bij micro-organismen, wekt het ook geen verbazing dat planten en microorganismen een intensieve interactie hebben. Een groot deel van het oppervlak,van planten is bedekt met een dun laagje bacteriën en andere micro-organismen. De groeizone aan de worteltop bijvoorbeeld synthetiseert verschillende typen organische moleculen die nodig zijn voor de groei van de wortel; sommige van deze moleculen lekken weg of worden uitgescheiden naar de omliggende bodem, waar ze beweeglijke bacteriën en andere microben aantrekken. Een aantal bacteriën gedraagt zich coöperatief, in die zin dat ze de plantengroei op een of andere manier bevordert. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) (Galston 1995). De meeste elementen, noodzakelijk voor de plantengroei, zijn opneembaar in oplossing na afbraak van gesteente of dringen in gasvormige toestand de plant binnen. Stikstof komt in de atmosfeer voor als gasvormig N2, maar is in die vorm niet beschikbaar voor hogere planten en dieren. Voordat die organismen er gebruik van kunnen maken moet het stikstofgas worden omgezet tot ammoniak (NH3), tijdens een proces dat stikstoffixatie heet. In de natuur zijn het vooral bacterën die aan stikstoffixatie doen(Galston 1995). Genera zoals Azotobacter, Azospirillum en Clostridium kunnen vrij in de bodem leven ; de meeste van deze vrijlevende bacteriën halen hun energie, voor de synthese van voedselmoleculen en voor de stikstoffixatie, uit de oxidatie van reeds gevormd rottend organisch materiaal. Die energie kan ook afkomstig zijn uit fotosynthese, zoals bij de Cyanobacteria Nostoc en Anabaena of bij anders gepigmenteerde fotosynthetisch actieve bacteriën als Chromatium (purper), Chlorobium (groen) en Rhodospirillum (rood). De stikstoffixerende, fotosynthetisch actieve bacterien Nostoc en Anabaena komen algemeen voor in holten in de bladeren van het watervarentje Azolla, dat algemeen voorkomt in natte rijstvelden in het Verre Oosten. Vermoedelijk krijgen de bacteriën vanuit de bladeren organische stoffen die via de fotosynthese zijn geproduceerd en die voor de groei van hun kolonies zorgen, terwijl de varen in ruil daarvoor gebonden stikstof terugkrijgt. Hoewel zowel Nostoc als Anabaena onafhankelijk kunnen leven, schijnen ze het bijzonder goed te doen als ze nauw verbonden zijn met Azolla. Oosterse boeren hebben door ervaring geleerd dat hun rijstplanten het best gedijen als ze op natte rijstvelden eerst Azolla laten groeien en afsterven. Bij het afsterven van de watervarens komen verschillende vormen vastgelegde stikstof vrij in het water op de rijstvelden; deze worden opgenomen door de jonge rijstplanten, die veel stikstof nodig hebben om een goede oogst te kunnen leveren. Een stikstoffixerende bacterie kan zich met een groot aantal soorten hogere planten verbinden. Dat blijkt uit de talrijke symbiosen tussen vlinderbloemigen en cellen van Rhizobium, een bacterie die erwten, bonen, klaver en alfalfaplanten koloniseert, en uit die van Bradyrhizobium, die een voorkeur heeft voor sojabonen. De stikstoffixatie gebeurt hier in wortelknolletjes. Een minder soort- of familiespecifieke stistoffixatie in wortelknolletjes gebeurt door Frankia. Deze bacterie induceert vorming van wortelknolletjes in de wortels van erg verschillende plantengenera als Alnus en Casuarina. Nog minder strikt is de associatie van Azospirillum lipoferum en de wortels van verscheidene tropische grassen waaronder maïs (Galston 1995).

1

I. Inleiding

22.. A Azzoossppiirriilllluum m 2.1. Taxonomie De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria in de rhizosfeer van Digitaria en Zea mais in Brazilië (Döbereiner et al. 1975,1976) Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. De naam Azospirillum is afgeleid van het Franse azote, stikstof en spirillum wijst op de spiraalvorm van de bacterie. Volgens Bergey's Manual of Systematic bacteriology (1984) wordt Azospirillum geklasseerd onder Aërobe/microaërofiele, beweeglijke, helixvormige of vibrioïde, gram-negatieve bacteriën . Zij zijn vrijlevende diazotrofen. In tegenstelling tot Spirocheten, die zich voortbewegen volgens een kurkentrekkervormige baan, hebben zij geen axiale filamenten . Zij hebben één of meerdere flagella aan één of aan beide polen . (Tortora et al. 1995) Moens et al. (1998) rapporteren het bezit van laterale flagellen voor beweging over een vast substraat.(3) A. brasilense bezit een megaplasmide waarop veel genen voorkomen die de flagellatie bepalen (Vande Broeck et al. 1995).

2.1.1. classificatie

Eubacteria Proteobacteria alpha subdivision Fam. Rhodospirillaceae. genus Azospirillum Tarrand et al. 1979

Soorten Azospirillum amazonense Magalhães et al. 1984, een zuur tolerante Azospirillum soort. Azospirillum brasilense corrig. Tarrand et al. 1979

fig. 1.1 : Azospirillum brasilense (bron : internet)

Azospirillum halopraeferens Reinhold et al. 1987, een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) Azospirillum irakense Khammas et al. 1991 een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van rijst en in de rhizosfere grond. Azospirillum largimobile corrig. (Skerman et al. 1983) Ben Dekhil et al. 1997 voorheen Conglomeromonas largomobilis subsp.largomobilis Skerman et al. 1983. Azospirillum lipoferum (Beijerinck 1925) Tarrand et al. 1979, species. (Type species van het genus )

2

I. Inleiding

2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum De leden van het stikstoffixerende genus Azospirillum zijn bodembacteriën die in associatie leven met het wortelstelsel van een aantal gastheerplanten, vooral tropische grassen. Zoals de meeste rhizosfeer bacteriën produceert dit genus fytohormonen. De excretie van planthormonen door de bacteriën kan enerzijds de groei van de gastheerplant en mede hierdoor de totale opbrengst van een gewas positief beïnvloeden. Verschillende bacteriële IAA biosynthesewegen zijn reeds beschreven. Het gesynthetiseerde IAA kan ook als aminozuur- of suikerconjugaat opgeslagen worden. Azospirillum gebruikt nutriënten die door de plant worden uitgescheiden en fixeert atmosferische stikstof (Fogher et al.1995) De afbraak van planten polysaccharides afkomstig van planten voorziet de bacteriën van nieuwe koolstofbronnen. Binnen het genus Azospirillum is de afbraak van pectine en polygalacturonaat het best gedocumenteerd voor A. irakense (Keijers et al. 1995). De bacteriën reageren chemotactisch op wortelexudaten en aërotactisch op de gereduceerde zuurstofconcentratie die nodig is voor stikstoffixatie (Vande Broeck et al. 1995). Er is geen absolute gastheerspecificiteit maar Azospirillum vertoont een hogere chemotactische respons voor de componenten die in wortelexudaten van de geprefereerde planten aanwezig zijn (Heinrich en Hess 1985 , Reingold et al. 1985). De stikstoffixatie is het meest uitgesproken bij enkele tropische grassen en bij suikerriet. De bacterie kan echter ook worden geïsoleerd uit het wortelstelsel van een groot aantal planten uit gematigde gebieden zoals mais.( Fogher et al.1995).

Fig. 1.2 : Confocaal beeld van een dwarse doorsnede van een mais wortel geïnoculeerd met A. brasilense gekleurd met antibodies tegen een glycoproteïne van de celwand van Azospirillum. De bacteriën liggen aan de buitenzijde van de wortel (aangeduid met de pijlen) en zijn op deze foto rood gekleurd. (bron: internet)

De aanhechting van Azospirillum aan plan-tenwortels gebeurt in twee duidelijk te onderscheiden fases. De eerste, de adsorp-tiefase, omvat een zwakke binding van de bacteriën aan de wortels. Tijdens de tweede 3

fase, of verankeringsfase, geraken de bacteria onomkeerbaar gebonden aan het wortel-oppervlak. Een tot I. Inleiding

nog toe niet gekarak-teriseerd calcofluor-bindend oppervlakte polysaccharide wordt verantwoordelijk geacht voor deze verankering. Bij de adsorptiefase is waarschijnlijk de tussen-komst van het polair flagellum belangrijk (Vande Broeck et al. 1998). Azospirillum werd reeds getest als inoculum voor granen en grassen in uiteenlopende klimatologische- en agronomische omstandigheden . Uit verschillende onderzoeken blijkt een positief effect op zaadopbrengst en proteïne gehalte van de vegetatieve organen (Fogher et al.1995). Commerciële Azospirillum inocula, onder de naam Azogreen-N en Biogold, worden reeds toegepast in de maïsteelt in landen zoals Frankrijk en India. Bij inoculatie van de wortels met Azospirillum is er een toename van het aantal wortelharen en de wortellengte ( Bellone et al. 1995). Dit vergroot het absorptieoppervlak, hetgeen de opname van nutriënten en water bevordert. De plant kan dus in meer ariede gebieden groeien en is sterker en groter. De planten waaraan Azospirillum werd gegeven zijn even produktief als diegene die stevig bemest werden. Onderzoekers hebben vastgesteld dat zij minder meststoffen kunnen toedien en toch goede opbrengsten kunnen krijgen. Dit zou landbouwers in ontwikkelingslanden kunnen helpen hun opbrengst te verhogen zonder hun kosten merkelijk op te drijven. Het gebruik van minder meststoffen verlaagt de hoeveelheid nutriënten die het oppervlakte- en drinkwater vervuilen in meer ontwikkelde landen. Spijtig genoeg is de opbrengst niet echt constant. Bepaalde velden reageren heel goed op het toevoegen van Azospirillum. Andere velden reageren helemaal niet. Deze variatie in respons op Azospirillum inoculatie zijn te wijten aan de grote variatie in bodem- en microflora componenten. Bij kolonisatie van de wortels van aardbeien stelt men een toename in grootte en aantal van de wortelharen vast, samen met gewijzigde morfolgie van de wortelharen (vertakte, gekrulde of spatelvormige-) en infectiedraad vorming bij een aantal. Bij gemengde infectie van A. brasilense en Glomus intraradix (een VAM-fungus) is er een positieve interactie die het interne- en externe kolonisatieproces versnelt (Bellone et al 1995). De verhoogde groei van de gastheerplant in aanwezigheid van Azospirillum wordt toegeschreven aan een verhoogde IAA concentratie en niet aan een verhoogde stikstof toevoer. Dit werd aangetoond door waarnemingen met een mutant met een verlaagde auxineproduktie. (Vande Broek et al. 1995)

4

I. Inleiding

2.3. Hormonen Plantenhormonen zijn organische substanties die actief zijn in uiterst kleine hoeveelheden (<1mM en vaak zelfs
2.3.1. Auxines Naast IAA (indool-3-azijnzuur) (Figuur 6) zijn ook IBA (indool-3-boterzuur) en 4-Cl-IAA natuurlijk voorkomende auxinen (Davies 1995).

Fig. 1.3 : De drie natuurlijke auxines. In de plant komen naast het vrije IAA, dat de primaire actieve vorm is, ook conjugaten voor die een bron zouden kunnen zijn van vrij IAA zonder dat er nood is aan een de novo synthese. De conjugaten kunnen zowel esters als amiden zijn. Deze geconjugeerde vorm wordt door de plant gcbruikt als transportmiddel naar een bepaald weefsel en biedt tevens bescherming tegen peroxidase. De voornaamste precursor van IAA is tryptofaan, waarbij de biosynthese in planten voornamelijk plaatsgrijpt in bladprimordia, jonge bladeren en in ontwikkelende zaden. Ook andere biosynthesewegen, waarbij het tryptofaan niet betrokken is, zijn bekend (Wright et al., 1991; Michalczuk et al., 1992; Normanly et al., 1993) Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen invloed op cellulair niveau enerzijds en op het niveau van de plant en haar organen anderzijds. Op cellulair niveau bevorderen auxinen de celstrekking. Hierdoor wordt ondermeer de stengel- en wortelgroei bevorderd. Tevens beïnvloeden zij ook de celdeling. Auxine diffundeert in de lente van de stengeltop naar het cambium en bevordert hier de celdeling, zodat secundair xyleem en floëem ontstaan(Davies 1995). Op niveau van de plant en organen spelen auxinen een rol in de groeicorrelatie. Dit is een verschijnsel waarbij de groei van het ene plantenorgaan (vb.zijmeristeem) afgestemd wordt op deze van een ander (apikale meristeem). IAA zorgt voor de communicatie tussen deze twee plantenweefsels. Auxinen bevorderen de wortelhaarvorming, vruchtgroei en vertragen de vruchtrijping, Samengevat zijn de functies van Auxines (Davies 1995): -Celdeling en celstrekking. -Differentiatie van floëem en xyleem -Wortelinitiatie -Apikale dominantie 5

-Uitstel van bladsenescentie I. Inleiding

2.3.1.1 Auxine en wortelontwikkeling Het plantenhormoon auxine controleert vele aspecten van de ontwikkeling en fungeert deels door inductie van de expressie van verschillende genen (Van den Berg et al. 1998). Auxine reguleert processen zoals wortelvorming, vasculaire ontwikkeling en gravitropie. Wortels gebruiken gespecialiseerde zwaartekracht gevoelige columella cellen in het wortelmutsje om de wortel oriëntatie te sturen. Na gravistimulus zetten de columella cellen, actief groeiende weefsels in de elongatie zone aan tot differentiële groei in de elongatie zone. Dit resulteert dan in een correcte buiging . IAA reguleert de zwaartekracht geïnduceerde buiging door inhibitie van wortelcel elongatie. Studie van een agravitrope Arabidopsis mutant van het AUX1 gen en experimenten met T-DNA leiden tot isolatie van het AUX1 polypeptide. Het heeft een sequentie dat lijkt op planten- en fungale aminozuur permeasen. Dit suggereert een transportfunctie voor een aminozuur-achtige molecule (tryptofaan) (Bennett et al. 1996). Arabidopsis thaliana semidominante SHY2 (short hypocotyl) mutaties veroorzaken bladvorming bij in het donker gegroeide planten. Dit suggereert dat SHY 2 een belangrijke rol speelt bij de regulatie van de ontwikkeling . Het SHY 2 gen codeert voor IAA3, een gekend lid van de auxine / IAA familie van auxine geïnduceerde genen. Tian en Reed (1999) isoleerden SHY2 mutaties met functieverlies. Terugmutaties en verliesmutaties beinvloeden de auxine – afhankelijke wortelgroei, vorming van zijwortels en de timing van gravitropie . Dit wijst erop dat SHY2/IAA3 verschillende auxine responsen in wortels reguleert. De verschillende fenotypes van de mutanten zijn een indicatie voor het vermogen van SHY2/IAA3 , verschillende auxine responsen te activeren en andere responsen te onderdrukken . Modellen die rekening houden met weefselspecificiteit, feedback inhibitie of de controle van auxinetransport zouden deze resultaten kunnen verklaren.

2.3.1.2 Bacteriële IAA-biosynthese De biosynthesewegen voor IAA bij Azospirillum zijn nog grotendeels onbekend. Drie ervan werden aangetoond door Prinsen et al. (1993) : • De indoolacetamide (IAM)-biosyntheseweg • Een tweede tryptofaan afhankelijke syntheseweg • Een tryptofaan-onafhankelijke syntheseweg Deze laatste is, in afwezigheid van exogeen tryptofaan in het bacterieel medium, de belangrijkste weg voor IAA biosynthese. Aan het F.A. Janssens Laboratorium voor Genetica te Leuven werd het indool-pyruvaat decarboxylase gen gecloneerd uit A. brasilense. In de overeenkomstige mutant (SpM7918) is de IAA biosynthese gereduceerd tot 10% van de wildtype produktie. Deze gegevens vormen de basis voor verder onderzoek betreffende de precursor van het indool-pyruvaat en het effect van indool-pyruvaat (en indoollactaat) accumulatie in de cel op IAA biosynthese.

6

I. Inleiding

2.3.2. Cytokinines Cytokinines zijn substanties die in de aanwezigheid van optimale auxineconcentraties celdeling induceren in tabaksmergcellen of gelijkaardige systemen gekweekt op een optimaal gedefinieerd medium (Horgan, 1984). Naast de cytokinine basen komen ook ribotiden, ribosiden en glucosiden voor. Cytokininen kunnen voorkomen in vrije vormen, maar ook als constituenten van sommige tRNAs. De biosyntheseplaatsen zijn de worteltoppen en ontwikkelende zaden, waarbij adenosine-monofosfaat de belangrijkste precursor is (Figuur 1.4) in de bacteriele biosyntheseweg. De biosyntheseweg in planten is nog niet aangetoond.

Fig. 1.4: De novo cytokinine biosynthese bij bacterien (Davies, 1995)

Fig.1.5: Biosynthese en metabolisme van cytokininen (Letham k Palni, 1983)

7

I. Inleiding

Men kan [9R-5’P]iP beschouwen als precursor van de overige vrije cytokininen. [9R-5’P]iP kan ook gehydroxyleerd worden tot zeatine derivaten. Vanaf dit punt zullen een aantal metabole reacties plaatsgrijpen waarbij men zowel aglyconen (d.i. Z en iP), glucosiden, ribosiden, ribotiden en aminozuurconjugaten als reductie- en oxidatie producten bekomt (Figuur 4). Deze metabolische reacties kunnen in 4 categorieen ingedeeld worden namelijk: conjugatie, hydrolyse, reductie en oxidatie (McGaw and Burch, 1995). Ribosiden en hun 5’ fosfaten (ribotiden) zijn waarschijnlijk de meest voorkomende natuurlijke cytokininen (Letham et al.,1983; McGaw et al.,1984; Scott et al.,1984). De conjugatie van de ribosylgroep gebeurt steeds op de 9 positie van de purinering. Het enzyme adenine phosphoribosyl transferase (APRT) is verantwoordelijk voor de conversie van de basen naar hun nucleotide vorm. Glucosylatie is niet enkel beperkt tot de 9 positie van de purinering zoals bij de ribosylconjugaten. 7- en 9glucosiden en de zijketen 0-glucosiden zijn de natuurlijke glucosiden. 3-glucosiden zijn waargenomen als metabolieten van extern toegevoegde cytokininen (Letham et al., 1982; McGaw et al., 1984). Nglucosylconjugatie, bekomen door de werking van glycosyltransferasen, wordt beschouwd als een belangrijke vorm van regulatie van de cytokinine activiteit. 7-en 9-glucosiden zijn biologisch inactief en enorm stabiel in de weefsels waarin ze gevormd zijn (Letham et al., 1983; Parker et al., 1973). In tegenstelling blijken 0-glucosiden eerder opslagvormen te zijn die een bron kunnen vormen van actieve cytokininen (Letham et al., 1983).

D Dooeellsstteellliinnggeenn vvaann ddiitt tthheessiissoonnddeerrzzooeekk We bekijken de associatie van Azospirillun met een gastheerplant. • In de eerste plaats gaan we na welk voordeel een plant haalt uit deze associatie. Aan de hand van zaaien inoculatieexperimenten, reeds gerapporteerd door Leuvense onderzoekers en waarvan wij de resultaten proberen te reproduceren, gaan wij na onder welke omstandigheden een groeibevorderend effect kan vastgesteld worden op de wortels van Triticum vulgare cv. Rubino kiemplanten door Azospirillum brasilense (Sp245). Wij gaan na of een gelijkaardig effekt bekomen wordt door toedienen van het fytohormoon indool-3-azijnzuur, tryptofaan en zijn intermediairen. • We bekijken ook, in welke mate wortelexudaatcomponenten de IAA-produktie door de bacterie verhogen. Het aandeel van tryptofaan in een verhoogde IAA-produktie gaan we na door toevoeging van verschillende concentraties tryptofaan aan een vloeibare bacteriecultuur. Dit vergelijken we met het gehalte aan indoolcomponenten van het wortelexudaat van de planten bij zaaiproeven. We gaan de relevantie van dit soort experimenten na. Waarschijnlijk ligt de concentratie van het tryptofaan dat in gelijkaardige proeven werd toegedient veel hoger dan in de natuur het geval is. De maximaal beschikbare hoeveelheid tryptofaan voor de bacterie wordt bepaald door het gehalte aan tryptofaan conjugaten in de wortel te bepalen. • Het is bekend dat Azospirillum brasilense ook cytokinines produceert. We meten of de concentraties die worden uitgescheiden significant genoeg zijn om een werkelijke invloed uit te oefenen op de plant. Daarbij is vooral de auxine/cytokinine balans belangrijk.

8

II. Materialen en Methoden

IIII.. M Maatteerriiaalleenn eenn M Meetthhooddeenn G Grrooeeiim meeddiiaa Vloeibaar Medium Azospirillum wordt gegroeid in een minimaal medium. Samenstelling van 1 liter MMAB-medium • 850 ml H2O • 50 ml AB-fosfaten 60 g/l K2HPO4 20 g/l NaH2PO4 • 50 ml AB-zouten 20 g/l NH4Cl 6 g/l MgSO4 . 2 H2O 3 g/l KCl 0.2 g/l CaCl2 0.05 g/l FeSO4 . 2 H2O • 50 ml 10 % malaat oplossing Agar •

•

Telling van aantal CFU’s (colony forming units) Zowel minimale als rijke agar zijn bruikbaar. Minimale agar is selectief ttz. weinig bacteriën kunnen malaat als enige koolstofbron gebruiken. ( 8.5 g agar / liter MMAB ) Op rijke agar groeit Azospirillum iets sneller, een voordeel bij telling van aantallen bacteriekolonies. Agar gebruikt voor zaaien inoculatieëxperiment 8.5 g/l agar 4.3 g/l MS-zouten Wasbuffer voor bacteriën

• • • •

1.24 g/l K2HPO4 0.39 g/l KH2PO4 8.8 g/l NaCl pH = 6.8 Hoagland planten voedingsmedium

1/1= per 0.5 l 50ml macroelementenoplossing 0.3 ml Fe-DPTA oplossing 0.5 ml sporenelementen oplossing Macroëlementen Per liter KNO3 10.2 g Ca(NO3)2 . 4 H2O 7.08 g NH4H2PO4 2.3 g 4.9 g MgSO4 . 7H2O

Fe-DPTA oplossing Per 100 ml CHELAL Fe(L) 2.545 ml ≅ Fe 2.73 E-3 M of 0.153 g

1

Sporenelementen Per liter H3BO3 MnCl2 . 4H2O CuSO4 . 5H2O H2MoO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O

2.86 g 1.81 g 0.08g 0.09 g 0.22g


MPCL planten voedingsmedium Stockoplossing per ½ liter 1.

Ca(NO3)2 . 4H2O KNO3

2.

K2SO4 MgSO4 . 7H2O

17.4 g 24 g

3.

PH 6.8 K2HPO4 KH2PO4 NH4NO3 KCl

26.11 g 20.4 g 24 g 14.8 g

4.

Na Fe (III) . EDTA

0.4035 g

5.

H3 BO3 MnSO4 . H2O ZnSO4 . 7H2O CuSO4 . H2O Na2MoO4 . 2H2O

1.72 g 0.325 g 0.425 g 0.18 0.09 g

82 g 10.1 g

pH = 6.8 Deze oplossing bleek echter onbruikbaar. Als controle werd ze een tweede maal aangemaakt. Telkens vormde zich een neerslag bij het samenvoegen van de verschillende stockoplossingen. Bij de planten groei experimenten werd uitsluitend gebruik gemaakt van Hoagland planten voedingsmedium. Deze oplossing gaf wel bevredigende resultaten.

2


H Heett aaaannttaall bbaacctteerriiëënn eenn ddee O Oppttiisscchhee D Deennssiitteeiitt vvaann eeeenn vvllooeeiibbaarree ccuullttuuuurr Indien er frequent een telling van het aantal CFU’s in verschillende vloeibare culturen op een bepaald tijdstip vereist is, kan men dit doen door de optische densiteit of de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte in een medium te bepalen. Hoe groter het aantal bacteriën in een medium, hoe hoger de lichtabsorptie. Van een aantal overnacht vloeibare bacterieculturen werd een verdunningsreeks gemaakt. Telkens werd van die verdunde cultuur een deel uitgeplaat op een minimale agar met malaat, waarop na een nacht incubatie bij 30°C het aantal kolonies werd geteld. Bij 250μl van die cultuur werd in een Labsystems Multiskan RC de optische densiteit bij 600 nm gemeten. Via lineaire regressie kan de bepaling van het aantal CFU’s in een cultuur voortaan via optische densiteits meting gebeuren. Bepaling van het Aantal Bacteriën adhv de Optische Densiteit bij 600 nm dmv Lineaire Regressie 1.00E+09

Aantal bacteriën

1.00E+08

RSQ=0.97311982

1.00E+07

Aantal bacteriën geteld na uitplaten op een agar Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(OD-waarde))+20.4) 1.00E+06 1.142

0.75

0.477

0.271

0.125

0.085

0.07

0.047

Optische Densiteit bij 600 nm

fig. 2.1 : Het verband tussen de optische densiteit bij 600 nm en het aantal bacteriën in verschillende verdunningen van een overnacht bacterie precultuur.

O.D. 1.142 0.75 0.477 0.271 0.125 0.085 0.07 0.047

# bacteriën 870000000 480000000 210000000 87000000 48000000 21000000 8700000 4800000

helling (lnm): 1.563725892 lnb: 20.42681127

ln (OD) 0.13278111 -0.28768207 -0.74023879 -1.30563646 -2.07944154 -2.46510402 -2.65926004 -3.05760768

ln (# Bact.) 20.58400377 19.98929666 19.16261809 18.28141868 17.68671157 16.860033 15.97883358 15.38412648

lny=lnmlnx+lnb 20.63444454 19.97695537 19.26928071 18.38515374 17.17513469 16.57206429 16.2684575 15.64555098

y=exp(lnmlnx+lnb) 915009069.6 474112583 233637356.9 96509667.12 28778372.1 15745486.13 11622547.28 6234138.659

Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(OD-waarde))+20.4)

tabel 2.1 : dmv lineaire regressie kan het aantal bacteriën in een precultuur bepaald worden a.d.v. de optische densiteit.

3


fig. 2.2 : Faze-contrast microscopische foto van een vloeibare cultuur van A. brasilense : Azospirillum brasilense zijn vrijlevende bacteriën. 1 CFU komt dus overeen met 1 bacterie.

11.. ZZaaaaii-- eenn IInnooccuullaattiieeëëxxppeerriim meenntteenn 1.1 Triticum aviculare Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens • Drie minuten in 70% methanol. • Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. • Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (een detergent). Natrium hypochloriet breekt DNA af, terwijl het detergent de membranen verstoort. • Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. • Een half uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H2O gepipetteerd. Per petrischaal worden vijf tarwezaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens plaatsen we ze één dag in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 °C. Dag 2 Aan reeksen van drie petrischalen worden verschillende concentraties indool-3-azijnzuur en een aantal van zijn metabolische precursoren of verschillende hoeveelheden bacteriën in 1ml wasbuffer voor bacteriën toegevoegd. De hormoon- en hormoon precursor oplossingen waren steriel. De producten werden eerst in een hoge concentratie (10-2 M) opgelost in MeOH met een druppeltje NaOH. Daarna werd dit tot de gewenste concentratie verdund met steriele wasbuffer voor bacteriën. Bij ieder experiment wordt als blanco 1ml wasbuffer toegevoegd.

4


Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer Bij het eerste experiment: • 10-4 M AA • 10-5 M AA • 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-4 M Indool-3-acetamide (IAM) • 10-5 M Indool-3-acetamide (IAM) • 10-4 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) • 10-5 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) • 10-4 M tryptamine (tra) • 10-5 M tryptamine (tra) • 10-4 M tryptofaan (trp) • 10-5 M tryptofaan (trp) Bij het tweede experiment: • 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) • 48.103 Azospirillum-cellen Bij het derde experiment: • 90 Azospirillum-cellen • 900 Azospirillum-cellen • 9.103 Azospirillum-cellen • 90.103 Azospirillum-cellen

Uiteindelijke concentratie in de petrischaal • • • • • • • • • • • • •

1

/3 .10-4 M AA /3 .10-5 M AA 1 /3 .10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-4 M Indool-3-acetamide (IAM) 1 /3 .10-5 M Indool-3-acetamide (IAM) 1 /3 .10-4 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 /3 .10-5 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 /3 .10-4 M tryptamine (tra) 1 /3 .10-5 M tryptamine (tra) 1 /3 .10-4 M tryptofaan (trp) 1 /3 .10-5 M tryptofaan (trp)

• • • • •

1

/3 .10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) /3 .10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 48.103 Azospirillum-cellen

• • • •

90 Azospirillum-cellen 900 Azospirillum-cellen 9.103 Azospirillum-cellen 90.103 Azospirillum-cellen

1

1

tabel 2.2 Ook deze handelingen gebeuren in de steriele omgeving van de laminaire air flow. De petrischalen worden weer in aluminiumfolie ingepakt en gaan vijf dagen in de groeikamer waar de zaden in het donker kiemen. Dag 7 De wortels van de kiemplantjes worden gekleurd met kristalviolet opgelost in ethanol. De wortels worden mooi uitgespreid in een petrischaal (zonder filtreerpapiertje). De schaal wordt dan rechtstreeks op een scanner gezet en als transparant ingescand. De kleuring van de wortels verhoogt het contrast. Het meten van de wortellengte gebeurt met behulp van een Scion Image, een computerprogramma dat vrij via het internet te krijgen is. Scion Image is een beeldverwerkings en –analyse programma voor PC’s. Met de functie “Freehand Line” teken ik een lijn over een wortel. Die wordt gemeten en genummerd. (fig. 2.2) Voor ieder kiemplantje weet ik zo het aantal wortels en de lengte ervan. De resultaten worden als tekst file geëxporteerd en bewaard. Later worden ze in Excell ingelezen.

5


fig. 2.2 : Geëtioleerde maiskiemplant in een petrischaal. De wortels zijn gekleurd met kristalviolet om het contrast te verhogen.

1.2 Zea mais Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden van Zea mais als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens • Tien minuten in 70% methanol. • Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. • Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (natrium dodecyl sulfaat). Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. • Een uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H2O gepipeteerd. Per petrischaal worden drie mais zaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens werden ze twee dagen in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 °C geplaatst om te kiemen.

6


Dag 3 Er werd nagegaan of alle zaden gekiemd waren. Het kiemingspercentage lag merkelijk hoger dan bij de proeven met tarwe. De niet gekiemde zaden werden verwijderd en vervangen door gekiemde uit een andere petrischaal zodat elke petrischaal drie gekiemde zaden bevatte. Vervolgens werden IAA en tryptofaan in verschillende concentraties en verschillende hoeveelheden bacteriën in 1 ml wasbuffer voor bacteriën toegediend aan telkens reeksen van vier petrischalen. Bij de blanco’s wordt 1ml wasbuffer toegevoegd. Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer • • • • • •

10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-4 M tryptofaan (trp) 10-5 M tryptofaan (trp) 105 Azospirillum-cellen

Uiteindelijke concentratie in de petrischaal • • • • • •

1

/3 .10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) /3 .10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 /3 .10-4 M tryptofaan (trp) 1 /3 .10-5 M tryptofaan (trp) 105 Azospirillum-cellen 1

tabel 2.3 De petrischalen worden weer ingepakt en zeven dagen in de groeikamer gezet. Dag 11 De wortels van de geëtioleerde kiemplanten werden gekleurd zoals hierboven beschreven voor tarwe. Het inscannen gebeurde nu ‘reflectief’ zoals bij een foto. Het meten van de wortellengte verliep identiek.

7


22.. W Woorrtteelleexxuuddaatteenn 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense 2.1.1 Materialen en methoden Zes gesteriliseerde 250 ml erlemeyers met gleuven in de zijkant. Hierin worden verschillende concentraties tryptofaan opgelost in MMAB. 2.1.1.1 Bereiding van de tryptofaan stockoplossing Op 10 ml H2O oplossing • 100mg tryptofaan • 1 druppel (1N) NaOH (bevordert het oplossen van trp door de molecule polair te maken) Soniceren + vortex in een falcon buis (oplossen). Filtreren in Flow door een bacteriële filter (Schleicher & Schuell FP 030/3 porie diameter 0.2 µm) (steriliseren) Toevoegen van verschillende hoeveelheden oplossing aan 50 ml MMAB. Toegevoegd volume stockoplossing / 50 ml MMAB (μl) 0 5 25 100 250 500

Tryptofaan eindconcentratie (μg/ml) 0 1 5 20 50 100 Tabel 2.4

2.1.1.2 Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan de erlemeyers met 50 ml MMAB wordt 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd.

2.1.1.3 Staalname Op verschillende tijdstippen, na 30, 60 en 90 uur, wordt telkens 10 ml en 5 ml staal genomen. In een falcon buis worden de stalen vervolgens gecentrifugeerd bij 2000 g gedurende 10 minuten. De bacterie pellet en het supernatans worden gescheiden en apart ingevroren bij –70°C. Ook wordt telkens van iedere cultuur een 250 μl staal genomen voor het meten van de optische densiteit bij 600 nm m.b.v. een Labsystems Multiskan RC.

2.1.1.4 Zuivering van IAA en IAA–precursoren Zuivering van het 5 ml supernatans. Aan het nog bevroren medium wordt 5 ml 0.1 M HCl en een aantal met zware isotopen gemerkte standaarden toegevoegd. Dit wordt gesoniceerd totdat het volledig ontdooid is. De stalen worden op een RP C18 kolom gebracht die vooraf geconditioneerd is met achtereenvolgens aceton, ethanol en gedestilleerd water. Na het water mag de kolom niet meer droog worden. Dan wordt de kolom gespoeld met 0.05 M HCl. Van het tot 0.05 M HCl verdunde staal wordt resp. 2ml en 8 ml apart gezuiverd.

8


Volgende standaarden werden toegevoegd. Bij het 2 ml deel : d(5)-Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) 13 C6- IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) 13 C6-IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) 15 N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) Bij het 8ml deel: 100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl 13C6-IAA oplossing (CDN isotopes) Op een Vacmaster (een bak die vacuum getrokken wordt, waarop men de kolommen plaatst en waarin vloeistof wordt opgevangen) worden de kolommen geladen. Daarna spoelt men de kolommen tweemaal met 0.05 M HCl (kolom laten leeglopen). De kolom wordt geëlueerd met 2 x 1.5 ml Acetonitril (Methyl cyanide). Het eluens wordt opgevangen in een glazen buisje en wordt ingedroogd in de HETOVAC VR1 Lab Equipment. Na het indrogen worden de stalen terug opgelost in 100 μl 100% methanol met enkele druppels rokend HCl en gemethyleerd met diazomethaan (Schlenk & Gellerman 1960) en terug gedroogd. De stalen worden gemethyleerd om ze stabiel te kunnen bewaren. Om de stalen over te brengen in LC-MS flesjes, worden ze opgelost in 50 μl 100% methanol Zuivering van de pellet. Aan de pellet in de Falcon-tube wordt 1 ml zure MeOH toegevoegd. Dit is methanol met een kleine hoeveelheid rokend HCl. Ook worden alle standaarden toegevoegd. • d(5)-Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) • 13C6- IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) • 13C6-IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) • 15N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) • 13C6-IAA :100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl oplossing (CDN isotopes) De Falcon buis wordt in ijs geplaatst. Om de bacteriecellen te vernietigen wordt de pellet gesoniceerd met een Vibra cell 400 Watt gedurende 3 minuten telkens met een puls van 5 seconden aan en 5 seconde af. De sonde wordt daarna afgespoeld met 0.05 M HCl en dit wordt in de Falcon-tube opgevangen. Het geheel wordt aangelengd tot 10 ml en wordt gecentrifugeerd bij 3000 g gedurende 10 minuten. Alleen het supernatans wordt op de kolom geladen om te voorkomen dat zij verstopt en verder onbruikbaar wordt. Het verdere verloop van de handelingen is identiek aan de zuivering van het medium.

2.1.1.5 Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren (Prinsen et al. 1997,1998) 2.1.1.5.1 Massa spectrometrie Het gebruik van massaspectrometrie kan zowel kwantitatieve als kwalitatieve informatie geven. Door de koppeling met HPLC bekomen we een hoge specificiteit en nauwkeurigheid. Een massaspectrometer maakt gebruik van magnetische en elektrische velden om krachten uit te oefenen op geladen deeltjes in vacuüm. Hiervoor moeten de moleculen geïoniseerd zijn alvorens zij door de massaspectrometer kunnen geanalyseerd worden. Maar nog belangrijker is dat deze moleculen in de gasfase in het vacuümsysteem worden geïntroduceerd. Voor gassen en vluchtige componenten is dit geen probleem, maar sommige stoffen zijn daarenboven nog thermolabiel. Deze stalen dienen te worden gedesolvateerd voor zij geanalyseerd kunnen worden. Alhoewel ionisatie en desolvatatie aparte processen zijn, wordt de term “ionisatie methode” frequent gebruikt om naar deze beide processen te verwijzen. De keuze van het type ionisatie is afhankelijk van de te analyseren componenten en van de informatie die men wil bekomen via de analyse.

9


Nadat de ionen in de bron zijn geïoniseerd komen zij in de quadrupool terecht. Een quadrupool bestaat uit 4 evenwijdige staven die een bepaalde lading dragen. Door de lading van de staven onderling te regelen, kan men een bepaalde massa selecteren die de detector bereikt. Om een bepaald staal te meten kan men gebruik maken van Select Ion Monitoring (SIM) of een scan. Wanneer men gebruik maakt van SIM, “fixeert” men de quadrupool op een bepaald ion met een bepaalde massa. Men stelt dus vooraf in welke massa het ion moet hebben wil het gedetecteerd worden. Bij een scan detecteerd men alle mogelijke massa’s die op de detector terecht komen.

Fig. 21.1. Voorstelling quadrupool massa- analysator.

Nadat alle stalen gemeten werden op LC-MS/MS worden de pieken in het massaspectrum geïntegreerd m.b.v. het computerprogramma MassLynx en kan de IAA concentratie berekend worden met behulp van volgende vergelijkingen: (Oppervl.x/Oppervl.y) = (x/y)

(1)

(Oppervl.x/Oppervl.y)*y= x

(2)

Hierin is:

Oppervlak x = geïntegreerde piekoppervlak van het niet gemerkt IAA Oppervlak y = geïntegreerde piekoppervlak van het 13C-IAA x = hoeveelheid (in mol) IAA dat initieel in het staal aanwezig was y = hoeveelheid (in mol) 13C-IAA toegevoegd als tracer

10


2.1.1.5.2 LC-MS/MS In deze analyse maken we gebruik van een “zachte” ionisatietechniek zoals Electrospray Ionisatie. Deze techniek zorgt voor een kleine tot geen fragmentatie. Deze methode maakt het mogelijk om erg grote en labiele moleculen te analyseren. Het staal, in oplossing, komt uit een hoog spanning capillair in een sterk elektrisch veld en dit onder atmosferische omstandigheden. Hierdoor ontstaat een aërosol van sterk geladen druppels. De verdamping van het solvent resulteert in ionen, die meestal verschillende ladingen dragen. Deze ionen worden via lenzen op de eerste quadrupool massa analysator gericht die door een prefilter beschermd wordt tegen contaminatie.

Fig. 24.1. Schematische voorstelling van een electrospray massaspectrometer. De analyse van alle stalen gebeurt door middel van micro LC-MS / MS (Prinsen et al. 1998). Specificaties zijn: LC instruments HPLC autosampler Kontron 465, HPLC Pump Kontron 422, HPLC detector Kontron 325 Analytische Kolom: Hypersil 5 µm C8 BDS 150 x 1 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Prekolom: Hypersil 5 µm C8 BDS 150 x 3 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Solvent: van 10 tot 80 % in 2.5 minuten Debiet: 100µl / minuut Massaspectrometrie: Fisons VG Quattro 2 Ionisatiemode: electrospray + Brontemperatuur: 80°C Capillaire spanning: 3.57 kV Cone spanning: 20 V Bij een collisie energie van 20 eV worden tandem massa spectra van het geprotoneerd moleculair ion ([MH]+) bekomen. De kwantificatie gebeurde door multiple reactant monitoring (MRM).

11


2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën Met wortelexudaten bedoelen we het totaal gehalte aan stoffen die al dan niet aktief uitgescheiden worden door de wortels in het omringende medium. 2.2.1. Verkrijgen van wortelexudaten • • • •

F1-Hybride mais zaad 7 Glazen Weck-bokalen Plastic roostertjes op pootjes Hoagland planten voedingsmedium

De zaden werden gesteriliseerd zoals reeds beschreven en kiemden in het donker gedurende twee dagen. De glazen bokalen met daarin de roostertjes werden geautoclaveerd en werden in de laminaire air flow tot net onder de roostertjes gevuld met ± 150 ml geautoclaveerde Hoagland oplossing. Op het roostertje in de potten legde ik drie gekiemde zaden, ervoor zorgend dat minstens één worteltje door de rooster tot in de vloeistof kwam. De potten werden met een glazen deksel gesloten. De planten (fig. 2.2) groeiden vervolgens allemaal vrij gelijkmatig gedurende negen dagen in de groeikamer bij 21.5°C. Bij het oogsten bleken slechts twee potten niet door fungi geïnfecteerd te zijn. Daarom stel ik een aanpassing voor van het protocol om zaden te steriliseren, zoals dit aan de tuinbouw hogeschool in Melle wordt gedaan. Hierbij wordt een hogere concentratie natrium hypochloriet gebruikt. Pot 2 bevatte twee uitgegroeide planten (één van de zaden had blijkbaar niet voldoende contact kunnen maken met het groeimedium) en 150 ml medium, pot 1 drie planten en 170 ml medium. Het Hoagland medium (met de wortelexudaten) van de twee potten werd verdeeld over falcon buizen van 50 ml. Telkens twee per pot ter analyse van het tryptofaan gehalte en één om aan een Azospirillum cultuur toe te dienen. 2.2.2 Analyse van de Indoolcomponenten Het medium was lichtjes troebel en werd 10 minuten bij 3000 g gecentrifugeerd. Er was na centrifugatie echter geen pellet zichtbaar. Het gehalte aan Trp en IAA werd bepaald zoals hierboven reeds beschreven in § 2.1.1.4 en § 2.1.1.5. In het medium is echter nog een tweede bron van Trp aanwezig in de vorm van eiwitten. Om een idee te krijgen van deze potentiële tryptofaan bron, werd er een alkalische hydrolyse uitgevoerd van het wortelexudaat. Aan 5ml wortelexudaat werd 5ml 14N NaOH toegevoegd en in dit alkalische milieu werd het staal gehydrolyseerd gedurende 3 uur, op 100°C en onder een waterverzadigde stikstof atmosfeer. Opnieuw op kamertemperatuur werd het staal verdund met ongeveer 20ml H2O en met 2N HCl getitreerd tot pH 2. De verdere zuivering verliep gelijkaardig met § 2.1.1.4. De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden, werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen. De wortel werd dan overgebracht in een eppendorf met 1 ml 80% MeOH. Het Trp werd overnacht en op –20°C door MeOH geëxtraheerd. De volgende ochtend werden de interne standaarden toegevoegd voor de uiteindelijke rendementsbepaling. 1/2 hiervan werd hiervan af genomen voor de bepaling van de vrije Trp conc (zie §2.1.1.4) en de andere helft werd onderworpen aan een alkalische hydrolyse. De alakalyse hydrolyse en verdere zuivering gebeurden zoals beschreven in § 2.2.2. 2.2.3 Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur Van elk van beide potten werd 42.5 ml medium filter gesteriliseerd (Schleicher&Schuell FP 030/3 porie grootte 0.2 µm). Daarna werden 3 geconcentreerde stockoplossingen toegevoegd nl.: 2.5 ml AB-zouten, 2.5 ml AB-fosfaten en 2.5 ml malaat, waarvan de samenstelling beschreven is onder de paragraaf ’’Groeimedia’’. Het resultaat is dan een oplossing met eenzelfde concentratie als MMAB-medium (plus de wortelexudaten en de zouten uit het Hoagland medium). Als blanco nam ik 50 ml MMAB-medium. Het vervolg van het experiment verliep identiek aan de vorige proef vanaf § 2.1.1.2.

12


2.2.3.1 Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan het medium, in gesteriliseerde erlemeyers met gleuven in de zijkant, werd 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd.

fig. 2.2: Een pot met maisplantjes. Op deze manier werden wortelexudaten verkregen. Zowel van de exudaten als van de wortels zelf werd het tryptofaangehalte bepaald. In het Hoagland medium waarin de planten groeiden (met de exudaten) werd daarna een bacteriecultuur gegroeid. 2.2.3.2 Staalname Na 30, 60 en 90 uur werd telkens 5 ml en 10 ml staal genomen en werd de Optische densiteit gemeten bij 600 nm in een Labsystems Multiskan RC. Na centrifugatie werden pellet en supernatans apart ingevroren bij –70°C. 2.2.3.3 Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA–precursoren Het gehalte aan IAA en zijn metabolische precursoren gemeten zoals hierboven reeds beschreven in § 2.1.1.4 en § 2.1.1.5.

13


2.3 Het tryptofaangehalte van wortels 2.3.1 Materialen en methoden De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen.

33.. C Cyyttookkiinniinneepprroodduukkttiiee ddoooorr AAzzoossppiirriilllluum m 3.1 Zuiveren van cytokinines De 10ml stalen van het experiment, beschreven in § 2.1, werden geanalyseerd op hun gehalte aan cytokinines. Zowel het supernatans (de door de bacterie in het medium uitgescheiden cytokinines) als de pellet (het endogene gehalte aan cytokinines) werden geanalyseerd. Zuivering van het supernatans De standaarden worden toegevoegd aan het supernatans. 20 pmol 2H5-zeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H3-DL-dihydrozeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H5-zeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H3-DL-dihydrozeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H5-zeatine-9-β-D-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H3-DL-dihydrozeatine-9-β-D-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H5-zeatine-riboside-5’-monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H3-DL-dihydrozeatine-riboside-5’-monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H6-N6-(2-isopentenyl)adenine, 98 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H6-N6-(2-isopentenyl)adenosine, 97 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H6-N6-(2-isopentenyl)adenosine-5’-monophosfate, 95 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2H6-N6-(2-isopentenyl)adenine-glucoside, 98 %, (APEX organics, Devon, UK)

14


Er wordt 20 ml H2O toegevoegd en het geheel wordt op pH 7 gebracht. Dit wordt geladen op een DEAEkolom met daaronder een C-18 kolom (geconditioneerd met EtOH en H2O). De kolom wordt vervolgens gespoeld met 20 ml H2O. 1. De C-18 kolom wordt geëlueerd met 80% MeOH. Het eluens wordt in een Rotavapor gedroogd onder vacuum tot waterfase. Daarna 3 ml PBS-buffer toevoegen en op pH7 brengen. De oplossing laden op een cytokinine immuno-affiniteitskolom met daaronder een C-18 kolom (geconditioneerd met EtOH, H2O en PBS) en naspoelen met 5 ml Milli Q water. • C-18 kolom: elueren met 3 ml 80% MeOH en het eluens drogen in de Speedvac. Deze fractie bevat de O-Glucosidische- en de N7-Glucosidische cytokinines. • CK-immuno-affiniteitskolom: elueren met 3 ml ijskoude 100% MeOH. De kolom moet onmiddelijk geregenereerd worden met H2O en PBS buffer. Zij wordt bi 4 °C bewaard, gevuld met PBS en azide om infecties en degradatie te vermijden. Het eluens wordt gedroogd in de Speedvac. Dit is de fractie met de vrije cytokinine basen. 222... De DEAE-kolom bevat de fractie met de cytokinine-fosfaten. Zij wordt geëlueerd met 10 ml 2M NH4HCO3. Daarna 30 ml H2O aan het eluens toevoegen en het geheel op een C-18 kolom (geconditioneerd met EtOH en H2O) brengen. Vervolgens elueren met 10 ml 80% MeOH. Drogen onder vacuum in een Rotavapor. Vervolgens 2 ml Tris 0.01 M pH 9.6 en 10 μl 1/100 alkalisch fosfatase toevoegen. Soniceren en vortexen om alles op te lossen. 30 tot 60 minuten bij 37°C het fosfatase zijn werk laten doen. Daarna 3 ml PBS toevoegen en op pH 7 brengen. De fosfaten zijn nu omgezet tot vrije basen. Zij worden op een immuno-affiniteitskolom geladen waar zij nu door de antibodies kunnen gebonden worden. Spoelen met 5 ml Milli Q water. Elueren met 3 ml ijskoude 100% MeOH. Stalen drogen in de Speedvac. Opnieuw de kolom onmiddelijk regenereren H2O en PBS buffer. Bewaren bij 4 °C in de koelkast met PBS en azide. Dit vertegenwoordigt de fractie met de cytokinine-fosfaten. Zuivering van de pellet. Aan de pellet in de Falcon-tube wordt 1 ml zure MeOH toegevoegd (methanol met een kleine hoeveelheid rokend HCl). Ook de standaarden worden tegevoegd. De Falcon buis wordt in een pot met ijs geplaatst. Om de bacteriecellen te lyseren wordt de pellet gesoniceerd met een Vibra cell 400 Watt gedurende 3 minuten telkens met een puls van 5 seconden aan en 5 seconde af. De sonde wordt daarna afgespoeld met 0.05 M HCl en dit wordt in de Falcon-tube opgevangen. Het geheel wordt aangelengd tot 10 ml en wordt gecentrifugeerd bij 3000 g gedurende 10 minuten. Aan het supernatans wordt 20 ml H2O toegevoegd, dat wordt op pH 7 gebracht en op de DEAEcarbonaat kolom geladen. Het verdere verloop van de zuivering is identiek aan de zuivering van het medium.

3.2 Detectie en kwantificatie van cytokinines De methode om cytokinines te kwantificeren is analoog aan die voor auxines (§2.1.1.5).

15


44.. C Chheem moottaaxxiiss eenn aassssoocciiaattiiee m meett ddee ppllaanntteennw woorrtteell Azospirillum is in staat zich, met behulp van de flagellen, aktief naar de wortel toe te bewegen, aangetrokken door componenten die door de wortel worden uitgescheiden (Vande Broek et al. 1998). Om deze chemotaxis aan te tonen en om de natuurlijke associatie van de bacterie met de plantenwortels te visualiseren, heb ik twee eenvoudige proefjes uitgevoerd. Materialen en methode • Petrischalen van 20 cm diameter • MS-agar. De agar bevat geen koolstofbronnen waarop Azospirillum kan groeien en kolonies vormen. • Tritimum aestivum cv. Rubino zaden (tarwe) • Zea mais F1-Hybride zaden (mais) • Azospirillum basilense Sp 245 overnacht vloeibare cultuur • Geacclimatiseerde planten groeikamer; 21.5°C; 16:8 uur licht:donker ; onder 2 ≠ types neon lampen De zaden werden gesteriliseerd. Drie minuten 70% methanol, 30 minuten natrium hypocloriet + SDS oplossing, 30 minuten imbibitie in steriel water. Chemotaxis Op iedere petrischaal met agar werden vier tarwezaden, ongeveer 4 cm van het midden gelegd. Na twee dagen kieming bij 21.5 °C werd in het midden van de schaal 0.1 ml met 2.1E6 Azospirillum cellen aangebracht. Dit gebeurde door de punt van de pipet in de agar te steken en te roeren zodat de bacteriën in de agar gemengd werden. De diameter van de omgeroerde plaats was ongeveer 1.5 cm. De schalen werden afgesloten met parafilm en terug in de groeikamer gezet. De opzet was dat de bacteriën zich naar de kiemwortel begaven en door de exudaten van de wortels beginnen groeien en in het medium t.h.v. de wortels kolonies vormen. De associatie met de wortels Voor het geval de bacteriën om een of andere reden niet zo mobiel bleken als verwacht (te viskeuze agar of niet voldoende energie door een gebrek aan voedingsstoffen), heb ik een variatie op het vorige uitgevoerd die toch de associatie tussen beide organismen visualiseert zonder de chemotaxis aan te tonen. Eerst werd op de agar 0.3 ml met 6E6 Azospirillum cellen gepipetteerd. De vloeistof werd met een omgebogen pasteur pipet in de agar gewreven zoals men doet om het aantal CFU’s te tellen. Vervolgens werden over iedere schaal drie mais zaden gelijkmatig verdeeld. Beide experimenten zijn moeilijk te kwantificeren. De bacteriën bevinden overal op de petrischaal maar, groeien (en worden waarneembaar als kolonies) slechts wanneer een plantenwortel in de buurt groeit en zij voedingstoffen kunnen opnemen. Wanneer kolonies slechts in de buurt van een wortel worden waargenomen tonen we hiermee de associatie van Azospirilum met een gastheer plant aan.

16

III. Resultaten en bespreking

IIIIII.. R Reessuullttaatteenn eenn B Beesspprreekkiinngg 1 Zaai- en Inoculatieëxperimenten 1.1 Triticum aviculare Aan de hand van zaaien inoculatieexperimenten gaan wij na onder welke omstandigheden een groeibevorderend effect kan vastgesteld worden op de wortels van Triticum aviculare cv. Rubino kiemplanten door Azospirillum brasilense (Sp245). Deze experimenten zijn initieel een reproductie van proeven waarover reeds werd gerapporteerd door Leuvense vorsers. Wij gaan na of een gelijkaardig effect bekomen wordt door toedienen van het fytohormoon indool-3-azijnzuur en zijn metabolische precursoren. 1.1.1 Het eerste experiment In een eerste reeks experimenten hebben we het effect van indol azijnzuur (concentraties: 3,3.10-9 M, 3,3.10-7 M, 3,3.10-5 M), anthranilaat (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M), tryptofaan (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M), indol acetamide (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M), tryptamine (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M) en indol pyruvaat (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M) nagegaan. In Fig. 1.1 en Fig. 1.2 worden respectievelijk de cumulatieve wortellengte en het totaal aantal wortels geplot. In Fig. 1.3 wordt het kiemingspercentage van de zaden voorgesteld. Daar een grote biologische variatie tussen de verschillende replica’s waar te nemen was, hebben we geopteerd om de verschillende individuele meetwaarden uit te zetten in een scatterdiagram en de individuele meetwaarden te vergelijken met de gemiddelde waarde. Deze spreiding van de verschillende meetwaarden geeft een beeld van de relevantie van verschillen tussen de gemiddelde behandeling. De wortellengte van de vijf plantjes binnen één petrischaal wordt opgeteld daar de vijf planten niet als onafhankelijke metingen kunnen worden beschouwd. Cumulatieve Wortellengte 160.00 140.00

Lengte (cm)

120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00

a Tr

a -5

Tr 3. 3E

IP yA

-6 3. 3E

5

IP yA 6

3. 3E -

IA M 5

3. 3E -

IA M

3. 3E -

A

6

A -5

3. 3E -

A 3. 3E

-6

A

trp 5

3. 3E

trp 6

3. 3E -

IA A

IA A

3. 3E -

3. 3E -5

IA A

3. 3E -7

bl an

3. 3E -9

co

0.00

Substraat Concentratie (M) n

Gemiddelde

Fig. 1.1 : De totale wortellengte van 15 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties IAA, Trp, Tra, AA, IAM en IpyA toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur ; Trp = Tryptofaan ; Tra = tryptamine ; AA= anthranilaat ; IpyA = Indol pyruvaat)

1

. III. Resultaten en bespreking Aantal Wortels 30.00

25.00

Aantal

20.00

15.00

10.00

5.00

a

a

Tr

Tr

-5 3. 3E

IP yA

-6 3. 3E

6

5

IP yA

3. 3E -

IA M

3. 3E -

A A

IA M

3. 3E -5

3. 3E -6

A 3. 3E

-6

-5

A

trp 5

3. 3E

trp 6

3. 3E -

IA A

3. 3E -

-5

-7

IA A 3. 3E

3. 3E

3. 3E

-9

IA A

bl an co

0.00

Substraat Concentratie (M) n

Gemiddelde

Fig. 1.2 : Het aantal wortels van 3 petrischalen met elk 5 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties IAA, Trp, Tra, AA, IAM en IpyA toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur ; Trp = Tryptofaan ; Tra = tryptamine ; AA= anthranilaat ; IpyA = Indol pyruvaat)

% Gekiemde Zaden 350.00

schaal 1

Schaal 2

Schaal 3

300.00

% kieming

250.00

200.00

150.00

100.00

50.00

bl

an co 3. 3E -9 IA A 3. 3E -7 IA A 3. 3E -5 IA A 3. 3E -6 trp 3. 3E -5 trp 3. 3E -6 A A 3. 3E -5 A A 3. 3E -6 IA M 3. 3E -5 IA M 3. 3E -6 IP yA 3. 3E -5 IP yA 3. 3E -6 Tr a 3. 3E -5 Tr a

0.00

Substraat Concentratie (M)

Fig. 1.3 : Het kiemingspercentage van 3 petrischalen met elk 5 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties IAA, Trp, Tra, AA, IAM en IpyA toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur ; Trp = Tryptofaan ; Tra = tryptamine ; AA= anthranilaat ; IpyA = Indol pyruvaat) Vooral de inhibitie van de kieming en daamee samenhangend, de geinhibeerde wortelgroei valt op bij hoge concentraties indol-3-azijnzuur, indol-3-acetamine, indol-3-pyruvaat en tryptamine. Het IAAeffect van de precursoren suggereert een vlotte omzetting naar IAA in de plant. Aangezien bij de kieming van tarwezaden eerst wortels gevormd worden, kan men zich vragen stellen bij de plaats van

2


IAA-biosynthese. Vooral indol-3-pyruvaat lijkt weinig effect te hebben op het aantal wortels en het kiemingspercentage van de zaden. Het IAA-effect manifesteert zich hier duidelijk pas na de wortelvorming. Is het mogelijk dat IAA niet exclusief in het stengel apikaal meristeem wordt gesynthetiseerd maar ook in de wortel zelf? 1.1.2 Tweede experiment Bij de tweede reeks experimenten hebben we het effect van indol azijnzuur (concentraties: 3,3.10-10 M, 3,3.10-9 M, 3,3.10-7 M en 3,3.10-5 M) en 48.10-3 Azospirillum cellen nagegaan. In Fig. 1.4 en Fig. 1.5 worden respectievelijk de cumulatieve wortellengte en het totaal aantal wortels geplot. Daar een grote biologische variatie tussen de verschillende replica’s waar te nemen was, hebben we geopteerd om de verschillende individuele meetwaarden uit te zetten in een scatterdiagram en de individuele meetwaarden te vergelijken met de gemiddelde waarde. Deze spreiding van de verschillende meetwaarden geeft een beeld van de relevantie van verschillen tussen de verschilende behandelingen. De wortellengte van de vijf plantjes binnen één petrischaal wordt opgeteld daar de vijf planten niet als onafhankelijke metingen kunnen worden beschouwd. Cumulatieve Wortellengte 300

250

Lengte (cm)

200

150

100

50

0 48E3 Bacteriën

Blanco

n

Gemiddelde

3.3E-10 M IAA

3.3E-9 M IAA

3.3E-7 M IAA

3.3E-5 M IAA

Concentratie Substraat

Fig. 1.4 : De totale wortellengte van 15 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties IAA en 48.10-3 Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur).

3


Aantal Wortels 29

27

Aantal

25

23

21

19

17

15 48E3 Bacteriën

Blanco

3.3E-10 M IAA

3.3E-9 M IAA

3.3E-7 M IAA

3.3E-5 M IAA

Substraat Concentratie n

Gemiddelde

Fig. 1.5 : Het aantal wortels van 3 petrischalen met elk 5 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties IAA en 48.10-3 Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur). 1.1.3 Inoculatie experiment Bij een derde reeks experimenten hebben we het effect van 90, 900, 9.10-3 en 90.10-3 Azospirillum cellen nagegaan. In Fig. 1.6 en Fig. 1.8 worden respectievelijk het totaal aantal wortels en de cumulatieve wortellengte geplot. Daar een grote biologische variatie tussen de verschillende replica’s waar te nemen was, hebben we geopteerd om de verschillende individuele meetwaarden uit te zetten in een scatterdiagram en de individuele meetwaarden te vergelijken met de gemiddelde waarde. Deze spreiding van de verschillende meetwaarden geeft een beeld van de relevantie van verschillen tussen de verschillende behandelingen. De wortellengte van de vijf plantjes binnen één petrischaal wordt opgeteld daar de vijf planten niet als onafhankelijke metingen kunnen worden beschouwd.

Aantal Wortels 34.00

32.00

30.00

Aantal

28.00

26.00

24.00

22.00

20.00

18.00

Blanco

90 bacteriën

n

Gemiddelde

900 bacteriën

9E3 bacteriën

90E3 bacteriën

Substraat

Fig. 1.6 :Het aantal wortels van n=1 petrischaal met 5 kiemplantjes, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. 4


In Fig. 1.7 wordt naast de cumulatieve wortellengte ook nog de gemiddelde lengte van de coleoptielen binnen één schaal weergegeven. Bij wijze van z-as wordt dit voorgesteld door de grootte van de bollen. We wilden op die manier nagaan of er een volledige inhibitie van de kieming van het zaad kan waargenomen worden of alleen maar een effect op de wortel.

Cumulatieve Wortellengte & Coleoptiellengte 120.00

100.00

Wortellengte (cm)

80.00

60.00

40.00

De gemiddelde coleoptiellengte van de vijf planten op een petrischaal wordt voorgesteld door de grootte van de sfeer 20.00

0.00 0.00

Blanco 1.00

90 bacteriën 2.00

900 bacteriën 3.00

9E3 bacteriën 4.00

90E35.00 bacteriën

Substraat

Fig. 1.7 : De totale wortellengte van 15 kiemplanten. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. Er werden verschillende concentraties Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. In de plaats van een Z-as stelt de grootte van de bollen de gemiddelde coleoptiellengte binnen 1 petrischaal voor. Cumulatieve Wortellengte 110.00

100.00

90.00

Lengte (cm)

80.00

70.00

60.00

50.00

40.00

30.00

20.00

Blanco

n

90 bacteriën

gemiddelde

900 bacteriën

9E3 bacteriën

90E3 bacteriën

Substraat

Fig. 1.8 : De totale wortellengte van 15 kiemplanten, 7 dagen na het zaaien. n=3 waarbij elke n=1 petrischaal met 5 kiemplanten. Er werden verschillende concentraties Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. Dezelfde gegevens als fig. 1.7 zonder de coleoptiellengte.

5

6.00


In Fig. 1.9 wordt de totale wortellengte t.o.v. de lengte van het coleoptiel van de individuele kiemplanten uitgezet. We wilden op die manier nagaan of er een volledige inhibitie van de kieming van het zaad kan waargenomen worden of alleen maar een effect op de wortel.

35.00

Totale Wortellengte (cm)

30.00

25.00

20.00

15.00

90E3 bacteriën 9E3 bacteriën 900 bacteriën 90 bacteriën Blanco

10.00

5.00

0.00 0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

Coleoptiellengte (cm)

Fig. 1.9 : Een scatterdiagram dat de totale wortellengte van een kiemplant t.o.v zijn coleoptiellengte voorstelt. We onderzoeken op deze wijze een correlatie binnen de groepen van planten die eenzelfde behandeling ondergingen. Uit de resultaten weergegeven in Fig. 1.1 tot Fig. 1.9 blijkt geen bevorderde groei door het toedienen van IAA. Bij het toedienen van 1 ml E-4 IAA zien we een inhibitie van de kieming. Deze concentratie is duidelijk toxisch voor de plant. Ook bij lagere concentraties is de wortellengte beduidend kleiner dan bij de blanco’s. Deze resultaten sluiten echter een mogelijk bevorderen van de groei door IAA niet uit. IAA zou namelijk initieel de kieming kunnen inhiberen, wat inhoud dat de behandelde kiemplanten een verschillende fysiologische leeftijd hebben. (Davies, 1995) en vervolgens de lengtegroei van de wortels kunnen bevorderen. Ook is het toedienen van IAA in deze vroege fase van de plantenontwikkeling waarschijnlijk niet relevant voor de levenswijze van Azospirillum brasilense. Zij koloniseert namelijk actief de wortels en niet de zaden. Dit testsysteem zoals dit door Leuvense onderzoekers (referentie) werd gerapporteerd, beschrijft waarschijnlijk niet wat we willen onderzoeken. In een poging hun resultaten te reproduceren weerleggen we hun onderzoek gedeeltelijk. IAA inhibeert de volledige kieming, ook de groei van het coleoptiel. De kieming is vertraagd en de kiemplanten die een verschillende behandeling ondergaan hebben dus een verschillende fysiologische leeftijd. Om de inhibitie van de kieming in rekening te brengen zodat we alleen naar het wortelgroei bevorderend effect van IAA kijken zouden we de wortellengte van groepen met dezelfde coleoptiellengte kunnen bekijken. Daarom hebben we een kiemingsexperiment uitgevoerd waarbij we iedere dag van blanco’s een staal van 15 planten, verdeeld over drie petrischalen namen (Fig. 1.9 tot Fig. 1.11). Zowel de coleoptiellengte als de wortellengte werd gemeten.

6


3

2.5 Coleoptiel Gemiddelde Wortellengte/plant

2

Lengte (cm)

1.5

1

0.5

0 1

2

3

4

5

-0.5

Leeftijd (dagen)

-1

Fig. 1.10 : De fysiologische leeftijd van kiemplanten a.d.v. de coleoptiellengte. Iedere dag werden 3 petrischalen met ieder 5 planten geoogst en werd zowel de wortellengte als de coleoptiellengte gemeten. 3.5

3

wortellengte (cm)

2.5

2

1.5 Leeftijd van de plantjes 1

dag 3 dag 4 dag 5 dag 2 dag 1

0.5

0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

coleoptiellengte (cm)

Fig. 1.11 : : De fysiologische leeftijd van kiemplanten a.d.v. de coleoptiellengte. Iedere dag werden 3 petrischalen met ieder 5 planten geoogst en werd zowel de wortellengte als de coleoptiellengte gemeten.

Uit Fig. 1.9 blijkt een grote overlapping. Het is moeilijk om duidelijke groepen te onderscheiden die een verschillende behandeling ondergingen. Een uitzondering hierop misschien is de groep waaraan 900 Azospirillum cellen per petrischaal werd toegediend. Als er een beste rechte door de groepen wordt getrokken lopen deze allemaal mooi evenwijdig en erg dicht bij elkaar. De helling van de rechte bij de groep van 900 toegevoegde cellen is kleiner. De groei (of de inhibitie ervan) in de stengel verloopt evenredig aan die in de wortel. De methode om bij deze experimenten een eventueel groeibevorderend effect vast te stellen door de inhibitie van de kieming in rekening te brengen a.d.v. Fig. 1.11 is niet afdoende. 7


De foutenvlaggen in fig. 1.10 zijn de standaarddeviaties tussen de drie gemiddelden van de wortellengte van de vijf planten op een petrischaal. Bij de stalen die ad random werden genomen op de vierde dag waren alle zaden van één petriplaat niet gekiemd. Bij die van de vijfde dag waren alle zaden van twee petriplaten niet gekiemd. De coleoptielen wortellengte hebben een maximum op de derde dag. Dit is een onzinnig resultaat. De spreiding van de resultaten en dus de fenotypische variatie m.b.t. de kieming laat zich niet beschrijven door slechts 15 planten per groep. Daarvoor is de genetische variatie van het gebruikte tarwe ras te groot. Voor dit soort onderzoek met deze plant is een veel grootser opgezet experiment met grotere populaties nodig wat in het kader van dit thesisonderzoek praktisch niet haalbaar is. Ook voor het standariseren en het representatief maken van fysiologische metingen zijn deze genetisch nog tamelijk verschillende planten erg onpraktisch. Een alternatief voor het statistisch beschrijven van die variatie is het werken met clonale planten. Bij zaaiexperimenten is dit echter geen optie. Genetische variatie vermindert ook door inteelt. Door generaties na elkaar planten aan zelfbestuiving te laten doen worden deze uiteindelijk volledig homozygoot en is het makkelijk diegenen met de beste kenmerken te selecteren door de volledige fenotypische expressie van het genoom. Inteelt vermindert echter de vruchtbaarheid. Wanneer men twee verschillende zuivere ingeteelde lijnen (waarvan men de gewenste eigenschappen heeft kunnen selecteren) met elkaar kruist wordt de verminderde vruchtbaarheid opgeheven door het heterosis effect (hybrid vigor). De F1-generatie is dan volledig heterozygoot maar alle planten zijn genetisch identiek. Zulke planten worden in de plantenveredeling F1-Hybriden tussen twee verschillende ingeteelde lijnen genoemd. Bij Zea mais is dit vanwege de gescheiden positie van de mannelijke en vrouwelijke bloeiwijze op de plant makkelijk te verwezenlijken. De twee ingeteelde lijnen zaait men op een veld op rijen naast elkaar. Van lijn A verwijdert men de mannelijke bloeiwijze bovenaan de plant. De vrouwlijke bloemen ervan worden uitsluitend bestoven door lijn B. De nakomelingen zijn allen F1-Hybriden. Een dergelijke techniek is bij de veredeling van tarwe praktisch onmogelijk. Het experiment wordt aangepast. Hormonen, hormoon precursoren en bacteriën worden na de kieming toegediend zodat de inhibitie van de kieming door IAA wordt uitgeschakeld.

1.2 Zea mais Bij dit experiment hebben we het effect van indol azijnzuur (concentraties: 3,3.10-10 M, 3,3.10-9 M, 3,3.10-7 M, 3,3.10-5 M) en tryptofaan (concentraties: 3,3.10-6 M, 3,3.10-5 M) en verschillende hoeveelheden Azospirillum (120, 1200 en 12000 cellen) nagegaan. In Fig. 1.12 en Fig. 1.13 worden respectievelijk de cumulatieve wortellengte en het totaal aantal wortels geplot. In Fig. 1.3 wordt het kiemingspercentage van de zaden voorgesteld. Daar een grote biologische variatie tussen de verschillende replica’s waar te nemen was, hebben we geopteerd om de verschillende individuele meetwaarden uit te zetten in een scatterdiagram en de individuele meetwaarden te vergelijken met de gemiddelde waarde. Deze spreiding van de verschillende meetwaarden geeft een beeld van de relevantie van verschillen tussen de verschillende behandelingen. De wortellengte van de drie plantjes binnen één petrischaal wordt opgeteld daar de drie planten niet als onafhankelijke metingen kunnen worden beschouwd.

8


Cumulatieve Wortellengte 300.00

250.00 n Gemiddelde

Lengte (cm)

200.00

150.00

100.00

50.00

0.00 120 Bacteriën

1.2E3 Bacteriën

12E3 Bacteriën

Blanco

3.3E-10 M IAA

3.3E-9 M IAA

3.3E-7 M IAA

3.3E-5 M IAA

3.3E-6 M trp

3.3E-5 M trp

Substraat Concentratie (Aantal bacteriën ; M)

Fig. 1.12 : De totale wortellengte van 12 kiemplanten in functie van verschillende behandelingen. n=4 waarbij elke n=1 petrischaal met 3 kiemplanten, 11 dagen na het zaaien. Er werden verschillende concentraties IAA en Trp en verschillende aantallen Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur ; Trp = Tryptofaan )

Aantal Wortels 160.00 140.00 120.00 n

Gemiddelde

3.3E-6 M trp

3.3E-5 M trp

Aantal

100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 120 Bacteriën

1.2E3 Bacteriën

12E3 Bacteriën

Blanco

3.3E-10 M IAA

3.3E-9 M IAA

3.3E-7 M IAA

3.3E-5 M IAA

Substraat Concentratie (aantal bacteriën ; M)

.Fig. 1.13 : Het aantal wortels van 12 kiemplanten in functie van verschillende behandelingen. n=4 waarbij elke n=1 petrischaal met 3 kiemplanten, 11 dagen na het zaaien. Er werden verschillende concentraties IAA en Trp en verschillende aantallen Azospirillum cellen toegevoegd aan de verschillende reeksen van platen. (IAA = indol azijnzuur ; Trp = Tryptofaan )

9


1.2.1 Het effect van bacteriën Het is moeilijk om in te schatten wat de auxine productie van de verschillende toegevoegde hoeveelheden bacteriën zou kunnen zijn. We weten immers niet hoe snel de bacteriën gegroeid zijn nadat ze waren toegevoegd. Een duidelijk groeibevorderend effect kan door het toevoegen van de bacteriën niet worden vastgesteld. Indien de groei van de bacteriën miniem is, zou het kunnen dat de hoeveelheid bacteriën te klein is. In § 2.2 wordt de IAA productie door A. brasilense besproken. Eén miljard bacteriën, in een vloeibare cultuur met wortelexudaten, produceren na 90 uur 6.10-6 M IAA. Duizend bacteriën produceren dan waarschijnlijk 6.10-12 M IAA. Dit is een normaal gesproken fysiologisch niet actieve concentratie (Davies 1995). Door de lokale productie van IAA tegen de wortel aan ( Azospirillum koloniseert de wortels) is er wel een invloed mogelijk. 1.2.2 Het effect van auxine en auxine-precursoren Hoewel deze gegevens statistisch niet significant zijn, kan er voor IAA een duidelijke trend in het dosis effect op de wortellengte worden waargenomen. Groeibevorderend bij een concentratie van 3,3.10-9 M, inhibitie van de groei bij een concentratie van 3,3.10-5 M. Tryptofaan geeft bij een concentratie van 1E-5 M geen duidelijke effecten t.o.v. de blanco. Wel zien we bij 3,3.10-5 M een verminderde groei t.o.v. 3,3.10-6 M . De concentratie t.g.v. de excretie in het medium door de wortel ligt rond 1.10-6 M (§2.2 en §2.4). Er is geen duidelijk effect op het aantal wortels.

2 Wortelexudaten In deze experimenten hebben we de fytohormoon productie van Azospirillum gemeten. We keken naar de invloed van wortelexudaten op de bacteriële groei. We groeiden de bacteriën in erlemeyers in MMAB medium. We gingen de invloed van verschillende tryptofaan concentraties na en de invloed van wortelexudaten in het algemeen op de IAA productie. 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense Deze proeven geven ons een idee van de concentratie-afhankelijke omzetting van exogeen tryptofaan in de tijd . 2.1.1 Aantal bacteriën Aantal Bacteriën in culturen met verschillende tryptofaan concentraties 9.00E+08

8.00E+08

Aantal bacteriën

7.00E+08

6.00E+08

5.00E+08 Trp concentratie

4.00E+08

3.00E+08

2.00E+08 0 uur

0.00E+00 1.00E+00 5.00E+00 2.00E+01 5.00E+01 1.00E+02

Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(OD-waarde))+20.4)

30 uur

60 uur

90 uur

Tijdstip van Staalname

Fig. 2.1 :Het aantal Azospirillum cellen op drie tijdstippen. De bacteriën werden gegroeid vloeibare culturen (MMAB) waaraan verschillende hoeveelheden tryptofaan werd toegevoegd.

10

in


2.1.2 IAA productie In deze experimenten hebben we de IAA productie van Azospirillum gemeten. We keken we naar de invloed van wortelexudaten op de bacteriële groei. We groeiden de bacteriën in 6 erlemeyers in MMAB medium waaraan verschillende tryptofaan concentraties werden toegevoegd. We gingen de invloed van verschillende tryptofaan concentraties na en de invloed van wortelexudaten in het algemeen op de IAA productie.

Fig. 2.2 : Het gehalte aan tryptofaan, voorgesteld op een logaritmische schaal, in zes Azospirillum culturen: 30, 60 en 90 uur na inoculatie. De inzet laat dezelfde gegevens op een lineaire schaal zien.

Fig. 2.3 : De productie van IAA,na het toedienen van tryptofaan voorgesteld op een logaritmische schaal, in zes Azospirillum culturen: 30, 60 en 90 uur na inoculatie. De inzet laat dezelfde gegevens op een lineaire schaal zien

11


Er is een duidelijke toename in de productie van IAA naarmate meer tryptofaan werd toegevoegd. Opmerkelijk is het hogere gehalte aan tryptofaan na 30 uur in de cultuur waar geen tryptofaan werd toegevoegd t.o.v. de cultuur waar 1μg/ml werd toegevoegd. Exogeen Trp inhibeert blijkbaar de endogene Trp-productie. Het lagere gehalte aan anthranilaat (de metabolische Trp precursor, zie data § 3) bevestigt dit. Een uitgebreide bespreking van de verschillende metabolische synthesewegen wordt later besproken onder § 3.

2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA productie van bacteriën Men heeft voor Azospirillum brasilense een mutant ( SpM7918) in de IAA biosynthese vanuit tryptofaan kunnen isoleren die toch nog 10% IAA t.o.v. het wildtype produceert. Tevens werd een tryptofaan onafhankelijke biosyntheseweg aangetoond. Uit recentere bevindingen blijkt dat Azospirillum brasilense echter twee ipdC genen bezit (indool pyruvaat decarboxilase) (Zimmer et al. 1998 ; Costacurta et al. 1994)). Daarom stellen wij als hypothese dat er geen tryptofaan onafhankelijke biosyntheseweg bestaat en dat alle IAA in de natuur via endogeen tryptofaan aangemaakt wordt. Bij de experimenten waarbij men tryptofaan toedient aan een Azospirillum cultuur gaat het steeds om concentraties waarvan wij denken dat ze in de natuur niet voorkomen (Zakharova et al. 1999 ; Prinsen et al. 1993). Als hypothese voor dit experiment stellen wij dat planten geen tryptofaan in zo’n grote concentraties via hun wortels in het milieu vrijstellen en dat toegenomen IAA productie louter te wijten is aan andere plantencomponenten die de bacterie metaboliseert. 2.2.1 Aantal bacteriën

Aantal Bacteriën in culturen met Wortelexudaten 1.10E+09 1.00E+09

Aantal bacteriën

9.00E+08 8.00E+08 7.00E+08 6.00E+08 5.00E+08 4.00E+08

Bron van de wortelexudaten Pot 1 Pot 2 Blanco (enkel MMAB)

3.00E+08 Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(OD-waarde))+20.4) 2.00E+08 0 uur

30 uur

60 uur

90 uur

Tijdstip van Staalname

Fig. 2.4 :Het aantal Azospirillum cellen op drie tijdstippen. De bacteriën werden gegroeid in vloeibare culturen (MMAB). Twee culturen bevatten wortelexudaten uit een verschillende bron; Pot 1 en pot 2 waar onder steriele condities respectievelijk 3 en 2 maisplanten in Hoagland nutriënten oplossing waren gegroeid. Een derde pot bevatte enkel MMAB. Uit deze figuur blijkt duidelijk het effekt van wortelexudaten op de bacteriële groei. Aan de blanco werden geen Hoagland zouten toegevoegd. Een verschil in groei zou daaraan te wijten kunnen zijn. Bij pot 1 met 3 planten zien we echter een betere groei dan bij pot 2, die maar 2 planten bevatte. Hier is dus sprake van een dosis effekt. Dit maakt het aannemelijk te stellen dat wortelexudaten een groeibevorderend effekt op Azospirillum hebben.

12


2.2.2 IAA productie In dit experiment werden bacteriën gegroeid in een medium dat wortelexudaten bevatte. Er werd geen synthetisch tryptofaan toegevoegd.

Fig. 2.5 : Tryptofaan gehalte van een vloeibare Azospirillum cultuur in MMAB met wortelexudaten. 30, 60 en 90 uur na inoculatie. In Fig. 2.5 zien we hoe vrijwel al het in het medium aanwezige Trp snel door de bacteriën werd opgenomen. De 5000 pmol/ml komt overeen met 1μg/ml, de concentratie waarbij in Fig.2.2 de endogene Trp productie geïnhibeerd werd.

Fig. 2.6 : De IAA (Indol azijnzuur) productie van Azospirillum brasilense in een vloeibare Azospirilum cultuur in MMAB met wortelexudaten. 30, 60 en 90 uur na inoculatie

13

Comment [G1]:


De hoeveelheid IAA (Fig. 2.6 ) in het medium van pot 1 na 90 uur is vergelijkbaar met de hoeveelheid voor de beginconcentratie Trp van 1μg/ml in Fig. 2.2. (nl. 6000 pmol/ml resp.5700 pmol/ml) In Tabel 1 onder § 2.4 wordt het totale Trp gehalte in pot 1 vermeld. Dit is de som van het vrije tryptofaan en het geconjugeerde tryptofaan: nl. ± 2000 pmol/ml. Qua grootte orde komt dit overeen met de hoeveelheid tryptofaan die men vertrekkend van de geproduceerde hoeveelheid IAA kan veronderstellen. De concentratie anthranilaat (zie verder bij de bespreking van de biosyntheseweg) in pellet en medium is vrij laag maar komt qua grootte orde weer overeen met de 5000pmol/ml toegevoegd Trp. Het is verwonderlijk dat na 30 uur het anthranilaat alleen in het supernatans terug te vinden is. Het is echter niet onmogelijk dat in het wortelexudaat ook anthranilaat aanwezig is. Wanneer de Trp concentratie daalt na 60 en 90 uur stijgt de anthranilaat concentratie in de pellet. De anthranilaat meting moet echter met voorzichtigheid geïnterpreteerd worden daar de pieken in het massaspectrum in de buurt van de detectielimiet lagen.

2.3 Mogelijke Tryptofaanbronnen in de natuur Een uitvoerig beschreven IAA-effect van Azospirillum is de toename, zowel in grootte van de wortels als in aantal wortelharen ( Bellone et al. 1995). Door het tijdelijke karakter van de wortelharen, ze komen vooral voor in de zone van wortelelongatie, en omdat tryptofaan een essentiële bouwsteen is, waarvan de diffusie doorheen de cortex in het medium puur verlies is, veronderstellen we de wortelharen als voornaamste bron van tryptofaan. Isolatie van wortelharen werd reeds beschreven voor Vicia.(W. Broughton, univ. Genève: mondelinge mededeling) Na een eerste poging bij Triticum aviculare blijkt het echter praktisch onmogelijk een voldoende hoeveelheid wortelharen te verzamelen. Zea mais lijkt een haalbaar alternatief. Er zijn echter veel planten nodig om een meetbare hoeveelheid wortelharen te verkrijgen en het is een heel arbeidsintensief werk. Daarom laat ik het met plezier na aan diegenen die na mij komen.

2.4 Het tryptofaangehalte van wortels We gaan ervan uit dat indien er een externe tryptofaanbron voor de IAA productie van de bacterie gebruikt is, deze afkomstig is van de wortelmutscellen maar ook van oude wortelharen. Bij planten van een week oud zal het tryptofaan waarschijnlijk slechts in beperkte mate terug te vinden zijn in het groeimedium. Het tryptofaangehalte van de wortels geeft ons een idee van de maximale beschikbare hoeveelheid tryptofaan voor de bacterie. We analyseren zowel het vrije tryptofaan als het tryptofaan gebonden in peptides.

Wortelexudaten

Wortel

Tryptofaan gehalte Vrij Tryptofaan

Pot 1 : ± 500 pmol/ml

Conjugaten (o.a. in peptides) (gemeten na basische hydrolyse)

Pot 1 : ± 1300 pmol/ml Pot 2 : ± 800 pmol/ml

Vrij Tryptofaan

Pot 1 : ± 74.103 pmol/gram vers gewicht Pot 2 : ± 45.103 pmol/gvg

Conjugaten (basische hydrolyse)

Pot 1 : ± 7.106 pmol/gvg Pot 2 : ± 2.106 pmol/gvg

Tabel 1 : Tryptofaangehalte van mais wortels en – wortelexudaten. Zowel vrij tryptofaan als tryptofaan in conjugaten werd gemeten. Het gehalte aan geconjugeerd tryptofaan is de maximaal beschikbare Trp bron voor Azospirillum. Het gehalte aan Tryptofaan in de wortelexudaten is miniem t.o.v. het gehalte aan tryptofaan dat we toedienden bij § 2.1.2 .

14


3 Productie van Fytohormonen door Azospirillum brasilense 3.1 Indool-3-azijnzuur

3.1.1 De verschillende metabolische IAA-synthesewegen in Azospirillum brasilense COOH

NH2

AA

? CH2CHCOOH NH2

N H

Trp CH2CH NOH

CH2CHCOOH

CH2CCOOH

N H

OH

O

IAOx

N H

N H

CH2CH2NH2

CH2CN

IPyA

ILA

N H

N H

CH2CHO

Tra

IAN

N H

CH2CNH2

CHO

IAAld

O N H

N H

CH2CH2OH

IAM

IAld N H

IEt

CH2COOH N H

Indole-3-acetic Acid

Fig. 3.1 : De verschillende IAA biosynthesewegen in Azospirillum brasilense (Prinsen et al. 1997). Tryptofaan is steeds de precursor in de biosynthese. Eén hypothetische syntheseweg echter zou tryptofaan onafhankelijk zijn.(Tra=tryptamine;Trp=tryptofaan;IAM=indol acetamide;IAN=indol acetonitrile;IpyA=indol pyruvaat;IAld=indol aldeyde;IAAld=indol acetaldehyde;ILA=indol lactaat;AA=anthranilaat)

Prinsen et al. (1993) toonden met behulp van de IAA mutant SpM7918 (verlaagde productie en opstapeling van IAM) en transconjugaten die hersteld waren in de IAA productie aan dat er minstens drie biosynthesewegen zijn, namelijk:

1. 2. 3.

de IAM biosyntheseweg een tryptofaan-afhankelijke biosyntheseweg een tryptofaan-onafhankelijke biosyntheseweg

Deze staan in voor respectievelijk 0.1%, 10% en 90% van de IAA productie wanneer geen tryptofaan wordt toegevoegd. Sinds dien is nog het bestaan van een derde tryptofaan-afhankelijke biosyntheseweg (via tryptamine) aangetoond in tryptamine (Van Laer). Het enige geïdentificeerde gen van de IAA biosyntheseweg dat geïdentificeerd werd is het indolpyruvaat decarboxylase gen, gecloneerd uit A. brasilense Sp245 (Costacurta et al. 1994)

15


3.1.2 Meting van de verschillende intermediairen in de IAA biosynthese (§ 2.1) In dit experiment hebben we de IAA productie en de productie van intermediairen in de IAA biosynthese door Azospirillum gemeten. We keken we naar de invloed van wortelexudaten op de bacteriële groei. We groeiden de bacteriën in 6 erlemeyers in MMAB medium waaraan verschillende tryptofaan concentraties werden toegevoegd. We gingen de invloed van verschillende tryptofaan concentraties na op de IAA productie. We bespreken hierna de verschillende biosynthese wegen.

Fig. 3.2 De anthranilaat productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

Fig. 3.3 De tryptofaan concentratie in een cultuur van Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. (1 µg/ml = 5000 pmol/ml) : Het gehalte aan tryptofaan, voorgesteld op een logaritmische schaal, in zes Azospirillum culturen. De inzet laat dezelfde gegevens op een lineaire schaal zien. 16


Fig. 3.4 De Indol azijnzuur productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De inzet laat dezelfde gegevens op een lineaire schaal zien.

Fig. 3.5 De Indol acetonitrile productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

17


Fig. 3.6 De Indol acetamide productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De inzet laat dezelfde gegevens op een lineaire schaal zien.

Fig. 3.7 De Indol acetaldehyde productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

18


Fig. 3.8 De Indol ethanol productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

Fig. 3.9 De tryptamine productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

19


Fig. 3.10 De Indol pyruvaat productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

Fig. 3.11 De Indol aldehyde productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5 20 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur.

20


3.1.3 Bespreking van de verschillende biosynthesewegen Zimmer en Elmrich Azospirillum.

(1991) postuleerden een regulatorisch model voor de IAA synthese in

Anthranilaat inhibeert de omzetting van Trp naar IAA. A. brasilense stelt enkel IAA vrij in aanwezigheid van Trp. In afwezigheid van Trp worden de genen voor de Trp synthese afgeschreven en vertaald en het metabolisme van Trp resulteert in een accumulatie van anthranilaat. Anthranilaat inhibeert de IAA synthese en voorkomt zo een verlies van Trp. In de aanwezigheid van extern tryptofaan wordt de Tryptofaansynthese geblokkeerd en daalt de intracellulaire concentratie van anthranilaat, waardoor de IAA synthese verhoogt.

Fig. A : Regulatorisch model voorgesteld door Zimmer. Dit model is echter nooit ten volle bewezen.

3.1.3.1 Anthranilaat De tryptofaan biosynthese via anthranilaat valt waarschijnlijk stil bij toedienen van grote hoeveelheden tryptofaan. De cultuur waar 0 µg Trp werd toegediend heeft na 30 uur een hoger AA gehalte dan de meeste anderen. Het hoge AA gehalte na 30 uur bij de cultuur met 100µg/ml trp wijt ik aan de afbraak van het Trp, dat waarschijlijk als extra koolstof- of stikstofbron voor andere cycli gebruikt wordt. De piek voor 1 µg/ml na 60 uur is merkwaardig. Deze piek staat waarschijnlijk voor een hoge de novo synthese van Trp en niet voor afbraak. Het tryptofaangehalte ligt voor deze cultuur na 90 uur welliswaar het laagst van allemaal maar, het gehalte van een aantal andere intermediairen (zoals Iet, Tra en IAld) ligt, overeenkomstig de AA concentratie, relatief hoog.

3.1.3.2 Tryptofaan De gemeten concentratie komt in grote lijnen overeen met de hoeveelheid toegediend Trp. Er is een geleidelijke afname, wat overeenkomt met een toename in de IAA concentratie. Het Trp in de cultuur met 0 µg beginconcentratie is vanzelfsprekend aan endogene de novo synthese te wijten.

21


3.1.3.3 Indol acetonitril (IAN) De pieken van indol acetonitrile liggen tegen de detectielimiet in het massaspectrum. Voor de enkele piek in de cultuur van 100 µg/ml Trp na 30 uur heb ik geen verklaring. 3.1.3.4 Indol acetamide (IAM) Het aandeel van de indol acetamide biosyntheseweg bedraagt hier minder dan 10%. Dit wijst er waarschijnlijk op dat IAM niet geaccumuleerd wordt. Het aandeel van de IAM biosyntheseweg is het kleinst bij een Trp concentratie van 1µg/ml, een concentratie die overeenkomt met die van wortelexudaten (§ 3.1.4) 3.1.3.5 Indol acetaldehyde (IAAld) In de cultuur met 5 µg/ml tryptofaan is het indol pyruvaat decarboxylase (-gen) (ipdC) duidelijk geïnhibeerd. Dit enzyme zet indol-3-pyruvaat om tot indol-3-acetaldehyde en indol-3-ethanol.

3.1.3.6 Indol ethanol (IEt) In de cultuur met 5 µg/ml tryptofaan is het indol pyruvaat decarboxylase (-gen) (ipdC) duidelijk geïnhibeerd. Dit enzyme zet indol-3-pyruvaat om tot indol-3-acetaldehyde en indol-3-ethanol (Van Laer 1999). Er is ook hier net zoals bij IAAld een verband met het gehalte aan anthranilaat. Na 60 uur is het exogene tryptofaan in de cultuur met 1 µg/ml sterk gedaald. Dit resulteert in een inductie van de genen voor de Trp synthese en de accumulatie van anthranilaat.

3.1.3.7 Tryptamine (Tra) De pieken zijn min of meer analoog aan de anthranilaat concentratie (vooral na 60 uur) . 3.1.3.8 Indol pyruvaat (IPyA) Tryptofaan wordt blijkbaar vlot omgezet tot indool pyruvaat. Ook hier zien we inhibitie bij een trp concentratie van 5 µg/ml. 3.1.3.9 Indol aldehyde (IAld) Ook hier valt de afwezigheid van het intermediair op bij de 5µg/ml Trp cultuur op. 3.1.3.10 Indool azijnzuur (IAA) De IAA productie stijgt met de concentratie toegevoegd tryptofaan. De relatief hoge IAA productie van de niet gesupplementeerde cultuur wordt veroorzaakt door de inhibitie van een aantal enzymes in de gesupplementeerde culturen tgv het exogene tryptofaan.

22

II. Resultaten en bespreking

3.1.4 De synthesewegen bij natuurlijke tryptofaan concentraties Bij dit experiment werd geen synthetisch tryptofaan toegediend. De bacterieculturen bevatten het Hoagland medium waarin mais planten waren gegroeid gedurende een tiental dagen. Er waren MMAB-zouten, MMAB-fosfaten en malaat toegevoegd tot dezelfde concentratie als bij MMAB medium.

COOH

A A

Fig. 3.12 : De anthranilaat concentratie in een in een Azospirillum cultuur in Hoagland medium met wortelexudaten na 30, 60 en 90 uur

23

NH2

24


3.2 cytokinines 3.2.1 Cytokinine excretie in het medium door Azospirillum Naast auxine werd bij het tryptofaan voedinsexperiment ook het gehalte aan cytokinine bepaald zowel in het medium als in de bacteriën zelf (pellet). Fig 3.13 tot Fig 3.15 stellen het cytokinine gehalte in het supernatans voor.

Fig. 3.13 De Zeatine productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5, 20, 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De voorgestelde waarden zijn gehaltes in het supernatans. Ontbrekende waarden werden niet gemeten.

25


Fig. 3.14 De Indol azijnzuur productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5, 20, 50, en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De voorgestelde waarden zijn gehaltes in het supernatans. Ontbrekende waarden werden niet gemeten.

Fig. 3.15 De totale cytokinine productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5, 20, 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De voorgestelde waarden zijn gehaltes in het supernatans. Ontbrekende waarden werden niet gemeten.

26


3.2.2 Cytokininegehalte van Azospirillum cellen

Fig. 3.16 De totale cytokinine productie door Azospirillum brasilense in MMAB (minimaal medium met malaat) waaraan verschillende concentraties tryptofaan werden toegevoegd (0, 1, 5, 20, 50 en 100 µg/ml) na 30 uur, 60 uur en 90 uur. De voorgestelde waarden zijn gehaltes in de pellet. Ontbrekende waarden werden niet gemeten. ( ZR = zeatine riboside, IPA = isopentenyl adenosine)

Slechts een deel van de stalen werd gemeten. Door gebrek aan meettijd kon het gehalte aan glucosidische cytokinines niet worden gekwantificeerd. Van slechts zeven stalen kon het gehalte aan cytokinine vrije basen en cytokinine-fosfaten worden bepaald. Ook wat de excretie van cytokinine basen en –fosfaten in het medium betreft zijn onze meetgegevens fragmentarisch. Niettemin kunnen we hieruit enkele relevante en tot nu toe weinig gekende gegevens halen met betrekking tot het effect van Azospirillum brasilense op de wortelgroei van planten. Een belangrijk gegeven is de auxine/cytokinine balans. Het maximale cytokininegehalte van een medium bedraagt 65 pmol/ml vrije base cytokinine plus 50 pmol/ml cytokinine-fosfaat, wat samen 115 pmol/ml cytokinine maakt. Glucosidische cytokininen hebben in de plant fysiologisch inactieve opslag-, reserve cytokinines die omgezet worden tot hun actieve (vrije base- of fosfaat-)vorm wanneer daar nood aan is. In ieder geval zijn deze stalen niet verloren en zullen ze gemeten worden wanneer de mogelijkheid zich voordoet.

3.2.3.1 De auxine/cytokinine balans De maximaal gemeten hoeveelheid cytokinines bedraagt 115 pmol/ml na 60 uur. Voor IAA bedraagt dit maximaal 150.000 pmol/ml bij een Trp beginconcentratie van 100 µg/ml en 6000 pmol/ml voor een min of meer ”natuurlijke” tryptofaan beginconcentratie. Daarmee komt de auxine/cytokininebalans in het beste geval op 6000/115 = 52 . De cytokinine concentratie is dus verwaarloosbaar t.o.v. de auxine concentratie. Hoewel Azospirillum brasilense wel degelijk cytokinines produceert, kan mogelijk de invloed van A. brasilense als een IAA effect beschouwd worden.

27


44.. C moottaaxxiiss eenn aassssoocciiaattiiee m woorrtteell Chheem meett ddee ppllaanntteennw Zowel de proef die de chemotaxis – als diegene die de associatie met de plantenwortel zou visualiseren is mislukt. Bij geen van beide was kolonievorming ter hoogte van de wortel waarneembaar. Indien de bacteriën zich naar de wortel toe zouden begeven hebben, hechten zij zich rond de wortel (waarschijnlijk in een dunne laag) zodat geen uitgebreide kolonies te zien zijn (Vande Broek et al. 1998) . Bij een experiment waarbij wortelexudaten in een putje in de agar aangebracht worden en bacteriën op een andere plaats op de agar zou men waarschijnlijk wel kolonies kunnen waarnemen in de richting van het putje in de agar. Omdat de exudaten zouden diffunderen zou misschien zelfs een gradiënt te zien zijn waarbij de grootte van de kolonies toeneemt naar de plaats waar de exudaten zijn aangebracht.

28

A Allggeem meennee C Coonncclluussiiee

Azospirillum is een rhizosfere bacterie die in associatie leeft met de wortels van een groot aantal planten. In tegenstelling met symbiotische plant-bacterie interacties, waar een duidelijk voordeel voor beide partners aangetoond is, spreekt men hier van een associatie. Bij de aanvang van dit onderzoek stelden wij ons de vraag of deze associatie al dan niet symbiotische kenmerken vertoont. Met dit onderzoek beoogden we de volgende doelstellingen : • Welk voordeel haalt een plant uit een associatie met Azospirillum? • In welke mate verhogen wortelexudaatcomponenten de IAA-productie door de bacterie ? • Produceert Azospirillum cytokininen en wat is de de auxine/cytokinine balans ? Haalt de plant enig voordeel uit de associatie tussen Azospirillum brasilense en de gastheer plant ? Uit de inoculatie experimenten blijkt geen duidelijke bevordering van de wortelgroei. Uit de experimenten met maïs waarbij we IAA toedienden blijkt wel een tendens die op groeibevordering wijst. We hebben Azospirillum in een cultuur opgegroeid en hebben een duidelijke IAA productie kunnen vaststellen. Waarom zien we niet dezelfde tendens van groeibevordering wanneer we Azospirillum cellen toevoegen ? We kunnen stellen dat het groeibevorderend effect niet statistisch significant is. Ofwel is er geen bevorderde groei t.g.v. het toedienen van IAA, ofwel speelt de spreiding van onze meetgegevens ons parten in die zin dat er een effect is, maar dat het niet wordt waargenomen door de grote variatie tussen de verschillende replica’s. Het testsysteem zoals het door Leuvense onderzoekers werd gepubliceerd (Van Laer , mondelinge mededeling), blijkt niet te werken. Ook de aangepaste versie, zoals we die uitvoerden met Zea mais laat geen effect van Azospirillum zien. Om met inoculatie experimenten significante resultaten te genereren is een veel grotere populatie binnen een bepaalde behandeling vereist. Het is daarom niet verwonderlijk dat de meeste artikels die groeibevorderende capaciteiten van Azospirillum rapporteren, over veldexperimenten handelen. Welke rol speelt de plant in de IAA productie door de bacteriën ? Daar alle data in de literatuur bekomen werden na een exogene toediening van 100 mg/l exogeen Trp, gingen we na in welke mate exogeen tryptofaan de IAA synthese verhoogt. De concentratie tryptofaan die we terugvonden in de wortelexudaten komt overeen met 1 µg/ml. Deze concentratie geeft bij het experiment waarbij tryptofaan werd toegevoegd een relatief hoge IAA productie na 30 uur ( Resultaten fig. 3.4 ). De IAA productie van de bacteriën die in het medium met wortelexudaat groeiden komt overeen met de IAA productie bij 1µg/ml Trp beginconcentratie. Ik stel me echter vragen bij de invloed van de Hoagland zouten in het medium met de wortelexudaten. De overige nutriënten in het medium moeten toch ook een groeibevorderend effect hebben, getuige het hogere aantal bacteriën in culturen met wortelexudaten. Hieraan hebben we niet gedacht toen we de Trp voedingsexperimenten begonnen. Niettemin hebben we na analyse van wortelexudaten kunnen aantonen dat de plant wel degelijk de bacteriën voorziet van tryptofaan. De endogene Trp synthese wordt geïnhibeerd wanneer exogeen Trp voorhanden is en zelfs een vrij lage exogene Trp concentratie geeft een verhoogde IAA productie. Verder zijn, gezien de Trp concentratie in de exudaten, experimenten waarbij hoge concentraties Trp worden toegediend om biosynthesewegen van IAA in Azospirillum te onderzoeken misschien niet echt relevant is voor wat er in de natuur gebeurt. Bij de experimenten waarbij we de bacteriën in wortelexudaten groeiden hebben we slechts 2 IAA intermediairen kunnen waarnemen namelijk Indol-3-acetamide en indol-3-pyruvaat. De intermediairen IAM en IPyA zijn representatief voor respectievelijk de IAM en IpyA biosynthese pathway. Dit komt overeen met de pathways die reeds eerder voor Azospirillum beschreven werden (Prinsen et al. 1993, Costacurta et al. 1994). Produceert Azospirillum cytokininen ?

Alhoewel een cytokinine productie beschreven werd voor andere plant-geassocieerde bacteria zoals Acinetobacter sp., Agrobacterium sp., Chromobacterium sp., Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Frankia sp. en Rhizobium sp. (voor een samenvatting zie Frankenberger en Arshad 1997) zijn in de literatuur geen gegevens m.b.t. de cytokininen biosynthese door Azospirillum voorhanden. Hoewel de totale hoeveelheid cytokinines die geproduceerd wordt door Azospirillum vrij hoog is in vergelijking met het cytokininegehalte van de wortel (minder dan 10 pmol / gvg in de wortel), speelt in het hormooneffect vooral de balans tussen auxines en cytokinines een rol. In de plantenwortel is deze verhouding ongeveer 10. De auxine/cytokinine verhouding, geproduceerd door Azospirillum brasilense bedraagt minimum 50. Het effect van Azospirillum brasilense is dus overwegend een IAA effect. Om van een werkelijke symbiose te spreken moet ook de bacterie zijn voordeel halen uit de associatie tussen beide partners. Uit de betere groei van de bacteriën die in de wortelexudaten groeiden (groter aantal bacteriën) blijkt dat de planten, nutriënten voor de bacterie ter beschikking stelt. Indien een groot deel van deze nutriënten van afgestorven wortelharen komt, is het voor de bacterie heel nuttig om IAA te produceren. Een bekend IAA effect op de wortels is namelijk de toename in grootte en aantal van de wortelharen. De Azospirillum-plant interactie: een Symbiose? Zeker niet obligaat maar, ik zou zeggen van wel.

V. Referenties

V V.. R Reeffeerreennttiieess Bellone C.H., de Bellone S.C. (1995) Morphogenesis of Strawberry Roots Infected by Azospirillum brasilense and V. A. Micorrhiza Azospirillum VI and Related Microorganisms Springer-Verlag Berlin Heidelberg Bennett M.J. , Marchant A. , Green H. G. ,May S. T. , Ward S.p. ,Millner P. A. ,Walker A. r. (1996) Arabidopsis AUX 1 Gene : A Permease-like Regulator of root gravitropism SCIENCE 273 :948-950 Costacurta A., Keijers V., Vanderleyden J. (1994) Molecular clonig and sequencing analysis of an Azospirillum brasilens indole-3-pyruvate decarboxylase gene Mol. Gen. Genet. 243 :463-472 Davies P. (1995) Plant Hormones Kluwer Fogher C. , Delledone M. , Frigerio L. (1995) Inoculation of genetically mlodified stains of Azospirillum : monitoring of population dynamic. Azospirillum VI and Related Microorganisms Springer-Verlag Berlin Heidelberg Frankenberger W.T. JR., Arshad M (1995) Phytohormones in soils Dekker Inc. New York Galston Arthur W.(1995) Levensprocessen van planten Natuur en Techniek. Heinrich D. , Hess D. (1985) Chemotactic attraction of Azospirillum lipoferum by wheat roots and characterisation of some attractants. Can. J. Microbiol. 31 : 26-31 Keijers Veerle, Sofie Dobbelare, My Ali Bekri, Jos Vanderleyden (1995) Biodegradation of polysacharides by Azospirillum. Azospirillum VI and Related Microorganisms Springer-Verlag Berlin Heidelberg Prinsen E. (1993) Phytohormones in plant bacterium interactions Doctoraats thesis (Antwerpen UIA) Prinsen E., Costacurta A., Michiels K., Vanderleyden J., Van Onkelen H., (1993) Azospirillum brasilense indole-3-acetic acid biosynthesis : evidence for a non-tryptophan dependent pathway Molecular Plant-Microbe interactions 6,5 :609-615 Prinsen E.,Van Dongen W., Esmans E., Van Onkelen H. (1997) HPLC linked electrospray tandem mass spectrometry : a rapid and reliable method to analyse indole-3-acetic acid metabolism in bacteria.

1

Journal of Mass Spectrometry 32 :12-22 Prinsen E.,Van Dongen W., Esmans E., Van Onkelen H. (1998) Micro and capillary liquid Chromatography -tandem mass spectrometry : a new dimension in Phytohormone research. Journal of Chromatography 826 :25-37 V. Referenties

Reingold B., Hurek T., Fendrik I. (1985) Strain specific chemotaxis of Azospirillum ssp. J.Bacteriol. 162 : 190-195 Schlenk, H en Gellerman, J.L. (1960) Esterification of fatty acids on a small scale. Anal. Chem. 32 : 1412-1414. Tian Q. , Reed J.W. (1999) Control of auxin-regulated root development by the Arabidopsis thaliana SHY/IAA3 gene Development 126 :711-721 Tortora G. J. , Funke B R. , Case C. L. (1995) Microbiology An Introduction The Benjamin /Cummings publishing company Vande Broek A., Lambrecht M., Vanderleyden J. (1998) PLANT-MICROBE INTERACTIONS: Bacterial chemotactic motility is important for the initiation of wheat root colonization by Azospirillum brasilense Microbiology 144:9, 2599-2606 Van den Berg, C., Weisbeek, P., and Scheres, B. (1998) Cell fate in the Arabidopsis root. Planta 205, 483-491. Van Laer Stijn (1999) Auxine Metabolisme in Azospirillum sp. Doctoraatsaanvraag Zakharova E., Shcherbakov A., Brudnik V., Skripko N., Bulkhin N., Ignatov V., (1999) Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense : insights from quantum chemistry Eur. J. Biochem. 259 :572-576 Zimmer W., Elmrich C. (1991) Regulation of the synthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum Advances in molecular gennetics of Plant-Microbe Interactions (Hennecke H., Verma £D.) Kluwer Academic Publshers Dordrecht, Boston p 465-468 Zimmer W., Wesche M., Timmermans L. (1998) Identification and isolation of the Indol-3-Pyruvate Decarboxylase Gene from Azospirillum brasilense Sp7 : Sequencing and functional anaysis of the gene locus Current Microbiology 36 : 327-331

2

3

A Affkkoorrttiinnggeenn

AA AB CFU DNA DPTA EtOH HPLC IAA IAM IAN IAld IAAld IpdC IPyA IPA IP LC-MS MeOH MMAB PBS SDS Trp Tra

anthranilaat Azospirillum brasilense colony forming unit desoxy ribose nucleïnezuur Chelator ethanol high pressure liquid chromatography Indol-3-azijnzuur Indol-3-acetamide Indol-3-acetonitrile Indol-3-aldehyde Indol-3-acetaldehyde Indol pyruvaat decarboxylase Indol-3-azijnzuur Isopentenyl adenosine Isopentenyl liquid chromatogrphy-mass spectrometry methanol minimaal medium (Azospirillum brasilense) buffervloeistof natrium dodecyl sulfaat (een detergent) tryptofaan tryptamine

Z ZR

zeatine zeatine riboside

Samenvatting Dankwoord

Recommend Documents