MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Role extracelulárního argininu v regulaci produkce oxidu dusnatého u endoteliálních buněk
Bakalářská práce
Adolf Koudelka
Vedoucí práce: Mgr. Michaela Pekarová, Ph.D.
Bibliografický záznam
Autor:
Adolf Koudelka Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Role extracelulárního argininu v regulaci produkce oxidu dusnatého u endoteliálních buněk
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Michaela Pekarová, Ph.D.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
49
Klíčová slova:
L-arginin, endoteliální buňky, oxid dusnatý, endoteliální syntáza oxidu dusnatého, asymetrický dimethylarginin
A
Stránka 2
Bibliographic Entry
Author:
Adolf Koudelka Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
The role of extracellular arginine in the regulation of nitric oxide production in endothelial cells
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Michaela Pekarová, Ph.D.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
49
Keyword:
L-arginine, endothelial cells, nitric oxide, endothelial nitric oxide synthase, asymmetric dimethylarginine
A Stránka 3
Abstrakt
A
Tato bakalářská práce byla věnována sledování vlivu aminokyseliny L-argininu (substrátu pro syntézu oxidu dusnatého) a asymetrického dymethylargininu (inhibitoru produkce oxidu dusnatého) na produkci oxidu dusnatého, dále na expresi a aktivaci proteinů důležitých v regulaci intracelulárních signálních drah vedoucích k produkci oxidu dusnatého u endoteliálních buněk. Práce byla zaměřena zejména na optimalizaci aktivace lidských umbilikálních žilních endoteliálních buněk, stanovení produkce oxidu dusnatého pomocí Griessovy kolorimetrické metody a sledování exprese proteinů pomocí metody Western blot.
Abstract In this thesis we has been devoted to monitoring the effect of the amino acid L-arginine (the substrate for nitric oxide synthesis) and asymmetric dymethylarginine (an inhibitor of nitric oxide) for the production of nitric oxide and also for the expression and activation of proteins which are important for the regulation of intracellular signaling pathways leading to the production of nitric oxide in endothelial cells. The work has been mainly focused on optimizing the activation of human umbilical vein endothelial cells, the defining of nitric oxide production by Griess colorimetric method and the monitoring of protein expression by using the Western blot method.
A
Stránka 4
A
Stránka 5
Poděkování Na tomto místě bych rád poděkoval Mgr. Michaele Pekarové Ph.D. za nedocenitelnou odbornou pomoc, poskytnutí literatury a informací, pomoc v laboratoři, a podporu při vypracovávání mé bakalářské práce.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 14. května 2012
……………………………… Jméno Příjmení
A
Stránka 6
Obsah 1.
Úvod ............................................................................................................................... 9
2.
Kardiovaskulární systém .............................................................................................. 10 Cévy .......................................................................................................................... 12
2.2. 2.2.1.
Tepny (arterie) ....................................................................................................... 13
2.2.2.
Žíly (vény) ............................................................................................................. 13
2.2.3.
Kapiláry ................................................................................................................. 14
3.
Endoteliální buňky ....................................................................................................... 15
3.1.
Fyziologické funkce u endoteliálních buněk ............................................................ 15
3.2.
Fyziologie působení NO u endoteliálních buněk ...................................................... 16
3.3.
Endoteliální NO-synthasa (eNOS) a signální dráhy spojené s její aktivací .............. 18
3.4.
L-arginin jako substrát pro NO syntézu .................................................................... 19
3.5.
Endogenní a syntetické inhibitory NOS ................................................................... 20
4.
Endoteliální dysfunkce ................................................................................................. 23 Role L-argininu a ADMA u endoteliální dysfunkce ................................................. 24
4.1. 5.
Cíle práce...................................................................................................................... 25
6.
Materiál ........................................................................................................................ 26
6.1.
Chemikálie ................................................................................................................ 26
6.2.
Biologický materiál ................................................................................................... 27
6.2.1.
Seznam použitých přístrojů....................................................................................... 28
6.3. 7.
Ovlivnění HUVEC L-argininem, ADMA a acetylcholinem ................................. 27
Metody ......................................................................................................................... 29
7.1. 7.1.1. 7.2.
Stanovení koncentrace nitritů Griessovou metodou ................................................. 29 Postup měření koncentrace nitritů/nitrátů .............................................................. 29 Stanovení koncentrace proteinů a příprava vzorků pro Western blot ....................... 29
7.2.1.
Příprava vzorků pro stanovení koncentrace proteinů ............................................ 29
7.2.2.
Postup měření koncentrace proteinů ...................................................................... 29
7.2.3.
Pufry použité při SDS PAGE a Western blot ........................................................ 30
7.3.
Stanovení exprese proteinů pomocí elektroforézy SDS PAGE a Western blot ........ 31
7.3.1.
Příprava gelů na elektroforézu ............................................................................... 31
7.3.2.
SDS PAGE............................................................................................................. 31 Stránka 7
7.3.3. 7.4. 8.
Western Blot .......................................................................................................... 31 Grafické zobrazení dat .............................................................................................. 32
Výsledky....................................................................................................................... 33
8.1.
Vliv L-argininu a ADMA na produkci NO u HUVEC ............................................. 33
8.2.
Vliv L-argininu a ADMA na koncentraci proteinů u HUVEC ................................. 34
8.3.
Vliv L-argininu a ADMA na expresi a aktivaci eNOS a ERK u HUVEC ............... 34
9.
Diskuze ......................................................................................................................... 38
10.
Závěr .......................................................................................................................... 40
11.
Seznam zkratek .......................................................................................................... 41
12.
Seznam použité literatury .......................................................................................... 43
13.
Internetové zdroje ...................................................................................................... 49
Stránka 8
1. Úvod Endoteliální buňky hrají důležitou roli v regulaci krevního tlaku, jelikož v cévách regulují průtok krve. Přestože je známo mnoho mediátorů, jenž tento proces ovlivňují, bezesporu nejdůležitějším je oxid dusnatý. Ten je v endotelu produkován syntázami oxidu dusnatého. Oxid dusnatý reguluje proliferaci vaskulární hladké svaloviny a inhibuje interakci krevních elementů se stěnami cév. Při narušení jeho produkce dochází ke vzniku endoteliální dysfunkce, která je spojována se vznikem mnoha velmi závažných onemocnění, jako je ateroskleróza, diabetes a srdeční selhání. Aminokyselina L-arginin je jediným známým substrátem pro tvorbu oxidu dusnatého, má tedy význačné postavení v procesu vzniku endoteliální dysfunkce. Klinické studie již dříve prokázaly, že L-arginin je významně zapojen do regulace kardiovaskulárního a imunitního systému. I přesto jsou molekulární mechanizmy zapojené do regulace endoteliálních buněk Largininem dosud neobjasněny.
Stránka 9
2. Kardiovaskulární systém Kardiovaskulární systém, neboli oběhová soustava, je soustava orgánů, jenž zajišťuje transport živin, hormonů a plynů do tkání a také transport odpadních látek z tkání. Všichni obratlovci, včetně člověka, mají uzavřenou oběhovou soustavu, kde transport látek zajišťuje krev. Oběhový systém se skládá z velkého (systémového, periferního) a malého (centrálního, plicního) krevního oběhu. Velký krevní oběh poháněný levou srdeční komorou je složen z řady paralelně zapojených okruhů. Ty vyživují jednotlivé orgány jako jsou srdce, ledviny, mozek, svalstvo, žaludek a střeva. Malý krevní oběh je poháněn pravou srdeční komorou, z níž se krev dostává do plic, kde dochází k jejímu okysličení (Vácha a spol., 2008). Kardiovaskulární systém lze rozdělit na dva podsystémy: krevní a lymfatický oběhový systém. Zatímco krevní podsystém má za úkol přečerpávat a dopravovat krev, živiny, kyslík a produkty metabolizmu do tkání a z tkání, funkce lymfatického podsystému spočívá v navrácení tkáňového moku, vyplňujícího tkáňové prostory, do krve. Funkce těchto podsystémů přispívá, spolu se systémem nervovým, k integrované funkci celého organizmu (Junqueira a spol., 1999). Oběhová soustava savců se skládá z následujících součástí:
srdce, jehož hlavní funkcí je přečerpávat krev,
tepny (arterie), které se s větvením neustále zmenšují a mají za úkol dopravovat krev, živiny (cukry, tuky, bílkoviny) a kyslík do tkání,
vény (žíly) do kterých se sbíhají kapiláry, vytváří systém stále větších trubic, které odvádějí produkty metabolizmu, jako jsou CO2, močovina apod. do srdce a do dalších zpracovatelských orgánů,
vlásečnice (kapiláry) - mnohovrstevnaté rozvětvené sítě tenkých trubiček, které spolu vydatně anastomozují (tvoří funkční spojení) a jejichž prostřednictvím dochází k výměně látek mezi tkáněmi a krví.
Z výše uvedeného je patrné, že žíly většinou vedou krev odkysličenou a tepny většinou krev okysličenou (výjimkou jsou přívodné a odvodné cévy plic). Tento jednoduchý oběh je komplikován orgány (např. játra, slinivka břišní), přes které se krev vrací do srdce a v nichž se cévy štěpí do drobných větviček a opět spojují do centrálního řečiště; vytváří se tak vrátnicový oběh (Roček online) (Obr. č.1).
Stránka 10
Obrázek č.1: Funkční organizace kardiovaskulárního/cévního systému. (Upraveno dle URL 1).
2.1. Srdce Srdce je dutý fibriomuskulární orgán, který je umístěn ve vazivovém vaku – osrdečníku (perikardu) (Eliška a Elišková, 1995). Srdce funguje jako pumpa, která pod určitým tlakem vhání krev do oběhového systému, jejíž vnitřní prostor je členěn systémem záklopek do menších komor (Roček online). Stěna srdce je tvořena třemi tunikami. Vnitřní vrstva (endokard) se skládá z jedné vrstvy plochých endoteliálních buněk a tenké subendotelové vrstvy řídkého vaziva, které obsahuje jak buňky elastické a kolagenní, tak i malé množství buněk hladkého svalstva. Střední vrstva (myokard) je složena z buněk svaloviny srdeční a je nejsilnější vrstvou stěny srdeční. Srdeční svalovina je zde uspořádána do vrstev obkružujících komory srdeční ve spirálách. Buňky tohoto svalstva jsou složeny z kontaktních elementů a z buněk generujících vzruchy a převádějících elektrické signály vyvolávající puls srdce. Vnější vrstva (epikard) je pokryv srdce, vytvářený viscerálním (útrobním) listem perikardu. Zevní vrstva krytu je tvořena jednovrstevným plochým epitelem (mezotelem), pod nímž je tenká vrstva vaziva. Subepikardová vrstva je tvořena řídkým vazivem, obsahujícím vény, nervy a nervová ganglia. Tuková tkáň obalující srdce je uložena právě v této vrstvě (Junqueira a spol., 1999).
Stránka 11
2.2. Cévy Cévy představují uzavřenou soustavu pružných trubic různého průsvitu, kterými je rozváděna krev do celého těla. Dělíme je na tepny (arterie), žíly (veny) a vlásečnice (kapiláry) (Prachařová 2006). Z anatomického pohledu rozlišujeme ve stěnách cév tři vrstvy, jejichž zastoupení a mocnost se liší podle typu cévy (Vácha a spol., 2008). Rozvoj jednotlivých struktur cévní stěny je pak dán funkčními faktory, které jsou pro jednotlivé úseky cévního řečiště odlišné (Prachařová, 2006). Vrstvy cévní stěny:
Vnější stěna (tunica externa) je tvořena vnější membránou a tunica adventicia. Adventicia je vrstva vaziva tvořená sítí elastických a kolagenních vláken. Ty mají význam pro mechanické vlastnosti cévní stěny a také na to, aby byla cévní stěna pružně zakotvena ve svém okolí (Trojan a spol., 2003).
Střední vrstva (tunica media) je tvořena z většiny hladkou svalovinou. Změnou napnutí této hladké svaloviny se mění průsvit cévy (vazokonstrikce a vazodilatace) (Trojan a spol., 2003).
Vnitřní vrstva (tunica intima) je tvořena hladkou vrstvou endotelových buněk, které jsou vystavené přímému styku s proudem krve. Hladký endotel působí antitromboticky a umožňuje hladké a nerušené proudění krve. Nad vrstvou endotelu je subendotelové vazivo, zabraňující odtržení vnitřní vrstvy vlivem proudění krve (Horký a Čech, 1999).
A
B
Obrázek č. 2: Struktura cévy. (A) Obrázek porovnávající stavbu svalové arterie (nahoře) a doprovázející vény (dole). Za povšimnutí stojí rozdíl v tloušťce tunika media a intima (převzato z Junqueira a spol. 1999). (B) Schematické znázornění jednotlivých vrstev cévy (upraveno podle Lippincott Williams & Wilkins, 2011).
Stránka 12
2.2.1. Tepny (arterie) Tepny přivádí krev do tkání, odolávají rytmickým změnám krevního tlaku, vyrovnávají pulzy srdce a tím se výrazně podílí na regulaci průtoku krve oběhovým systémem. Dělí se dle velikosti na velké arterie elastického typu, svalové arterie středního či velkého kalibru a arterioly. Stěny velkých arterií (zejména aorty a její hlavních větví) jsou silnější než stěny žil stejného typu a bývají také označovány jako tepny vývodné (jejich hlavním úkolem je transportovat krev směrem od srdce k dalším orgánům). Tyto cévy, jenž obsahují velké množství elastinu, mají na starosti zejména tlumit nárazové rozdíly vznikající činností srdce. Zároveň je jejich intima vystlána endotelovými buňkami, které mají klíčovou roli v regulaci jejich fyziologických funkcí. Vazivová vlákna silně vyvinuté subendotelové vrstvy mají podélnou orientaci a jsou důležité při deformaci endotelu během rytmických kontrakcí a dilatací tepen (Junqueira a spol., 1999). Distribuční arterie, neboli arterie středního kalibru, mají za úkol rozvádět krev do jednotlivých orgánů. Jejich svalová vrstva jim umožňuje kontrolu nad krevním zásobením jednotlivých orgánů za pomoci relaxace nebo kontrakce (v důsledku hlavních nervových impulzů, nebo lokálních chemických impulzů) (Junqueira a spol., 1999; Trojan a spol., 2003). Nejmenší tepny, tedy arterioly, mají nízký průsvit a průměr menší než 0,5 mm. Jejich lumen je vystlán endotelovými buňkami podobnými endoteliím souvislých kapilár, které se významným způsobem podílí na regulaci koagulačních mechanismů. Subendotelová vrstva je jen velmi tenká a vnitřní elastická blanka až na velké arterioly chybí (Junqueira a spol., 1999; Horký a Čech, 1999).
2.2.2. Žíly (vény) Žíly přivádí krev z tkání do srdce za účasti hladkého svalstva a speciálních chlopní. O vénách lze také uvažovat jako o zásobárně krve, nachází se v nich totiž až 70% celkového objemu krve. Stejně jako arterie i žíly se dělí podle průměru na venuly, vény malého, středního a velkého průměru (Junqueira a spol., 1999). Velké vény tvoří dobře vyvinuta intima a tunica media je mnohem tenčí s jen několika málo vrstvami hladkých svalových buněk a hojností vaziva. V žilách je nejsilnější a také nejlépe vyvinutá adventicia. U dutých a plicních žil dokonce obsahuje v krátké vzdálenosti od jejich vyústění do síní i svalovinu srdeční. Ve vénách ležících pod úrovní srdce (břišní žíly a podobně) obsahuje podélné svazky hladké svaloviny. Toto adventiciální svalstvo zabraňuje roztažení cévy tím, že zesílí její stěnu. Podélné a cirkulární uspořádání hladkého svalstva v těchto žilách umožňuje, navzdory gravitaci, peristalticky čerpat krev směrem k srdci (Horký a Čech, 1999).
Stránka 13
Až na hlavní kmeny má většina vén malý a střední kalibr, tj. 1 až 9 mm. Intima je u tohoto typu vén většinou opatřena tenkou subendotelovou vrstvou, někdy tato vrstva může chybět úplně. Media je sestavená z malých svazků hladké svaloviny, jež jsou tvořeny buňkami smíšenými s retikulárními vlákny jemnou síťovinou elastických vláken. Kolagenní vrstva adventicie je zde dobře vyvinuta (Junqueira a spol., 1999). Malé a velké vény jsou na rozdíl od arterií opatřeny chlopněmi. Tyto chlopně jsou sestaveny ze dvou záhybů tunica intima, čnějících do lumenu. Obsahují elastické vazivo a jsou po obou stranách kryty endotelem. Tyto chlopně se hojně vyskytují především v žilách končetin. Mají za úkol usměrňovat krev směrem k srdci. Hnací sílou pro tento pohyb krve jsou nejen stahy srdce, ale i stahy kosterního svalstva (Junqueira a spol., 1999; Vácha a spol. 2008). Na rozdíl od žil malého, středního a velkého průměru, se průměr venul pohybuje mezi 0,1 1 mm. Jejich intima je složena z endotelu, tenké vrstvy tunica media, neobsahující žádnou, nebo jen velmi málo vrstev hladké svaloviny. Adventicia je zde, na rozdíl od arterií, nejsilnější a je tvořena vazivem s velkým obsahem kolagenu. Venuly s průsvitem do 50 μm mají jak stavbu, tak ostatní biologické rysy kapilár. Z tohoto důvodu hrají důležitou roli v zánětlivých procesech a ve vzájemné výměně metabolitů mezi tkáněmi a krví (Junqueira a spol. 1999; Trojan a spol., 2003).
2.2.3. Kapiláry Vlásečnice (kapiláry) se skládají z jedné vrstvy endotelových buněk (Vácha a spol., 2008). Zevní povrch kapilár je zpravidla lemován bazální laminou, která je produktem endotelu (Junqueira a spol. 1999). Mají menší průměr než arterioly, ale jejich celkový sumární průřez je tak velký, že se na periferním odporu tolik jako arterioly nepodílejí. Jsou styčnou plochou mezi krví a tkáněmi. Na této úrovni probíhá přesun látek z krve do mezibuněčné – intersticiální tekutiny a naopak. Průtok krve je v nich již naprosto plynulý, bez nárazů, což je pro výměnu ideální. Ze sítě vlásečnic je krev vedena do venul, ty se spojují ve větší žíly a dále zpět k srdci (Vácha a spol. 2008). Jejich průměr se pohybuje mezi 7 a 9 μm a délka mezi 0,25 až 1 mm. Celková délka kapilár v lidském organismu byla odhadnuta asi na 96000 km. (Junqueira a spol. 1999) Krev v kapilárách proudí rychlostí asi 0,5 mm/sec. Na odstupu kapilár z arteriol jsou tzv. prekapilární svěrače, což jsou svalová vlákna, která stažením uzavřou vstup krve do kapilár. Ačkoli jsou kapiláry nepatrných rozměrů, jejich celkový průřez je asi 500 - 700 krát větší, než průřez srdečnice, největší tepny v lidském těle. (URL 2).
Stránka 14
3. Endoteliální buňky V minulosti byl endotel považován za inertní vrstvu, u které se předpokládalo, že má pouze nereaktivní bariérové vlastnosti. Dnes je ale jasné, že endotelové buňky se aktivně podílí na regulaci celkové homeostázy v organizmu.
3.1. Fyziologické funkce u endoteliálních buněk Endotel je totiž tvořený endoteliálními buňkami, které jsou součástí rozsáhlého a aktivního endokrinního orgánu, který udržuje homeostázi vnitřního prostoru cév a zabezpečuje neporušený tok krve (Karásek a kol., 2004). Jeho hlavní funkcí je regulace průsvitu tepny dle závislosti na aktuálních nárocích vyživovaných tkání na dodávku kyslíku, živin a odplavení vznikajícího oxidu uhličitého a dalších metabolitů. Například při intenzivní fyzické práci dojde k několikanásobnému zvýšení průtoku krve kosterní svalovinou, přičemž dochází ke zvýšení rychlosti toku krve. To vede k vazodilataci (rozšíření cévy), která je zprostředkována cévním endotelem. Endotel následně začne produkovat různé vazodilatační působky (Horký a Čech, 1999; Karásek a kol., 2004). V tabulce č. 1 jsou uvedeny hlavní vazodilatační a vazokonstrikční mediátory cév. Tab. č. 1. Mediátory vazodilatace a vazokonstrikce u cév.
Endoteliální buňky se mohou nacházet ve třech funkčně odlišných stavech - jako klidové (málo
aktivní
až
neaktivní),
komprimované
(„předaktivované“)
a
aktivované.
Neporušené a klidové (inaktivované) endotelové buňky nedovolují cirkulujícím leukocytům pevnější adhezi na svůj povrch (Hořejší a Bartůňková, 2005). Tato adheze je jednou z nejzákladnějších podmínek ke spuštění zánětlivé reakce v okolní tkáni, ať už za obranným nebo poškozujícím účelem. Endogenní zánětlivé mediátory a exogenní produkty mikroorganismů či jiných replikujících se agens tak mohou aktivovat cirkulující leukocyty a endoteliální buňky a tím zesílit adhezivní interakce mezi nimi. Jejich výsledkem je extravazace (únik tekutiny mimo cévní řečiště do okolní tkáně), čili přestup leukocytů do místa zánětu. Tento děj má zásadní význam pro obranu hostitele proti pronikajícím patogenům a také pro opravu tkáňového poškození, na druhou stranu může přispět k patogenezi různých zánětlivých, hypersenzitivních a autoimunitních stavů Stránka 15
(Hořejší a Bartůňková, 2005, Štvrtinová a kol., 1998). Kromě toho se endoteliální buňky mohou podílet na koagulačních a také trombotických procesech (Leiper a kol., 2007). Dalším důležitým faktem je, že řada z výše uvedených schopností endoteliálních buněk regulovat cévní a imunitní homeostázi je přímo nebo nepřímo spojena s endotelem zprostředkovanou produkcí oxidu dusnatého (NO) (Anaesth, 2004; Malík a Šimek, 2003), kterého metabolizmu a fyziologickému působení na endoteliální buňky bude věnována následující kapitola.
3.2. Fyziologie působení NO u endoteliálních buněk NO je plynný lipofilní volný radikál, který reaguje s různými molekulami a má mnoho druhů účinku (Dobutovic a spol., 2011). NO je radikál a ve své valenční sféře obsahuje 11 elektronů, z nichž jeden je volný, díky němu je molekula velmi reaktivních a její biologický poločas je 4 sekundy (Murray a spol., 2002). Za přítomnosti kyslíku oxiduje na NO2. NO je rozpustný ve vodě i lipidech, díky čemuž se snadno dostává skrz cytoplazmatické membrány (Hořejší a Bartůňková, 2005), kde může ovlivňovat řadu biosyntetických, metabolických a signalizačních procesů (Dobutovic a spol., 2011). NO vzniká z guanidinové skupiny přítomné na molekule L-argininu, přičemž je tato reakce katalyzována syntázou oxidu dusnatého (NOS, z angl. Nitric oxide synthase) (Obr.č.3) (Andrew a Mayer, 1999).
Obr. č. 3: Tvorba NO. Reakční schéma oxidace L-argininu na meziprodukt Hydroxy-L-arginin a následná oxidace na L-citrulin a NO (upraveno dle Andrew a Mayer, 1999).
Většina buněk lidského i zvířecího organizmu je schopna si NO sama syntetizovat (Krejčová, 2005). Důležitým zdrojem NO jsou právě vaskulární endoteliální buňky, které ho za fyziologických podmínek produkují v relativně nízkých koncentracích (řádově pM). Takto vzniknuvší NO působí spíše jako faktor regulující vasodilataci cév zprostředkovanou aktivací enzymu guanylátcyklázy a navyšováním koncentrace cyklického guanozín-3’,5‘-monofosfátu (cGMP) v buňkách hladké svaloviny cév (Ledvina a spol., 2006). Navíc, NO produkovaný endoteliálními buňkami inhibuje agregaci krevních destiček a přilnavost leukocytů na povrch cév (Obr.č.4) (Wallis, 2005). Na rozdíl od toho při aktivaci imunitních buněk (zejména pak Stránka 16
profesionálních fagocytů) je NO produkován ve vysokých koncentracích (řádově μM) a účastní se protizánětlivých, antivirálních, antibakteriálních a antioxidačních procesů (Gallová, 2001).
Obr.č.4: Základní fyziologické funkce endoteliálních buněk jsou zprostředkované působením NO. Endoteliální buňky uvnitř cév reagují na fyziologické podněty, to vede ke změnám produkce NO. Navýšením produkce NO se endoteliální buňky podílí na relaxaci hladké svaloviny, inhibici agregace destiček a adheze monocytů (FAD: flavinadenindinukleotid, FMN: flavin mononukleotid, BH4: tetrahydrobiopterin, GTP: guanozín-5'-trifosfát, camp: cyklický guanozin-3’, 5‘-monofosfát) (upraveno dle Vrablík a spol., 2011).
Spouštění produkce NO je závislé na působení různých vazodilatačních mediátorů (acetylcholinu, bradykininu aj.), ty navozují relaxaci hladké svaloviny cévních stěn. Tyto mediátory na hladkou svalovinu nepůsobí přímo. V prvním kroku tvorby NO dochází k jejich interakci s vaskulárními endoteliálními buňkami prostřednictvím specifických receptorů. Tyto receptory jsou spojeny s fosfatidylinositolovým cyklem, ten uvolní Ca2+ ionty, což má za následek aktivaci eNOS a tím pádem navýšení produkce NO. Ten poté difunduje do hladké svaloviny v tunica media arteriol a aktivuje cytosolovou guanylát-cyklázu. Guanylát-cykláza zvýší nitrobuněčnou hladinu cyklického GMP (cGMP). Působením cGMP dochází k aktivaci proteinkináz, které následnou fosforylací specifické svalové bílkoviny způsobují relaxaci hladké svaloviny. Tím, že cAMP zvyšuje koncentraci NO, působí jako inhibitor agregace a adhese krevních destiček (Murray a spol., 2002). Jak již bylo zmíněno výše NO je produkován enzymy NOS. Doposud byly popsány jejich tři izoformy: endoteliální (eNOS), neuronová (nNOS) a inducibilní (iNOS) (Kashiwagi a spol. 2002, Wallis, 2005). eNOS a nNOS jsou také označovány jako konstruktivní NOS (cNOS) (Wallis, 2005) a jejich aktivace je přímo spojena se zvýšením intracelulární koncentrace Ca2+ iontů. Na rozdíl od toho iNOS je tzv. „indukovatelnou“ formou NOS (vyskytující se u profesionálních Stránka 17
fagocytů), která je sice nezávislá na změně koncentrace Ca2+, ale její exprese musí být nejprve indukována působením specifických aktivátorů imunitních buněk (Sethi a Dikshit, 2000; Ledvina a spol., 2006). Všechny NOS jsou stereospecifické (substrátem může být pouze
L-arginin) a
vyžadují pro svou správnou funkci přítomnost několika kofaktorů znázorněných na obr. č. 5. (Murray a spol., 2002; Dostál a spol., 2004).
Obr.č. 5: Schéma struktury NO-synthasy. Enzym funguje jako dimer, každá z podjednotek je složena z reduktázy a oxygenázy. Na obrázku jsou patrné kofaktory (calmodulin: CaM, flavin adenine dinucleotide FAD, flavin mononukleotid: FMN, tetrahydrobiopterin: BH4) a substrát (L-arginin, Arg), ty jsou nezbytné pro jeho správnou funkci (upraveno podle Andrew a Mayer, 1999).
3.3. Endoteliální NO-synthasa (eNOS) a signální dráhy spojené s její aktivací Jak již bylo uvedeno výše, aktivace eNOS je spouštěná změnou intracelulární koncentrace Ca2+ , kdy dochází k jeho interakci s calmodulinem a poté k aktivaci samotné eNOS. Zajímavé je, že eNOS se sdružuje do struktury známé jako caveolae (jenž tvoří vchlípení plazmatické membrány na povrchu endoteliálních buněk) a je zde asociována s proteiny zvanými caveoliny. Zdá se, že právě lokalizace eNOS do caveolae je účelně propojena s procesem její efektivní aktivace, protože uvnitř caveolae dochází taktéž ke shlukování receptorů potřebných pro aktivaci eNOS (receptory pro acetylcholin, bradykinin a pod.) a také například transportéry (CAT, z angl. Cationic amino acid transportér) určené pro přenos L-argininu (substrátu pro NO produkci) dovnitř buněk (Fleming a Busse, 1999). K aktivaci eNOS dochází pod vlivem různých faktorů, z níž asi nejdůležitější z hlediska regulace fyziologických funkcí endotelu je působení napětí (tzv. „shear stress“) na rozhraní endoteliální buňky a krve. K dalším aktivátorům patří například bradykinin, histamin, acetylcholin a serotonin (Fleming a Busse, 1999; Wallis, 2005). NO, jenž je produkován prostřednictvím eNOS, je uvolňován buď směrem od lumenu cévy, kde působí na uvolnění vaskulárního hladkého svalstva tím, že zvýší hladinu cyklicného GMP (cGMP) a tím pádem aktivací cGMP-kinázy v hladké svalovině, nebo směrem do lumenu cévy, kde inhibuje agregaci krevních destiček a přilnavost leukocytů k cévní stěně (Li a Forstermann, 2000). Existuje také celá řada intracelulárních drah vedoucích k aktivaci eNOS, z níž se zdá klíčová aktivace extracelulárními signálmi regulované protein kinázy (ERK), která patří do rodiny Stránka 18
mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), kam dále patří c-Jun N-terminální kináza (JNK) a p38 MAPK (Yoshizumi a spol., 2003). ERK jsou aktivovány růstovými faktory, phorbolovými estery
a
ligandy
pro
receptory
připojené
k
heterometrického
G-proteinu,
cytokiny,
transformovanými růstovými faktory, osmotickými ale i jinými buněčnými stresory a také depolymerizací mikrotubulů. Aktivace ERK 1/2 se podílí na mnoha buněčných pochodech, jako řízení buněčné mobility, proliferace, dělení, přežití, propustnosti membrán a také mají pravděpodobně důležitou roli při zprostředkování protizánětlivých podnětů (Raman a spol., 2007; Talaibek a spol., 2003).
Obr.č. 6: Schématické znázornění role MAPK v aktivaci endoteliálních buněk. Smykové napětí („Shear stress“) působící uvnitř cév a napomáhající její ochraně, vede k aktivaci ERK. Hlavním efektem působení napětí je produkce NO, jenž silně potlačuje adhezi molekul (jako jsou E-selektin, VCAM-1, MCP1) (Hoefen a Berg, 2001; Ruan a spol., 2010). Následuje zvýšení fosforylací eNOS a produkce NO, jenž působí například proti vzniku aterosklerózy (Ruan a spol., 2010). Na druhou stranu JNK a p38 (jejíž aktivace je sprostředkovaná působením zánětlivých mediátorů – IL-1, TNF) mají inhibiční efekt na ERK a tedy i na produkci NO prostřednictvím eNOS (Hoefen a Berg, 2001). Upraveno dle Andrew a Mayer, 1999.
3.4. L-arginin jako substrát pro NO syntézu L-arginin je nejbazičtější aminokyselina, ve své struktuře obsahuje guanidinovou skupinu (obr. č. 6). V kapitole 3.3.1. bylo již zmíněno, že je jediným známým substrátem pro tvorbu NO, a proto hraje nezastupitelnou roli v regulaci fyziologických procesů probíhajících v endotelu (Wu a Morris, 1998). Pro člověka je esenciální pouze v období růstu, u savců je syntetizován metabolickou dráhou z prolinu, glutaminu či glutamátu. V rostlinách se nachází ve větším množství, jelikož jsou schopny ho syntetizovat ve větším objemu než lidé.
Stránka 19
Obr. č. 7: Vzorec L-argininu (převzato ULR 3).
Za patofyziologických podmínek (jako je endoteliální dysfunkce, sepse, astma), kdy endogenní syntéza L-argininu nepokrývá metabolickou potřebu organizmu, se stává jeho hlavním zdrojem příjem v potravě. L-arginin je tedy označován jako semiesenciální aminokyselina (Wu a Morris, 1998). L-arginin se významným dílem podílí na syntéze proteinů, jako substrát jej navíc, kromě NOS, využívá celá řada enzymů, jako arginasa, arginin dekarboxyláza a arginin:glycin aminotransferasa (Wu a Morris, 1998). Endogenní syntéza L-argininu probíhá ve dvou úrovních: na úrovni buněčné a úrovni „celotělové“. Lidský organismus získává L-arginin jednak recyklací tělních proteinů (tzv. proteinový „turnover“), některé buňky jsou však schopny L-arginin vytvořit de novo, a to konverzí z L-citrullinu působením arginino-sukcinát syntetázy a arginino-sukcinát lyázy (Wu a Morris, 1998).
3.5. Endogenní a syntetické inhibitory NOS Tak jako má L-arginin nezastupitelnou roli v regulaci produkce NO jako substrát pro jeho syntézu, také inhibice produkce NO je klíčová z hlediska fyziologie endotelia. V rámci organizmu byly objeveny endogenně produkované inhibitory NOS, které dokáží kompetitivně blokovat aktivního centrum NOS. Jsou to deriváty L-argininu: NG-monomethyl-L-argininem (L-NMMA) a NG,NG-dimethyl-L-argininem (asymetrický dimethylarginin, ADMA) a symetrický dimethylarginin (SDMA), jenž není přímím inhibitorem NOS (Obr.č.8) (Široká a spol., 2005).
Obr. č. 8: Chemická struktura L-argininu, a endogenních inhibitorů NOS: na obrázku je patrna struktura inhibitorů NOS v porovnání s L-argininem, methyly na inhibitorech jsou vyznačeny šedou barvou (upraveno dle Raed, 2007).
Stránka 20
ADMA a L-NMMA jsou syntetizovány během metylace reziduí bílkovin s argininem pomocí
enzymu
S-adenosylmethionin:protein
arginin
methyltransferázy
(protein
arginin
methyltransferáza, PRMT). Tyto enzymy přenáší methylovou skupinu z S-adenosylmethioninu (SAM) na arginin, čímž se tvoří metylovaný arginin a S-adenosylhomocystein (SAH), ten je následně hydrolyzován na homocystein (Obr. č. 9). (Beltowski a Kedra, 2006).
Obr. č. 9: Schéma syntézy a metabolizmu inhibitorů NOS (upraveno dle Beltowski a Kedra, 2006).
Je odhadováno, že 1-4% reziduí argininu je methylováno v této ireverzibilní reakci, jelikož bílkoviny vázané na zbytcích argininu nemohou být již demethylované. Volné methylargininy jsou uvolňovány v průběhu proteolýzy a nejsou začleněny zpět do proteinu. Normální plazmatická hladina ADMA je menší než 1 μM, ale je zvýšená až desetinásobně u pacientů s chronickým selháním ledvin v konečné fázi, ale také u dalších patologických stavech (2-3-krát). Methylargininy jsou eliminovány renálním vylučováním. Více než 90% ADMA a L-NMMA je metabolizováno dimethylarginin dimethylaminohydrolázou (DDAH), která je degraduje na citrulin a dimethylamin, resp. monomethylamin (Obr. č. 9) (Beltowski a Kedra, 2006). DDAH je exprimována v mnoha tkáních včetně endoteliálních buněk, mozku a pankreatu, avšak hlavní orgány zodpovědné za metabolismus ADMA jsou játra a ledviny. Jen velmi malá část ADMA získané z krve je obsažena v moči, většina je metabolizována renální DDAH. (Beltowski a Kedra, 2006). Vedle ADMA, jsou endogenně produkovanými methylarginininy také: L-NMMA a SDMA. L-NMMA je stejně silný inhibitor NOS jako ADMA, ale jeho koncentrace v plazmě je asi desetkrát nižší, nicméně intracelulární koncentrace L-NMMA a ADMA je srovnatelná alespoň v některých tkáních, což naznačuje, že oba jsou důležitými inhibitory (Landin a spol., 2009; Sydow a spol., 2005). ADMA a L-NMMA jsou popisovány jako inhibitory všech tří forem NOS a jejich obsah je mnohem větší v intracelulárních prostorech, než v extracelulárních. (Landin a spol., 2009). SDMA není typickým inhibitorem NOS jako ADMA a L-NMMA. SDMA spolu s ADMA a LStránka 21
NMMA zasahuje do přepravy L-argininu, jenž je zprostředkovávána CAT umístěnými v plazmatické membráně. Bylo popsáno, že zamezením transportu L-argininu redukují produkci NO, což je podstatou inhibice NOS pomocí SDMA (Landin a spol., 2009). Kromě tří endogenně produkovaných inhibitorů existuje i celá řada syntetických inhibitorů, které je možno rozdělit do tří skupin. První jsou inhibitory na bázi L-argininu (nebo také analogy L-argininu substituované na terminálních guanidinových a amidinových dusících). Jsou to vesměs kompetitivní inhibitory, které obsazují vazebné místo, kam se běžně váže substrát na enzymu NOS (např. NΩ-nitro-L-arginin, L-NA, cyklopropyl-L-arginin, N-iminoethyl-L-ornitin, NG-methyl-Larginin, L-NMA). Tato skupina inhibitorů má vliv na přenos elektronů a redukci hemového železa, přičemž disponují různorodou selektivitou i účinností vůči jednotlivým izoformám NOS (Peterson, 1992, Olken a Marletta, 1992, McCall a spol., 1991, Sakuma a spol., 1992). Druhou skupinu tvoří inhibitory na bázi aminů, deriváty L-citrulinu a L-lysinu (jako jsou L-thiocitrulin, γ-thiureido-Lnorvalin, S-ethyl- a S-methyl-thiocitrulin), které jsou sice silnými stereospecifickými inhibitory izoformem eNOS a nNOS, ale mají jen omezené terapeutické účinky (špatně pronikají do buněk) (Frey a kol., 2004, Zhu a spol., 2004). Třetí skupina je tvořena inhibitory na jiné než aminové bázi (imidazoly, 7-nitroindazoly, guanidiny, isothiomočoviny, iminobiotin, ebselen, tannin), které mají nízkou akutní toxicitu a byl potvrzen jejich protizánětlivý účinek (Tilton, 1993, Zhang a spol., 1997, Wolf a Lubeskie, 1996, Moorchhala a spol., 2005, Thiemarmann, 1998).
Stránka 22
4. Endoteliální dysfunkce Jak již bylo zmíněno výše endoteliální buňky jsou klíčové pro udržení cévní a imunitní homeostázy. V případě vzniku nerovnováhy mezi vazoaktivními mechanizmy a hemokoagulačními mediátory dochází k funkčnímu postižení vaskulárního endotelu a vzniku endoteliální dysfunkce. Tento proces má za následek převahu vazokonstrikčních, aterogenních a protrombotických mechanizmů, které zvyšují propustnost cévní stěny, což hraje klíčovou úlohu v patofyziologii některých cévních chorob a poruch (Karásek a spol., 2004). Například oxidativní stres zvyšuje permeabilitu vaskulárního endotelu a podporuje adhezi leukocytů, které jsou spojené se změnami signálních drah v endotelu a regulaci redoxních transkripčních faktorů jako je aktivátor proteinu-1 a nukleární faktor-κB (Hazel a Roebruck, 2001). Ke zvýšení oxidativního stresu dochází například v místě zánětu nebo infekce, kde dochází k lokálnímu zvýšení produkce reaktivních kyslíkových (RKM), dusíkových (RDM) metabolitů a zánětlivých cytokinů. Dochází k aktivaci endotelu, jenž je vystaven působení těchto mediátorů po delší dobu a paradoxně vede také k produkci RKM přímo aktivovanými endoteliálními buňkami, čímž endotel výrazně přispívá k udržení na oxidanty bohatého prostředí v místě zánětu. Dále vystavení endoteliálních buněk hypoxii (nedostatku kyslíku) následující reoxygenací (obnovení dodávky kyslíku) indukuje produkci O2-, což vede k, od endotelu odvozené, produkci RKM, jenž přispívá k ischemicko-repulzivnímu poškození (Hazel a Roebruck, 2001). Dysfunkce vaskulární endoteliální bariéry v ischemicko-repulzivním poškození, které je spojeno s toxickým množstvím ROS (Reaktivní kyslíkové radikály) zvyšujícím propustnost cévní stěny při aktivaci leukocytů a endoteliálních buněk. Existuje řada známých příčin, jenž působí jako iniciátory vzniku endoteliální dysfunkce. Je to zejména inhalace tabákového kouře, nedostatek kyslíku v organizmu, působení ionizujícího záření a cytostatik (obr. č. 10) (Dostálek, 2007; Šípek a kol., 2000). Kromě toho se má za to, že endoteliální dysfunkce je obecně spojena se zvýšením oxidativního stresu (což může vést k narušení funkcí redoxně sensitivních drah) a hlavně sníženou biologickou dostupností NO, který je zodpovědný za relaxaci cév (Cook, 2000; Antoniades a spol., 2009). V dlouhodobějším měřítku vedou tyto procesy k trvalému poškozování endotelu, které může mít za následek zvyšování krevního
tlaku,
infiltraci
endotelu
imunokomplexy,
rozvoj
aterosklerózy
a
kardiovaskulárních onemocnění (Šípek a spol., 2000).
Stránka 23
jiných
Obr. č. 10: Příčiny vzniku a důsledky endoteliální dysfunkce. Endoteliální dysfunkce může nastat při nerovnováze produkce vazokonstrikčních a vazodilatačních látek. Ta je způsobena různými faktory, projevuje se snížením biologické dostupnosti NO, což bývá spojeno s nedostatečnou relaxací cév a zvýšenou adhezí trombocytů a leukocytů na její povrch, migrací a nadměrnou proliferací hladké svaloviny cév (upraveno podle Vrablík a kol., 2011).
4.1. Role L-argininu a ADMA u endoteliální dysfunkce Jak bylo zmíněno v předchozí kapitole, poškození endotelu a endoteliální dysfunkce je jedním z nejsledovanějších a nejzkoumanějších parametrů předpovídajících riziko rozvoje kardiovaskulárních onemocnění (Chan a Chan, 2002, Veresh a spol., 2008). Většina studií navíc ukazuje, že informace důležité pro prognózu kardiovaskulárních komplikací lze zjistit sledováním produkce NO a také poměru plazmatických koncentrací L-argininu (jediného známého substrátu pro syntézu NO) a endogenního inhibitoru NOS, ADMA (Leiper a kol., 2004; Gornik a Creager, 2004; Wu a Meininger, 2000). Důležitým faktem však je, že prozatím nebyly odhaleny molekulární mechanismy jenž by objasnili působení ADMA v rámci rozvoje endoteliální dysfunkce.
Stránka 24
5. Cíle práce L-arginin je velice důležitá aminokyselina, jenž je spojována zejména s produkcí NO, který kontroluje dilataci cév, zpuštění koagulační dráhy a funkci imunitních buněk. Účinky L-argininu a také NO však mohou být negativně regulovány prostřednictvím přítomností zvýšené koncentrace endogenního inhibitoru NOS, ADMA. Jelikož je poměr plazmatických koncentrací L-argininu a ADMA v organizmu považován za významný predikční faktor při rozvoji závažných onemocnění, je důležité objasnit molekulární mechanismy spojené s jejich působením na fyziologické i patofyziologické funkce endoteliálních buněk. Hypotézou je, že L-arginin a ADMA jsou schopny regulovat nejen produkci NO, ale také aktivaci intracelulárních signálních drah jenž jsou klíčové pro aktivaci endoteliálních buněk.
Sledovat efekt L-argininu a ADMA na produkci NO u in vitro modelu vaskulárních endoteliálních buněk.
Popsat efekt L-argininu a ADMA na expresi a aktivaci eNOS a ERK, které jsou významné pro základní funkce endoteliálních buněk.
Stránka 25
6. Materiál Všechny použité materiály, jejich optimální koncentrace a celkové objemy reakčních směsí byly zvoleny a dále připravovány na podkladě výsledků experimentů uskutečněných v Laboratoři patofyziologie volných radikálů (BFÚ AV ČR, v.v.i.).
6.1. Chemikálie
Acrylamid 4K – Lösung (30%); (AppliChem GmbH, Německo)
Albumin izolovaný z kravského séra (z angl. Albumin from bovine serum); (SigmaAldrich Chemie GmbH, Německo)
Anti-eNOS králičí IgG1; (BD Transduction Laboratories, USA)
Anti-fosforylovaná eNOS králičí IgG; (Cell Signaling Technology, USA)
Anti-ERK (1/2) králičí IgG; (Cell Signaling Technology, USA)
Anti-fosforylovaná ERK (1/2) králičí IgG; (Cell Signaling Technology, USA)
Anti-β-actin myší IgG; (SantaCruz Biotechnology, USA)
APS (peroxodisíran amonný, z angl. Ammonium persulfate), (NH4)2S2O8; (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
Asymetrický dimethylarginin C8H18N4O2 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
Azid sodný (99%), NaN3; (Janssen Chimica, Belgie)
Kit pro stanovení koncentrace proteinů (BCATM, z angl. Protein Assay Reagent, Pierce, USA)
DTT (Dithiothreitol), HSCH2CH(OH)CH(OH)CH2SH; (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
L-arginin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
Myší a králičí sekundární protilátka konjugovaná s křenovou peroxidasou (Cell Signaling Technology, USA)
EDTA
(dihydrát
sodné
soli
kyseliny
ethylendiamintetraoctové,z
angl.
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
Gentamicin sulfát; (SERVA Electrophoresis GmbH, Německo)
Griessův reagent (modifikovaný); (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo) Stránka 26
LPS (Lipopolysacharid z E. coli, serotype 026:B6); (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
β-mercaptoethanol, HSCH2CH2OH; (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
Nitrit sodný – krystalický, NaNO2; (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Německo)
PMSF (fenylmethylsulfonyl fluorid, z angl. Phenylmethylsulfonyl fluoride); (Fluka BioChemika, Švýcarsko)
PVDF (polyvinyliden difluorid, z angl. Polyvinylidene Difluoride)
SDS (Dodecylsulfát sodný, z angl. Sodium dodecylsulphate), C12H25SO4Na; (SERVA Electrophoresis GmbH, Německo)
značený žebříček pro Western blot (PageRuler™ Prestained Protein Ladder; Fermentas GmbH, Kanada)
TEMED
(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine),
(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2;
(Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, Německo)
TRIS [Tris (hydroxymethyl) aminomethan]; (SERVA Electrophoresis GmbH, Německo)
Tween 20; (Fluka BioChemika, Švýcarsko)
6.2. Biologický materiál Pro všechny in vitro experimenty byly využity lidské umbilikální žilní endoteliální buňky, HUVEC (ECACC, Velká Británie). Buňky byly pěstovány v kultivačním médiu (EBM, z angl. endotellial cell basal medium, Lonza, USA) v kultivačních nádobách (75 cm2, PAA, USA). Při jejich pasážování bylo nejdříve odsáto staré médium a následně byl přidán 1% trypsin + EDTA. Po zhruba 5–10 min inkubace při 37°C bylo k uvolněným buňkám přidáno malé množství čerstvého kultivačního média. Buňky byly poté nasazeny do kultivačních nádob, nebo vysazeny na 6-ti jamkové desky v koncentraci 1,5 x 103 buněk/jamka.
6.2.1. Ovlivnění HUVEC L-argininem, ADMA a acetylcholinem Po přesazení na 6-ti jamkové desky byly buňky dále pěstovány, dokud nedosáhly úplné konfluence (tzn. pokryly 100% povrchu jamek). Po dosažení konfluence bylo buňkám vyměněno čerstvé médium a do některých jamek byl přidán L-arginin (1 mM), ADMA (100µM) nebo jejich kombinace. Takto vysazené buňky byly ponechány 24 h při 37°C v CO2 inkubátoru. Některé z nich byly následně aktivovány acetylcholinem (ACh, 5µM) po dobu 10 min. (přesné rozložení experimentů viz obr. č. 11). Po ukončení experimentů bylo odsáto kultivační médium, které poté sloužilo pro stanovení nitritů pomocí Griessovy kolorimetrické metody. Buňky, které zůstaly Stránka 27
přisednuté v jamkách byly lyzovány na ledě pomocí lyzačního roztoku a všechny vzorky byly zamraženy na -80oC.
Obr. č 11: Obsah jednotlivých jamek u experimentů. Ve všech jamkách byly napěstovány konfluentní kultury buněk HUVEC. Jako negativní kontrola (neg. kontrola) sloužili buňky kultivované po dobu 24 hod. bez použití jiných testovaných látek a bez následné stimulace ACh. Pozitivní kontrolou (poz. kontrola) byly buňky kultivované po dobu 24 hod. bez použití jiných testovaných látek a následně aktivované ACh (5μM) po dobu 10 min. Další experimentální skupiny tvořili buňky ovlivněné pomocí L-argininu (Larg, 1mM), ADMA (100μM), v jejich vzájemné kombinaci po dobu 24 hod. a také v kombinaci s 10 min. aktivací pomocí ACh (5μM).
6.3. Seznam použitých přístrojů V experimentech provedených v této bakalářské práci bylo využito následujících přístrojů, které jsou dostupné v Laboratoři patofyziologie volných radikálů (BFÚ AV ČR, v.v.i.):
HERA Cell CO2 Inkubátor (Heraeus, Německo)
Aparatura pro SDS-elektroforézu a Western blot (BioRad, USA)
Světelný mikroskop (Olympus, Japonsko)
Spektorfotomer (Sunrise, TECAN, Rakousko)
HypercassetteTM (Amersham Pharmacia Biotech, Velká Británie)
MiniSpin (Eppendorf, Německo)
Roler Rollery Stuart (Fisher Scientific, Česká Republika)
Sonikátor Sonoplus (Bandelin, Německo)
Světelný mikroskop (Olympus, Japonsko)
Centrifuga 5417R (Eppendorf, Německo)
Při práci bylo dále použito běžné laboratorní vybavení.
Stránka 28
7. Metody 7.1. Stanovení koncentrace nitritů Griessovou metodou V této bakalářské práci byla použita metoda nepřímého stanovení NO, která je založená na spektrofotometrickém stanovení nitritů po diazotaci sulfanilamidu a kopulaci s N-(1naftyl)ethylendiaminem. s detekcí při 540 nm (Kupková a Beneš, 2004) (viz obr. č. 11). V případě biologických vzorků musí být nitráty, vzniklé reakcí NO s hemoglobinem, redukovány zpět na nitrity, tím zajistíme stanovení celkové hladiny produktů oxidace NO.
7.1.1. Postup měření koncentrace nitritů/nitrátů Před stanovením koncentrace nitritů byl připraven zásobní roztok NaNO 2 (520 µM). Pro tvorbu kalibrační závislosti byl tento zásobní roztok vícenásobně zředěn, načež vznikly kalibrační vzorky o koncentracích 52 µM - 0,203 µM. Poté byl supernatant (kultivační médium odebrané po ukončení experimentu) pipetován na 96 jamkovou mikrotitrační destičku (po 150 µl každého vzorku resp. kalibračního roztoku). Do takto nachystaných jamek bylo přidáno 150 µl Griessova činidla, mikrotitrační destička byla inkubována 15 min. v temnu při pokojové teplotě. Změna zbarvení jednotlivých vzorků byla následně změřena při 540 nm (SPECTRA Sunrise). Z kalibrační vzorků byla sestavena regresní rovnici, z níž bylo provedeno stanovení nitritů v testovaných vzorcích.
7.2. Stanovení koncentrace proteinů a příprava vzorků pro Western blot Koncentrace proteinů byla ve všech vzorcích stanovena pomocí spektrofotometrické metody (BCA Protein assay). Metoda využívá sodné soli kyseliny bicinchoninové (BCA), která komplexuje ionty Cu+ tvořené reakcí peptidové vazby s Cu2+. Činidlo se připravuje smíšením roztoků sodné soli BCA v alkalickém prostředí a CuSO4. Změna absorbance je poté měřena při 562 nm pomocí spektrofotometru.
7.2.1. Příprava vzorků pro stanovení koncentrace proteinů Po ukončení experimentů byly buňky vždy lyzovány na ledě pomocí lyzačního roztoku, byly pečlivě seškrábány z destiček a přeneseny do mikrozkumavek (Eppendorf, Německo) s bezpečnostním uzávěrem. Vzorky povařené 15-20 min. při 99°C byly dále homogenizovány pomocí sonikátoru a následně opět povařeny 10-15 min. při 99°C. V takto připravených vzorcích byla stanovena koncentrace proteinů.
7.2.2. Postup měření koncentrace proteinů Homogenizované a povařené vzorky byly pipetovány do mikrotitrační destičky. Pro přípravu kalibrační křivky byl použit zásobní roztok bovinního albuminu (20 mg.ml-1) rozpuštěného v lyzačním pufru, který byl ředěn v rozmezí 6 – 0,0625 mg.ml-1. Na 96 jamkovou mikrotitrační Stránka 29
destičku bylo pipetováno 10 µl vzorku nebo kalibračního roztoku a to v paralelách a poté bylo přidáno 200 µl reagentu A+B (zředěného podle návodu výrobce kitu). Po 15 min. inkubaci při 37 oC byla změřena absorbance (562 nm) (Sunrise). Z hodnoty absorbance kalibračních vzorků byla sestavena regresní rovnice, která byla použita pro výpočet koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích. Vzorky naředěné na požadovanou koncentraci byly smíchány s „Leamliho“ pufrem a skladovány při -20oC.
7.2.3. Pufry použité při SDS PAGE a Western blot Seznam všech použitých pufrů je uveden v tabulce č. 2. Všechny roztoky byly připravovány v souladu s návody, které jsou dostupné v Laboratoři patofyziologie volných radikálů. Tab. č. 2: Přehledný seznam roztoků a pufrů.
Stránka 30
7.3. Stanovení exprese proteinů pomocí elektroforézy SDS PAGE a Western blot Western blot je nejpoužívanější imunochemickou metodou. Využívá specifických protilátek rozpoznávajících antigenní strukturu hledaného denaturovaného proteinu ve vzorku. Proteiny rozdělené pomocí SDS PAGE jsou přeneseny na vhodný nosič (v případě této práce na PVDF membránu). Výhodou metody je její sensitivita a specificita (Rumlová a kol.,2006).
7.3.1. Příprava gelů na elektroforézu Před samotnou elektroforézou bylo potřeba vyrobit gel užívaný k rozdělení proteinů. Postup začínal důkladným čistěním skel pomocí 80% ethanolu. Poté byly do spodní části nalévacího stojanu umístěny gumové podložky a na ně skla přiložené čelem k sobě. Podle návodu byly nachystané gely vhodné hustoty (v tomto případě 10%, viz. tab. č. 3), TEMED a APS byly přidány těsně před nalitím gelů. Rozdělovací gelu byl zalit destilovanou vodou a ponechán 20 min. při pokojové teplotě. Poté byl přidán hřebíkový gel, do kterého byl umístěn hřebínek. Po jeho ztuhnutí byly gely vloženy do pufru pro elektroforézu a nechány přes noc zakryté fólií při 4oC.
Tab. č. 3: Seznam látek a roztoků pro přípravu gelů určených pro elektroforézu.
7.3.2. SDS PAGE Gely připravené v předchozím kroku byly vloženy do aparatury spolu s pufrem pro elektroforézu. Vzorky byly pipetovány do jednotlivých jamek dle předem stanoveného rozpisu. Elektroforéza byla provedena při 120 V přibližně 2 hod. Po vyjetí tzv. čela (modrý pruh tvořený „Laemliho“ pufrem a zbytkem lehčích proteinů) z gelu byla elektroforéza ukončena a gely vytaženy z aparatury.
7.3.3. Western Blot Po ukončení elektroforézy byly gely vloženy do vaničky s „blotovacím“ pufrem a zde byla sestavena aparatura pro přenos proteinů z gelů na PVDF membrány. Nachystané kazety byly vloženy do nástavce s „blotovacím“ pufrem a ledovými bločky. Přenos proteinů se poté uskutečnil pří 280 mA/2-3hod. Po ukončení přenosu proteinů byly membrány vloženy do blokovacího roztoku s obsahem proteinů (v případě této práce k tomu sloužilo odtučněné 5% mléko). Po 1 hod. inkubace byly Stránka 31
membrány vloženy do jednotlivých primárních protilátek a inkubovány při pokojové teplotě 1 hod. Po přemytí membrán 3 x v TBS-T pufru byly membrány inkubovány se sekundárními protilátkami (konjugovanými s křenovou peroxidasou) 1 hod. při pokojové teplotě a poté opět 3 x promyty v TBS-T pufru. Ředění protilátek pro jednotlivé proteiny je uvedeno v tab. č. 4. Membrány byly vyvolány standardním způsobem pomocí chemiluminiscenčního (CL) kitu. CL signál byl vyvolán na radiografické filmy (Agfa, Belgie), kde byla exprese proteinů pozorována jako viditelné černě proužky v oblasti hledané molekulové hmotnosti. Filmy byly naskenovány a použity pro následnou analýzu optické denzity (hustoty) jednotlivých proužků (ImageJ®).
Tab. č. 4: Ředění užitých protilátek pro proteiny detekované metodou Western blot. U každému proteinu je zaznamenáno ředění jeho primární protilátky (PP) a druh zvířete, které ji vyprodukovalo. V pravé části tabulky je popsán typ a ředění sekundární protilátky (SP).
7.4. Grafické zobrazení dat Data zobrazena v grafech jsou reprezentována hodnotami naměřenými v jednom opakování. Míra exprese proteinů je v grafech zobrazena jako optická denzita (OD), která byla stanovena pro jednotlivé proteiny pomocí ImageJ®. Z důvodu jednoho opakování experimentů nebyla provedena statistická analýza naměřených dat. Pro účely analýzy budou všechny experimenty provedeny minimálně ve dvou dalších opakováních.
Stránka 32
8. Výsledky 8.1. Vliv L-argininu a ADMA na produkci NO u HUVEC V prvních experimentech byla stanovena koncentrace nitritů, konečných produktů metabolizmu NO (Hazel a kol., 2001). Produkce byla sledována pomocí Griessovy kolorimetrické metody popsané v kapitole 8.1. V těchto experimentech byla aktivace produkce NO u HUVEC indukována pomocí Acetylcholinu (Ach, 5 µM) a tyto buňky sloužily jako pozitivní kontrola. Další část buněk byla ovlivněna pomocí L-argininu (1mM), ADMA (100µM) respektive jejich kombinací. Jako negativní kontrola sloužili buňky HUVEC inkubované 24 hod pouze v přítomnosti kultivačního média bez následné aktivace pomocí ACh. Jak je patrné z grafu č.1, akumulace nitritů u všech experimentálních skupin byla ovlivněna pouze v malém rozsahu. Zdá se však, že aktivace HUVEC pomocí Acetylcholinu (24 hod.) vedla k malému zvýšení produkce NO· v porovnání s negativní kontrolou (graf č.1). Dále bylo pozorováno, že L-arginin zvýšil koncentraci nitritů jak u buněk aktivovaných ACh, tak u buněk, jenž aktivovány nebyly. Endogenní inhibitor NOS, ADMA mírně snižoval koncentrace nitritů u buněk jenž nebyly aktivovány ACh, na rozdíl od toho u aktivovaných HUVEC ke změně koncentrace nitritů nedošlo. L-arginin nedokázal zvrátit snížení koncentrace nitritů po použití ADMA a to jak u nestimulovaných tak i stimulovaných buněk (graf č.1).
Graf. č. 1. Akumulace nitritů v kultivačním médiu u HUVEC. Graf znázorňuje koncentraci nitritů ve vzorcích HUVEC ovlivněných L-argininem (1 mM), ADMA (100 µM) a acetylcholinem (Ach, 5 µM) po 48 hodinách inkubace. Vzorky podtržené linkou a označeny jsou právě ty, jenž byly aktivovány acetylcholinem po dobu 10 min. Sloupce v grafech jsou reprezentovány hodnotami naměřenými v jednom opakování.
Stránka 33
8.2. Vliv L-argininu a ADMA na koncentraci proteinů u HUVEC V následujících experimentech byla stanovena koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích HUVEC inkubovaných s testovanými látkami po dobu 24 hod. a aktivovanými Ach po dobu 10 min (graf č. 2). Toto stanovení sloužilo jednak k ověření zda testované látky neovlivnili viabilitu buněk v průběhu experimentů a jednak pro vyrovnání koncentrace totálního proteinů v jednotlivých vzorcích. V žádné testované skupině nebyla pozorována změna koncentrace proteinů (graf č.2).
Graf. č. 2. Koncentrace proteinů u HUVEC. Graf znázorňuje koncentraci proteinů ve vzorcích HUVEC ovlivněných L-argininem (1 mM), ADMA (100 µM) a acetylcholinem (Ach, 5 µM) po dobu 24 hodin. Sloupce podtržené linkou a označeny Ach jsou právě ty, jenž byly následně aktivovány acetylcholinem po dobu 10 min. Sloupce v grafech jsou reprezentovány hodnotami naměřenými v jednom opakování.
8.3. Vliv L-argininu a ADMA na expresi a aktivaci eNOS a ERK u HUVEC V následujících experimentech byla sledována aktivace a exprese eNOS pomocí metody Western blotu podrobně popsané v kapitole 7.3.3. Nejdříve jsme sledovali efekt stimulace buněk pomocí Ach (5 µM), kdy se ukázalo, že ACh mírně zvyšuje expresi eNOS. V případě nestimulovaných buněk inkubovaných v přítomnosti testovaných látek bylo zaznamenáno zvýšení exprese eNOS po použití L-argininu (1 mM), ADMA (100 µM) a také u jejich kombinace. Toto zvýšení bylo výraznější u buněk, které byly po 24 hod. inkubaci aktivovány pomocí ACh po dobu 10 min.
Stránka 34
Graf. č. 3. Exprese a aktivace eNOS u HUVEC. Graf znázorňuje expresi a aktivaci eNOS u endoteliálních buněk HUVEC ovlivněných L-argininem (1 mM), ADMA (100 µM) a acetylcholinem (Ach, 5 µM) po dobu 24 hod. Sloupce podtržené linkou a označeny Ach jsou právě ty, jenž byly následně aktivovány acetylcholinem po dobu 10 min. Sloupce v grafech jsou reprezentovány hodnotami naměřenými v jednom opakování.
Pro sledování aktivace eNOS bylo využito stanovení její fosforylované formy. V grafu č. 3 je patrné, že ACh indukoval fosforylaci eNOS, což je patrné na pozitivní kontrole. U nestimulovaných buněk vedlo použití L-argininu (1 mM) k rapidnímu navýšení exprese proteinu, naopak použití ADMA (100 µM) vedlo ke snížení exprese. Kombinace L-argininu (1 mM) a ADMA (100 µM) ke zvýšení exprese proteinu oproti negativní kontrole nevedla. Aktivace pomocí Stránka 35
ACh (5 µM) po dobu 10 minut vedla ke zvýšení exprese jak u HUVEC s L-argininem (1 mM), tak u HUVEC s ADMA (100 µM), při kombinaci obou zmíněných však došlo ke snížení exprese oproti pozitivní kontrole.
Graf. č. 4. Exprese a aktivace ERK1/2 u HUVEC. Graf znázorňuje expresi a aktivaci ERK1/2 u endoteliálních buněk HUVEC ovlivněných L-argininem (1 mM), ADMA (100 µM) a acetylcholinem (Ach, 5 µM) po dobu 24 hod. Sloupce podtržené linkou a označeny Ach jsou právě ty, jenž byly následně aktivovány acetylcholinem po dobu 10 min. Sloupce v grafech jsou reprezentovány hodnotami naměřenými v jednom opakování.
Stránka 36
Z grafu č. 4 je patrno, že použití L-argininu (1 mM), ADMA (100 µM) i jejich kombinace, u které je snížení exprese nejmenší, vede u totální ERK 1/2 ke snížení exprese proteinů. Tento efekt je obdobný i u buněk HUVEC aktivovaných pomocí ACh (5 µM). Při sledování aktivace ERK 1/2 bylo užito stanovení její fosforylované formy. V grafu č. 4 je patrné, že při použití L-argininu (1 mM) se exprese fosforylované ERK 1/2 zvýšila, při použití ADMA (100 µM) se oproti použití L-argininu (1 mM) exprese proteinu zvýšila ještě výrazněji. Nejvyšší exprese byla zaznamenána při použití kombinace obou zmíněných. Použití ACh (5 µM) má na expresi fosforylované ERK 1/2 u buněk HUVEC výrazně inhibiční efekt a to jak při použití L-argininu (1 mM), ADMA (100 µM), tak jejich kombinace. Jako kontrola pro sledování exprese totálních proteinů sloužilo stanovení exprese β-actinu. Jak je patrné z grafu č.5 exprese β-actinu nebyla výrazně odlišná u všech experimentálních skupin.
Graf č. 5: Exprese β-actinu u HUVEC. Graf znázorňuje expresi β-actinu u endoteliálních buněk HUVEC ovlivněných L-argininem (1 mM), ADMA (100 µM) a acetylcholinem (Ach, 5 µM) po dobu 24 hod. Sloupce podtržené linkou a označeny Ach jsou právě ty, jenž byly následně aktivovány acetylcholinem po dobu 10 min. Sloupce v grafech jsou reprezentovány hodnotami naměřenými v jednom opakování.
Stránka 37
9. Diskuze Produkce a biologická dostupnost NO je při posuzování funkce vaskulárních endoteliálních buněk považována za jeden z klíčových faktorů (Karásek a kol, 2004; Gornik a Crager, 2004). NO je totiž nejsilnějším známým vazodilatátorem, prostřednictvím stimulace guanylát-cyklázy je zodpovědný za produkci cGMP, jenž reguluje dilataci cév (Furchgott a Zawadski, 1980; Ingarro a spol., 1984; Murad, 1996). Je tedy zřejmé, že jakýkoliv podnět regulující produkci NO může mít za následek vznik či prohloubení endoteliální dysfunkce, která je dále spojena s rozvojem závažných onemocnění (např. srdečné selhání, diabetes, sepse a jiné) (Veresh a spol., 2008; Gokce, 2004). Středem pozornosti se stává také L-arginin, který je doposud jediný známý substrát pro NOS (také eNOS) a tedy produkci NO v rámci vaskulárního endotelia (Tousoulis a spol., 2002; Adams a spol., 1997). V experimentech provedených v rámci této bakalářské práce se bohužel nepodařilo zaznamenat změnu produkce NO u lidských endoteliálních buněk po působení zvýšené koncentrace L-argininu a to ani v případě současné stimulace buněk pomocí ACh. Jelikož je ACh známým aktivátorem produkce NO u endoteliálních buněk (Kamada a spol., 2001) předpokladem bylo, že samotné přidání ACh a také zvýšení koncentrace L-argininu bude mít za následek nárůst produkce NO. Ačkoli byly tyto předpoklady v souladu s již publikovanými daty (Tousoulise a spol., 2002; Joshi a spol., 2007) tento postup se ukázal jako neúčinný. Nezměněná akumulace nitritů naměřená v kultivačním médiu byla ale v rozporu s výsledky dostupnými ze stanovení aktivace a eNOS, kde se ukázalo, že L-arginin měl na tento proces zásadní vliv. V případě aktivované formy eNOS bylo zaznamenáno zvýšení v přítomnosti L-argininu (1 mM), což bylo také doprovázené celkovým zvýšením exprese eNOS. Podobné výsledky byly zaznamenány i pro buňky, které byly následně aktivovány pomocí ACh, což naznačuje, že by teoreticky mělo dojít ke zvýšené produkci NO. Důvodem selhání při stanovení produkce NO byla tedy pravděpodobně kolorimetrická metoda, která nebyla dostatečně citlivá pro zaznamenání změn v koncentraci NO produkovaného z endoteliálních buněk. V budoucnu je proto naplánováno využití jiných metod dostupných pro stanovení produkce NO. Ačkoli je metabolizmus L-argininu složitě kontrolován na vícero úrovních, existuje pouze málo informací o jeho schopnostech regulovat endoteliální funkce, které nejsou přímo spojeny s produkcí NO (Wu a Morris, 1998). Je to zejména jeho schopnost regulovat hodnotu krevního, ale i intracelulárního pH, depolarizaci membrán a produkci superoxidového anionu u endoteliálních buněk endoteliálních buněk (Wascher a spol., 1997; Tousoulis a spol., 2002). Nedávno bylo také zjištěno, že L-arginin může ve zvýšených koncentracích (5 - 10 mM) aktivovat receptory spřažené s G-proteiny, přičemž tento proces je spojen s aktivací fosfolipázy C a uvolňováním intracelulárního vápníku (Joshi a spol., 2007). Proto byly další experimenty v rámci této práce zaměřeny na sledování vlivu L-argininu na aktivaci intracelulárních signálních drah jenž jsou Stránka 38
spojeny také s aktivací endoteliálních buněk. Bylo zjištěno, že zvýšením koncentrace L-argininu v kultivačním médiu endoteliálních buněk dochází k aktivaci ERK, jenž je známým regulátorem uvolňování intracelulárních zásob Ca2+ iontů (Krause a spol., 2012). Tato změna však není patrná v případě následné stimulace buněk pomocí ACh. Tyto data dokazují, že L-arginin je pravděpodobně zapojen do regulace intracelulárních dra, jenž jsou důležité pro aktivaci endoteliálních buněk. Pro fyziologické i patofyziologické procesy probíhající ve vaskulárním endoteliu je klíčová také přítomnost nebo zvýšená koncentrace ADMA (endogenně produkovaného inhibitoru NOS), který byl potvrzen jako rizikový faktor u vzniku různých onemocnění (Leiper a spol., 2007; Zaklzewicz a Eickelberg, 2009; Teerlink, 2006). ADMA jako kompetitivní inhibitor NOS může přímo napomáhat vazokonstrikci, snižovat tak biologickou dostupnost L-argininu v organizmu a způsobovat tak vznik chorob jako je inzulin rezistentní diabetes mellitus a kardiovaskulární onemocnění (Cooke, 2000; Chan a Chan, 2002; Sydow a Munzel, 2003; Cook, 2000; Antoniades a spol., 2009). Zajímavé je, že ačkoli se ADMA považuje za kompetitivní inhibitor všech známých izoforem NOS, prozatím byly jeho inhibiční účinky ověřeny pouze pro nNOS izolovanou z lidské tkáně (Fiedler a Stothard, 2009). Existují však studie, kde bylo prokázáno, že ADMA redukuje produkci NO u endoteliálních buněk (Toth a spol., 2006). V experimentech provedených v této bakalářské práci byl sledován efekt ADMA na produkci NO u endoteliálních buněk. Ukázalo se, jako u experimentů s L-argininem, že nedošlo k žádné změně v akumulaci nitritů ve vzorkách kultivačního média odebraného z endoteliálních buněk a to ani v přítomnosti ACh. Při sledování exprese a aktivace eNOS však bylo zjištěno, že ADMA sice zvyšuje expresi eNOS avšak sama nedokáže způsobit její aktivaci. Zajímavé bylo pozorování blokace zvýšené aktivace eNOS u buněk, které byly kultivovány v kombinaci s Largininem. Tyto experimenty naznačují, že docházelo k ireverzibilnímu blokování aktivace eNOS prostřednictvím ADMA. V experimentech, kde byl sledován efekt ADMA na expresi a aktivaci ERK bylo zjištěno, že ADMA zvyšuje aktivaci ERK a to dokonce více než samotný L-arginin. Nejúčinnější se zdála být kombinace ADMA a L-argininu v případě endoteliálních buněk, které nebyly dále aktivovány pomocí ACh. Tyto data jsou v souladu se zjištěními publikovanými skupinou Jiang a spol., 2007, kteří potvrdili vliv ADMA na aktivaci ERK a také p38 u nestimulovaných endoteliálních buněk což dokazuje možnou roli ADMA v regulaci důležitých intracelulárních signálních drah.
Stránka 39
10. Závěr V této bakalářské práci byla zjištěna důležitá fakta, potvrzující unikátní roli L-argininu a jeho endogenního inhibitoru ADMA v regulaci fyziologických funkcí vaskulárních endoteliálních buněk. Bylo zjištěno, že zvýšením koncentrace L-argininu v kultivačním médiu endoteliálních buněk dochází ke zvýšené aktivaci a expresi eNOS. Tato exprese a aktivace byla dále ovlivněna přítomností zvýšené koncentrace ADMA. Změna v expresi eNOS zprostředkovaná L-argininem a ADMA byla spojena také se změnou v aktivaci ERK, jenž je významně zapojena do regulace intracelulárních signálních drah vedoucích k aktivaci jak endoteliálních zodpovědný buněk tak i samotné eNOS. Tyto výsledky můžou přispět k objasnění molekulárních mechanismů regulace aktivace endoteliálních buněk v přítomnosti zvýšené koncentrace ADMA, jenž je spojována s rozvojem závažných onemocnění. Cílem další práce bude zejména zopakovat experimenty popsané v této práci a vytipovat další signální dráhy, které by mohli být zapojeny do metabolismu L-argininu a ADMA.
Stránka 40
11. Seznam zkratek ADMA
NG,NG-dimethyl-L-arginin (Asymetrický dimethylarginin)
ACh
Acethylcholin
APS
Peroxodisíran amonný (z angl. Ammonium persulfate)
BH4
Tetrahydrobiopterin
BCA
Bicinchoninová kyselina (z angl. Bicinchoninic Acid)
CaM
Calmodulin
CAT
Kationický transportér aminokyselin (z angl. Cationic amino acid transportér)
cGMP
Cyklický guanosin-monofosfát (Cyclic guanosine monophosphate)
CL
Chemoluminiscenční
cNOS
Konstitutivní NO-syntáza (z angl. constitutive)
DDAH
Dimethylarginin dimetylaminohydroláza
DDT
Dithiotriethol
EBM
Bazální médium pro endoteliální buňky (z angl. endotellial cell basal medium)
EDTA
Chelaton 2, polyaminokarboxylová kyselina
eNOS
Endoteliální syntáza oxidu dusnatého (z angl. Endotelial nitric oxide synthese)
ERK
Extracelulární signální regulované protein kinázy (Extracellular signalregulated kinases)
FAD
Flavin adenin dinukleotid
FMN
Flavin mononukleotid
HUVEC
Lidské umbilikální žilní endoteliální buňky (z angl. Human umbilical vein endothlelial cells
iNOS
Inducibilní syntáza oxidu dusnatého (z angl. Inducible nitric oxid synthese)
JNK
c-Jun N-terminální kinázy
L-NA
NΩ-nitro-L-arginin
L-NMA
NG-methyl-L-arginin
L-NMMA
NG–monomethyl–L-arginin
LPS
Lipopolysacharid Stránka 41
MAPK
Mitogen-aktivovaná protein kináza (z angl. Mitogen-activated protein kinase)
nNOS
Neuronální oxid dusnatý syntáza (z angl. Neuronal nitric oxide synthese)
NOS
Syntáza oxidu dusnatého
OD
Optická denzita
PBS
Fosfátový pufr (z angl. phosphate buffer solution)
PP
Primární protilátka
PRMT
Protein arginin transferáza
PVDF
(Polyvinylidene Difluoride)
RDM
Reaktivní dusíkové metabolity
RKM
Reaktivní kyslíkové metabolity
ROS
Reaktivní kyslíkové radikály (z angl. Reactive oxygen species)
SAH
S-adenosylhomocystein
SAM
S-adenosylmethionin
SP
Sekundární protilátka
SDMA
Symetrický NG,NG-dimethyl-L-arginin
SDS
Dodecylsíran sodný (z angl. sodiumdodecilsulfát)
TBS-T
Tris pufr (z angl. tris buffer solution-tween 20)
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TRIS
Tris-(hydroxymetyl)-aminometan
Stránka 42
12. Seznam použité literatury Andrew J. a Mayer P. (1999). Enzymatic function of nitric oxide synthases. Cardiovascular Reserch: 43, 521–531. Antoanides Ch., Shirodaria Ch., Lesson P., Antonopulos A., Warrick N., Van-Assche T., Cunnington C., Tousoulis D., Pallai R., Ratnatunga Ch., Stefanadis Ch. a Channon K. M. (2009). Association of plasma asymmetrical dimethylarginine (ADMA) with elevated vascular superoxide production and endothelial nitric oxide synthase uncoupling: implications for endothelial function in human atherosclerosis. Oxford, UK: European Heart Journal 30, 1142–1150. Beltowski J. a Kedra A. (2006). Asymmetric dimethylarginine (ADMA) as a target for pharmacotherapy. Lublin Poland: Pharmacological report: 58, 159-176. Chan N. N., Chan J. C. N. (2002) Asymmetric dimethylarginine (ADMA): a potential link between endothelial dysfunction and cardiovascular diseases in insulin resistance syndrome? Hong Kong, Chineese: Diabetologia: 45,1609–1616. Cooke J. P. (2000) Does ADMA cause endothelial disfunction? Thromb Vasc Biol: 9, 2032-2037. Dobutovic B., Smiljanić K., Soskić S., Dungen H. D. a Insenović E. R. (2011). Nitric oxide and its role in cardiovascular disease. The Open Nitric Oxide Journal: 3, 65-71. Dostál J. a Kaplan P. (2004). Lékařská chemie II.. Brno: Vydavatelství MU, Lékařská chemie: ISBN: 80-210-2731-2. Dostálek M. (2007). Oxidativní stres, biomarkery oxidativního stresu. Vanderbilt. University School of Medicine, Nashville: dostupné z URL 4. Dweik R. A. The lung in the balance: arginine, methylated arginines, and nitric oxide. American Physiological Society: 1, 15-17. Eliška O., Elišková M. (1995). Systematická, topografická a klinická ANATOMIE VII. SRDCE A CÉVNÍ SYSTÉM. Praha: Unitisk, ISBN: 80-7184-108-0. Fledler L. R. a Wojdak-Stothard B. (2009). The DDAH/ADMA pathway in the control of endothelial cell migration and angiogenesis. Biochem. soc. trans.: 12, 43–47 Fleming I. a Busse R. (1999) Signal transduction of eNOS activation. Cardiovascular Research: 8, 532-541. Stránka 43
Frey Ch., Narayanan K., McMillan K., Spack L., Gross S. S., Masters B. S. a Griffith O. W. (1994). L-thiocitrulin. The journal of biological chemistry: 9, 83-91. Furchgott R. F., Zawadzki J.V. (1980). The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature.;288: 373–376. Galley H. F. a Webster N. R. (2004). Physiology of the endotelium. British Journal of Anesthesia, 93-105-13. Gallová L. (2001). Reaktivní metaboliky kyslíku a dusíku produkované fagocyty. Brno, Diplomová práce. Masarykova universita, Přírodovědecká fakulta. Gocke N. (2004). L-arginine and hypertension. J. Nutr. 9, 2807–2811. Gornik H. L. a Creager M. A. (2004). Arginine and Endothelial and Vascular Health. J. Nutr. 134: 10, 2880–2887. Hazel L. a Roebuck K. A. (2001). Oxidant stress and endothelial cell dysfunction. American physiologycal society: 1, 36-61. Hoefen R. J. a Berk B. C. (2002). The role of MAP kinases in endothelial activation. NY US: Vascul Pharmacol.: 5, 271-3. Horký D. a Čech S (1999). Mikroskopická anatomie. Brno: Vydavatelství MU, 80-210-2208-6. Hořejší V. a Bartuňková J. (2005). Základy imunologie. Praha: Triton. ISBN: 80-7254-686-4. Ignarro L.J., Burke T.M., Wood K.S., Wolin M.S. a Kadowitz P.J.(1984). Association between cyclic GMP accumulation and acetylcholine-elicited relaxation of bovine intrapulmonary artery. J Pharmacol Exp Ther.: 3, 682–690. Jiang J.L., Wang S., Li N.S., Zhang X.H., Deng H.W., Li Y.J. (2007). The inhibitory effect of simvastatin on the ADMA induced in Flammatory reaction is mediated by MAPK pathways in endothelial cells. Biochem Cell Biol.: 2, 66-77. Joshi M. S., Ferguson T.B., Johnson F.K., Johnson R.A., Partasarathy S. a Lancaster J.R. (2007). Receptor-mediated activation of nitric oxide synthesis by arginine in endothelial cells. PNAS: 6, 104. Junqueira L. C., Carneiro J., Kelley R. O. (1997). Základy histologie. Vydavatelství H&K, ISBN 80-85787-37-7. Kamada, K., Angelis J. De, Roeder R. G. and Burley S. K.. (2001). Crystal structure of the CStránka 44
terminal domain of the RAP74 subunit of human transcription factor IIF. Proc. Natl. Acad. Sci.: 6, 960-966. Karásek D., Vaverková H., Halenka M. a Hutyra M. (2004). Endoteliální dysfunkce, možnosti její detekce a využití v klinické praxi. Interní medicína pro praxi: 9, 450-453. Kashiwagi S., Kajiura M., Yoshimura, Y. a Suematsu M. (2002). Nonendothelial source of nitric oxide in arterioles but not in venules. Circulation Research, 91, 55–64. Krause B.J. , Prieto C.P., Muñoz-Urrutia E., San Martín S., Sobrevia L., Casanello P. (2012). Role of arginase-2 and eNOS in the differential vascular reactivity and hypoxia-induced endothelial response in umbilical arteries and veins. Placenta 33 360-366 Krejčová D. (2005). Fyziologické účinky oxidu dusnatého. Brno: Bakalářská práce. Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie. Vedoucí práce doc. RNDr. Antonín Lojek, CSc. Kupková Z. a Beneš L. (2004). Chemické vlastnosti, biologické účinky a metody detekce biologického oxidu dusnatého. Chemické listy: 2, 116-122. Landim M.B.P., Filho A.C. a Chagas A.C.P. (2009). Asymmetric dimethylarginine (ADMA) and endothelial dysfunction: amplifications for atherogenesis. CLINICS 64, 471-8. Ledvina M., Stroskotalová A. a Cerman J. (2003). Biochemie pro studující medicíny I. díl. 1.vyd. Karolium, 80, 246-849. Leiper J., Nandi M., Torondel B., Murray-Rust J., Malaki M., Ohara B., Rosseter S., Anthony S., Madhani M., Selwood d., Smith C., Wojciak-Stothart B., Rudiger A.,Stidwill R., McDonald N.Q. a Vallence P. (2007). Disruption of methylarginine metabolism impairs vascular homeostasis. Nat. Med.: 2, 198-203 Li H., Forstermann U. (2000). Structure-Activity Relationship of Staurosporine Analogs in Regulating Expression of Endothelial Nitric-Oxide Synthase Gene. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics: 57, 427-435. Malík J. a Šimek J. (2003). Cévní stěna, endoteliální dysfunkce a nemocný s hyperlipoproteinemií. Kardiofórum: 3, 23-25.
Stránka 45
McCall T. B., Feelisch M., Palmer R. M. J. a Moncada S. (1991). Identification of N-iminoethyl-Lornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells. Br. J. Pharmacol., 102, 234-238. Moochhala S.M., Lu J., Xing M.C., Anuar F., Ng K.C., Yang K.L., Whiteman M., Atan S. (2005). Mercaptoethylguanidine inhibition of inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expressions induced in rats after fluid-percussion brain injury. J Trauma.: 8, 450-7. Murad F. (1996) Albert Lasker Medical Research Awards: signal transduction using nitric oxide and cyclic guanosine monophosphate. JAMA: 276, 1189 –1192. Murray A. R., Kisin E., Leonard S. S.,Young S. H. Kommineri C., Kagan V. E., Castranova V., Shvedova A. A. (2009). Oxidative stress and inflammatory response indermal toxicityof single-walled carbon nanotubes. Toxycology: 3, 161-171 Prachařová L. (2006). Reakce krevních destiček na poškození cévní stěny. Brno: Bakalářská práce. Masarykova uninerzita, Přírodovědecká fakulta, Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie živočichů a imunologie. Vedoucí práce RNDr. Milan Číž, Ph.D. Peterson D.A., Peterson D.C., Archer S. a Weir E.K. (1992) The non specificity of specific nitric oxide synthase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun: 9, 797-801. Raman M,, Chen W, a Cobb M,H, (2007). Differential regulation and Properties of MAPKS. Oncogene: 5, 3100-3012. Roček Z. (online). Obecná morfologie živočichů, oběhová soustava. URL 5. Ruan L.,Torres Ch. M., Qian J., Chen F., Mintz J.D., Stepp D.W., Fulton D. a Venema R.C. (2010). Pin1 Prolyl Isomerase Regulates Endothelial Nitric Oxide Synthase. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol.: 2, 392-398 Rumlová M., Pačes V. a Ruml T. (2006) Základní metody genového inženýrství. Sakuma I., Togashi H., Yoshioka M., Saito H., Yanagida M., Tamura M., Kobayashi T., Yasuda H., Gross S. S. a Levi R. (1992) NG-methyl-L-arginine, an inhibitor of L-arginine-derived nitric oxide synthesis, stimulates renal sympathetic nerve activity in vivo. A role for nitric oxide in the central regulation of sympathetic tone? Journal of the american heartassociation: 3, 607-611 Sethi, S. a Dikshit, M. (2000) Modulation of polymorphonuclear leukocytes function by nitric oxide. Thrombosis Research: 11, 223–247.
Stránka 46
Sydow K., Mondon C.E. a Cooke J.P. (2005). Insulin resistance: potential role of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor ADMA. Vasc. Med.: 10, 35 Široká R., Racek J. a Rajdl D. a Cibulka R. (2005). Asymetrický dimethylarginin-nový rizikový faktor kardiovaskulárních onemocnění. Vnitřní lékařství: 3, 249-255 Šípek S. a kol. (2000). Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci. Grada Publishing. ISBN: 80-7169-704-4. Štvrtinová V., Ferenčík M., Hulín I. a Jahnová E. (1998). Cievny endotel ako operátor prenosu informácií medzi kardiovaskulárnym a imunytným systémom. Bratislavske lekárske listy: 1,5-19. Talaibek B., Verin A.D., Birukova A., Lui F., Crow M.T., a Garcia J.G.N. (2003). Role of CaM kinase II and ERK activation in thrombin-induced endothelial cell barrier dysfunction. Maryland, US: AJP Lung Cellular and Molecular Physiology: 7: 43-54. Teerlink T. (2006). HPLC analysis of ADMA and other methylated l-arginine analogs in biological fluids. Journal of Chromatography: 5, 21–29. Thiemarmann Ch. (1998). The Use of Selective Inhibitors of Inducible Nitric Oxide Synthase in Septic Shock. Sepsis 1, 123–129. Tilton R.G., Chang K., Hasan K.S., Smith S.R., Petrash J.M., Misko T.P., Moore W.M., Currie M.G., Corbett J.A., McDaniel M.L. (1993). Prevention of diabetic vascular dysfunction by guanidines. Inhibition of nitric oxide synthase versus advanced glycation end-product formation. Diabetes: 2, 221-232. Toth J., Racz A., Kaminski P.M., Wollin M.S., Bagi Z. a Koller A. (2006). Asymmetrical Dimethylarginine inhibits Shear Stress–Induced Nitric Oxide Release and Dilation and Elicits Superoxide-Mediated Increase in Arteriolar Tone. Hypertension: 3, 563-568. Tousoulis D., Antoniades Ch., Goumas G., Stefanadis Ch. a Toutouzas P. (2002). L-Arginine in cardiovascular disease: dream or reality? Vascular Medicine 7: 203–211. Trojan S. A KOLEKTIV (2006). Lékařská fyziologie. Grada Publishing, ISBN 80-7169-788-5 Vácha M., Fellnerová I., Bičík V., Petrásek R. a Šimek V. (2008). Srovnávací fyziologie živočichů. Studio ARX, ISBN: 978-80-210-3379-5. Veresh Z., Racz A.,Lotz G.a Koller A. (2008). ADMA Impairs Nitric Oxide–Mediated Arteriolar Function Due to Increased Superoxide Production by Angiotensin II–NAD(P)H Oxidase Stránka 47
Pathway. Hypertension: 5, 960-966. Vráblík M., Janotová M., Motyková E. a Prusíková M. (2011). Endoteliální dysfunkce - první stádium aterosklerózy. Medicína v praxi: 3, 119-122. Wallis J. P. (2005). Nitric oxideand blood: rewiew. Transfusion medicine: 8: 1-11. Wascher T.C., Posch K., Wallner S., Hermetter A., Kostner G.M., Graier W.F. (1997). Vascular effects of L-arginine: anything beyond a substrate for the NO-synthase? Biochem. Biophys. Res. Commun.: 5, 35–38. Wolf D. J. a Lubeskie A. (1996). Inactivation of nitric oxide synthase isoforms by diaminoguanidine and NG-amino-L-arginine. Biochem. a Biophys. Arch.: 1, 227-234. Wu G. a Meininger C. (2000). Arginine Nutrition and Cardiovascular Function. The journal of nutricion: 11, 2626–2629. Wu G. a Morris S. (1998). Arginine metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem: 11, 1-17. Yoshizumi M., Abe J., Tsuchiya K., Berk B.C. a Tamaki T. (2003). Atheroprotective Effect of Laminar Fluid Shear Stress in Endothelial Cells: Possible Role of Mitogen-Activated Protein Kinases. J Pharmacol Sci 91, 172 – 176 Zakrzewicz D. a Eickelberg O. (2009). From arginine methylation to ADMA: A novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary medicine: 1, 5-9. Zhang W, Pettersson A, Thorén P a Hedner T. (1997).
Effects of 1,1-dimethylguanidine
administration on blood pressure, heart rate and renal sympathetic nerve activity in normotensive and spontaneously hypertensive rats. Acta Physiol Scand.: 1, 1-6. Zhu G., Gao X., Zhang F. a Wang W. (2004) Reduced nitric oxide in the rostral ventrolateral medulla enhances cardiac sympathetic afferent reflex in rats with chronic heart failure. Acta Physiologica sinica: 1: 47-53.
Stránka 48
13. Internetové zdroje URL 1: http://www.urgomedical.com/Pathophysiologies/Compression/The-venous-
system/In-the-cardiovascular-system URL 2: http://www.zdravi4u.cz/view.php?cisloclanku=2007061202 URL 3: http://www.nitricoxidesupplementsite.com/pre-workout-supplements URL 4: http://www.zdn.cz/clanek/postgradualni-medicina/oxidativni-stres-biomarkeryoxidativniho-stresu-300319 URL 5: http://rocek.gli.cas.cz/Courses/Microsoft%20Word%20-%20Morfologie13def.pdf
Stránka 49
