MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Rodina proteinů 14-3-3: Dvojsečná zbraň v nádorové biologii Bakalářská práce
Brno 2011
Jana Nováková
Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala Mgr. Pavlu Bouchalovi PhD. za odborné vedení, rady a korekce, poskytnuté materiály, cenný čas a za laskavý přístup. Také Mgr. Ivě Struhárové za neocenitelnou pomoc při provádění experimentu a jeho vyhodnocování, stejně tak jako za vstřícnost. Děkuji Mgr. Jakubu Tremlovi za vytvoření elektronické formy schémat působení proteinů 14-3-3 v G1/S a G2/M kontrolních uzlech buněčného cyklu. Zároveň bych tímto ráda vyjádřila vděčnost své rodině a přátelům za blízkost a podporu během studia. Můj největší dík patří mému Bohu, Ježíši Kristu. Práce byla řešena v rámci grantového projektu Grantové agentury České republiky č. P304/10/0868 a s podporou Evropského fondu pro regionální rozvoj (RECAMO; CZ 1.05/2.1.00/03.0101).
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Rodina proteinů 14-3-3: Dvojsečná zbraň ve vývoji nádorů vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Pavla Bouchala PhD. za použití uvedených zdrojů a literatury. V Brně, 10. 05. 2011
…………………………… Jana Nováková 2
Informovaný souhlas pacientů Pacienti Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) dávají informovaný souhlas s podstoupením operačního výkonu. MOÚ užívá řadu informovaných souhlasů podle účelu a povahy výkonu. Součástí souhlasů jsou také prohlášení, že pacient souhlasí s tím, že: „v rámci běžných diagnostických postupů byl odebrán z jeho těla biologický materiál, který může být použit pro výzkumné účely“ a aby „údaje z jeho zdravotnické dokumentace (demografické údaje, údaje o zdravotním stavu, údaje o poskytnuté zdravotní péči) mohly být využívány zdravotnickými pracovníky MOÚ pro vědecké studie v oboru lékařské vědy či v příbuzném oboru s tím, že mimo zdravotnické pracovníky MOÚ budou tyto údaje sdělovány výlučně v anonymizované podobě, tj. nikdo z těchto údajů nepozná, že se týkají pacientovy osoby.“
3
OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................................................. 6 2. ÚVOD ........................................................................................................................................................... 8 3. TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................................................ 9 3.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ 14-3-3...................................................................... 9 3.1.1 Objevení a název ............................................................................................................................. 9 3.1.2 Výskyt .............................................................................................................................................. 9 3.1.3 Struktura ....................................................................................................................................... 10 3.1.4 Vazebné vlastnosti......................................................................................................................... 11 3.1.5 Význam a funkce ........................................................................................................................... 14 3.2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU .............................................................................................. 16 3.2.1 Přechod z G2 fáze do mitózy ......................................................................................................... 17 3.2.2 Přechod z G1 do S fáze .................................................................................................................. 19 3.2.3 FOXO............................................................................................................................................ 20 3.3. APOPTÓZA ....................................................................................................................................... 21 3.3.1 Rodina Bcl-2 ................................................................................................................................. 21 3.4 POTENCIÁLNÍ ONKOGENY .......................................................................................................... 23 3.4.1 Ras-Raf-MAPK ............................................................................................................................. 23 3.4.2 Bcr-Abl.......................................................................................................................................... 23 3.4.3 Cbl................................................................................................................................................. 24 3.4.4 IGF-IR-IRS-1-PI-3K ..................................................................................................................... 24 3.4.5 TERT ............................................................................................................................................. 24 3.4.6 Histonové deacetylázy (HDACs)................................................................................................... 25 3.4.7 Integriny........................................................................................................................................ 25 3.5 14-3-3Σ (STRATIFIN)......................................................................................................................... 26 3.5.1 Struktura ....................................................................................................................................... 26 3.5.2 Regulace exprese 14-3-3σ ............................................................................................................. 27 3.5.3 14-3-3σ a vznik nádorů ................................................................................................................. 29 3.5.4 Metastázování a invazivita nádorů ............................................................................................... 30 3.5.5 Terapeutika ................................................................................................................................... 31 3.6 PRINCIP POUŽITÝCH METOD ..................................................................................................... 32 3.6.1 SDS Gelová polyakrylamidová elektroforéza (SDS PAGE).......................................................... 32 3.6.2 Western Blotting............................................................................................................................ 32 3.6.3 iTRAQ-2DLC-MS/MS ................................................................................................................... 33 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................................................... 35 4.1 MATERIÁL A METODY .................................................................................................................. 36
4
4.1.1 Přístroje a materiál....................................................................................................................... 36 4.1.2 Použité chemikálie ........................................................................................................................ 36 4.1.4 Metody .......................................................................................................................................... 38 4.2 VÝSLEDKY ........................................................................................................................................ 40 5. DISKUSE ................................................................................................................................................... 43 6. SOUHRN.................................................................................................................................................... 45 7. SUMMARY................................................................................................................................................ 46 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...................................................................................................... 47
5
1. SEZNAM ZKRATEK Abl
Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1
ADAM22
a disintegrin and metalloprotease domain 22
AKT
proteinová rodina protein kinas b
APS
ammonium persulphate
ASK
apoptosis signal-regulating kinase
BAD
Bcl-2-associated death promoter
BAK
Bcl-2 homologous antagonist/killer
BAX
Bcl-2–associated X protein
Bcl-2
B-cell lymphoma 2
Bcl-XL
B-cell lymphoma-extra large
Bcl-XS
B-cell lymphoma-extra small
Bcr
breakpoint cluster region
Bfl-1/A1
B cell lymphoma-2–related gene expressed in fetal liver-1/A1
BID
BH3 domain interacting death agonist
BRCA1
breast cancer growth suppressor protein 1
BSA
bovine serum albumin
Cbl
casitas B-lineage lymphoma
CDC2
cell division control protien 2
CDC25
cell division cycle 25
Chk1
checkpoint kinase 1
CDK
cyclin-dependent kinase
CRD
cysteine rich domain
CSB
complete sample buffer
C-TAK1
Cdc twenty-five C associated protein kinase
DEAE
diethylaminoethanole
DNMT
DNA methyltransferase
ECL
enhanced chemiluminiscence
EFP
estrogen-induced zinc finger protein
FOXO
the forkhead box O
Gx fáze
gap phase 6
GPIbα
glycoprotein Ib α
HDACs
histone deacetylases
HPLC
high performance liquid chromatography
IGF-1R
insulin-like growth factor 1 receptor
IRS-1
insulin receptor substrate 1
iTRAQ-2DLCMS/MS
isobaric tags for relative and absolute quantification and twodimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry
M fáze
mitosis phase
MAPK
mitogen-activated protein kinase
Mcl-1
induced myeloid leukemia cell differentiation protein
MEK = MAPKK
mitogen-activated protein kinase kinase
MOPS
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
MOÚ
Masarykův onkologický ústav
NHS
N-hydroxysuccinimide
P130Cas
protein 130 Crk-associated substrate
KIP1
p27
protein 27
PBS
phosphate buffered saline
PI-3K
phosphatidylinositol 3 kinase
Raf
rapidly accelerated fibrosacroma
RAMPx
rabbit anti mouse peroxidase
Ras
rat sarcinoma
S fáze
synthesis phase
SDS
sodium dodecyl sulphate
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED
N, N, N´, N´- tetramethylethylendiamin
TERT
telomerase reverse transcriptase
TRP
tetratricopeptide repead helices
7
2. ÚVOD Rodina proteinů 14-3-3 je velmi rozmanitá, přitažlivá a rozhodně ne nudná. Je zapojena v mnoha buněčných pochodech u živočichů i rostlin. Tato bakalářská práce však bude věnována okruhu jejich působení, o němž se ve společnosti mluví lehčeji, netýká-li se přímo nás nebo někoho blízkého, nikdy však ne lehce. Jde o rakovinu. Jak již název práce napovídá, proteiny 14-3-3 zde budou nastíněny jako dvojsečná zbraň v nádorové biologii. Nebo možná jako herci. Herci s mnoha rolemi a mnoha tvářemi. Rádi se převlékají z jedné role, z jedné funkce v buňce, do druhé a nasazují si při tom masky. Jednou milé a dobré, když buňce s poškozenou DNA nedovolí pokračovat v buněčném cyklu, jindy zlé a škaredé, pokud té samé buňce umožní neuposlechnout příkaz o tom, že má raději sama sebe zabít, než aby později zničila celý organismus. K důkladnému pochopení charakteru divadelních postav je často potřeba podívat se i za jeviště do míst, která se samotným představením na první pohled příliš nesouvisí. Zaměříme se tedy i na strukturu a vazebné vlastnosti 14-3-3, protože právě z nich vyplývá způsob, jakým 14-3-3 interagují s klientními proteiny. Hlavním hrdinou dramatu je 14-3-3σ, známý také jako stratifin. Ani kladný, ani záporný. I u něho se projevuje rozpolcený charakter vlastní celé rodině. Točit se kolem něj budeme rovněž v experimentální části práce. Všem čtenářům přeji, aby si na následujících stranách užili „dobrodružství“ s rodinou 14-3-3 a aby je uchvátila tak, jako si získala mě.
8
3. TEORETICKÁ ČÁST
3.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ 14-3-3 3.1.1 Objevení a název Proteiny 14-3-3 jsou hojně se vyskytující polypeptidy kyselé povahy, o velikosti monomeru 28-32 kDa [1, 2] a velkém množství isoelektrických bodů [8]. Poprvé je identifikovali Moore a Perez v roce 1967 [3, 10, 12, 15], řidčeji se můžeme setkat i s letopočtem 1968 [11, 13].
Stalo se tak během analýzy proteinového složení hovězí mozkové tkáně, se zaměřením na bílkoviny rozpustné ve vodě. Při práci využívali podomácku vyrobenou aparaturu pro DEAE-celulózovou chromatografii a s její pomocí získané frakce dále vyhodnocovali elektroforézou na škrobovém gelu [8, 10, 12, 15]. A právě díky těmto dvěma separačním metodám dostaly 14-3-3 své neobvyklé jméno. Z chromatografické kolony totiž vystoupily ve 14. frakci a v následujícím kroku se staly součástí podílu nazvaného 3.3 [12]. Rodina 14-3-3 má různý počet členů v závislosti na zkoumaném organismu, u savců jich však najdeme sedm. Své pojmenování isoformy dostaly podle pořadí, v jakém eluovaly z HPLC [13]. Rozeznáváme tedy 14-3-3 β, γ, ε, ζ, σ, τ a 14-3-3 η [1, 2, 4, 5, 6]. Fosforylovaná forma 14-3-3β se značí jako α a pokud se setkáme se 14-3-3δ, jde o fosforylovanou 14-3-3ζ [15]. Každá z
isoforem je kódována svým vlastním,
charakteristickým genem [2, 4].
3.1.2 Výskyt Rodina proteinů 14-3-3 vykazuje vysokou homologii a nachází se ve všech eukaryotických organismech od kvasinek přes octomilky a africké žáby rodu Xenopus [4] až k savcům [2] včetně člověka [4]. Přičemž u kvasinek, Drosophila a Caenohabditis elegans se vyskytují dvě isoformy, u rostlin třináct (podle některých zdrojů patnáct [10, 14]) a u savců sedm [2]. A právě těmito sedmi členy rodiny 14-3-3 se budeme dále zabývat. Je důležité, že každý ze sedmi podtypů má jiné rozšíření a lokalizaci.
9
14-3-3ζ se ve vysoké koncentraci nachází v šedé hmotě mozkové. Isoformy β, γ a η nalezneme především v Purkyňových buňkách mozečku, ε v hypofýze a τ v gliových buňkách bílé hmoty [15]. Jednotlivé isoformy jsou vysoce konzervativní a jsou přítomny nejen v mozku, ale i v různých lidských tkáních [7]. Například 14-3-3 τ a σ jsou ve zvýšeném množství exprimovány v epiteliálních buňkách a T lymfocytech [12, 13]. Rozdíly v distribuci a množství odrážejí funkční rozdílnost jednotlivých podtypů [15].
3.1.3 Struktura Trojrozměrná struktura proteinů 14-3-3 byla odhalena rentgenovou strukturní analýzou u krystalů isoforem ζ a τ. S ohledem na vysokou homologii v rámci celé rodiny lze výsledky zobecnit na celou skupinu [8, 12]. Sekvenční homologie je vysoká jak v rámci jednotlivých isoforem, tak i mezi 14-3-3 vyskytujícími se u různých živočišných druhů [15]. Proteiny 14-3-3 se pořadím aminokyselin a tím pádem i strukturou odlišují od většiny ostatních bílkovin. Jedinou významnější podobnost lze najít v oblasti TRP (tetratricopeptide repeat helices), která se nachází u širokého spektra proteinů. Skládá se ze sady 3-16 motivů, které dohromady zformují nosné struktury schopné zprostředkovávat spojení mezi dvěma proteiny i sdružování multiproteinových komplexů [12]. Struktura monomeru Každý monomer se skládá z devíti antiparalelně uspořádaných α helixů [3], seskupených do N-koncové a C-koncové domény [12], takže v konečném důsledku vytvářejí formaci, která připomíná písmeno L [8] nebo třeba šálek na čaj [14]. Vnitřní část struktury se skládá ze čtyř helixů: α3 a α 5, které obsahují polární, nabité aminokyseliny α 7 a α 9 s vysokým obsahem nepolárních, hydrofobních aminokyselin [8]. Velmi zajímavý je fakt, že struktura vnitřní části, tvořící vazebnou kapsu, je v rámci celé proteinové rodiny víceméně konzervativní. Naproti tomu vnější povrch monomeru vykazuje vysokou variabilitu [3].
10
Struktura dimeru Monomery proteinů 14-3-3 mají schopnost se samy sdružovat do homo nebo heterodimerů s tím, že někteří členové rodiny – především σ a γ – upřednostňují homodimerizaci, zatímco jiní – hlavně ε – preferují tvorbu heterodimerů [1]. Dimerizace nastává mezi N-koncovými doménami [12]; tedy mezi helixem α1 prvního a řetězci α3 a α
4
druhého monomeru. A právě vysoká podobnost v pořadí
aminokyselin u α1 a α 3 umožňuje výše zmíněnou heterodimerizaci [8]. Ale nezávisle na tom, jestli se dimer skládá ze dvou stejných nebo různých podjednotek, má vždy podobný tvar. Při pohledu zepředu připomíná řecké písmeno ω. Jeho vnitřní část je tvořena helixy α1, α3 a α4 a šroubovice α 5 až α9 jsou uskupeny do vnější struktury, která ohraničuje jako zeď dvě vnitřní vazebná místa pro ligandy z řad peptidů nebo proteinů [12]. Jsou uspořádána opačným směrem, jakoby naproti sobě [3, 12]. Tento fakt je velmi důležitý pro pochopení funkcí proteinů 14-3-3. Díky dvěma vazebným místům mohou současně interagovat s:
dvěma klientními proteiny a upravovat tak jejich aktivitu a účinky. Je
pravděpodobné, že tento způsob existuje jen pro určité, specifické páry. Příkladem může být třeba souběžné vázání Raf-1 s Brc nebo A20. (Fyziologický dopad zatím nebyl objasněn.)
pouze jediným proteinem, ovšem za vzniku daleko pevnější vazby,
pokud ligand obsahuje vazebné motivy s nízkou schopností interakce. Za tuto skupinu můžeme jmenovat například Cbl. Nebo, pokud protein obsahuje dvě vazebná místa s vysokou afinitou ke 14-3-3, např. Raf-1, má spojení za následek změnu jeho konformace a tím pádem i funkce [3]. Jak nepřímo vyplývá z výše uvedeného, ke vzniku interakce musí být přítomen motiv o specifické struktuře nejen na 14-3-3, ale i na proteinu, který se s ním váže. Jelikož se jedná o velmi důležitou problematiku, bude jí věnována následující podkapitola.
3.1.4 Vazebné vlastnosti Homo i heterodimery proteinů 14-3-3 interagují s řadou buněčných proteinů, jejichž počet se podle střízlivých odhadů pohybuje kolem dvou set [6], jiné zdroje mluví až o sedmi stech [4]. Jiné označení pro ně zní klientní proteiny. V antickém světě se klientem rozuměla osoba závislá na svém ochránci, zatímco v současném jazyce je jako klient 11
označován spíše někdo, kdo využívá služby jistého odborníka [9]. A přesně tyto dva významy vystihují vztah proteinů 14-3-3 a jejich ligandů. V důsledku vazby na protein rodiny 14-3-3 u klientního proteinu může dojít k aktivaci nebo represi jeho enzymové aktivity či funkce, zamezení jeho degradace či zabránění pohybu proteinu z cytoplazmy do jádra nebo naopak [4]. Vazebné motivy klientních proteinů Jak bylo objasněno výše, struktura vazebného místa je vysoce konzervativní, dokonce i mezi jednotlivými členy rodiny 14-3-3. A proto musí ligandy obsahovat taktéž vysoce konzervativní vazebné motivy. Většina z nich je závislá na předchozí fosforylaci, avšak malé množství proteinů se může vázat na 14-3-3 pomocí specifických sekvencí, které fosforylaci nevyžadují [4]. Motivy spojené s fosforylací K jejich odhalení došlo pomocí kinázy Raf [12]. Ukázalo se, že předchozí fosforylace proteinu je nepostradatelná pro jeho navázání na 14-3-3. Muslin et al. poskytli důkaz o dvou vazebných motivech:
RSXpSXP (modus 1) je podporovaný v pozici -1 aromatickými nebo kladně nabitými aminokyselinami
RXXXpSXP (modus 2), u něhož nacházíme aromatické aminokyseliny v pozici -2, aminokyselinové zbytky s kladným nábojem v poloze -1 a Leu, Glu, Ala nebo Met v poloze +1 [15] V obou případech pS znamená fosfoserin [1], X značí aminokyselinu. Nově došlo k objevení C-koncového vazebného motivu SWTX (modus 3),
známého u šesti vazebných proteinů; X znamená jakoukoli aminokyselinu kromě prolinu [14]. Mezi ligandy rodiny 14-3-3, které jsou závislé na fosforylaci, patří například [11]: o kinázy (Raf-1, kináza MEK, kináza P13) o receptory (receptor pro glukokortikoidy) o enzymy (tyrosin a tryptofan hydroxyláza, N-acetyltransferáza) o strukturní a cytoskeletální proteiny (vimentin a keratiny) o proteiny zapojené v regulaci buněčného cyklu (CDC25, p53, p27 a WEE1) o transkripční faktory (proteiny vážící se na TATA-box) 12
o proteiny navozující apoptózu (BAD) Motivy nezávislé na fosforylaci Ačkoli většina, minimálně více než polovina [14], proteinů využívá pro spojení se 14-3-3 fosforylované sekvence, není tomu tak ve všech případech. Proteiny 14-3-3 jsou schopné interakce i s nefosforylovanými ligandy a je více než pravděpodobné, že obě dvě skupiny využívají totéž vazebné místo na 14-3-3. Napovídá tomu i fakt, že interakce s nefosforylovanými klientními proteiny neproběhne v přítomnosti fosforylovaných ligandů. Tato třída klientních proteinů využívá dva vazebné motivy [3]: RSESEE, který je podobný již zmiňovanému modu 1, tedy RSXpSXP RSX1-3E motiv objevený s využitím bakteriofágních proteinů Z proteinů, které se váží s 14-3-3 nezávisle na fosforylaci, lze jmenovat například [10, 3]: o Exoenzym S o R18 o Raf-1, která obsahuje třetí, na fosforylaci nezávislé místo pro vazbu 14-3-3, velmi bohaté na Cys. Bývá proto označováno jako CRD (cysteine-rich domain) o GPIbα nacházející se v krevních destičkách o 5-fosfatáza Na první pohled by se mohlo zdát, že ligandy se sekvencí, jenž nevyžaduje fosforylaci, jsou znevýhodněné oproti silnější a početnější skupině. Není to však pravidlem, neboť vazba, kterou vytvoří, je velmi stabilní a vysokoafinitní, srovnatelná s vysokoafinitní u fosforylovaných proteinů, které ji však ne vždy musí vytvořit [3], jak bude vysvětleno dále.
Síla interakce Nezávisle na potřebě fosforylace se zdá, že různá vazebná místa se na 14-3-3 váží s různou silou či razancí a pokud je jich na proteinu víc, jejich účinek se násobí. Ligand se dvěma motivy se váže třicetkrát silněji než ten s jedním. U většiny proteinů najdeme jedno hlavní místo, které plní roli „strážce“ nebo „vrátného“. Pokud chybí nebo není fosforylované, afinita druhotných vazebných míst k 143-3 je příliš slabá na to, aby přerostla ve stabilní interakci. Na druhou stranu, když je dominantní místo fosforylované a spojí se s jedním z vazebných míst v molekule dimeru 13
14-3-3, druhotná místa jsou rovněž schopná interakce a dodávají celému komplexu mnohem vyšší stabilitu.
3.1.5 Význam a funkce V době svého objevu byly 14-3-3 považovány za sice hojně rozšířené (tvoří 1% všech ve vodě rozpustných bílkovin v centrální nervové soustavě [3]), avšak funkčně nikterak důležité proteiny. Na své „znovuobjevení“ si musela tato jedinečná rodina zhruba dvě desetiletí [15] počkat. První funkcí,
připsanou těmto proteinům, byla aktivace tyrozinových a
tryptofanových hydroláz, což jsou enzymy podílející se na syntéze serotoninu, katecholaminu, dopaminu a dalších neurotransmiterů. Následně se ukázalo, že regulují (konkrétně inhibují) aktivitu protein kinázy C a jsou schopny interakce s Brc. Od tohoto objevu byl již jen krůček ke zjištění, že tvoří komplexy s nepřeberným množstvím kináz, fosfatáz a dalších proteinů [12], které kontrolují například [2, 4, 12, 13]: průběh buněčného cyklu (CDC25) vnitrobuněčnou signalizaci (Raf-1) odpověď na stres a apoptózu (BAD, což je protein vázající se na Bcl-2) regulaci transkripce buněčný metabolismus integritu cytoskeletu Mimo to hrají – díky svému přirozenému výskytu v savčím mozku – roli při vzniku neurodegenerativních
onemocnění
jako
je
Creutzfeldt-Jakobova
nemoc
nebo
Alzheimerova a Parkinsonova nemoc [12]. To staví 14-3-3 do role velice důležitých buněčných regulátorů a mnohé způsoby jejich působení jistě ještě čekají na své odhalení. Následující kapitoly však budou pojednávat o úloze 14-3-3 v oblasti vývoje nádorů. Na základě mnohých výzkumů má největší vliv při tomto procesu jejich zapojení v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Následně se více zaměříme na negativní stranu charakteru 14-3-3 – shrneme si jejich roli ve tvorbě nádorů, kdy se mohou chovat jako
14
možné onkogeny. Tento potenciál je dán schopností regulovat rozmanité produkty vzniklé transkripcí onkogenů stejně jako produkty genů, jenž vznik nádorů potlačují [14, 15]. V předposlední kapitole teoretické části se zastavíme u zcela výjimečného člena rodiny 14-3-3, a to u isoformy σ. Ze strukturních odlišností pochopíme důvody jeho jedinečné reaktivity, shrneme způsoby, jakými může být regulován a nakonec bude rozvinuta i jeho úloha v tumorigenezi, metastázování nádorů a ve spojitosti s nádorovými terapeutiky.
15
3.2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU V následujících dvou kapitolách rozebereme úlohu 14-3-3 v průběhu života buňky i při její smrti: buněčný cyklus a apoptózu. Čtenář při tom bude mít možnost porozumět dvojsečnému charakteru 14-3-3 ve vývoji a vzniku nádorů. Buněčný cyklus je uspořádaný sled událostí v životě eukaryotické buňky, od jejího vzniku dělením rodičovské buňky až do jejího vlastního rozdělení na dvě nové buňky. Skládá se z fází M, G1, S a G2 [30]. Zdárný průběh buněčného cyklu je velmi důležitý pro udržení integrity genomu. Proto se hned několik kontrolních mechanismů stará o to, aby buňka do další fáze cyklu vstoupila až po zkontrolování dokončení fáze předchozí [4]. V buňce proto nalézáme tzv. řídící soustavu buněčného cyklu. Občas bývá přirovnávána k programátoru automatické pračky. Stejně jako on pracuje i řídící soustava samovolně, poháněna zabudovaným časovačem. A stejně jako prací cyklus je i ten buněčný ovlivněn vnějšími (u pračky např. dodávka vody) i vnitřními (čidla hlídající, kdy se buben naplní vodou) zásahy. Buněčný cyklus lze takto ovlivnit ve třech místech, nazývaných jako kontrolní nebo též rozhodovací uzly. Nacházejí se v G1, G2 a M fázi [30]. Rodina proteinů 14-3-3 je významně zapojena v G2 a G1 kontrolním uzlu buněčného cyklu [4].
Obr. č. 1: Řídící soustava buněčného cyklu na mechanickém modelu [30].
16
3.2.1 Přechod z G2 fáze do mitózy U dělící se buňky se střídá mitotická fáze s interfází, růstovým obdobím. Po první části interfáze (G1) následuje S-fáze, kdy se zdvojují chromozomy. Závěrečná část interfáze se označuje G2. V průběhu M-fáze dochází k rozdělení jádra na dvě dceřiná se stejnou genetickou informací [30]. Stěžejním regulačním krokem pro přechod G2/M je u eukaryot aktivace komplexu CDC2-cyklin B, který spouští vstup do mitózy a stal se proto díky této své funkci rovněž známý pod názvem „faktor podporující M-fázi“. Hlavním místem zásahu regulačních faktorů je v komplexu právě protein kináza CDC2. Aktivuje se defosforylací [3, 24].
Obr. č.2: Schématické působení 14-3-3 v souvislosti s komplexem CDC2-cyklin B v G2/M kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]).
CDC25 Fosfatáza CDC25 je klíčový aktivátor kinázy CDC2. Není proto překvapením, že díky své důležitosti je silně regulována [3]. V následující části budou shrnuty hlavní regulátory, mezi nimiž mají výsadní postavení právě proteiny 14-3-3. Proteiny 14-3-3 Ovlivňují fosfatázu CDC25 dvěma způsoby. Jednak změnou funkce a jednak změnou lokalizace. Během interfáze, kdy je nežádoucí vstup do mitózy, je CDC25 deaktivována vazbou 14-3-3 po předchozí fosforylaci. Pokud je 14-3-3 neschopen vazby, dojde ke vstupu do mitózy i v případě poškození DNA.
17
Aby mohla CDC25 vykonávat svou funkci iniciátora mitózy, je potřebný vstup do jádra, kde se nachází CDC2. Interakce se 14-3-3 velmi dobře koreluje s jejím umístěním v cytoplazmě, ačkoli mechanismus tohoto děje nebyl doposud spolehlivě objasněn. Vlastní interakce CDC25-14-3-3 rovněž podléhá regulaci. Kinázy jako Chk1, Chk2 nebo C-TAK1 specificky fosforylují v reakci na buněčné signály fosfatázu CDC25 na Ser216 [3, 4, 25]. Chk1 Po poškození DNA je aktivována Chk1 [11], která, jak už bylo zmíněno výše, fosforyluje CDC25. K její aktivaci je však potřebná i vazba 14-3-3 [4], což znamená, že 14-3-3 jsou jí nejen regulovány, ale vystupují rovněž jako její regulátory. WEE1 Tato kináza inaktivuje komplex CDC2-cyklin B fosforylací CDC2. Rovněž patří mezi regulační cíle 14-3-3. Při společné expresi WEE1 a 14-3-3β roste účinnost WEE1 a tím i zabránění vstupu buňky do mitózy. Avšak isoforma τ má na WEE1 naprosto opačný účinek: pokud se na ni po předchozí fosforylaci naváže, deaktivuje WEE1 rozpadem v cytoplazmě. To umožňuje vstup do mitózy. Tyto poznatky nutně vedou k závěru, že jednotliví členové proteinové rodiny 14-3-3 mají při regulaci buněčného cyklu odlišné funkce [4, 24]. Protein 14-3-3σ (Stratifin) Po poškození DNA se zvýší produkce 14-3-3σ. Jistou úlohu sehrává i BRCA1 ve spolupráci s p53. Stratifin inaktivuje CDC2 a zabraňuje tím vstupu buňky do mitózy [4]. Děje se tak změnou její lokalizace, protože 14-3-3σ znemožní vstup do jádra a tím pádem i zahájení mitotické fáze [3]. Buňky, kterým chybí 14-3-3σ, po poškození DNA ztrácí schopnost zastavit se v G2/M kontrolním bodu a začnou se nekontrolovatelně dělit [4]. Pokud bychom tedy měli shrnout funkci 14-3-3 při přechodu z G2 do M fáze buněčného cyklu, lze konstatovat, že po poškození DNA či jiných signálech zadržují buňku v G2 fázi a brání jejímu dalšímu dělení.
18
3.2.2 Přechod z G1 do S fáze Tento kontrolní uzel se zdá být pro většinu buněk nejdůležitějším. Jestliže v něm buňka obdrží signál, obvykle dokončí cyklus a rozdělí se. Jestliže v tomto bodu naopak spouštěcí signál neobdrží, přenese se do nedělícího se stavu, nazývaného G0 fáze. V té se nachází většina buněk lidského těla [30]. Pro přechod G1/S je rozhodující přítomnost a aktivita CDK komplexů, analogů mitotického komplexu CDC2-cyklin B. Pro svoji důležitost jsou i ony vysoce regulovány různými molekulami, mezi nimiž jsou opět důležité 14-3-3. V následujících podkapitolách budou uvedeny podrobnější informace o jednotlivých regulátorech CDK komplexů, které souvisejí se 14-3-3 [4].
Obr. č. 3: Schématické působení 14-3-3 v souvislosti s komplexem CDK-cyklin v G1/S kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]).
CDC25A Fosfatáza CDC25A zaujímá funkci ústředního regulátora v tomto kontrolním bodě buněčného cyklu. Defosforyluje CDK2 na Thr-14 a Thr-15 a tím jí umožňuje vykonat její úlohu. Proteiny 14-3-3 ji inaktivují rozpadem v cytoplazmě. 14-3-3σ Stratifin je v rámci své rodiny skutečně výjimečný, neboť jako jediný může interagovat přímo s kinázami CDK2 a 4. Výzkumy ukázaly, že 14-3-3σ zabránil inaktivací činnosti komplexu CDK-cyklin pokračování buněčného cyklu u buněk rakoviny prsu [4]. 19
p27KIP1 Tento buněčný regulátor inaktivuje komplex CDK-cyklin a zapříčiňuje tím zastavení v G1 fázi buněčného cyklu [4]. Plní tedy funkci nádorového supresoru a jeho hladina je snížena v mnoha typech lidských nádorů [2]. Jestli však p27KIP1 bude skutečně působit jako inhibitor, závisí na jeho koncentraci, případné vazbě s dalšími komplexy a jeho lokalizaci. A právě umístění je regulováno fosforylačně-dependentní vazbou s proteiny rodiny 14-3-3. Je k němu, jako ve většině případů, potřebná předchozí fosforylace, o níž se stará kináza zvaná AKT. Svou práci může vykonat na dvou odlišných threoninových zbytcích:
Po fosforylaci na Thr-198 se p27KIP1 váže s 14-3-3ε, η a τ ( nikoli však s β a ζ)
a je zadržen v cytoplazmě. To znamená, že AKT tímto způsobem podporuje aktivaci CDK a pokračování v buněčném cyklu.
Pokud proběhne fosforylace na Thr-157, vytvoří se vazebné místo pro 14-3-
3β, ε, γ, τ, ζ (avšak nikoli pro σ) a dochází k přemístění p27KIP1 v cytoplazmě a opět se tím otevírá cesta k pokračování v buněčném cyklu [4]. Jde tedy o – v této skupině výjimečný – případ, kdy 14-3-3 nezastavily, ale pomohly spustit průběh buněčného cyklu.
3.2.3 FOXO Transkripční faktory FOXO (the forkhead box O) neovlivňují přímo aktivitu CDK ani CDC2 komplexů. Jejich vliv na průběh buněčného cyklu je však natolik významný, že je nelze opomenout. Jde o klíčové regulátory funkcí inzulinu a ostatních faktorů, které aktivuje níže zmíněná dráha PI-3K-AKT. Jsou zapojené v mnoha biologických procesech, jako je délka života buňky, buněčná smrt a buněčný cyklus [2]. Konkrétně v buněčném cyklu zprostředkovávají zastavení v G1 fázi aktivací genu pro p27KIP1 , která probíhá přes jednu z isoforem 14-3-3. Zároveň jsou zapletené do regulace přechodu z G2 do M fáze buněčného cyklu. Zřejmě i v tomto případě jsou zapojené proteiny 14-3-3 [4]. Znamená to tedy, že transkripční faktory FOXO patří mezi nádorové supresory a rodina 14-3-3 jejich práci zdárně podporuje.
20
3.3. APOPTÓZA Apoptózou rozumíme konečné stádium geneticky řízeného děje, kdy geny, které jsou naprogramované k buněčné smrti, spustí na základě určitých podnětů kaskádu sebevražedných proteinů [30]. Fenomén programované buněčné smrti je běžným jevem u obratlovců i bezobratlých a poprvé byl pozorován v 50. letech 20. století. Sehrává důležitou úlohu v mnoha fyziologických pochodech, jako je například embryonální vývoj, homeostáza již diferenciovaných tkání nebo odstranění imunitních buněk, které reagují s vlastními strukturami a vyvolaly by tak vznik autoimunitního onemocnění. Selhání apoptózy je příčinou řady nemocí, mimo jiné i rakoviny [30]. Za normálních podmínek buňka osciluje v rovnováze mezi pro-apoptickými a antiapoptickými signály, které mohou být posunuty extracelulárními vlivy. Proteiny 14-3-3 hrají důležitou roli v několika apoptických drahách [16]. Nejvýznamnější z nich jsou spojeny s rodinou Bcl-2, kterou se budeme nadále zabývat.
3.3.1 Rodina Bcl-2 Členové této rodiny jsou významnými regulačními proteiny v oblasti apoptózy indukované mnoha rozdílnými stimuly [27]. Lze je rozdělit na: o Proteiny pro-apoptické (BAD, BID, BAX, Bak, Bcl-xs) o Proteiny anti-apoptické (Bcl-2, Bcl-XL, Bfl-1/A1, Mcl-1) Nejrozsáhleji studovanými proteiny, u kterých se navíc jako u jediných prokázala vazba se 14-3-3, jsou BAD a BAX [16]. BAX Za normálních okolností se BAX vždy nachází v cytoplazmě v neaktivním stavu. Po poškození DNA, pokud v buňce z nějakého důvodu chybí 14-3-3σ, se BAX přemístí do mitochondrie a do oblasti centrosomů a nutí buňku k rychlé apoptóze. Pokud je však 14-3-3σ přítomen, situace vypadá naprosto jinak. Interaguje s BAX a zadrží jej v cytoplazmě [11]. To buňce umožní neuposlechnout apoptické signály a existuje dále i s poškozenou DNA.
21
BAD BAD, stejně jako ostatní homology Bcl-2, je schopný dimerizovat s některými členy své vlastní proteinové rodiny. Má nespornou důležitost jako mediátor apoptózy hned ze dvou důvodů, kterými je vysoké rozšíření v lidských tkáních a koncentrace dynamicky regulovaná apoptickými stimuly [3]. BAD zapříčiňuje buněčnou smrt tím, že svou vazbou inaktivuje anti-apoptické proteiny Bcl-2 nebo Bcl-x. To se může změnit díky fosforylačně-dependentní vazbě 14-3-3. Ta způsobí konformační změny BAD, které vyústí v jeho oddělení od Bcl-2 a Bcl-x. Vliv BAD, jenž by vedl k apoptóze, je tím potlačen. Na jednu stranu to buňce poskytuje více času na opravy DNA, na druhou stranu se může začít nekontrolovatelně dělit a v případě nerozeznání imunitním systémem se změnit v nádor [11]. Lze si tedy povšimnout skutečně dvojí tváře proteinů 14-3-3: na jednu stranu figurují jako ochránci v kontrolních uzlech buněčného cyklu, kdy svými regulačními mechanismy nepustí do další fáze buňku s poškozenou DNA. Navíc působí synergisticky s proteinem p53 [4]. Na druhou stranu umožňují svým anti-apoptickým působením buňce nepodlehnout signálu, který ji nutí spáchat sebevraždu. To jim propůjčuje masku potenciálních onkogenů. Protože však nejde o jediný případ takovéhoto jejich chování, bude čtvrtá část shrnutí vlastností proteinů 14-3-3 věnována právě případům, kdy svým regulačním působením podporují tumorigenezi.
22
3.4 POTENCIÁLNÍ ONKOGENY Jak jsme si ukázali v kapitole 3.1.4, proteiny 14-3-3 mají schopnost vázat a regulovat veliké množství klientních proteinů. Mezi nimi také produkty onkogenů stejně jako produkty genů potlačujících vnik a rozvoj nádorů. Oprávněně proto zaznívají úvahy, že 143-3 se podílejí na karcinogenezi [2]. Na druhou stranu je nutno podotknout, že se zatím nezískaly žádné důkazy o přímé roli 14-3-3 ve vzniku rakoviny [11]. Výjimku tvoří pouze 14-3-3σ, který bude rozvinut v příští kapitole.
3.4.1 Ras-Raf-MAPK Raf-1 je kináza regulována extracelulárními signály. Lze se s ní rovněž setkat pod názvem MAP (mitogen-activated protein). MAPK signální kaskáda kontroluje buněčný růst, dělení a přežití. Je rozdělena do mnoha kroků o ještě větším množství substrátů [11]. 14-3-3 mohou regulovat Raf dvojím způsobem:
V G0 buňkách, které nedostávají žádný singál zvenčí, udržují Raf kinázu
v neaktivním stavu tím, že stabilizují její konformaci (děje se tak vazbou přes konkrétní serinový zbytek).
Pokud je však přijat vnější signál, podporují aktivaci Raf a stabilizují její
aktivní konformaci (opět díky vazbě na serinový zbytek). Aktivovaná Raf se naváže na Ras a aktivuje MAPK signální dráhu [2, 3]. Na Raf lze dobře vysledovat protichůdné působení 14-3-3. Mohou totiž buněčný růst jak potlačit inhibicí Raf, tak i navodit tím, že umožní její aktivaci. Ačkoli mutace Raf nejsou přímo spojené s výskytem rakoviny, je funkce této kinázy potřebná pro růst rakovinných buněk indukovaný změnami v hladinách růstových faktorů a nebo mutacemi v genu Ras [2]. A protože se 14-3-3 na její aktivaci přímo podílí, mají zde funkci potenciálních onkogenů.
3.4.2 Bcr-Abl Jde o protein vytvořený z produktu genu BCR a Abl tyrosin kinázy. Přestože se jedná o jeden z prvních objevených klientních proteinů 14-3-3, přesný způsob regulace zůstává 23
zatím neznámý. Obě podjednotky totiž obsahují vazebná místa pro 14-3-3. Nicméně se zdá, že k interakci dochází přes Bcr. Efekt 14-3-3 na funkci Bcr-Abl zahrnuje regulaci jeho lokalizace. Nejprve se nachází v cytoplazmě, avšak po spojení s 14-3-3 získává funkce spojené s onkogenními vlastnostmi. Nedávno došlo k odhalení vlivu rodiny 14-3-3 na přesun Abl mezi cytoplazmou a jádrem. Onkogen Bcr-Abl se objevuje u mnoha typů nádorů. Velmi frekventovaný je například u chronické myeloidní leukémie [2].
3.4.3 Cbl Cbl není přímo onkogen, ale protoonkogen. Slouží jako ústřední bod pro přenos signálu z tyrosin kináz spojených s receptory. Pokud se na něho naváže některá z isoforem 14-3-3, zablokuje tím místo pro přenos signálu z T-buněčného receptoru a v důsledku toho i jeho aktivaci. To poskytuje nádorové buňce možnost uniknout dozoru imunitního systému [2].
3.4.4 IGF-IR-IRS-1-PI-3K Pod tímto složitým názvem se skrývají insulinový a s insulinem spojen růstový faktor I (IGF-I), který přenáší signály o růstu a přežití buňky na základě aktivace dvěma cestami. První z nich je Ras-MAPK dráha, druhou PI-3K-AKT. Nenormální exprese IGFIR a PI-3K je rakovinná. Proteiny 14-3-3 se váží IGF-IR a IRS-1 a negativně je regulují podobně jako Cbl [2].
3.4.5 TERT TERT je označení katalytické podjednotky telomerázového komplexu a její zvýšená exprese je dokumentována u mnoha typů lidských nádorů. Telomeráza je komplex, který obsahuje reverzní transkriptázu a katalyzuje syntézu a prodloužení telomer. Aktivace telomerázy je běžným jevem ve většině zhoubných nádorů. Proteiny 14-3-3 na ni působí tak, že svou vazbou zabraňují, aby se přesunula do jádra. Nedávno bylo prokázáno, že toto spojení je zodpovědné za za anti-apoptickou aktivitu TERT a za vznik rakoviny vaječníku způsobené AKT a estrogen dependentním způsobem [2]. 24
3.4.6 Histonové deacetylázy (HDACs) Histonové deacetylázy patří mezi hormony, jejichž deregulace je běžná u většiny nádorů. To je řadí mezi terapeuticky významné cílové molekuly pro nově vyvíjené léky. Proteiny 14-3-3 po své vazbě na HDACs způsobují, že se histonové deacetylázy vyloučí z jádra [2].
3.4.7 Integriny Integriny jsou rodinou glykoproteinů, která se vyskytuje na buněčném povrchu a má funkci buněčných receptorů. Jde o heterodimery skládající se z podjednotek α a β, jež existují v několika podtypech. V závislosti na konformaci své molekuly mohou zaujímat klidovou neaktivní formu nebo vysokoafinitní aktivní formu schopnou přenosu signálu [11, 38]. Regulují přenos signálu jak zevnitř buňky ven, tak z vnějšího prostředí dovnitř. Tvoří tak spojku, poslíčka mezi extracelulární matrix a cytoskeletem, což jim dává vládu nad rozšiřováním, migrací a přežitím dané buňky [28]. Isoforma 14-3-3β interaguje s cytoplazmatickou částí intergrinu β1 tak, že zvýšená exprese 14-3-3β má za následek rozšíření a migraci buňky. Interakce v tomto případě probíhá způsobem nezávislým na fosforylaci [11], avšak například spojení s β4 a β2 fosforylaci zahrnuje tak, jak je u 14-3-3 zvykem [2]. Kromě toho se prokázalo spojení i mezi ostatními podtypy 14-3-3 a integriny β2, β3 a β4. Proteiny 14-3-3 se pomocí integrinů účastní na regulaci přenosu signálu jak do buňky, tak i z buňky [28]. Vzhledem k funkcím integrinů lze z výše uvedených informací uvažovat o souvislosti 14-3-3 a metastázování nádorů.
Obr. č. 4: Struktura integrinu [38].
25
3.5 14-3-3σ (STRATIFIN) Tento člen jinak vysoce konzervativní rodiny eukaryotických proteinů se od ostatních isoforem liší svou strukturou a tím pádem i funkcemi [7]. Bílá vrána, černá ovce rodiny, mohli bychom říci. Nebo také jedinečný a výjimečný protein se specifickými vlastnostmi. Druhé tvrzení je jistě vhodnější, a proto si pojďme udělat poznávací cestu za strukturou a reguací 14-3-3σ, objevme jeho úlohu při vzniku nádorů, při jejich metastázování a nádorová terapeutika spojená s 14-3-3σ.
3.5.1 Struktura Doposud není plně objasněno, na základě jakého principu vykonává 14-3-3σ tak spolehlivě své funkce i v přítomnosti ostatních isoforem, a to dokonce pokud jsou exprimovány ve větších koncentracích [17]. Všechny podtypy totiž vykazují vysokou shodu struktury, například rodina lidských 14-3-3 vzájemně vykazuje až 44,4% sekvenční homologie [7]. Přesto však zůstává nesporným faktem jedinečnost stratifinu. A proto se pokusíme shrnout několik strukturních odlišností proteinu 14-3-3σ. Tvorba homodimeru Prvním rozdílem je upřednostňování tvorby homodimeru, čímž se spolu s 14-3-3γ vymyká běžnému chování v rámci proteinové rodiny. Při zkoumání oblasti spojení mezi dvěma podjednotkami byly nalezeny dvě interakce zodpovědné za typické vlastnosti 14-33σ:
Prvním z nich je elektrostatická interakce mezi Lys9 a Glu83, která se vyskytuje dvakrát díky bilaterální souměrnosti proteinu a nachází se pouze u 14-3-3σ.
Druhým je interakce mezi aromatickými jádry aminokyselin Phe25 a Tyr84, která je stejně jako elektrostatická interakce mezi lysinem a glutaminem jedinečná a v dimeru ji nalezneme dvakrát [7, 19]. Při výzkumech, kdy se pracovalo se zmutovaným 14-3-3σ, došli vědci k závěru, že
homodimerizace skutečně zodpovídá za jedinečné vlastnosti stratifinu [7].
26
Smyčka mezi Ala203 a Asp215 Dalším rozdílem mezi 14-3-3σ a ostatními členy rodiny je tvorba smyčky mezi aminokyselinovými zbytky Ala203 a Asp215. Nachází ve vazebném místě pro klientní proteiny a nalézáme ji ve dvou možných konformacích:
V případě 14-3-3σ zaujímá smyčka „otevřenou konformaci“ vzhledem k vazebnému místu pro ligandy. Bývá velmi dobře vytvořena v jednom z monomerů, avšak ve druhém je znatelná pouze nezřetelně.
U proteinů 14-3-3ζ a τ se smyčka z části složí na sebe do „uzavřené konformace“, avšak hraje rovněž specifickou roli při vazbě ligandu. Po navázání klientního proteinu je její C-konec vytlačen ven z vazebného místa.
Hlavním rozdílem mezi isoformami je s nejvyšší pravděpodobností poloha smyčky vzhledem k vazebnému místu. Tyto rozdíly naznačují, že jde o hlavní oblast, která určuje ligandovou specifitu [17]. Rozdíly mimo vazebnou kapsu Je velmi zajímavé, že 14-3-3σ se liší od ostatních členů své rodiny i mimo vazebnou kapsu. Nejvýznamnější jsou tato dvě místa:
Oblast
ležící
naproti
vazebné
štěrbině,
charakteristická
ojedinělými
aminokyselinovými zbytky Met202, Asp204 a His206. Vytvářejí kontakty s proteinovými ligandy a jsou zodpovědné za jejich specifitu a selektivitu. Váží se zde fosfopeptidy, například CDC25C.
Pozoruhodný je rovněž krátký úsek o 10-20 aminokyselinách poblíž karboxylového konce 14-3-3. Jde o nejvíce flexibilní část v molekulách této rodiny a s nejvyšší pravděpodobností hraje roli v regulaci 14-3-3 a vazbě jejich ligandů [7].
3.5.2 Regulace exprese 14-3-3σ Exprese 14-3-3σ může být regulována rozmanitými způsoby. Epigenetické umlčování Termín „epigenetický“ se vztahuje k informaci, která je přenesena z rodičovského genomu do další generace buněk a která není kódována primární sekvencí DNA. Epigenetické mechanismy jsou u normálních buněk nepostradatelné pro regulaci genové 27
exprese a integrity genomu. Častou formou přenosu epigenetické informace je methylace DNA, konkrétně methylace dinukleotidu CpG na 5. uhlíku cytosinu [31, 33]. Lokální hypermethylace promotorových oblastí je spojená s transkripčním umlčováním genu, který je tím připraven o své funkční projevy. V normálních buňkách je CpG methylace zajištěna dvěma typy methyltransferáz – enzymů katalyzujících připojení methylu v C-5 pozici cysteinu:
DNMT2, která slouží jako podpůrná methyltransferáza
DNMT3A a DNMT3B, jež zprostředkovávají methylaci [31].
Methylované CpG dinukleotidy jsou následně rozpoznány specifickými proteiny, které přetvoří strukturu chromatinu na transkripčně neaktivní, umlčený [33]. Methylace promotoru genu 14-3-3σ se prokázala u řady nádorů. Můžeme jmenovat například rakovinu prsu (96%), jater (89%), plic (83%), dělohy (60%), vaječníků (60%), prostaty (45%), kůže a žaludku. Nicméně je nutné podotknout, že úroveň methylace nemusí zcela odpovídat úrovni exprese 14-3-3σ. Příkladem jsou třeba nádor děložního čípku nebo konečníku [7, 11]. Regulace zprostředkovaná p53 Protein p53 si díky svým aktivitám vysloužil téměř básnický, avšak přiléhavý název „strážce genomu“. K jeho aktivaci dochází po poškození DNA. Zastává hned několik funkcí, z nichž můžeme jmenovat pozastavení buněčného cyklu, poslání buňky do apoptické dráhy a podporu genové stability [11, 31]. Přechod z G2 do M fáze reguluje za pomoci proteinu 14-3-3σ. Po poškození DNA je p53 defosforylovaný a díky tomu se naváže na promotor genu 14-3-3σ, čímž zvýší jeho expresi. 14-3-3σ potom znemožní vstup buňky do mitózy, jak jsme si ukázali v kapitole 3.2.1. Efekt je však oboustranný, protože vytvořený 14-3-3σ přímo snižuje pozitivní zpětnou vazbou transkripční aktivitu p53 [7, 10, 11]. Nedávno se prokázalo, že když p53 reaguje na poškození DNA, spolupracuje při tom s BRCA1, dalším tumor supresorovým genem [11].
28
p63 Tento protein patří k těm, které ovládají buněčný cyklus a apoptózu. Existuje ve dvou hlavních isoformách:
TAp63 – navozuje apoptózu transaktivací p53
ΔNp63 – tlumí transaktivaci p53 a TAp63 negativně dominantním způsobem. Zároveň potlačuje i funkce 14-3-3σ obsazením vazebného místa pro p53 [11, 33].
Další regulátory Tyto regulátory se týkají jak 14-3-3σ, tak i 14-3-3 proteinů obecně. Jedním ze způsobů, jakým může být hladina proteinů 14-3-3 regulována, je pomocí tuberinu. Pro bližší seznámení se s ním uveďme, že jde o nádorový supresor, ovlivňující funkci p27KIP1. Jeho zvýšená exprese pozitivně reguluje hladinu proteinů 14-3-3σ, ale i ε a ζ [4]. Kromě toho se mohou proteiny 14-3-3 sdružovat s fosforylovanými keratiny, především s kreatinem K18. Tím se výrazně zmenší jejich schopnost vazby s jinými klientními proteiny (například enzymy CDC2 nebo CDC25C). Stejný účinek jako u keratinů byl popsán rovněž u vimentinu [4, 15]. Post-transkripční modifikace Exprese 14-3-3σ může být rovněž regulována post-transkripčně na základě degradace nebo stability proteinů. Pro porozumění těmto mechanismům je potřebné provést ještě detailnější studie [7]. Některé způsoby jsou ale již objasněné a mezi ně patří například regulace pomocí EFP (estrogen-induced zinc finger protein). 14-3-3σ je takto regulovaný v prsním eptiteliu, vyústěním toho je ubikvitinace a rychlá degradace stratifinu. Bylo prokázáno, že nadměrná exprese EFP způsobuje vznik nádorů [11].
3.5.3 14-3-3σ a vznik nádorů Velké množství ligandů proteinů 14-3-3 jsou produkty protoonkogenů nebo onkogenů, což naznačuje jejich účast v nádorové transformaci [3].
29
Jak jsme si ukázali výše, ztráta nebo alespoň snížení přítomnosti 14-3-3σ je u lidí spojeno se vznikem mnoha typů rakovinných nádorů. K nejvýznamnějšímu ovlivnění dochází u rakoviny prsu [7, 11, 14] a to především u primárních nádorů [31]. Toto zjištění vede zákonitě ke spekulacím, že 14-3-3σ má potenciál jako tumorsupresorový gen. Je velmi zajímavé, že změna exprese v nádorech se netýká ostatních isoforem, takže tato funkce je zřejmě specifická právě pro stratifin. Míra jeho exprese koreluje v některých případech se stupněm nemoci [10]. Zvýšené množství 14-3-3σ v buňce však nemusí být za všech okolností pozitivním jevem, protože bylo pozorováno u některých nádorů rakoviny prsu (s bazálním nebo myoepiteliálním fenotypem), kdy bychom podle výše uvedených informací čekali 14-3-3σ málo (jako je tomu například u luminálních epiteliálních nádorů) [7]. Tento fakt o tom, že 14-3-3 se při vývoji nádorů skutečně chovají jako dvojsečná zbraň. Pro úplné potvrzení jeho role v rozvoji nádorů je však ještě potřeba provést řadu specializovaných studií [7].
3.5.4 Metastázování a invazivita nádorů Je možné, že 14-3-3σ je zapojený i v metastázování a invazivitě nádorů. Vyšší exprese 14-3-3σ je u rakoviny ženských pohlavních orgánů přímo úměrná větší velikosti nádorů a jejich hlubší invazivitě [7]. Stejné nálezy se týkají i rakoviny plic a jejího metastázování do lymfatických uzlin [22]. Mezi nepřímé důkazy o zapojení 14-3-3σ v procesu metastázování, patří to, že byla pozorována jeho sekrece ven z buněk u rakoviny kůže a slinivky, jejímž důsledkem byla zvýšená exprese kolagenázy. Tento nález je o to více fascinující, že 14-3-3σ nemá signální sekvence, které by buňce dávaly najevo, že protein je určený k exportu do mezibuněčného prostoru [7]. Dalším způsobem, kterým může být 14-3-3σ spojen s metastazováním, je přes integriny zmíněné v kapitole 3.4.7 nebo proteiny jako ADAM22, Ron či p130Cas [2]. V rozporu s těmito pozorováními lze uvést studii, která dokumentovala fakt, že zvýšená hladina mimoděložního 14-3-3σ potlačovala migraci buněk a měla naopak ozdravující účinky. Nepochybně, je příliš brzy na úplné shrnutí úlohy 14-3-3σ v metastázování a invazivitě buněk a stejně jako u tumorigeneze je i zde potřeba další výzkumné činnosti [7].
30
3.5.5 Terapeutika Zapojení v procesech, které jsou přímo spjaté se vznikem rakoviny, předurčuje 14-33σ jako jeden z cílů protirakovinných léčiv. Je k tomu vhodný jako jediný z celé rodiny 143-3. Rozeberme si nyní hlavní způsoby léčby spojené s 14-3-3σ podle oblastí, v nichž stratifin působí svými regulačními funkcemi. Buněčný cyklus Při léčbě zaměřující se na 14-3-3σ jakožto regulátora buněčného cyklu, je hlavním přístupem fosforylace jeho klientních proteinů, například CDC25C. Následkem je pokračování buněčného cyklu. Předpokládá se při tom, že buňky s poškozenou DNA podlehnou mitotické katastrofě a budou poslány do apoptické dráhy [11]. Apoptóza Difopein je kompetitivní inhibitor BAD ve vazbě na 14-3-3σ. To má dalekosáhlé následky. Pokud se na 14-3-3σ nenaváže BAD, nemůže se celý komplex spojit s Bcl-2 a buňka vstupuje do apoptózy [11]. Methylace Jde především o proces epigenetického umlčování, zmíněný v kapitole 3.5.2. Zde jsme si ukázali, že v různých typech nádorů je 14-3-3σ velmi často umlčovaný CpG methylací. Změna tohoto procesu může nastat přidáním inhibitoru methylace, kterým jsou například 5-aza-2-deoxycytidin nebo Zebularin, a inhibitorů histidinových deacetyláz [11].
31
3.6 PRINCIP POUŽITÝCH METOD 3.6.1 SDS Gelová polyakrylamidová elektroforéza (SDS PAGE)
Jak již název napovídá, elektroforéza je prováděna na polyakrylamidovém gelu. Při jeho přípravě zde figurují dvě důležité sloučeniny: APS (persíran amonný), který iniciuje polymeraci akrylamidu, a TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylethylnediamin), který ji katalyzuje a přidává se tedy ještě před APS [23]. V koncentračním a separačním gelu i v elektroforetickém pufru se nachází SDS, dodecylsulfát sodný. Jde o molekulu s negativním nábojem a detergentními vlastnostmi. Denaturuje proteiny a obalí je, čímž jim udělí záporný náboj. Počet navázaných molekul SDS je zhruba úměrný molekulové hmotnosti proteinů, proto mají všechny stejný náboj na jednotku hmotnosti [21] a mohou se během migrace k anodě rozdělovat pouze na základě molekulových hmotností. Čím menší molekulovou hmotnost mají, tím blíže k anodě budou později detekovány. Dalším činidlem důležitým pro správný průběh SDS-PAGE, je 2-merkaptoethanol, jenž se přidává do vzorku. Díky svým redukčním vlastnostem eliminuje disulfidové vazby proteinu [21].
3.6.2 Western Blotting Pod názvem této metody se skrývá jednak přenos proteinů z elektroforetického gelu na nitrocelulózovou, polyvinylfluoridovou nebo nylonovou membránu, jednak i jejich následná identifikace pomocí protilátek. Důvodem přenosu je struktura elektroforetického gelu, která znemožňuje přímou interakci protilátky a proteinu. Přenos se může uskutečňovat na základě různých fyzikálních principů jako je prostá difúze, kapilární vzlínání, podtlak nebo elektrické pole. V našem případě bylo využito právě elektroblottingu, který je z daných modifikací nejúčinnějším, v jedné z jeho forem nazvané wet blotting podle toho, že po dobu průběhu přenosu jsou kazety ponořeny do blotovacího pufru. Po přenosu na membránu se provede zviditelnění přenesených proteinů pomocí Ponceau S, Fast Green nebo Amidočerni10 B. Příčinou je kontrola správného průběhu přenosu i elektroforézy ještě před nanesením nákladných protilátek. Membrána obsahuje mnoho vazebných míst pro proteiny a protože indikační molekuly jsou rovněž bílkoviny, je třeba vazebná místa membrány před použitím 32
protilátky blokovat. Za tímto účelem lze použít inertní proteiny BSA, kasein, hemoglobin, želatinu nebo nízkotučné mléko jako v našem experimentu [21]. Právě z tohoto důvodu bylo v roztoku sušeného odtučněného mléka provedeno propláchnutí membrán po obarvení pomocí Ponceau S, blokace na třepačce a také naředění primárních i sekundární protilátky. Detekce hledaných proteinů je prováděna velmi selektivně monoklonálními protilátkami. Protilátka se specificky naváže na určitý epitop daného proteinu, který vůči ní zaujímá roli antigenu [20]. Vzniklý imunokomplex se spojí se značenou sekundární protilátkou, která rozeznává doménu primární protilátky. Sekundární protilátky jsou konjugovány s různými typy značek, např. radioaktivní, fluorescenční, luminiscenční. Nejčastěji používanou značkou je enzym (peroxidáza či fosfatáza), který katalyzuje chemiluminiscenční reakci s později přidaným substrátem. Toho
se
využije
chemiluminiscencí
vizualizaci
při
ozářen
právě
v místě
výsledků, výskytu
neboť
fotografický
zkoumaných
film
proteinů.
je Pro
vyhodnocování se obvykle používá negativ tohoto obrazu.
3.6.3 iTRAQ-2DLC-MS/MS iTRAQ je zkratka vytvořená z anglických slov „Isobaric tags for relative and absolute quantification,“ v překladu tedy „isobarické značky pro relativní a absolutní kvantifikaci“ [29]. V současné době jsou isobarické značky velmi často využívanou strategií pro kvantifikaci relativního i absolutního množství proteinů [34]. Proteiny jsou nejprve selektivně naštěpeny na peptidy enzymem trypsinem, který tak učiní na C-straně argininu a lysinu. Následně jsou peptidy zredukovány, alkylovány a označeny značkou iTRAQ, jež obsahuje tyto části:
Repotrérovou skupinu. Jejím základem je N-methylpiperazin a je to právě ona, kdo umožňuje kvantitativní analýzu proteinů. Spolu s balanční skupinou obsahuje isotopy
13
C,
15
N,
18
O. Relativní molekulová hmotnost reportérové
skupiny se pohybuje v rozmezí 113-121 s vynecháním 120.
Balanční skupinu. Ta je tvořena karbonylem a její relativní molekulovou hmotnost najdeme v rozsahu od 184 do 192, avšak hodnota 185 se vynechává. Hmotnost celé značky musí vždy činit 305 [29, 35] .
Reaktivní skupinu. Pod tímto názvem se skrývá polovina molekuly Nhydroxysukcinimidu (NHS), který váže peptidy přes volné aminoskupiny. To znamená přes ty, které se vyskytují na N-koncích a na lysinu. Jde o velmi 33
citlivý reagent, a proto je se při práci potřeba ujistit, zda pufry a ostatní regenty neobsahují primární aminoskupiny. Tím vypadávají ze hry reagenty jako Tris pufr nebo hydrogenuhličitan amonný. NHS mimo to reaguje s cysteinem, který musí být z tohoto důvodu předem zablokován, a v nízkém pH s tyrosinovými zbytky [34]. Separace označených peptidů se provádí 2D chromatografií. Pomocí MS/MS pak dochází k identifikaci a kvantifikaci a následně i původních proteinů [29]. Praktický význam iTRAQ značení spočívá především ve schopnosti kvantifikovat proteiny respektive peptidy až z 8 různých vzorků v jedné analýze [36].
34
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Cíl experimentální části bakalářské práce: Stanovit expresi proteinu 14-3-3 sigma v souboru směsných lyzátů karcinomů prsu v závislosti na klinickopatologických charakteristikách (grade, stav lymfatických uzlin). Získaná data srovnat s výsledky proteomického experimentu.
35
4.1 MATERIÁL A METODY 4.1.1 Přístroje a materiál Centrifuga
Centrifuge 5402
(Eppendorf, Německo)
Vortex
MS1 Minishaker
(IKA, Německo)
Vařič
Monotherm Electronicrührer
(Variomag, USA)
Elektromag. míchačka
RCT basic
(IKA, Německo)
Třepačka
WT16
(Bio-Rad, USA) TM
Zařízení pro elektroforézu MINI PROTEAN
(Bio-Rad, USA)
Zdroj proudu a napětí
(Bio-Rad, USA)
Power Pac 300
Zařízení pro Wet-Blotting MSSSF
(Bio-Rad, USA)
Scanner
GS-800 Calibrated Densitometer
(Bio-Rad, USA)
Parafilm
Chicago, IL. 60631
(Peckiney Plastic Packing,
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette
(Thermo Scientific, USA)
USA) Blokovací membrána
Medical X-ray Film Blue CP-BU NEW
(AFGA, Belgie)
ABS Cassette
Quanta Rapid
(Kronex, USA)
Sušené mléko
Laktino sušené mléko odtučněné
(PML a. s., Česká republika)
Software pro analýzu gelů Quantity One 4.6.1.
(Bio-Rad, USA)
4.1.2 Použité chemikálie Abcam (UK):
RAMPx
(rabbit
anti
mouse
horse
radish
peroxidase
conjgated IgG) 14-3-3 sigma antibody [1.N.6] Sigma (Švýcarsko):
2-Merkaptoethanol Monoclonal anti-actin antibody produced in mouse (AC-40)
Použité pufry: 2x CSB (complete sample buffer): 10% glycerol, 0,06 mol.l-1 TRIS HCl pH 6,8, 0,004% bromfenolová modř, 2% SDS, 5% 2-merkaptoethanol
36
20x MOPS: 1 mol.l-1 MOPS, 1 mol.l-1 TRIS-base, 2% SDS, 20 mol.l-1 EDTA 10x PBS: 1,4 mol.l-1 NaCl, 27 mmol.l-1 KCl, 15 mmol.l-1 KH2PO4, 70 m mol.l-1 NaHPO4.12 H2O ECL rozok A: 405 μmol.l-1 kyselina kumarová, 0,5 mmol.l-1 EDTA, 10 mmol.l-1 luminol, 200 mmol.l-1 TRIS pH 9,4 ECL roztok B: 0,5 mmol.l-1 EDTA, 8 mmol.l-1 peroxoboritan sodný, 50 mmol.l-1 octan sodný Ponceau S: 0,2 % Ponceau S, 3 % kyselina trichloroctová, 3 % kyselina sulfonsalycilová 4.1.3 Zpracovávaný vzorek Při práci byly použity vzorky tkáňových lyzátů prsu uchovávané na MOÚ při -80°C. Sada 24 směsných lyzátů nebyla ve svých klinicko patologických parametrech konzistentní, a proto jsou uvedeny v Tabulce č. 1. Tabulka č. 1: Tabulka klinickopatologických charakteristik směsných nádorových lyzátů. Grade
Metastáze metastázující
Grade 1 nemetastázující metastázující Grade 3 nemetastázující
37
Označení vzorku 1
9
17
2
10
18
3
11
19
4
12
20
5
13
21
6
14
22
7
15
23
8
16
24
4.1.4 Metody Příprava vzorku Vzorky byly připraveny tak, aby se v každém nacházelo vždy 15 μg celkového proteinu. Protože koncentrace proteinu ve vzorcích byla individuální, pipetovaný objem se lišil. K roztoku byl přidán vždy stejný objem 2x koncentrovaného CSB pufru s 2merkaptoethanolem. Po smíchání již není potřeba pracovat na ledu, pokračovalo se tedy při laboratorní teplotě. Označené mikrozkumavky byly opatřeny barevnými zarážkami a povařeny 10 minut ve vodní lázni o zhruba 100 °C. Poté byly ochlazeny na ledové lázni a centrifugovány 14000 g/10 min/4 °C. Elektroforéza Separace
byla
prováděna
na
5%
koncentračním
a
12%
separačním
polyakrylamidovém gelu. Předem nalité gely byly umístěny do aparatury a vnitřní prostor byl zalit MOPS pufrem. Po ujištění se, že pufr neuniká do vnějšího prostoru, byly naneseny vzorky spolu se standardem. Poté byl MOPS pufrem zalit i vnější prostor elektroforetické vany. Elektroforéza běžela 15 minut při napětí 80 V a 60 minut při napětí 100 V, dokud linie bromfenolové modři nedosáhla spodního okraje gelu. Po skončení elektroforézy byl pufr slit a vyjmuté, oříznuté gely byly umístěny na membránu pro Wet Blotting. Wet Blotting Do kazety byly naskládány v následujícím pořadí:
Houba (namočená v blotovacím pufru)
2 Whatmany (speciální silné filtrační papíry, namočené v blotovacím pufru)
Membrána
Gel
2 Whatmany (namočené v blotovacím pufru)
Houba (namočená v blotovacím pufru)
Byly odstraněny vzduchové bubliny a kazeta byla přenesena do elektroforetické vany. Po přidání míchadélka, ledové vložky a blotovacího pufru (4 °C) byl zahájen proces blotování připojením ke zdroji napětí. Proces probíhal 90 minut při napětí 100 V. V pravidelných intervalech byly vyměňovány ledové vložky. 38
Imunochemická detekce Membrány s přenesenými proteiny byly vyjmuty z blottingových kazet a propláchnuty v PBS. Poté byly ponořeny do Ponceau S a dvakrát propláchnuty v PBS. Ořezané a označené byly blokovány 1 hodinu v 5% roztoku sušeného odtučněného mléka v PBS + 0,1% Tween 20 na třepačce při pokojové teplotě. Poté byly přeneseny na misku vystlanou parafilmem a přelity roztokem mléka a primárních protilátek 14-3-3 sigma antibody [1.N.6] o ředění 1:750 a Monoclonal antiactin antibody AC-40 o ředění 1:6000. Následovala inkubace přes noc při 4°C. Druhý den bylo provedeno odstranění primární protilátky: odlití mléka, krátké promytí membrán v PBS a poté důkladnější na třepačce:
1x 10 min v 1x PBS
2x 10 min v 1x PBS + 0,1% Tween 20
1x 10 min v 1x PBS
Osušené membrány byly naskládány na misku s parafilmem a přelity sekundární protilátkou RAMPx v mléce o ředění 1:1000, která se specificky navázala na obě primární protilátky. Takto ošetřené membrány se inkubovaly 1 hodinu při pokojové teplotě. Odstranění sekundární protilátky probíhalo stejně jako odstranění protilátky primární, včetně výše uvedeného postupu na třepačce. Filtračním papírem osušené membrány byly pečlivě naskládány na předem očištěné sklo a přelity ECL směsí (roztok A a B v poměru 1:1). Následovala inkubace po 3 minut a odsátí ECL. Sklo bylo překryto potravinářskou fólií. Spolu s fotografickým filmem Medical Xray Film Blue bylo vystaveno expozici 30s a 60s, filmy byly následně vyvolány v klasické fotografické vývojce. Analýza obrazu Fotografické filmy byly naskenovány přístrojem GS-800 Calibrated Densitometer od firmy Bio-Rad a následně vyhodnoceny programem Quantity one 4.6.1. Software je rovněž dodávaný firmou Bio-Rad.
39
4.2 VÝSLEDKY Obr. č. 5 vznikl oskenováním fotografického filmu s třicetisekundovou dobou expozice. Číslice nad elektroforetickými drahami jsou označením vzorků. Nad a pod samotnými bandy β-aktinu a 14-3-3σ je možno si povšimnout i slabších, méně výrazných linií. Jedná se o nespecifickou interakci používaných protilátek.
β-aktin
β-aktin
14-3-3σ
14-3-3σ
β-aktin 14-3-3σ
β-aktin 14-3-3σ
Obrázek č. 5: Bandy β-aktinu a 14-3-3σ pro jednotlivé vzorky při 30 s expozici filmu.
Následně došlo k vyhodnocení programem Quantity one 4.6.1. Výsledné hodnoty, u nichž je brána v úvahu jak plocha, tak i optická intenzita bandu, jsou uvedeny v Tabulce č. 2. Tabulka č. 3 uvádí stejné parametry získané totožným způsobem, avšak z výsledků při 60 s expozici fotografického filmu. Díky lidskému faktoru při vytyčování ploch bandů je nutné počítat s drobnými nepřesnostmi výsledků.
40
Tabulka č. 2: Výsledky vyhodnocení Contour Qty aktinu a 14-3-3σ programem Quantity one 4.6.1. při 30 s expozici filmu. Grade 1 Charakteristika vzorku
Metastázující
Nemetastázující
Poměr průměrů metastazující/ nemetastázující
Vzorek
Contour Qty 14-3-3σ [optická hustota.mm2]
Contour Qty Aktinu [optická hustota.mm2]
Grade 3 Poměr Contour Qty 14-3-3σ/Aktin
Průměr
Vzorek
Contour Qty 14-3-3σ [optická hustota.mm2]
Contour Qty Aktinu [optická hustota.mm2]
Poměr Contour Qty 14-3-3σ/Aktin
1
2,628
13,324
0,197
5
0,000
11,917
0,000
2
2,992
18,195
0,164
6
3,546
14,558
0,243
9
1,951
10,782
0,181
13
8,252
12,739
0,648
10
6,219
11,975
0,519
14
7,465
14,117
0,529
17
5,088
11,906
0,427
21
0,000
14,109
0,000
18
5,482
7,669
0,714
22
1,115
22,252
0,050
3
2,739
18,153
0,150
7
7,396
8,157
0,907
4
1,599
17,585
0,090
8
5,963
11,431
0,522
11
4,656
9,842
0,473
15
4,885
13,714
0,356
12
1,208
13,251
0,091
16
2,944
13,844
0,213
19
0,749
19,792
0,037
23
9,672
20,726
0,467
20
0,040
16,458
0,002
24
0,156
23,352
0,007
2,603 ± 0,160s
0,367 ± 0,224s
0,141 ± 0,171s
Průměr
0,245 ± 0,283s
0,412 ± 0,305s
0,595 ± 0,192s
Tabulka č. 3: Výsledky vyhodnocení Contour Qty aktinu a 14-3-3σ programem Quantity one 4.6.1. při 60 s expozici filmu. Grade 1 Charakteristika vzorku
Metastázující
Nemetastázující
Poměr průměrů metastazující/ nemetastázující
Vzorek
Contour Qty 14-3-3σ [optická hustota.mm2]
Contour Qty Aktinu [optická hustota.mm2]
Grade 3 Poměr Contour Qty 14-3-3σ/Aktin
Průměr
Vzorek
Contour Qty 14-3-3σ [optická hustota.mm2]
Contour Qty Aktinu [optická hustota.mm2]
Poměr Contour Qty 14-3-3σ/Aktin
1
5,487
21,749
0,252
5
0,000
15,630
0,000
2
5,855
27,875
0,210
6
4,916
17,420
0,282
9
3,795
13,051
0,291
13
12,513
20,855
0,600
10
14,656
11,086
1,322
14
14,911
24,077
0,619
17
7,305
17,486
0,418
21
0,000
20,505
0,000
18
7,968
10,114
0,788
22
5,358
29,469
0,182
3
6,649
27,59
0,245
7
9,060
10,135
0,894
4
3,835
23,281
0,165
8
13,732
8,387
1,637
11
9,382
13,428
0,699
15
8,940
21,306
0,420
12
4,516
18,241
0,248
16
7,028
21,871
0,321
19
3,696
28,759
0,129
23
17,400
24,127
0,721
20
0,380
22,545
0,017
24
3,600
29,792
0,121
0,547 ± 0,434s
0,250 ± 0,236s
2,108 ± 0,210s
0,410 ± 0,286s
42
Průměr
0,281 ± 0,277s
0,686 ± 0,543s
Ve dvou nezávislých stanoveních intenzit bandů uvedených v Tabulce 2 a 3 bylo dosaženo přibližně stejných poměrů. Patrná je zvýšená hladina 14-3-3σ u metastazujících nádorů grade 1, nikoli však grade 3, kde ve vztahu k nemetastazujícím karcinomům došlo spíše k mírnému snížení množství stratifinu.
5. DISKUSE Na poli výzkumu rakoviny patří studie o metastázování nádorů k častým, avšak velmi složitým tématům. Protože biologické funkce jsou vykonávány proteiny, analýza proteomu je pro klinické účely daleko výhodnější než analýza genomu [22]. Výsledky experimentální části bakalářské práce byly srovnávány s výsledky proteomického experimentu, v jehož rámci bylo screenováno asi 4000 proteinů, mezi nimi i 14-3-3σ. Patřil totiž k proteinům se zvýšenou hladinou u metastazujících karcinomů prsu. Pomocí iTRAQ-2DLC-MS/MS byla nalezena 1,45 krát zvýšená hladina 14-3-3σ u metastazujících karcinomů prsu grade 1 v porovnání s nemetastázujícími na hladině významnosti p = 0,001 .U karcinomů gradu 3 naopak statisticky nevýznamné snížení 0,89 krát na hladině významnosti p = 0,374 u metastazujících nádorů ve vztahu k nemetastázujícím. To koreluje s výsledky získanými během našeho experimentu, uvedenými v Tabulkách č. 2 a 3. Bakalářská práce tedy potvrdila závěry proteomického experimentu nezávislou metodou, která využívá zcela jiného principu. V této oblasti bylo provedeno skupinami vědců více studií pro různé typy nádorů. U karcinomu
nosohltanu
snížení
hladiny
14-3-3σ
významně
koreluje
s jeho
metastazováním do lymfatických uzlin [22], což souhlasí s výzkumy provedenými v případě rakoviny plic – nádory metastazující do mízních uzlin vykazovaly snížené množství 14-3-3σ vůči spinocelulárnímu karcinomu plic bez tvorby metastáz [22]. Tento trend je stejný jako u karcinomu prsu grade 3. Naopak v případě rakoviny slinivky byla u 71% nádorů prokázána souvislost se zvýšenou hladinou 14-3-3σ a metastazováním do lymfatických uzlin [37]. Ke stejným závěrům se došlo i u adenokarcinomu děložní sliznice [26]. Stejně tak jako u karcinomu prsu grade 1. Zatím nebylo zjištěno, co způsobuje tento rozdíl mezi jednotlivými typy nádorů. A nutno připustit, že rozdíl v expresi 14-3-3σ u nádoru prsu může být způsoben nejen jeho
grade, ale i fenotypem. Karcinomy s bazálním nebo myoepiteliálním fenotypem vykazují expresi 14-3-3σ zvýšenou, zatímco u luminálních nádorů je spíše snížená [37]. Protože však pro náš experiment byly použity lyzáty skládající se vždy ze 4 vzorků stejného grade a metastatického potenciálu, avšak různého fenotypu, lze v našem případě tento vliv vyloučit. Jelikož shodné závěry o hladině 14-3-3σ v závislosti na grade a metastázování karcinomu prsu byly učiněny ve dvou na sobě nezávislých experimentech (proteomický experiment a praktická část této bakalářské práce), stávají se tyto údaje zajímavými pro další výzkum. A perspektivně i pro volbu terapie, neboť z výše uvedených dat lze uvažovat stratifin jako možný biomarker rizika metastázování karcinomu prsu v závislosti na jeho grade. To by umožnilo včasné nasazení odpovídající léčby. Je však ještě potřeba dalších potvrzení a výzkumné činnosti.
44
6. SOUHRN Proteiny 14-3-3 jsou polypeptidy kyselé povahy o hmotnosti monomeru 28-32 kDa. Vyskytují se u všech eukaryot ve formě dimeru, což určuje jejich vazebné vlastnosti. Většina interakcí probíhá fosforylačně-dependentním způsobem, malá část nikoli. U savců nacházíme sedm isoforem. 14-3-3 působí prostřednictvím klientních proteinů v G1/S a G2/M kontrolních uzlech buněčného cyklu tak, že nedovolují buňce s poškozenou DNA přejít do další fáze cyklu, a poskytují jí tímto čas na reparace. Působí proti vzniku nádorů. Ve prospěch rakovinného bujení naopak pracují při regulaci apoptických proteinů rodiny Bcl-2, kdy dovolují buňce neuposlechnout proapoptické signály, a ve spojení s proteiny uvedenými v kapitole 3.4. Stratifin, protein 14-3-3σ se od ostatních isoforem odlišuje strukturou a tím pádem i vlastnostmi a funkcí. Jako u jediného člena rodiny zde byla skutečně prokázána souvislost se vznikem nádorů. Díky tomu je také cílem některých protinádorových terapeutik. V experimentální části byla zkoumána závislost hladiny 14-3-3σ na grade a metastázování karcinomů prsu. U grade 1 byla hladina u metastázujích ve vztahu k nemetastazujícím zvýšená, u nádorů grade 3 naopak lehce snížená. Získaná data byla srovnána s výsledky analogického proteomického experiementu.
45
7. SUMMARY The 14-3-3 proteins are abundant 28-32 kDa acidic polypeptides found in all eukaryotic organisms. Seven family members are expressed in mammals. They form dimmers with subsequent effects on their binding properties. The most of the functional interactions are carried out in a phosphorylation-dependent manner, but some are independent of phosphorylation. 14-3-3 family proteins are involved in the regulation of G1/S and G2/M phase transition by several mechanisms dependent on their ligands. In this case they counteract the proliferation of tumor. However, due to some of their client proteins (especially the Bcl-2 protein family) 14-3-3 proteins play an active role in delaying and suppressing apoptosis. 14-3-3 proteins have great importance in connection with human cancer by the regulation of various oncogenes and tumor suppressor genes and their protein products. As such, they have a double-edged sword character in tumor development. The 14-3-3σ isoform (also called stratifin) differs from the other isoforms with both its structure and functions. As the only family member with 14-3-3σ was significant association with tumorigenesis and metastasis. That is why stratifin is a common target of anti-cancer drug treatment. In the experimental part of my bachelor thesis stratifin level was examined to investigate the relationship between stratifin expression and protein level, breast tumor grade cancer grade and lymph node metastasis. Metastatic tumors grade 1 exhibited increased level of 14-3-3σ compared to non-metastatic ones. On the other hand, metastatic tumors grade 3 had slightly lower Stratifin expression compared to non-metastatic ones. The data were compared with the results of a proteomic experiment performed in parallel.
46
8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1]
Morrison DK. The 14-3-3 proteins: integrators of diverse signaling cues that impact cell fate and cancer development. Trends Cell Biol. 2009 19:16-23.
[2]
Tzivion G, Gusta VS, Kaplun L, Balan V. 14-3-3 proteins as potential oncogenes. Seminars in Cancer Biol. 2006. 16:203-213.
[3]
Fu H, Subramanian RR, Masters SC. 14-3-3 proteins: structure, function, and regulation. Annu
[4]
Rev Pharmacol Toxicol. 2000. 40:617-47.
Hermeking H, Benzinger A. 14-3-3 proteins in cell cycle regulation. Seminars in Cancer Biol. 2006. 16:183-192.
[5]
Lee MH, Lozano G. Regulation of the p53-MKM2 pathway by 14-3-3σ and other proteins. Seminars in Cancer Biol. 2006. 16:225-234.
[6]
Porter GW, Khuri FR, Fu H.14-3-3/client protein interactions integrate survival and apoptotic pahtways. Seminars in Cancer Biology 2006. 16:193-202.
[7]
Li Z, Liu JY, Zhang JT. 14-3-3σ, the double-edged sword of human cancers. Am J Transl Res. 2009. 1:326-40.
[8]
Ferl RJ, Manak MS, Reyes MF. The 14-3-3s. Genome Biology. 2002. 3(7):3010.13010.7
[9]
Petráčková V, Kraus J et al. Akademický slovník cizích slov. Academia Praha. 2001.390.
[10] Dougherty MK, Morrison DK. Unlocking the code of 14-3-3. J Cell Sci. 2004. 15(117):1875-84. [11] Mhawech P. 14-3-3 proteins--an update. Cell Res. 2005. 15(4):228-36. [12] Aitken A. 14-3-3 proteins: a historic overview. Semin Cancer Biol. 2006. 16(3):162-72. [13] Jones DH, Martin H, Madrazo J, Robinson KA, Nielsen P, Roseboom PH, Patel Y, Howell SA, Aitken A. Expression and structural analysis of 14-3-3 proteins. J Mol Biol. 1995. 245(4):375-84. [14] Yaffe MB. How do 14-3-3 proteins work? Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett. 2002. 513(1):53-7. [15] Takahashi Y. The 14-3-3 proteins: gene, gene expression, and function. Neurochem Res. 2003. 28(8):1265-73. [16] Rosenquist M. 14-3-3 proteins in apoptosis. Braz J Med Biol Res. 2003. 36(4):403-8.
47
[17] Brenzinger A, Popowicz GM, Joy JK, Majumdar S, Holak TA, Hermeking H. The crystal structure of the non-liganded 14-3-3σ protein: insight into determinant sof isoform specific ligand binding and dimerization. Cell Res. 2005. 15(4):219-227. [18] Feng W, Shen L, Wen S, Rosen DG, Jelinek J, Hu X, Huan S, Juany M, Liu J, Sahin AA, Hunt KK, Bast RC, Shen Y, Issa JJ, Yu Y. Correlation between CpG methylation profiles and hormone receptor status in breast cancers. Breast cancer research. 2007. 9:R57. [19] Gardino KA, Smerdon JS, Yaffe MB. Structural determinants of 14-3-3 binding specificities and regulation of subcellular localization of 14-3-3 ligand complexes: A comparison of the X-ray crystal structures of all human 14-3-3 isoforms. Seminars in cancer biology. 2006. 16:173-182. [20] Číž M. Antigeny, hlavní histokompabilitní complex a prezentace antigenu. Přednáška Imunologie Bi5220. 2011. 1-32. [21] www.med.muni.cz/patfyz/tmbg/western-bak.pdf (25-02-2011) [22] Dan-juan L, Gui D, Zhi-qiang X, Hui-xin Y, Cui L, Fang P, Mao-yu L, Peng-fei Z, Yong-heng C, Zhu-chu C. Identificating 14-3-3 sigma as a lymph node metastasis-related protein in human lung squamous carcinoma. Cancer Letters. 2009. 279:65-73. [23] wiki.answers.com/Q/What´s_the_function_of_TEMED (27-02-2011) [24] Lee J, Kumagai A, Dunphy WG. Positive Regulation of Wee1 by Chk1 and 14-3-3 Proteins. Molecular Biology of the Cell. 2001. 12:551-563. [25] Aitken A, Baxter H, Dubois T, Clokie S, Mackie S, Mitchell K, Peden A, Zemlickova E. 14-3-3 Proteins in Cell Regulation. Biochemical Society. 2002. 30(4):351-360. [26] Nakayama H, Sano T, Motegi A, Oyama T, Nakajima T. Increasing 14-3-3 sigma expression with declining estrogen receptor α and estrogen-responsive finger protein expression defines malignant progression of endometrial carcinoma. Pathology International. 2005. 55:707-715. [27] Masters SC, Fu H. 14-3-3 Proteins Mediate an Essential Anti-apoptotic Signal. The Journal of Biological Chemistry. 2001. 276(48):45193-452000. [28] Wilker E, Yaffe MB. 14-3-3 Proteins – focus on cancer and human disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2004. 37:633-642. [29] Wiese S, Reidegeld KA, Meyer HE, Warscheid B. Protein labeling by iTRAQ. A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 2007. 7:340350. [30] Campebel NA, Reece JB. Biologie. Computer Press, a. s., 2006.214-231. 48
[31] Lodygin D, Hermeking H. The role of epigenetic inactivation of 14-3-3σ in human cancer. Cell Research. 2005. 15(4):237-246. [32] Zurita M, Lara PC, del Moral R, Torres B, Linares-Fernández JL, Arrabal SR, Martínez-Galán J, Oliver FJ, de Almodóvar JMR. Hypermethylated 14-3-3σ and ESR1 gene promoters in serum as candidate biomarkers for the diagnosis and treatment efficacy of breast cancer metastasis. BMC Cancer. 2010. 10:217. [33] Lodygin D, Hermeking H. Epigenetic silencing of 14-3-3sigma in cancer. Seminars in Cancer Biology. 2006. 16:214-224. [34] Unwin RD. Quantification of Proteins by iTRAQ. LC-MS/MS in Proteomics, Methods in Molecular Biology 658. Springer Science+Business Media. 2010. 205-215. [35] Zieske LR. A perspective on the use of iTRAQTM reagent technology for protein complex and profiling studies. Journal of Experimental Botany. 2006. 57(7):1501-1508. [36] Bouchal P, Roumeliotis T, Hrstka R, Nenutil R, Vojtesek B, Garbis SD. Biomarker Discovery in Low-Grade Breast Cancer Using Isobaric Stable Isotope Tags and TwoDimensional Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (iTRAQ-2DLCMS/MS) Based Quantitative Proteomic Analysis. Journal of proteome research. 2009. 8 (1): 362-373. [37] Li Z, Dong Z, Myer D, Yip-Schneider M, Liu J, Cui J, Schmidt CM, Zang JT. Role of 14-3-3σ in poor prognosis and in radiation and drug resistance of human pancreatic cancers. BMC Cancer. 2010. 10:598-609. [38] Kubala
L.
Buněčná
komunikace
(povrchové
molekuly,
vybrané
intracelulárního přenosu signálu). Přednáška Imunologie Bi5220. 2011. 1-28.
49
mechanismy
