VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Plíšková L., Hrochová K., Kutová R. Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové

PREANALYTICKÁ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII





Preanalytická chyba – cokoli, co se objeví před vlastní analýzou a má vliv (zhoršení) na výsledek (53 – 75 %, Plebani 2007 61,9 %) Soustředíme se především na některé faktory, které mají v mol.biologii zásadní vliv na výsledek

TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE K minimalizaci preanalytické variability poskytuje laboratoř svým klientům soubor potřebných informací o přípravě pacienta, odběru materiálu, skladování a transportu vzorku. Příprava pacienta  Odběr materiálu  Uchování a transport  Uchování a úprava vzorku v laboratoři 

PŘÍPRAVA PACIENTA Dieta, fyzická zátěž, stres…  Načasování odběru monitorování léčby zásadní při odběru krve na průkaz bakterií 



Informovaný souhlas extrahumánní x humánní genom

TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE Příprava pacienta  Odběr materiálu  Uchování a transport  Uchování a úprava vzorku v laboratoři 

ODBĚR MATERIÁLU identifikace, shoda s žádankou, žádanka….  lokalizace odběru – důležité u patogenů odběr ze stejného místa jako pro mikroskopii  vhodný odběrový materiál - inhibice (heparin, aktivní uhlí, formaldehyd) - vazba na konkrétní metodu (výtěžnost DNA – borélie monitorování )  množství odebraného materiálu zvýšení citlivosti, možnost izolace virové DNA, bakteriální DNA, virové RNA 


UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře  uchování před transportem – teplota, doba  transport – forma transportu, teplota, doba souvisí se stabilitou DNA/RNA Obecně platí: teplota 4 – 8 st. C, do 72 hod, při delším skladování zamrazit (jak poté dodat do laboratoře?)

UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Nejméně validních informací (laboratorní příručky, internet, publikace) Informace v kitech - v rámci protokolu odběr, centrifugace, transport, stabilita, dále izolace, PCR, detekce např. kity Qiagen - artusCMV, artusHBV, artusHCV plná krev dodat chlazenou, plasma -20 st. C ne heparin - artus EBV, HSV – žádná informace  experimentální testování stability

UCHOVÁNÍ A TRANSPORT Teplota

Den odběru, izolace a PCR

5. den izolace a PCR

7. den izolace a PCR

EBV (kopie/ml)

2 – 8 st. C

9x104

7x104

2x104

CMV (kopie/ml)

2 – 8 st. C

7x102

1x103

2x103

VZV (Ct)

2 – 8 st. C

19,27

19,79

16,49

HBV DNA IU/ml

2 – 8 st. C

2 500

4 370

3 150

RT

3x104

2x104

2x104

5x105

8x105

5x105

HCV (IU/ml) 2 – 8 st. C RT

7x104

-

9x104

Pravidla  Laboratorní příručka - 5 dnů


UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI Preanalytická fáze až analytická fáze  příjem, centrifugace, alikvotace  teplota a doba skladování materiálu (experimentální ověření - předchozí)  teplota a doba skladování NA Testování stability DNA u vybraných patogenů pomocí rt PCR, kde je měřitelná hodnota (Ct hodnota nebo absolutní kvantita) 

VLIV SKLADOVÁNÍ (1 ROK) NA STABILITU DNA Analýza po izolaci DNA

Analýzy po skladování 12 – 24 měsíců

HSV1 DNA (likvor)

190 kopií/ml

HSV neprokázána opakovaně

Mycobacterium TBC (DNA)

Ct = 36,48

Ct = 40,12 (cut-off = 38)

Testování 30 vzorků.

PREANALYTICKÁ FÁZE  ANALYTICKÁ FÁZE

Kde je hranice?  Část preanalytické fáze prováděné v laboratoři zasahuje do vlastní analýzy - průkaz DNA bakterií při léčbě ATB (zvolit centrifugaci) - zvolit vhodnou extrakci pro DNA/RNA (mikroorganismus, typ biolog.materiálu)  Informace – spolupráce s klinikem 

Odběr materiálu – humánní genom dle požadovaného typu vyšetření DNA typ materiálu RNA typ odběrových zkumavek Informace v laboratorní příručce

ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM 

vhodný typ odběrového materiálu – dle typu vyšetření DNA

x

RNA

DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA

nádorová

fetální

RNA – total RNA, small RNA, miRNA, expresní profily, mutace

nesrážlivá krev/KD- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin  suchá výtěrovka/konzervační medium  tkáň – nativní , fixovaná 

LOKALIZACE ODBĚRU – HUMÁNNÍ GENOM 

Somatické mutace – - hematoonkologie – KD, periferní krev, uzliny, CSF - onkologie – nádorová tkáň, fixovaný nátěr

–počet nádorových buněk ovlivňuje výsledek vyšetření

ODBĚR MATERIÁLU - HUMÁNNÍ GENOM 

vhodný typ odběrového materiálu – dle typu vyšetření DNA

x

RNA

DNA - germline mutace, somatické mutace, volná plazmatická DNA

nádorová

fetální

RNA – total RNA, small RNA, miRNA, expresní profily, mutace

nesrážlivá krev- vhodný antikoagulační prostředek EDTA, citrát/ NE heparin  KD, tkáň, CSF,.. 

TYPICKÉ OBLASTI PREANALYTICKÉ FÁZE- humánní genom Příprava pacienta  Odběr materiálu  Uchování a transport  Uchování a úprava vzorku v laboratoři 

UCHOVÁNÍ A TRANSPORT interval mezi odběrem vzorku a příjmem do laboratoře  Uchování před transportem – teplota, doba 

RNA – nesmí se mrazit! 

Transport – forma transportu, teplota, doba definováno v laboratorní příručce

dle obecného doporučení dle experimentálních dat


UCHOVÁNÍ A ÚPRAVA VZORKU V LABORATOŘI - DLE TYPU VYŠETŘENÍ příjem, centrifugace, alikvotace  teplota a doba skladování 

(DNA- stabilní, možné opakovaně mrazit X RNA – velmi nestabilní, nemrazit)

preanalytika až analytika - prolínání - separace buněk, izolace DNA/RNA, reverzní transkripce) - většina komerčních kitů začíná rt PCR – preanalytiku neřeší



Stabilita RNA- kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL metodou rt PCR 80 70 60 50 4 st. RT

40 30 20 10 0 2

24

48

72 čas (h)

144

ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi Rozvoj metod molekulární biologie – 21.století  Náročné metody  Individuální přístup k vzorkům 

ZÁVĚR Chyby v preanalytické fázi  Rozvoj

metod molekulární biologie – 21.století  Náročné metody  Individuální přístup k vzorkům  Standardizace

metod v laboratoři Standardizace metod mezi laboratořemi

 př.- European LeukemiaNet (ELN) – snaha o standardizaci preanalytické fáze u metody kvantifikace fúzního transkriptu BCR/ABL u CML pacientů

děkuji Vám za pozornost

VÝZNAM NĚKTERÝCH FAKTORŮ PREANALYTICKÉ FÁZE V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Recommend Documents