Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Molekulální komplexy chromatinu CEITEC , Masarykova univerzita

Praktický kurz

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno, Univerzitní kampus Bohunice blok A2, seminární místnost 1.21 Datum: 22.1. – 24.1. 2013 Začátek vždy v 9:00 Vedoucí kurzu: Mgr. Ctirad Hofr Ph.D [email protected]

Kurz je organizován v rámci projektu OP VK

Moderní biofyzikální metody: pokročilé vzdělávání v experimentální biologii registrační číslo CZ.1.07/2.3.00/09.0046.

www.modernibiofyzika.cz

Časový plán Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii

9-13

Úterý

Středa

Čtvrtek

Úvod organizace kurzu

Anisotropie fluorescence přednáška

Fluorescenční mikroskopie přednáška

1.Měření spektrálních charakteristik proteinů a DNA návod Skupina A Nanophotemeter

5. Příprava fluorescenčně značeného proteinu Skupina A, B návod

2.Stanovení koncentrace proteinů Bradfordové metodou návod Skupina B Spektrofotometr

9. Příprava mikroskopických preparátů pro lokalizaci transgenních proteinů (každý si připraví vlastní preparát) návod

6. Předvedení měření anizotropie fluorescence Skupina A, B

10. Sledování připravených preparátů rostlin obsahujících GFP a RFP v živých buňkách za použití fluorescenční mikroskopie Skupina A, B

záměna skupin

záměna skupin

záměna skupin

3. Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond návod Skupina C (3 účastníci) Fluorimetr Fmax4 4. Fluorescenční stanovení koncentrace DNA návod Skupina D (3 účastníci) SpectroVis

7. Vizualizace makromolekul při horizontální elektroforetické separaci (EMSA) návod

11. Měření vlastní fluorescence aminokyselin a proteinů Skupina C návod 12. Stanovení koncentrace DNA a proteinu za použití komerčně dostupných kitů 1 návod Skupina D

záměna skupin A a B na stanovištích 1 a 2

oběd

14-17

záměna skupin C a D na stanovištích 3 a 4

8. Agarosová elektroforéza sledovaná v reálném čase Skupina C, D společně

Záměna skupin C a D na stanovištích 11 a 12

Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace DNA a proteinů Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul. Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm. Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c.ε za předpokladu, že měříme v 1 cm kyvetě a známe extinkční koeficient ε, který má jednotku [M-1cm-1] pro molární koncentraci nebo [mL.mg-1cm-1] pro koncentraci v mg/mL. V případě, že neznáme extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA o absorbanci 1 má koncentraci 50 µg/mL a pro převod na molární koncentraci nukleotidu DNA pak vztah 320 µg/mL = 1 mM. Pro určení koncentrace proteinů spektroskopicky lze využít absorbance proteinů při 280 nm. Jestliže známe primární sekvenci aminokyselin proteinu, lze extinkční koeficient vypočítat http://www.expasy.org/tools/protparam.html. Ze změřené absorbance pak určíme koncentraci proteinu. Znalost extinkčního koeficientu není nutná v případě univerzální Bradfordové metody. Bradfordové metoda je v současnosti nejrozšířenější způsob určování koncentrace proteinu. Bradfordové metoda využívá posunu absorpčního maxima „Coomasie Blue“ po vazbě na protein. Za použití kalibrační křivky se známou koncentrací proteinu lze určit skutečnou koncentraci neznámého proteinu nebo směsi proteinů. Materiál • •

DNA (Salmon sperm; přibližná koncentrace = 7,5 mg/mL) Oligonukleotid CNF2_Bot (5´ GTTATCCTTTGAGGGTTTAG; přibližná koncentrace = 0,02 mg/mL) • BSA (hovězí sérový albumin; ε = 0.677 ml mg-1 cm-1, MW = 66430; přibližná koncentrace 5 mg/mL) • TE pufr, destilovaná voda • Bradford reagent (BioRad) • Kyvety a spektrofotometr DNA 1. Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci DNA. 2. Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm. 3. Určete polohu absorpčního maxima. 4. Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/mL a v OD/mL. 5. Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo spektroskopicky možno přesně stanovit jeho koncentraci. 6. Změřte absorpční spektrum v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm. 7. Nastavení NanoPhotometer: Functions – Wavescan – nastavte min a max λ – OK – Blank - vzorek 8. Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient ε260 a spektroskopicky určete jeho koncentraci. http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx?c=EU 9. Změřte spektrum značeného oligonukleotidu ve stejném rozsahu vlnových délek a porovnejte jej se spektrem neznačeného oligonukleotidu.

Protein UV spektroskopie 1. Připravte roztok BSA v TE pufru ze zásobního roztoku tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci BSA. 2. Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm: Nastavení přístroje Beckman DU®730 :Wavelength Scan – Options – λ – nastavit hodnoty min a max λ – OK – blank - vzorek 3. Určete polohu absorpčního maxima. 4. Stanovte přesnou molární koncentraci BSA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného roztoku při 280 nm.

Bradfordové metoda 1. Připravte standardní kalibrační křivku pro měření koncentrace proteinu Bradfordové metodu. 2. Změřte koncentraci BSA pomocí této metody. 3. Vezměte roztok reakčního Bradfordové činidla z lednice a nechte jej zahřát na pokojovou teplotu a promíchejte. 4. Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do mikrozkumavek tak, že do 980 µL reakčního Bradfordové činidla přidejte vždy 20 µ L TE pufru nebo 20 µL 0.125 mg/mL , 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL a 1.5 mg/mL standardů. 5. Současně připravte stejným způsobem roztok BSA ze zásobného roztoku, který jste naředili tak, aby bylo možno přesně určit jeho koncentraci. 6. Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě. Inkubace by neměla přesáhnout 1h. 7. Nastavení spektrofotometru: Beckman DU®530: Protein assay – Bradford – STD Curve – Units: mg/ml – tlačítko MORE – Create table – vypište hodnoty koncentrací standardů od nejmenší – Entry Done Změřte absorbanci blanku Změřte absorbanci roztoku standardů. Při měření postupujte od nejnižší koncentrace standardu k nejvyšší. Po posledním standardu se vytvoří kalibrační křivka. Změňte rovnici: Next formula – Entry Done Beckman DU®730: Protein Assay Analysis – Bradford – Start – Standard Curve – Standards Setup - vypište hodnoty koncentrací standardů od nejmenší přes Edit concentration – Done –změřte absorbanci blanku, poté standardů. Změňte rovnici na Non-linear - Done 8. Změřte absorbanci blanku, jednoho standardu (pro kontrolu) a poté neznámého vzorku a pomocí kalibrační křivky určete jeho koncentraci. 9. Porovnejte hodnoty koncentrace zásobního roztoku BSA určené spektroskopicky při 280 nm a pomocí Bradfordové metody.

Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluoroforů V tomto experimentu je ukázán vliv pH na fluorescenci a absorpci fluorescenční značky fluoresceinu rozpuštěné ve stejné koncentraci v roztocích o různém pH. Je rovněž demonstrován vliv teploty na intenzitu fluorescence. Materiál      

Fluorescein - NIST-traceable standard - 50 µM (Molecular Probes, Invitrogen) Spektrofluorometr vybavený kryostatem (chlazenou vodní lázní) Pufr 5 (20 mM MES, pH 5.0) Pufr 7 (50 mM fosfát sodný, pH 7.0) Pufr 9 (50 mM glycin, pH 9.0) Kyveta

Postup 1. Připravte vzorky fluoresceinu 10 000x naředěním roztoku NIST standardu jeho přidáním 1,5 µL do 1499 µL roztoku pufru 5, pufru 7 a pufru 9 a následným dalším naředěním (150 µL 1000x zřeď. roztoku do 1350 µL příslušného pufru). 2. Změřte excitační spektra vzorků při λ(em) = 515 nm Pozn. Začněte měřením fluoresceinu v pufru 9, pak v pufru 7 a nakonec změřte při stejných nastaveních fluorescein v pufru 5. 3. Změřte emisní spektra vzorků při λ(ex) = 488 nm 4. Znovu změřte emisní a excitační spektrum fluoresceinu v pufru 9 při 20°C, zahřejte vzorek vodní lázní na 40°C a znovu změřte spektra.

Obr. 1: Vliv pH na excitační a emisní spektrum fluoresceinu. Výsledky Při změně pufru z pH 7 na pH 5 a při zvýšení teploty dochází ke snížení intenzity fluorescence fluoresceinu.

Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci Fluorescenční značení lze využít při sledování elektroforetické migrace makromolekul. V případě, že jsou protein a DNA naznačeny rozdílnou fluorescenční značkou, lze nezávisle detekovat polohu DNA a proteinů a sledovat jejich vzájemnou interakci. Materiál             

DNA fragment s navázanou fluorescenční značkou Indodicarbocyanine (Cy5) (excitace 650 nm, emise 670 nm) protein s navázanou fluorescenční značkou Alexa Fluor 488 (excitace 496 nm, emise 519 nm) roztok akrylamidu 30% (akrylamid : bisakrylamid ~ 37,5:1) Upozornění: Akrylamid je neurotoxin. Je nutno pracovat v rukavicích! 5X TBE (450 mM Tris, 450 mM kys. boritá, 10 mM EDTA) 30% APS (ammonium persulfate) TEMED (N, N, N´-tetramethylethylendiamin) Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný) ddH2O n-butanol nasycený vodou (45 ml n-butanolu smíchaný s 5 ml ddH2O) mikrozkumavky 6x nanášecí pufr (60% glycerol, 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 60 mM EDTA) aparatura pro horizontální elektroforézu fluorescenční scanner FLA-7000

Postup 1. Připravte směs pro horizontální akrylamidový gel tak, že smícháte odpovídající množství zásobního roztoku akrylamidu (neurotoxin!), 5X TBE a ddH2O, aby výsledná koncentrace akrylamidu byla 5 % v 0.25X TBE a celkový objem směsi byl 80 ml. Jednotlivé složky přidávejte v pořadí: ddH2O, 5x TBE, dále 400 µl 30% APS a 26,4 µl TEMED a až nakonec 30% akrylamid. Dobře promíchejte, nalijte do formy a nasaďte hřebínek na 10 jamek. Směs se po nalití do formy přelije vrstvou n-butanolu, aby mohlo dojít k polymeraci bez přístupu vzduchu. Nechte 1 hodinu polymerizovat na stole. 2. Připravte roztok fluorescenčně značené DNA ve fosfátovém pufru tak, aby byla jeho výsledná koncentrace 1,5 pmol/µl (zásobní DNA: 2 vysušené alikvoty po 15 pmol) 3. Připravte roztok fluorescenčně značeného proteinu ve fosfátovém pufru tak, aby byla jeho koncentrace 6 pmol/µl. (zásobní protein: přibližně 8 pmol/µl – bude upřesněno) 4. Připravte vzorky do mikrozkumavek podle následující tabulky v pořadí: fosfátový pufr, protein, DNA, nanášecí pufr

zkumavka číslo:

1

2

3

4

5

6

7

8

DNA : protein

9

10

pouze DNA

pouze 1:24 protein

1:2

1:4

1:6

1:8

1:12

1:16

1:20

DNA (1,5 pmol/μl)

2

2

2

2

2

2

2

2

2

-

protein (6 pmol/μl)

-

1

2

3

4

6

8

10

12

1

fosfátový pufr

13

12

11

10

9

7

5

3

1

14

6x nanášecí pufr

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

5. Nechte 10 minut inkubovat za laboratorní teploty. 6. Sestavte aparaturu pro horizontální elektroforézu a naplňte ji 0.25X TBE pufrem (připravte 2 litry pufru). 7. Odstraňte hřebínek a vložte gel do elektroforetické vany. 8. Naneste vzorky na gel v pořadí jako je v tabulce. 9. Spusťte elektroforézu při napětí 40 V. Po 30 minutách zvyšte napětí na 90 V a nechte pokračovat dalších 90 minut. 10. Detekujte fluorescenci značené DNA na fluorescenčním scanneru s nastavením budícího záření a detekčního filtru na Indodicarbocyanine [Cy5]. 11. Detekujte fluorescenci značeného proteinu na fluorescenčním scanneru s nastavením budícího záření a detekčního filtru na Alexa fluor [Alexa488]. 12. Porovnejte obě výsledná zobrazení a určete oblasti, ve kterých se vyskytují komplexy vzniklé vazbou proteinu na DNA.

Obr. 1 Příklad překryvu zobrazení při různém fluorescenčním značení DNA a proteinu

Vlastní fluorescence proteinů Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami v nich obsaženými: tryptofanem (Trp), tyrozinem (Tyr) a fenylalaninem (Phe). Dominující je fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin. V této úloze jsou změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého tryptofanu, tyrozinu a fenylalaninu. Vlastnosti L-tryptofanu  MW = 204,23  absorpční maximum: λexmax = 295 nm  fluorescenční emisní maximum: λemmax = 353 nm  emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí Vlastnosti L-tyrozinu  MW = 181,19  absorpční maximum: λexmax = 275 nm  fluorescenční emisní maximum: λemmax = 304 nm  emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla Vlastnosti L-fenylalaninu  MW = 165,19  absorpční maximum: λexmax = 260 nm  fluorescenční emisní maximum: λemmax = 282 nm  emise Phe je strukturovaná Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových délkách, takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový výtěžek fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci v proteinech lze selektivně excitovat při 295-305 nm. Materiál  L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem), L-fenylalanin (Applichem)  Hovězí sérový albumin (BSA, MW = 67000)  pufr A (120 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 30 mmol/l Tris HCl, pH 7,4) Postup 1. Připravené zásobní roztoky Trp, Tyr, Phe a BSA nařeďte pufrem A pomocí tabulky: 1. ředění

Trp

zásobní koncentrace 10 mM

1. počet ředění (např. 100x)

5 μM

2. ředění (to 1500 μl) 100 nM

Tyr

2 mM

20 μM

142,8 nM

Phe

10 mM

16,66 μM

-------

BSA

0,3 mM

0,6 μM

30 nM

2. počet ředění

-------

2. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce. excitační spektrum λem (nm) λex (nm) L-tryptofan 350 240-300 L-tyrozin 300 240-290 L-fenylalanin 280 240-270 albumin 350 240-320

emisní spektrum λex (nm) λem (nm) 280 290-420 270 280-450 250 260-360 280 300-420

Výsledky Změřená excitační a emisní spektra vlastní fluorescence tryptofanu (Trp), tyrozinu (Tyr), fenylalaninu (Phe) a albuminu v pufru A jsou na Obr.1 a Obr 2. Z výsledných spekter je zřejmé, že prakticky veškerá vlastní fluorescence albuminu pochází od tryptofanu. Měření byla provedena na spektrofluorometru FluoroMax-4.

1 .2 x1 0

Intenzita fluorescence

1 .0 x1 0

6

TR P

6

8 .0 x1 0

5

6 .0 x1 0

5

4 .0 x1 0

5

2 .0 x1 0

5

ALB PHE TYR

0 .0 240

260

280

300

320

(n m )

Obr. 1 Excitační spektra 5 μM Trp (λem = 350 nm), 20 μM Tyr (λem = 300 nm), 200 μM Phe (λem = 280 nm) a 0.6 μM albuminu (λem = 350 nm).

Intenzita fluorescence

1 .2 x1 0

6

1 .0 x1 0

6

8 .0 x1 0

5

6 .0 x1 0

5

4 .0 x1 0

5

2 .0 x1 0

5

ALB

TR P

PH E TYR

0 .0 250

3 00

350

400

(n m )

Obr. 2 Emisní spektra 5 μM Trp (λex = 280 nm), 20 μM Tyr (λex = 270 nm), 200 μM Phe (λex = 250 nm) a 0.6 μM albuminu (λex = 280 nm).

Fluorescenční stanovení koncentrace DNA Určení koncentrace DNA je často základním krokem při analýze biologického materiálu a je součástí mnoha laboratorních protokolů. Znalost přesné koncentrace DNA je důležitá pro celou řadu technik (např. sekvenování, klonování cDNA, transkripce RNA). Koncentrace DNA je nejčastěji měřena UV spektroskopií, určením hodnoty absorbance při 260 nm (Abs260 = 1 pro dvouřetězcovou DNA o koncentraci 50 µ g/mL; v 1 cm kyvetě). Ke kvantifikaci nižších koncentrací DNA, než jsou detekovatelné za použití UV spektroskopie lze použít fluorescenční sondy, které se vážou na dvouřetězcovou DNA a vykazují několikanásobný nárůst intenzity fluorescence po navázání. K sondám, které lze použít ke stanovení koncentrace DNA patří GelStar. Tato fluorescenční sonda má excitační maximum kolem 493 nm a emituje v oblasti 530 nm.

Materiál     

Spektrofluorometr SpectroVis Plus (Vernier) Kyveta (2 mL) Roztok DNA (Salmon sperm) GelStar (10000x) 1x TE pufr Destilovaná voda

Příprava roztoků 1x TE: 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA pH 8,0

100x GelStar 2 µl zásobního 10000x koncentrovaného roztoku GelStar nařeďte na objem 200 µl 1x TE pufrem

Standardní roztok DNA Abs260 = 0,364 koncentrace = ?

Vytvoření standardní křivky 1. Připravte následná ředění roztoku DNA v 1X TE s koncentrací: 5 ng/µ l, 2,5 ng/µ l, 1,25 ng/µ l, 0,625 ng/µ l, 0,3125 ng/µ l po 1mL) 2. Připravte blank: 1 mL 1x TE pufru 3. Ke každé koncentraci 1mL standardního roztoku DNA a k blanku přidejte vždy 20µ l 100x GelStar roztoku a 980 µ l 1xTE pufru. Promíchejte a postupně pipetujte do kyvety. Celková koncentrace DNA standardů v kyvetě je nyní poloviční (2,50, 1,25, . . . ng/µ l) 4. Všechny standardy a vzorky s GelStar uchovejte v temnu až do měření. 5. Zapněte spektrofluorometr podle návodu. 6. Spusťte program Logger Pro 3.8.2 7. Změřte intenzitu fluorescence Experiment – Change units – Spectrometer – Fluorescence – excitační vlnová délka 8. Změřte nejdříve intenzitu fluorescence blanku, následně standardy: vložte kyvetu, měření spustíte tlačítkem Collect a zastavíte Stop 9. Hodnoty intenzity zapište do tabulky a vyneste do grafu hodnoty intenzity fluorescence standardů na koncentraci vzorku.

Měření neznámého vzorku 1. Nařeďte neznámý vzorek v 1x TE na celkový objem 1mL. Objem v mikrozkumavce: 0,5 ml. 2. Přidejte 20 µ l 100x GelStar a 980 µ l 1xTE pufru. 3. Změřte intenzitu fluorescence neznámého vzorku. 4. Určete podle standardní křivky koncentraci DNA v neznámém vzorku. Výsledky Stanovení koncentrace DNA v původním neředěném neznámém vzorku.

Stanovení koncentrace DNA a proteinu pomocí mikrofluorometru

Materiál • • • • •

Quant-iT™ dsDNA BR Assay Kit, Quant-iT™ ssDNA Assay Kit, Quant-iT™ protein Assay Kit Standardy dsDNA, ssDNA a proteinu Vzorek dsDNA, ssDNA a proteinu o neznámé koncentraci Qubit mikrozkumavky Mikrofluorometr Qubit™ (Invitrogen)

Postup 1. Připravte si cca 1 ml Working solution smícháním Quant-iT™ reagent a Quant-iT™ buffer v poměru 1:200 (1 µl reagent : 200 µl buffer) zvlášť pro ssDNA, dsDNA a protein 2. Připravte standardy smícháním 190 µl Working solution + 10 µl příslušného standardu #1 a #2 (#3 pro protein) 3. Připravte vzorek o neznámé koncentraci ve dvou mikrozkumavkách smícháním 195 µl Working solution + 5 µl vzorku 4. Standardy i vzorky krátce promíchejte na vortexu (2-3 sec), opatrně - ve vzorku nesmí být bublinky!! 5. Inkubace 5-10 minut při laboratorní teplotě 6. Zapněte Qubit fluorometr, vyberte příslušnou metodu (metoda v přístroji musí mít stejný název jako kit, který používáte), nová kalibrace (standardy), poté změřte neznámý vzorek (od každé zkumavky 3 měření) Pozn.: Měření by mělo probíhat za laboratorní teploty (22- 28°C). Teplota vzorků by měla být stejná, proto nedržte zkumavku se vzorkem před měřením dlouho v rukách, po každém měření zkumavku ihned vytáhněte z přístroje a mezi jednotlivými měřeními ji ponechte inkubovat alespoň 30 sec při laboratorní teplotě.

Výsledky Stanovení koncentrace DNA a RNA v neznámých vzorcích.

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii 2012: Fluorescenční mikroskopie při lokalizaci transgenních proteinů exprimovaných v listech Nicotiana benthamiana Cíl praktické úĺohy: a) b) c)

osvojit si protokol pro přípravu preparátu pro in vivo mikroskopii a analýzu distribuce fluorescenčních proteinů v buňkách praktický nácvik infiltrace bakteriální kultury do listů N. benthamiana a příprava mikroskopického preparátu z transientně transformovaných listů

Teorie: Fluorescenční proteiny jsou nejčastěji používány jako markery pro studium lokalizace proteinů zájmu v buněčných strukturách živých buněk, tzv. in vivo. Základní princip je takový, že se vytvoří fúzní gen, ve kterém je v totožném čtecím rámci exprimován marker (GFP, BFP,CFP,YFP etc.) a cílový protein jako jediná molekula. Expresní vektory s fúzními geny jsou u rostlin nejčastěji založené na T-DNA, která se buď začleňuje do genomu (stabilní transformace) nebo nezačleněná zůstává v buňce (tranzientní tranformace), kde je po několika dnech její exprese umlčena, nebo se vyředí buněčným dělením. Zatímco příprava stabilních transformantů vyžaduje několik měsíců potřebných pro jejich selekci, pomocí tranzientní transformace získáme výsledek relativně rychle, během několika dní (3-4). V obou těchto případech cílové proteiny lokalizují podle signálních sekvencí, které obsahují, a v místě kumulace pak pozorujeme fluorescenční signál.

Postup při přípravě preparátu pro in vivo mikroskopii Materiál je nutné udržovat ve fyziologicky blízkých podmínkách, proto připravíme tzv. biochamber obsahující rostlinné kultivační medium Murashinge/Skoog (MS). Vzorky jsou uzavřeny biofolií, která propouští vzduch. 1. Oboustranná lepící páska je vystřihnuta do tvaru čtverce jehož strana je asi 24mm ~ krátké straně krycího skla. V tomto čtverci je pak vyříznuto okénko, jak ukazuje schéma, a páska je nalepena na KRYCÍ sklo.

lepící páska

lepící páska nalepená na krycím skle

2. Dovnitř tohoto okénka napipetujeme 20µl MS media a vložíme 2-3 dny staré semenáčky Arabidopsis, které byly ve svislé poloze pěstovány na agarové plotně obsahující MS medium. 3. Okénko zakryjeme biofolií. 4. Takto připravený preparát je přilepen páskou na nosič obsahující otvor pro cirkulaci vzduchu, a to biofolií směrem do otvoru. Preparát vložíme do mikroskopu krycím sklem směrem k objektivu. V této komůrce semenáčky Arabidopsis rostou až několik dní.

Postup při infiltraci bakteriální kultury do listů N. benthamiana a přípravě mikroskopického preparátu z transientně transformovaných listů 1. kolonie agrobakteriálního klonu se odpíchne do 5ml media a kultivuje se do OD600 = 0.8 1.0. Pokud je OD vyšší kultura se na požadovanou koncentraci naředí (cca 24h) 2. napěstovaná kultura se stočí ve výkyvném rotoru (8000 RPM) a pak se rozsuspenduje ve stejném objemu infiltračního media (10mM MES, 10mM MgCl2, pH~5.7, sterilní) 3. pro samotnou infiltraci se kultura smíchá se stejně připraveným pomocným kmenem agromabteria p19 nebo HcPro, které potlačují mechanizmy umlčování genů. Kultury se smíchají v poměru 1:1 a nechají odpočívat 10 min na ledu 4. žlutou špičkou se naruší spodní epidermis listu a 1ml stříkačkou se vtlačí bakteriální suspenze do pletiva. Infiltrovaná oblast listu se označí fixou a místo vpichu se prorazí skrz. (Rostliny by měly být 4-6 týdnů vzrostlé, cca 30 cm, dobře zalité před infiltrací a pouze primární listy by měly být infiltrovány. 5. Analýza se provádí po 3 – 4 dnech buď na listových výsečích nebo sloupnuté epidermis.