RNA-interferentie in foto-aging: mogelijke toepassingen

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN  

Academiejaar 2011 - 2012

RNA-interferentie in foto-aging: mogelijke toepassingen

Paulien MEERSSEMAN

Promotor: dr. ir. Barbara Geusens Co-promotor: dr. Stefanie Bracke

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER IN DE GENEESKUNDE

 

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

Academiejaar 2011 - 2012

RNA-interferentie in foto-aging: mogelijke toepassingen

Paulien MEERSSEMAN

Promotor: dr. ir. Barbara Geusens Co-promotor: dr. Stefanie Bracke

Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER IN DE GENEESKUNDE

 

 

Voorwoord Deze masterproef had niet tot stand gekomen zonder het verbeter- en sturingswerk van mijn promotor en co-promotor. Ze waren altijd vlot bereikbaar en stonden altijd open voor vragen. Daarnaast zou ik graag mijn vriend, vrienden en familie bedanken die mij gedurende deze twee jaar hebben gesteund wanneer het niet altijd even vlot verliep en ze voor de nodige ontspanning tussenin konden zorgen.

Inhoudstafel VOORWOORD INHOUDSTAFEL LIJST MET AFKORTINGEN ABSTRACT ............................................................................................................................................ 1 INLEIDING ............................................................................................................................................ 2 1. FOTOAGING ..................................................................................................................................... 2 1.1. DEFINITIE ....................................................................................................................................... 2 1.2. FYSIOLOGIE.................................................................................................................................... 2 1.2.1. Fotoaging versus intrinsieke huidveroudering ........................................................................... 3 1.3. FOTOBIOLOGIE ............................................................................................................................... 5 2. BESTAANDE BEHANDELINGEN ........................................................................................................ 6 2.1. PREVENTIE ..................................................................................................................................... 6 2.2. FYSISCHE BEHANDELINGEN ........................................................................................................... 7 2.3. FARMACOLOGISCHE BEHANDELINGEN .......................................................................................... 7 2.3.1. Topische retinoïden .................................................................................................................... 7 2.3.2. α-Hydroxyzuren .......................................................................................................................... 8 2.4. VERNIEUWENDE BEHANDELINGEN ................................................................................................ 8 2.4.1. Antioxidanten ............................................................................................................................. 9 2.4.2. T4 endonuclease V (T4N5) ........................................................................................................ 9 2.4.3. Thymine dinucleotide (pTT) ...................................................................................................... 9 3. HET RNAI MECHANISME .............................................................................................................. 10 3.1. ONTDEKKING ............................................................................................................................... 10 3.2. MECHANISME............................................................................................................................... 10 3.2.1. Kernmechanisme ...................................................................................................................... 10 3.2.2. Plaats van siRNA en short hairpin (shRNA) in RNAi mechanisme ........................................ 12 3.2.2.1. siRNA .................................................................................................................................... 12 3.2.2.2. shRNA ................................................................................................................................... 12 3.2.3. Plaats van miRNA in RNAi mechanisme................................................................................. 13 METHODOLOGIE ............................................................................................................................. 14 RESULTATEN..................................................................................................................................... 15 1. FOTOAGING: HISTOLOGISCHE EN MOLECULAIRE WIJZIGINGEN .............................................. 15 2. POTENTIËLE TARGETS VOOR SILENCING DOOR MIDDEL VAN SIRNA ....................................... 18 2.1. COLLAGEEN HOMEOSTASE .......................................................................................................... 19 2.1.1. EGF ........................................................................................................................................... 19 2.1.2. Transforming Growth Factor β (TGF-β ) ................................................................................. 20 2.1.3. Insulin/Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) ............................................................................ 21 2.1.4. Cysteïne-rijk proteïne 61 (CYR61/CNN1) ............................................................................... 22 2.1.5. Samenvatting van de pathways van de collageen homeostase ................................................. 22 2.2. ROS ............................................................................................................................................. 23 2.3. OXIDOREDUCTASE THIOREDOXINE-1 (TRX-1) ............................................................................ 24

2.4. INVOLUCRINE/Β-1 INTEGRINE RATIO ........................................................................................... 25 2.5. HYALURONIDASE (HYAL) .......................................................................................................... 26 2.6. SAMENVATTING POTENTIËLE TARGETS ....................................................................................... 26 3. MIRNA IN AGING ........................................................................................................................... 27 4. TOPISCHE BEHANDELING (“GENE CREAM”)................................................................................ 29 DISCUSSIE........................................................................................................................................... 30 REFERENTIELIJST........................................................................................................................... 32

Lijst met afkortingen Ago2:

Argonaut 2

AHA:

α-hydroxyzuren

AP-1:

Activator proteïne-1

COL1A1:

Collageen type 1 alfa 1

CPD:

Cyclobutaan pyrimidine dimeer

CYR61/CCN1:

Cysteïne-rijk proteïne 61

dsRNA:

Dubbelstrengig RNA

ECM:

Extracellulaire matrix

EGF:

Epidermale groeifactor

Egr-1:

Early growth response factor-1

EMEA:

European medicines agency

ERT:

Ets-related transcription

FDA:

Food and drug administration

FOXO:

Forkhead box gene, group O family

HAS:

Hyaluron synthase

HYAL:

Hyaluronidase

IGF-1:

Insulin/insulin-like growth factor-1

IL:

Interleukine

MAPK:

Mitogeen-geactiveerde proteïne kinases

MC1R:

Melanocortine-1 receptor

MEKK1:

MEK kinase 1

miRNA:

MicroRNA

MKKK:

MAPK kinase kinase

MMP:

Matrix metalloproteïnase

NF-κB:

Nucleaire factor-kappa B

NHKs:

Normale humane keratinocyten

PI3K:

Fosfatidylinositol-3 kinase

PKB:

Proteïne kinase B

PKR:

Proteïne kinase R

pre-miRNA:

Precursor miRNA

pri-miRNA:

Primair miRNA

PTGS:

post-transcriptionele gen silencing

PTPs:

Proteïne thyrosine fosfatases

pTT:

thymine dinucleotide

RAR:

Retinoïnezuurreceptoren

RISC:

RNA-induced silencing complex

RNAi:

RNA interference

ROS:

Reactieve zuurstofverbindingen

RXR:

Retinoïd X receptoren

SBE:

Smad binding element

SC:

Stratum corneum

shRNA:

Short hairpin RNA

siRNA:

Small interfering RNA

SMases:

Sphingomyelinases

T4N5:

T4 endonuclease V

TGF-β:

Tranforming growth factor β

TGIF:

TG3-interacting factor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α

Trx-1:

Oxidoreductase thioredoxine-1

Abstract De huid wordt chronisch blootgesteld aan uv-straling van de zon. Dit heeft premature huidveroudering, cutane fotoaging genaamd tot gevolg. Behandelingen om de berokkende schade door fotoaging tegen te gaan, zijn vaak ingrijpend. Daarnaast zijn de meeste ofwel weinig efficiënt, ofwel weinig specifiek. Mede door toegenomen kennis in het proces van fotoaging en de identificatie van belangrijke elementen in dit proces lijkt een therapie op basis van het RNA interference (RNAi) mechanisme een waardig alternatief te bieden. Het doel van deze literatuurstudie is een beeld te schetsen van de molecules die een belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van fotoaging en die als potentiële target kunnen dienen voor een specifieke behandeling op basis van het RNAi mechanisme. Om tot deze potentiële targets te komen werd gebruik gemaakt van talrijke reviews en wetenschappelijke onderzoeken besproken in de literatuur. Hierbij werd zowel aandacht besteed aan opgereguleerde genen en eiwitten, als aan opgereguleerde of downgereguleerde microRNAs (miRNAs). Small interfering RNA (siRNA), anti-miRNAs en/of precursor miRNAs (pre-miRNA) zouden hierbij kunnen worden ingezet met als doel het corrigeren van de pathofysiologie. Uit de studie kwamen volgende molecules naar voor als meest potentiële targets voor silencing door middel van siRNA: EGF/EGF-achtige liganden, EGF-receptor, intrinsiek tyrosine kinase, small GTPbindende eiwitfamilies, SMases, ceramide, MAPK, Raf-1, MEK1, Erk, AP-1 en MMP. Deze potentiële targets maken deel uit van de pathway ‘epidermale groeifactor’, een belangrijk onderdeel van de collageen homeostase. AP-1 lijkt met zijn effecten op zowel de fibroblasten als de keratinocyten één van de belangrijkste potentiële targets te zijn. Uit de studie kan worden besloten dat slechts weinig bekend is over miRNAs en fotoaging, waaruit de noodzaak aan meer wetenschappelijk onderzoek volgt.

     

 

 

 

1  

Inleiding De huid, het grootste orgaan van het menselijk lichaam, wordt chronisch blootgesteld aan uv-straling van de zon. De steeds slinkende ozonloog leidt tot een toename van uv-straling op het aardoppervlak. Dit brengt een groeiende aandacht teweeg voor de schadelijke gevolgen van blootstelling aan uvstralen op de huid: fotoaging, zonnebrand, immunosupressie en carcinogenese. Fotoaging, de meest voorkomende vorm van huidbeschadiging door uv-stralen, brengt schade toe aan het bindweefsel, de melanocyten en de microvasculatuur (1). Recente inzichten over fotoaging van de humane huid hebben talrijke fysieke gevolgen, histologische karakteristieken en moleculaire mechanismen van uvblootstelling ontrafeld. Deze toegenomen kennis in het proces van fotoaging en de identificatie van belangrijke elementen in dit proces, vormt een belangrijke aanzet tot de productie van specifieke therapieën tegen fotoaging. RNA interference (RNAi) is een mechanisme dat kan worden toegepast om moleculen, die een belangrijke rol spelen in het proces van fotoaging, te beïnvloeden en ligt dan ook aan de basis van een nieuwe alternatieve therapie die in deze literatuurstudie wordt voorgesteld. Huidveroudering is een biologisch proces dat kan worden onderverdeeld in twee types. Terwijl intrinsieke huidveroudering onvermijdbaar is, is extrinsieke huidveroudering dat niet. Een belangrijke vorm van extrinsieke huidveroudering is fotoaging. De schadelijke invloed van uv-stralen wordt tegenwoordig nog steeds onderschat. Dermatologen pleiten al jaren voor het frequenter gebruik van zonnecrèmes als bescherming tegen uv-stralen. Daarnaast is men ook op zoek naar behandelingen die de reeds berokkende schade door fotoaging tegengaan. Op cosmetisch vlak bestaan er reeds een aantal behandelingen, maar deze zijn ofwel weinig efficiënt ofwel weinig specifiek. Daarom wordt in deze literatuurstudie dieper ingegaan op een alternatieve therapie voor fotoaging: manipulatie van het proces met behulp van small interfering RNAs (siRNAs) en microRNAs (miRNAs) die op dit moment een hot topic zijn en mogelijks een oplossing kunnen bieden tegen de gevolgen van fotoaging.

1.

Fotoaging 1.1. Definitie

Chronische bloodstelling aan uv-stralen zorgt voor premature huidveroudering, cutane fotoaging genaamd. Fotoaging beschrijft typische klinische kenmerken, deze worden hieronder uitgebreid besproken. De klinische kenmerken zijn het gevolg van dermale wijzigingen. Dit wordt histologisch bevestigd door het dunner worden van de epidermis en de desorganisatie van het dermale bindweefsel. 1.2. Fysiologie Huidveroudering is eerder een ‘cosmetische dan wel een medische zorg’. Het is echter een aspect dat velen onder ons bezig houdt en is een courante reden waarom patiënten op consult komen in de cosmetische dermatologie (2). Hoewel de educatie over preventie van huidveroudering de laatste jaren         2      

enorm is toegenomen, mede dankzij de media en het internet, blijft er een enorme vraag naar een efficiënte behandeling die huidveroudering tegengaat. Voor het ontwikkelen van een therapie is het bijgevolg belangrijk om de onderliggende mechanismen te ontrafelen. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen intrinsieke huidveroudering (chronologische huidveroudering) en extrinsieke huidveroudering.

Extrinsieke

huidveroudering

ontstaat

voornamelijk

als

gevolg

van

omgevingsfactoren. Chemische factoren zoals luchtvervuiling, tabak, alcohol en drugs alsook fysische factoren zoals zonlicht (uv) hebben een duidelijk effect op veranderingen in de huid (3). Dit type huidveroudering en dan vooral de uv-radiatie is de hoofdoorzaak van premature huidveroudering (4). De klinische tekenen van extrinsieke huidveroudering zijn vooral duidelijk bij patiënten die frequent aan de zon werden blootgesteld. In deze literatuurstudie wordt enkel de hoofdfactor van extrinisieke huidveroudering, namelijk fotoaging, besproken. 1.2.1. Fotoaging versus intrinsieke huidveroudering Intrinsieke huidveroudering is huidveroudering die ontstaat door ouderdom en genetische voorgeschiktheid (2). Deze huidveroudering wordt ten eerste gedetermineerd door telomeren. Wanneer een telomeer te kort wordt, zal dit in de cel aanleiding geven tot cellulaire veroudering/apoptosis (5). Ten tweede zijn keratinocyten deels resistent tegen deze apoptosis, dit heeft tot gevolg dat er tijd is voor accumulatie van DNA- en eiwitschade (6). De intrinsieke huidveroudering kan bepaald worden door een vermindering van een aantal klinische, histologische en fysiologische elementen in de tegen uv-stralen beschermde huid (7). Intrinsieke huidveroudering veroorzaakt een afname van: de epidermale turnover, de klaring van chemische substanties van de dermis, de thermoregulatie, de snelheid van re-epithelialisatie na een wonde, de dikte en cellulariteit van de dermis, de mechanische bescherming, de snelheid van het immuunsysteem, de zweet- en sebumproductie, de capaciteit van de vitamine D synthese, de sensorische perceptie en de vasculaire reactiviteit (7). Bij toenemende leeftijd kan een daling in de respons van keratinocyten en fibroblasten op groeifactoren worden vastgesteld, dit leidt tot een verminderde capaciteit van de proliferatie van de keratinocyt en fibroblast (8). Ook de menopauze heeft een belangrijke invloed op de veroudering van de huid, alsook bepaalde ziekten en psychische problemen (3). Intrinsieke huidveroudering wordt gekenmerkt door een ‘losse’ huid en kan het makkelijkst worden beoordeeld op plekken die nauwelijks aan de zon worden blootgesteld (Figuur 1). Dergelijke huid is dun, egaal, droog, intact en vertoont fijne rimpels. De dunne huid is het gevolg van de verdunning van de epidermis, de dermoepidermale junctie en de dermis (7). Intrinsieke veroudering gaat soms gepaard met het ontstaan van benigne neoplasma’s zoals verruca seborrhoica en angioma senile (9).

     

 

 

 

3  

Figuur 1: Intrinsieke huidveroudering (10).

  Bij visuele inspectie van fotoaging wordt vastgesteld dat de huid vaak een lederen uitzicht heeft, mede gekenmerkt door een droog, vaal en rood voorkomen. Onregelmatige lichte en donkere gepigmenteerde vlekken zijn zichtbaar en de huid vertoont diepe rimpels (Figuur 2). Zoals bij intrinsieke huidveroudering wordt de huid losser, dit is onder andere het gevolg van een verlies aan collageen type 1 bij huidveroudering (10). Typisch voor fotoaging is het ontstaan van telangiëctasieën (verwijde bloedvaatjes), premaligne laesies, elastosis (accumulatie van elastine), actinische purpura en achteruitgang van de wondheling (9, 11, 12).

Figuur 2: Extrinsieke huidveroudering (13).

  De wijzigingen ter hoogte van de dermis zijn de hoofdverantwoordelijken voor de klinische veranderingen ten gevolge van fotoaging. Daarnaast zijn er ook een aantal veranderingen ter hoogte van de epidermis, pigmentaire veranderingen zijn hiervan een voorbeeld (12). Op deze histologische veranderingen wordt dieper ingegaan verder in deze literatuurstudie. In Tabel 1 wordt een vergelijking gemaakt tussen de klinische tekenen van intrinsieke huidveroudering en fotoaging.

     

 

 

 

4  

Intrinsieke huidveroudering

Fotoaging

Lossere huid

Lossere huid

Dun

Dik

Egaal

Vaal

Droog

Droog

Onaangetast

Rood

Fijne rimpels

Diepere rimpels

Benigne neoplasma’s

Lederen uitzicht Onregelmatige pigmentvlekken Premaligne letsels Telangiëctasieën Elastosis Actinische purpura Achteruitgang van de wondheling

Tabel 1: Intrinsieke huidveroudering vs. fotoaging.

  1.3. Fotobiologie Om de moleculaire mechanismen verantwoordelijk voor fotoaging in de humane huid goed te begrijpen is kennis van het elektromagnetisch spectrum, meer bepaald van het uv-spectrum cruciaal. In tegenstelling tot de effecten van het zichtbare licht en het infraroodlicht, waar in de wetenschappelijke literatuur nog niet veel resultaten over te vinden zijn (14), is het effect van het uvspectrum op de humane huid grondig bestudeerd. In deze literatuurstudie wordt enkel rekening gehouden met het effect van het uv-licht op fotoaging. Het uv-spectrum wordt onderverdeeld in drie belangrijke componenten: uv A (320-400 nm), uv B (290-320 nm) en uv C (270-290 nm) (15). Enkel uv A en uv B bereiken het aardoppervlak (15). Uv C wordt gefilterd door de ozonlaag en de atmosfeer (15). Hoewel de ratio van uv A/uv B 20/1 is (16), hebben beide stralen acute en chronische effecten op de humane huid. Uv B-stralen zijn het talrijkst tijdens de zomermaanden (15). Het biologisch effect van de uv-stralen op de humane huid is het gevolg van de aanwezigheid van absorberende chromoforen in de huid (15). Afhankelijk van de golflengte van de uv-stralen wordt de interactie met verschillende huidcellen op verschillende dieptes bepaald (15). Uv A-stralen hebben invloed op epidermale keratinocyten en de dieper gelegen dermale fibroblasten (15). Uv B-stralen penetreren minder diep, ze worden hoofdzakelijk geabsorbeerd in de epidermis en hebben daar hun invloed op cellen (voorbeeld keratinocyten) (15). De energie die geabsorbeerd wordt, leidt tot verschillende chemische reacties (15). Deze zijn de oorzaak van de histologische en klinische veranderingen van fotoaging (15). Absorptie van uv A door de chromoforen gebeurt hoofdzakelijk indirect via een energietransfer naar zuurstof dat als gevolg hiervan reactieve zuurstofverbindingen (ROS) genereert (15). De ROS veroorzaken onder andere transcriptiefactor activatie, lipide      

 

 

 

5  

peroxidatie en DNA-strengbreuken (15). De absorptie van uv B door de chromoforen heeft een meer direct effect: cross-linking van aangrenzende DNA pyrimidines en andere soorten van DNAgerelateerde schade (17). De vorming van vrije radicalen is verantwoordelijk voor ongeveer 50 % van de schade aangericht door uv-stralen, de andere mechanismen (zoals de directe cellulaire schade) zijn verantwoordelijk voor de rest (18).

Figuur 3: Radiatie van de zon, het spectrum van de uv-golflengten en hun effecten op de huid (19). Uv B penetreert tot in de epidermis. Daar heeft het invloed op epidermale cellen zoals de keratinocyten. Uv A penetreert dieper en heeft zowel een effect op de epidermale cellen als op de dermale fibroblasten.

 

2.

Bestaande behandelingen

Op dit moment bestaan er al verschillende behandelingen die de effecten van fotoaging kunnen tegengaan. Deze behandelingen worden hier opgedeeld in fysische, farmacologische en vernieuwende behandelingen. Naast deze verschillende behandelingen wordt hier ook preventie besproken. 2.1. Preventie In eerste instantie is preventie nog altijd de belangrijkste beschermende maatregel tegen fotoaging. Onder preventie verstaan we het gebruik van zonnecrèmes, zonbeschermende kledij en het vermijden van de zon. Preventie zorgt op iedere leeftijd voor een daling van het risico op actinische keratose en spinocellulair carcinoom (20-23). Tijdens de kinderjaren zorgt preventie vooral voor het dalen van het risico op basocellulair carcinoom (24).

     

 

 

 

6  

2.2. Fysische behandelingen Onder fysische behandelingen worden behandelingen verstaan die niet met behulp van crèmes werken, maar

eerder

met

behulp

van

een

kleine

ingreep.

Voorbeelden

hiervan

zijn:

facelift,

laserbehandelingen, dermabrasie, botulinum toxine, collageen injectie en chemische peeling. Ondanks het feit dat het merendeel van deze behandelingen zorgen voor een klinische verbetering, zijn ze niet zonder risico. Het valt buiten het doel van deze literatuurstudie de verschillende behandelingen verder individueel toe te lichten. 2.3. Farmacologische behandelingen Farmacologische behandelingen oefenen via geneesmiddelen hun effect uit op fotoaging. Omdat de behandeling op basis van RNAi eerder hiertussen zijn plaats kent, worden deze behandelingen wat uitgebreider besproken. De samenvatting van deze klasse behandelingen is terug te vinden in Tabel 2. 2.3.1.

Topische retinoïden

Topische retinoïden zijn op dit moment de beste farmacologische behandeling tegen fotoaging (25). In gerandomiseerde klinische studies had de behandeling met topische retinoïden een significante verbetering op de tekenen van fotoaging ten opzichte van een placebo (25). Retinoïden zijn natuurlijke en synthetische derivaten van all-trans-retinol, beter gekend als vitamine A (25). Het effect van retinoïden wordt verkregen door binding en activatie van de retinoïnezuurreceptoren (RAR). De RAR bevinden zich op de keratinocyten, fibroblasten en melanocyten (26, 27). Hoewel er nog weinig geweten is over het precieze mechanisme van de retinoïden, wordt vermoed dat de RAR en retinoïd X receptoren (RXR) de productie van procollageen stimuleren en de inhibitie van matrix metalloproteïnases (MMPs) verhogen (28). Topische retinoïden reduceren de tekenen van fotoaging. Ze zorgen onder andere voor een afname van rimpels, dyspigmentatie en tactiele ruwheid. Ze worden ook gebruikt in de behandeling van lentigines (29), acne (30) en psoriasis (31). Ook het collageen type 1 stijgt terug (32). Er zijn een aantal soorten topische retinoïden: tretinoïne, isotretinoïne en tazaroteen. Een nadeel van topische retinoïden is dat ze lokale irritatie en erytheem kunnen veroorzaken. Van orale retinoïden is bekend dat ze teratogeen zijn, maar ook bij lokaal gebruik is het risico op teratogeniciteit niet uit te sluiten (33). Daarom wordt de behandeling van topische retinoïden niet toegepast bij zwangere vrouwen (33). Naast de behandeling met topische retinoïden wordt onderzoek verricht naar het effect van orale retinoïden op de tekenen van fotoaging. Uit één studie blijkt dat orale retinoïden enkel nog maar een effect hebben op eventuele chemopreventie, maar de histologische bevindingen waren niet significant. Enkel op de epidermale expressie van p53 werd een significante verandering gevonden bij behandeling met orale isotretinoïne in tegenstelling tot de placebo’s (34).      

 

 

 

7  

2.3.2.

α-Hydroxyzuren

De alfa-hydroxyzuren (AHA), ook wel fruitzuren genoemd, zijn bestanddelen die unieke en specifieke effecten veroorzaken op de structuur van de huid. Het zijn hoofdzakelijk extracten van natuurlijke bestanddelen. Behandeling met deze zuren wordt ook wel een chemische peeling genoemd. Het effect van AHA’s op de huid hangt voornamelijk af van hun pH en concentratie. AHA’s zorgen voor een verandering op verschillende niveaus. Door hun lage pH zorgen ze voor een reductie van de pH, wanneer ze worden aangebracht op de huid. AHA’s worden gebruikt bij verschillende dermatologische ziekten, bijvoorbeeld bij de behandeling van psoriasis (35). Eén van hun functies is dan ook de stimulatie van desquamatie. AHA’s interfereren met ionbindingen (25). AHA’s zorgen voor een afname van de tactiele ruwheid en de dyspigmentatie. Dit werd aangetoond in twee gerandomiseerde humane studies (36, 37). In één van deze studies werd daarnaast ook aangetoond dat er een verbetering is van de vale kleur van het gezicht ten gevolge van fotoaging (36). AHA’s hebben geen invloed op rimpels, ook voor de bestrijding van actinische keratose zijn AHA’s niet nuttig (36, 37). De bijwerkingen van AHA’s zijn lokale huidirritatie en erytheem, die beide kort na de behandeling kunnen optreden. Soort behandeling

Effect

Topische retinoïden

Bijwerkingen en nadelen

-Afname van de rimpels

-Lokale irritatie

-Afname van de dyspigmentatie

-Erytheem

-Afname van de tactiele ruwheid -Afname van de lentigines -Stijgen van collageen type 1

AHA

-Afname van de dyspigmentatie

-Lokale irritatie

-Afname van de tactiele ruwheid

-Erytheem

-Afname van de vale kleur van het gezicht Tabel 2: Farmacologische behandelingen.

  Een aantal topische producten die niet op voorschrift zijn, zouden een beperkte activiteit tegen huidveroudering hebben. Deze producten worden ‘cosmeceuticals’ genoemd aangezien ze niet gereglementeerd zijn door de Food and Drug Administration (FDA) in de VS of de European Medicines Agency (EMEA) in Europa. Wegens beperkte beschikbare data is het moeilijk een goede beoordeling te maken van hun werkzaamheid. 2.4. Vernieuwende behandelingen We categoriseren behandelingen als ‘vernieuwend’ wanneer er nog niet genoeg evidentie bestaat omtrent de behandeling. In Tabel 3 worden de vernieuwende behandelingen kort samengevat.      

 

 

 

8  

2.4.1.

Antioxidanten

Een belangrijke rol in het verouderingsproces is weggelegd voor ROS. Dit zijn chemische molecules die reactief zuurstof bevatten (=oxidanten). Vrije radicalen in de vorm van bijvoorbeeld het superoxide anion, hydroxyl radicalen en waterstofperoxide kunnen schade aanrichten aan eiwitten, DNA en lipiden. Hierdoor worden eiwitten minder functioneel, kunnen er mutaties optreden in het DNA en kan er schade ontstaan aan membranen. Uv-radiatie induceert de vorming van ROS in de huid. Antioxidanten voorkomen ongewenste oxidatie en inhiberen bijgevolg de werking van de oxidanten. Hierdoor zullen schadelijke effecten uitblijven. Er zijn een groot aantal antioxidanten die gebruikt kunnen worden voor de preventie of behandeling van fotoaging zoals vitamine C (=ascorbinezuur), vitamine E en β-caroteen. Onvoldoende studies slagen er tot nu toe in het effect van de behandeling of preventie van fotoaging met antioxidanten aan te tonen. 2.4.2.

T4 endonuclease V (T4N5)

T4N5 is een DNA-herstelenzyme, afkomstig van een bacteriofaag. T4N5 kan DNA-schade geïnduceerd door uv-radiatie herstellen, door reparatie van de cyclobutaan pyrimidine dimeren (CPD’s) die ontstaan na inwerking van uv B op de cel. Een studie toonde aan dat het aanbrengen van T4N5 liposomen na uv-radiatie zorgt voor een gedeeltelijke protectie van de huid, ook al is de zonnebrand reeds begonnen (38). Bij patiënten met xeroderma pigmentosa heeft de topische behandeling met T4N5 op de huid een protectief effect tegen het ontstaan van actinische keratose en basocellulair carcinoom (39). T4N5 kan een toepassing vinden in zowel de preventie als de behandeling van fotoaging. 2.4.3. Thymine dinucleotide (pTT) pTT wordt gevormd bij DNA-schade als gevolg van uv inwerking. Deze thymidine dinucleotiden zorgen ervoor dat er een celcyclus arrest is in de S-fase, de fase waarin het DNA wordt gekopieerd en gedupliceerd, wat leidt tot een protectief effect (40). Bij haarloze muizen zorgt de topische applicatie van pTT voor een daling van het aantal mutaties geïnduceerd door uv-radiatie (41). Daarmee gaat een daling gepaard van het aantal carcinoma geïnduceerd door uv-radiatie in deze muizen (41). Ten slotte zorgt deze behandeling met pTT voor een toename van de verwijdering van DNA fotoproduct (41). pTT zou gebruikt kunnen worden voor het voorkomen van DNA-schade ten gevolge van uv-radiatie. Soort behandeling Antioxidanten T4N5 pTT

Werkingsmechanisme Gaan effect van oxidanten tegen T4N5 herstelt CPD pTT veroorzaakt cyclus arrest in de S fase van de celcyclus Tabel 3: Vernieuwende behandelingen.

       

 

 

 

9  

3.

Het RNAi mechanisme

Vele bestaande therapieën zijn ingrijpend en veroorzaken heel wat bijwerkingen (zie hierboven), daarnaast zijn de meeste ofwel weinig efficiënt ofwel weinig specifiek. Een alternatieve therapie op basis van het RNAi mechanisme biedt een mogelijke oplossing. Door middel van siRNA of beïnvloeding van miRNA zouden verschillende mediatoren betrokken in het fotoaging proces gemanipuleerd kunnen worden. Hieronder wordt dit RNAi mechanisme verduidelijkt. 3.1. Ontdekking RNAi verwijst naar een cellulair proces waar gen silencing plaatsvindt door middel van sequentiespecifieke inhibitie met dubbelstrengig RNA (dsRNA) (42). Niet enkel RNA, maar ook verschillende andere cellulaire proteïnes zijn bij dit proces betrokken. Dit zeer efficiënt proces van posttranscriptionele gen silencing (PTGS) is sterk bewaard gebleven in eukaryoten (42). Het RNAi mechanisme biedt vermoedelijk een bescherming tegen virussen en genetische instabiliteit afkomstig van mobiele genetische elementen, bijvoorbeeld transposons (42). Het mechanisme werd voor het eerst waargenomen bij planten (43). De correcte beschrijving ervan kwam pas op het einde van de jaren ’90, gebruik makend van de nematode C.elegans (44). Hiervoor kregen Andrew Fire en Craig Mello in 2006 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde (45, 46). Uitgaande van het aantal publicaties behoort RNAi, samen met proteomics tot één van de meest dynamische velden in de biotechnologie (47). In 2004, 6 jaar na de ontdekking van het RNAi mechanisme, begonnen de eerste siRNA

gebaseerde

therapeutica

in

fase

I

klinische

trials

voor

ouderdom

gerelateerde

maculadegeneratie (48). 3.2. Mechanisme RNAi is een potent en zeer specifiek gen-silencing mechanisme. Inbrengen van exogeen dsRNA onder vorm van siRNA in de cel of endogeen geproduceerde molecules (miRNAs) kunnen het mechanisme triggeren. 3.2.1. Kernmechanisme Het kernmechanisme wordt geïllustreerd aan de hand van het gebruik van een siRNA. In een eerste stap knipt het endonuclease Dicer het lange dsRNA in kleinere siRNAs, deze zijn ongeveer 21 nucleotiden lang. Daarvan vormen 19 nucleotiden een helix, 2 nucleotiden zijn aan elk 3’ einde onpaar (42). De kernfunctie van het RNAi mechanisme bevindt zich in het RNA-induced silencing complex (RISC), een ribonucleoproteïne complex. Wanneer het siRNA terechtkomt in het cytoplasma, wordt het geïncorporeerd in dit complex. Het RISC complex bevat onder andere het Argonaut 2 (Ago2)      

 

 

 

10  

endonuclease. Na binding op het RISC zal een ATP-afhankelijk helicase het siRNA-duplex ontwinden. Als de RNA duplex geladen op het RISC perfect complementair is, zal Ago2 de sense (passenger) streng knippen waardoor een actieve RISC wordt gevormd, die de antisense (guide) streng bevat. De siRNA guide streng bindt vervolgens op de complementaire regio van het mRNA. Daarna knipt Ago2 het mRNA tussen base 10 en 11 vanaf het 5’ uiteinde van de antisense streng (49, 50). Hierdoor ontstaan onbeschermde uiteinden, waardoor er geen 5’cap structuur of polyA staart meer aanwezig is. Deze onbeschermde uiteinden leiden tot afbraak van de fragmenten door intracellulaire ribonucleasen met als gevolg een stop in de synthetisatie van het gecodeerde proteïne (42). Het geactiveerde RISC kan opnieuw worden gebruikt in de RNAi cyclus éénmaal het mRNA is gekliefd. Het RISC kan dus meerdere RNA transcripten binden en vernietigen (51). In Figuur 4 wordt het algemeen RNAi mechanisme geïllustreerd.

Figuur 4: Het RNAi mechanisme (52). 1)siRNA: lang dsRNA wordt gekliefd door Dicer tot siRNA of synthetisch siRNA wordt in het cytoplasma van de cel ingebracht. Het siRNA wordt geïncorporeerd in het RISC complex (gele bol met Ago2 in), die onder andere het Ago2 bevat. Hierdoor wordt een actief RISC gevormd die de antisense bevat. Het geactiveerde RISC zoekt daarna zijn target mRNA en gebruikt de antisense streng om de klieving van het target mRNA te begeleiden. Het RISC kan daarna gerecycleerd worden en opnieuw verschillende malen klieven. 2)miRNA: polymerase II schrijft lange primaire transcripten over (primair miRNA (pri-miRNA)). Het enzym Drosha knipt de haarspeldstructuren (precursor

     

 

 

 

11  

miRNA (pre-miRNA)) uit het pri-miRNA. Het pre-miRNA wordt uit de nucleus geëxporteerd door exportine-5. In het cytoplasma klieft Dicer het pre-miRNA tot matuur miRNA. Wanneer miRNAs worden ingebracht start de pathway vanaf hier: het miRNA (natuurlijk of ingebracht) bindt op het RISC. Afhankelijk van de graad van overeenkomst tussen het miRNA en mRNA vindt er ofwel mRNA degradatie of onderdrukking van de translatie plaats (42). 3)short hairpin RNA (shRNA): shRNA wordt via een vector in de nucleus gebracht, daar volgt het dezelfde pathway als het pre-miRNA.

  3.2.2. Plaats van siRNA en short hairpin (shRNA) in RNAi mechanisme 3.2.2.1.

siRNA

In tegenstelling tot species zoals C.elegans en D.melangoster, zet het gebruik van lang dsRNA bij zoogdieren een aangeboren antiviraal immuunrespons in gang door inductie van interferongelinkte pathways (53). De essentiële componenten van het RNAi mechanisme zijn wel bewaard gebleven (54, 55). In zoogdiercellen is het mogelijk met behulp van exogeen ingebrachte korte dsRNA (21-23 nucleotiden) triggers, siRNAs genaamd, efficiënte sequentiespecifieke gen silencing te induceren (56, 57). Korte RNA triggers induceren het RNAi mechanisme zonder een proteïne kinase R (PKR) respons te veroorzaken of antivirale pathways in gang te zetten, omdat ze Dicer afbraakproducten nabootsen (53, 57). Deze siRNA’s zijn synthetische RNA molecules van 21-23 baseparen lang. De activiteit van het siRNA is transiënt, dit is te wijten aan degradatie van het siRNA door RNasen (58). Naast degradatie speelt de snelheid van celdeling een belangrijke rol, door de deling daalt de concentratie van siRNA in de cellen (50). Hoe sneller de cellen delen, hoe vlugger de concentratie daalt en hoe vlugger de silencing wordt onderbroken. 3.2.2.2.

shRNA

shRNA biedt de oplossing voor de transiënte werking van siRNA. Via het shRNA kan siRNA in plaats van chemisch gesynthetiseerd, intracelullair worden geproduceerd uit shRNA precursoren, door voortdurend vrijgesteld te worden uit polymerase-gedreven expressie cassettes (58). Dit systeem is vectorgebaseerd (plasmide of virale vectoren). De plasmide vectoren zijn extrachromosomaal stabiel zolang de cel niet deelt. Wanneer de cel deelt, verdwijnt het effect van het shRNA. Bij het gebruik van virale vectoren, kan een stabiele integratie in het genoom worden bekomen. Daardoor is het aspect veiligheid bij het gebruik van virale vectoren zeer belangrijk. Omwille hiervan spitst deze literatuurstudie zich vooral op het werken met siRNA om het eventuele gevaar van mutagenese te omzeilen. In Figuur 4 wordt de werking van shRNA geïllustreerd. RNAi therapeutica ontwikkeld om de RNAi pathway te gebruiken omvatten dus typisch de transfectie van synthetisch siRNA in het cytoplasma van de cel.

     

 

 

 

12  

3.2.3. Plaats van miRNA in RNAi mechanisme Endogene, kleine (19-25 nucleotiden), niet gecodeerde RNAs gekend als miRNAs klieven in tegenstelling tot siRNAs het mRNA van het target gen niet. Ze zorgen daarentegen voor de suppressie van mRNA translatie (59, 60). Deze suppressie kan onder meer het gevolg zijn van een verlaging van de ratio van de translatie (na initiatie) (49). Een andere mogelijkheid is een niet-productieve translatie waarbij de ratio van translatie gelijk blijft (49). miRNAs hebben ook het potentieel om mRNA degradatie te versterken (61). Een derde, minder goed begrepen pathway van RNAi betreft heterochromatine silencing door kleine RNAs (62). Hierop wordt echter niet verder ingegaan. miRNAs zijn enkelstrengige RNA’s van 19-25 baseparen lang, gemaakt uit endogene haarspeldvormige transcripten en induceren posttranscriptionele genonderdrukking (63). De aanmaak van miRNAs gebeurt in de celkern. RNA polymerase II schrijft lange primaire transcripten over: primair miRNA (pri-miRNA). Deze transcripten worden door het enzym Drosha omgezet tot hairpinintermediairen, precursor miRNA (pre-miRNA) genaamd. Dit wordt uit de nucleus geëxporteerd door exportine-5 (63). In het cytoplasma wordt het pre-miRNA door het enzyme Dicer omgezet tot een mature miRNA duplex, 22 nucleotiden lang, die kan binden op RISC (63). Bij miRNA is een perfecte complementariteit met target mRNA niet nodig (64). Hieruit kan er worden geconcludeerd dat interactie met meerdere targets mogelijk is. Voor therapeutische doeleinden kan gebruik gemaakt worden van het pre-miRNA of van het antimiRNA. Het effect van pre-miRNA werd hierboven reeds beschreven, het synthetische anti-miRNA werkt antagonerend en kan specifieke miRNAs inhiberen (65). In Figuur 4 wordt de werking van miRNAs geïllustreerd.  

     

 

 

 

13  

Methodologie De inhoud van deze masterproef bestaat uit een literatuurstudie over huidveroudering, meer specifiek fotoaging. Fotoaging, reeds bestaande behandelingen en het RNAi mechanisme werden reeds in de inleiding toegelicht. Het effect van uv op de celhomeostase met betrekking tot histologische en moleculaire wijzigingen, potentiële targets voor siRNA, miRNA in aging en het concept van een “gene cream”, worden in deze masterproef verder onderzocht. Over het eigenlijk onderwerp van deze masterproef, “RNA-interferentie in foto-aging: mogelijke toepassingen”, werd nog niet veel gepubliceerd, dit is dan ook een persoonlijke benadering en interesse. Deze techniek zou een doorbraak kunnen zijn in de behandeling van huidveroudering. De literatuurstudie gebeurde voornamelijk via Pubmed, dit via een combinatie van verschillende termen: ‘photoaging’, ‘skin’, ‘siRNA’, ‘anti-aging’, ‘treatment’, ‘collagen’, ‘miRNA’. Via de bekomen artikels werden nieuwe termen gevonden waarvan gebruik werd gemaakt tijdens de verdere uitdieping van de literatuur. Veel artikels werden gevonden via de link ‘Related citations’. Daarnaast werden ook een aantal reviews bestudeerd, waaruit veel referenties vloeiden.

     

 

 

 

14  

Resultaten 1.

Fotoaging: histologische en moleculaire wijzigingen

De dagdagelijkse blootstelling aan direct of indirect zonlicht is één van de voornaamste oorzaken van extrinsieke huidveroudering (3). Waar bij intrinsieke veroudering de histologische veranderingen zich voornamelijk manifesteren als een graduele atrofie van de epidermis (naast atrofie van de extracellulaire matrix (ECM) en daling in aantal fibroblasten), wordt de aan zon blootgestelde huid gekarakteriseerd door een verdikking van de epidermis en een accumulatie van abnormaal elastisch weefsel in de dermis, elastosis solaris genaamd (66-68). Het lederen uitzicht van de huid is toe te schrijven aan een dikkere epidermis, meer bepaald een verdikking van het stratum corneum (SC) ten gevolge van het ‘chronische letsel’ dat optreedt bij herhaaldelijke blootstelling aan de zon (69). Dit chronische letsel ontstaat door een aanhoudende poging van het lichaam om de huid te herstellen (11). Hierdoor ontstaat een foutieve degeneratie van de corneocytdesmosomen, hetgeen resulteert in verdikking van het SC (11). Aan zon blootgestelde huid wordt eveneens gekenmerkt door een verhoogde expressie van involucrine, wat impliceert dat het differentiatieproces van de keratinocyten is verstoord (70). In de basale cellen van de epidermis, is ten slotte de expressie van β-1 integrine op het celoppervlak sterk gereduceerd, samen met een parallelle downregulatie van het β-1 integrine mRNA (70). De β-1 integrines zijn verantwoordelijk voor de hechting van de basale keratinocyten aan elkaar en aan de basale membraan (11). Integrines worden gebruikt als merkers van keratinocyt proliferatie en hun adhesie aan de ECM. Uit deze waarnemingen kan er gesuggereerd worden dat de proliferatie en adhesie van verouderde keratinocyten als gevolg van fotoaging significant verslechterd is (11). In Figuur 5 en Tabel 4 worden de wijzigingen ter hoogte van de epidermis samengevat.

Figuur 5: Wijzigingen ter hoogte van de epidermis (71).

 

     

 

 

 

15  

Wijzigingen ter hoogte van de epidermis Stratum corneum

-Verdikking -Involucrine expressie ↑ → verstoord proliferatieproces

Basale cellen

-Expressie van β-1 integrine op het cel-oppervlak ↓ -Parallelle downregulatie van het β-1 integrine mRNA Wijzigingen ter hoogte van de dermo-epidermale junctie

Keratinocyt

-Collageen type VII expressie ↓ Tabel 4: Wijzigingen ter hoogte van de epidermis en dermo-epidermale junctie.

  Naast de invloed van fotoaging op de epidermis, wordt ook de dermo-epidermale junctie erdoor beïnvloed. Ter hoogte van deze junctie is de expressie van collageen type VII in de keratinocyten gedaald (11). Het collageen type VII is een element van de verankeringsfilamenten. Deze filamenten zijn verantwoordelijk voor een stevige verbinding tussen de basale keratinocyten en de dermis. De reductie van collageen type VII is deels verantwoordelijk voor het ontstaan van rimpels. De rimpels zijn onder andere het gevolg van een minder stevige verbinding tussen de basale keratinocyten en de dermis (72). In Figuur 6 en Tabel 4 worden de wijzigingen ter hoogte van de dermo-epidermale junctie samengevat.

type VII collageen

Figuur 6: Wijzigingen ter hoogte van de dermo-epidermale junctie (73).

  In de dermis is er in het hoger gelegen gedeelte een significante depletie van fibrilline en fibrillinepositieve structuren waarneembaar (74).          

 

16  

In het middelste (intermediair) en diepste gelegen deel van de dermis is er een accumulatie van abnormaal elastisch weefsel, elastosis solaris genoemd (66). Dit is het gevolg van een daling van de fibrilline-1 expressie (75) en een verhoogde transcriptionele activiteit van het elastine gen (11, 75). De gevormde elastische vezels zijn echter dystrofisch en afgeknot en zijn bijgevolg niet functioneel in het voorzien van elasticiteit in de huid. Tevens bevatten deze abnormale elastine vezels een verhoogde hoeveelheid versican (een chondroïtine-sulfaat proteoglycan) en desmosine (76, 77). Desmosine is verantwoordelijk voor de rubberen eigenschappen van elastine. Op deze gewijzigde elastinevezels, kunnen exogene substanties neervallen zoals lysozymes, deze correleren met een basofiele degeneratie van de elastinevezels (78). Dit abnormaal elastische weefsel met een abnormale expressie van versican en een stijging van desmosine vervangt de normale dermis, die voor de gevolgen van fotoaging voornamelijk uit collageen bestond (11). Het collageen is in zones met elastosis solaris schaars aanwezig (75). MMPs worden geïnduceerd door uv-radiatie (79) en zijn verantwoordelijk voor de afbraak van bindweefselcomponenten, zoals collageen type I (80). In tegenstelling tot collageen type I, stijgt collageen type III in de dermis bij fotoaging (81). Ter hoogte van zones met elastosis solaris werd er naast deze wijzigingen een stijging van de glycosaminoglycanen (lange ketens van disachariden, component van bindweefsel) vastgesteld, dit kon al afgeleid worden uit de aanwezigheid van versican (11). De functie van glycosaminoglycanen is hydratatie, maar hier functioneren ze niet, waarschijnlijk door hun associatie met abnormaal elastisch weefsel (11). In Figuur 7 en Tabel 5 worden de wijzigingen ter hoogte van de dermis samengevat.

Figuur 7: Wijzigingen ter hoogte van de dermis (82).

           

 

 

 

17  

Wijzigingen ter hoogte van de dermis Bovenste deel

-Depletie fibrilline en fibrilline-postieve structuren

Middelste en diepste deel

-Fibrilline-1 expressie ↓ → elastosis solaris -Stimulatie elastine promotoractiviteit → elastosis solaris -Versican ↑ -Desmosine ↑ -Collageen type I ↓ -Collageen type III ↑ -MMPs ↑ -Glycosaminoglycanen ↑ Tabel 5: Wijzingingen ter hoogte van de dermis.

  Ten slotte ontstaan onder invloed van uv-radiatie wijzigingen ter hoogte van de bloedvaten. Er is een verdikking van de vasculaire wanden van de postcapillaire venules, arteriële en veneuze capillairen. Dit door de additie van een laag van “basaal membraan-achtig” materiaal (11).

2.

Potentiële targets voor silencing door middel van siRNA

Hierboven werden reeds een aantal moleculaire wijzigingen post-uv vermeld. Hieruit voortvloeiend werd een literatuurstudie verricht naar de pathways van deze moleculaire wijzigingen en andere pathways waar uv invloed op heeft. Er werd in deze pathways gezocht naar mogelijke moleculaire targets, onder de voorwaarde dat deze stegen post-uv. Het is de bedoeling dat door middel van het RNAi mechanisme deze targets geïnhibeerd worden zodat fotoaging tegengegaan wordt. De invloed van uv loopt via diverse pathways. Figuur 8 toont een samenvattend beeld van de invloed van uv op de fibroblasten en keratinocyten, het is een verduidelijking van één van de meest bestudeerde mechanismen. Uv-radiatie zorgt voor de inductie van verschillende receptoren op de fibroblasten en keratinocyten. Epidermale groeifactor- (EGF), interleukine (IL) 1- en tumor necrosis factor α receptoren (TNF-α) zijn groeifactor- en cytokinereceptoren die geactiveerd worden binnen 15 minuten na blootstelling aan uv (2 maal de minimale erytheem dosis) (17). Deze receptoren worden geactiveerd door stimulatie van tyrosine kinases (83). Door middel van signaal transductie cascades worden ter hoogte van de fibroblasten en keratinocyten activator proteïnes (AP-1) geactiveerd (84).

     

 

 

 

18  

Ter hoogte van de fibroblast werkt AP-1 op twee manieren in op de afbraak van de dermale matrix. Ten eerste inhibeert AP-1 de procollageen promotoren. Ten tweede stimuleert AP-1 de MMP promotoren (84). Ter hoogte van de keratinocyt stimuleert AP-1 enkel de MMP promotoren (84). De gevormde MMPs ter hoogte van beide cellen zorgen voor afbraak van de dermale matrix wat op zijn beurt leidt tot een imperfect herstel en dus fotoaging (84).

Figuur 8: Schema uv geïnduceerde signaaltransductie pathway (84). Uv activeert groeifactoren en cytokine receptoren. Deze receptoren starten een signaal transductie cascade. Dit zorgt voor de activatie van AP-1. Ter hoogte van de fibroblasten stimuleert AP-1 MMP promotoren en inhibeert het procollageen promotoren. Ter hoogte van de keratinocyten stimuleert AP1 enkel MMP promotoren. Het effect van beide cellen samen zorgt voor de aanmaak van MMPs die de dermale matrix afbreken en een imperfect herstel tot gevolg hebben. Dit zorgt voor fotoaging.

  2.1. Collageen homeostase Onder invloed van uv daalt collageen type I en stijgt collageen type III. De daling van het collageen type I gebeurt enerzijds via de afbraak van het collageen door MMPs en anderzijds via de inhibitie van de aanmaak van collageen door inhibitie van de productie van type-I procollageen (85). 2.1.1. EGF De pathway van EGF en EGF-achtige liganden is het meest bestudeerd onder de biochemische pathways, die worden getriggerd na uv-radiatie (7). Wanneer EGF of een EGF-achtige ligand bindt op de EGF-receptor (ook wel ErbB1 genoemd) ontstaat er een homo- of heterodimerisatie met ErbB2 of ErbB3 waardoor er een transfosforylatie ontstaat van specifieke tyrosine residu’s (7). Deze transfosforylatie wordt verkregen door de werking van het intrinsiek tyrosine kinase (het intracellulair domein van de EGF-receptor) (7). Onder invloed van uv-radiatie vindt activatie van de receptor al plaats binnen de 10 minuten (7). De defosforylatie van deze receptor gebeurt onder invloed van de proteïne thyrosine fosfatases (PTPs) (7). Er wordt gesuggereerd dat uv-radiatie de PTPs inhibeert,         19      

aangezien bij uv-radiatie de fosforylatie van de tyrosinases voor een langere periode aanwezig blijft (7). Er wordt aangenomen dat de inactivatie van de PTPs het gevolg is van de oxidatie van Nacetylcysteïne, die aanwezig is in de katalytisch actieve delen van de PTPs (7). Deze oxidatie is het gevolg van de blootstelling aan de ROS, die gegenereerd werden door de uv-radiatie (4). De inactivatie van de PTPs heeft niet alleen tot gevolg dat de receptor gefosforyleert blijft, ook andere celmembraan- en cytokinereceptoren kunnen geactiveerd worden (7). Dit leidt tot de activatie van small GTP-bindende eiwitfamilies die directe of indirecte (via andere GTP-binding proteïnes of ROS) regulatoren zijn van de mitogeen-geactiveerde proteïne kinases (MAPK) (7). Niet alleen ROS, maar ook ceramide stijgt na uv-radiatie. Het ceramide lijkt afhankelijk van de gestegen ROS productie aangezien deze twee parallel stijgen onder invloed van uv (86). De stijging van uv-geïnduceerde ceramide wordt daarentegen tegengegaan door vitamine E (86). Ceramide wordt verkregen uit sphingomyeline door sphingomelinases (SMases), het sphingomyeline activeert vlug Raf-1, MEK1 en Erk (87). Het ceramide draagt deels bij tot de activatie van de MAPK (86). De activatie van deze MAPK draagt indirect bij tot de activatie van de transcriptiefactoren van AP-1 (7). AP-1 zorgt voor de regulatie van de transcriptie van verschillende MMP families (zie hierboven) (7). 2.1.2. Transforming Growth Factor β (TGF-β ) TGF-β is een multifunctioneel cytokine. Het inhibeert de groei van epidermale keratinocyten en stimuleert de groei van dermale fibroblasten (88). Dit eiwit speelt een belangrijke rol in de regulatie van procollageen type-I synthese (1). Uv-radiatie inhibeert in de fibroblasten van de huid TGF-β type II receptor promoter transcriptie en proteïne synthese (1). Door de daling van deze receptoren, wordt er een downstream activatie van de Smad 2/3 pathway vermeden. Hierdoor daalt de productie van type I procollageen (1), dit omwille van de rechtstreekse regulatie van TGF-β via de Smad3 binding elementen in de promoter regio (89). Wanneer er geen uv-radiatie aanwezig is, bindt TGF-β op TGF-β type II receptor. Deze binding zorgt voor activatie van de intrinsieke serine/threonine kinase activiteit van de TGF-β type I receptor, deze receptor fosforyleert op zijn beurt de transcriptiefactors Smad 2 en Smad 3. Gefosforyleerd Smad 2 en Smad 3 gaan samen met Smad 4 transloceren naar de nucleus (Figuur 9). Hier functioneren ze als transcriptieregulator van specifieke genen die TGF-β responselementen in hun promotorenregio aanwezig hebben (90). Dit zal tot gevolg hebben dat de expressie van MMP-1 en MMP-3 wordt geïnhibeerd (7). Early growth response factor-1 (Egr-1) kan deze pathway negatief beïnvloeden door zijn omgekeerde werking op de TGF-β type II receptor (91). Egr-1 interageert met de ets-related transcription (ERT) regio van de TGF-β type II receptor proximale promotor en onderdrukt zo de TGF-β type II receptor activiteit (92). Daarnaast werd ook gevonden dat Egr-1 vlug en sterk geïnduceerd wordt onder invloed

     

 

 

 

20  

van uv-radiatie waardoor de mogelijkheid bestaat dat Egr-1 stijgt onder invloed van uv-radiatie en hierdoor de TGF-β type II receptor downreguleert (1).

Figuur 9: De TGF-β /Smad pathway (93). TGF-β bindt op TGF-β type II receptor (1). Vervolgens vormen receptor type II (2) en I één complex (3) waardoor type I receptor gefosforyleerd wordt (4). Door de intrinsieke activatie van de kinase activiteit van de TGF-β type I receptor fosforyleert receptor type I vervolgens R-Smad (5) die daarna samen met Smad 4 een complex vormt (6) en naar de kern transloceert (7). Daar bindt het complex aan een DNA-binding partner (8) en dit complex bindt zich vervolgens aan een specifieke enhancer in de doelgenen (9) waardoor de transcriptie wordt geactiveerd.

  2.1.3.

Insulin/Insulin-like growth factor-1 (IGF-1)

Naast TGF-β speelt de signalisatie van insulin/insulin-like growth factor-1 een rol bij het collageen metabolisme. Wanneer er geen binding is tussen IGF-1 en zijn specifieke receptor op het celoppervlak, blijft de forkhead box gene, group O family (FOXO) zijn werking behouden op het DNA (Figuur 10a). Als er daarentegen een binding plaatsvindt tussen IGF-1 en een specifieke receptor van het celoppervlak, wordt fosfatidylinositol-3 kinase (PI3K) geactiveerd, waarna een activatie plaatsvindt van het proteïne kinase B (PKB). Dit proteïne kinase B fosforyleert op zijn beurt FOXO. Met betrekking tot uv-radiatie, hier het FOXO1a (94). Na de fosforylatie van FOXO begeeft FOXO zich naar het cytoplasma van de cel. Daar wordt het gedegradeerd in de ubiquitine-proteasoom pathway (95, 96) (Figuur 10b). Wanneer er nu uv-radiatie aanwezig is, blijkt dat het FOXO1a significant daalt (97). Daarnaast bewijst een studie dat het significant onderdrukken van FOXO1a met siRNA leidde tot een daling van het collageen type I en een stijging van MMP-1 en 2 (97). Daaruit werd geconcludeerd dat FOXO1a betrokken is in de veranderingen van het collageen type I en de MMPs in humane dermale fibroblasten (97).

     

 

 

 

21  

Figuur 10: IGF-1 pathway (98). A: geen binding aanwezig van IGF-1, FOXO1a kan zijn werking uitoefenen. B: IGF-1 bindt op de receptor. Fosfatidylinositol-3 kinase (PI3K) wordt geactiveerd. PI3K zorgt voor de activatie van het proteïne kinase B ook wel Akt genaamd. Het Akt fosforyleert het FOXO1a wat de binding op het DNA inhibeert. Hierdoor verplaatst FOXO1a zich naar de kern waar het wordt afgebroken in de ubiquitine-proteasoom pathway.

  2.1.4. Cysteïne-rijk proteïne 61 (CYR61/CNN1) CYR61/CNN1 is een deel van de CCN familie. Uv-radiatie doet de binding van c-Jun en c-Fos toenemen op het AP-1 element in de promotor regio van CYR61. Door de toename van de binding op AP-1, stijgt de CYR61 gen expressie. Het CYR61 eiwit induceert op zijn beurt een gedeeltelijke reductie van type I procollageen en een gedeeltelijke opregulatie van MMP-1 (99). Na Uv-radiatie stijgt het CYR61 mRNA significant, maar de stijging is wel transiënt. Na zo’n 24 uur is het mRNA terug op het basale niveau, het CYR61 eiwit blijft daarentegen langer dan 24 uur verhoogd (99). 2.1.5.

Samenvatting van de pathways van de collageen homeostase

In Figuur 11 is een samenvatting te zien van de verschillende moleculaire pathways die beïnvloed worden door uv-radiatie.

     

 

 

 

22  

Figuur 11: Samenvatting pathways (4). Uv-radiatie zorgt voor activatie van de cytokine- en groeifactorreceptor. Dit leidt verder tot de activatie van drie MAPH modules, namelijk Erk, JNK en p38. De activatie van Erk, JNK en p38 is versterkt door ROS. ROS voert zijn werking uit via de inhibitie van PTPs en de activatie van MAPK Kinase Kinases (MKKKs). Wanneer deze pathways geactiveerd worden, fosforyleren de MAPKs de transcriptiefactoren (onder andere Elk-1, c-Jun, ATF-2). De activatie van deze transcriptiefactoren leidt tot een stijging van de expressie van AP-1. AP-1 zorgt op zijn beurt voor de opregulatie van MMPs en de downregulatie van procollageen I productie. Naast deze pathway downreguleert uvradiatie de TGF-β pathway, via reductie van de TβRII expressie en stijging van I-Smad. Deze inhibitie kan versterkt worden door de interferentie die bestaat tussen de Smad en de MAPK pathways: Erk kan de R-Smad accumulatie in de nucleus onderdrukken door middel van fosforylatie van Smad in de linker regio en stimulatie van de Smad co-respressor TG3interacting Factor (TGIF) door stabilisatie van het proteïne. Dit leidt tot een gedaalde activiteit van transcriptiefactor Smad Binding Element (SBE) die leidt tot downregulatie van de procollageen I synthese.

  2.2. ROS ROS zouden een centrale rol spelen in de moleculaire pathways ten gevolge van uv-radiatie. Bij uvradiatie stijgt onder andere het aantal waterstofperoxides (100). Daarnaast zorgt de uv-radiatie voor de daling van antioxidanten (101). De stijging van het aantal ROS zorgt voor veranderingen in de      

 

 

 

23  

structuren van genen en proteïnes die aanleiding geven tot beschadiging van de huid (4). Eén van deze ROS is het superoxide anion die wordt gevormd wanneer de energie afkomstig van endogene uvabsorberende chromoforen wordt getransfereerd naar een moleculair oxygen (102). NADH-/NADPH, tryptofaan riboflavine en trans-urocanisch zuur behoren tot deze uv-absorberende chromoforen (102). Door deze energietransfer wordt het superoxide anion door middel van het superoxide dismutase omgevormd tot H202 (103). Dit H202 zal in de aanwezigheid van ijzer en koper omgevormd worden tot hydroxyl radicalen (103). Deze hydroxyl radicalen zullen op hun beurt verschillende proteïnes zoals onder andere Raf, proteïne tyrosine fosfatases en MEK Kinase 1 (MEKK1) activeren (4). In Figuur 12 wordt de rol van oxidatieve stress bij uv-radiatie en veroudering geïllustreerd.

Figuur 12: Rol van ROS in aging en uv respons (4). Na uv-radiatie stijgt het ROS. Een gestegen ROS zorgt voor accumulatie van DNA mutaties, stimulatie van signaal transductie pathways en proteïne modificatie. De accumulatie van DNA mutatie kan op zijn beurt leiden tot veranderde structuur van de genen. Stimulatie van signaal transductie pathways leidt tot veranderde activiteiten van bepaalde genen en proteïne modificatie leidt tot veranderde structuur en functie van bepaalde proteïnes. Deze drie veranderingen kunnen op hun beurt leiden tot dysregulatie van de intracellulaire en extracelullaire homeostase.

2.3. Oxidoreductase thioredoxine-1 (Trx-1) Trx-1 is een belangrijke redox regulator. Naast zijn anti-oxidatieve en anti-apoptotische eigenschappen, bindt Trx-1 op en reguleert het transcriptiefactoren (104). Een studie evalueerde het effect van Trx na uv-radiatie op MMP-1 en collageen type 1 alfa 1 (COL1A1). Uit deze studie bleek dat Trx de uv A-geïnduceerde expressie van MMP-1 inhibeerde, maar niet de uv B-geïnduceerde expressie (104). Hiertegenover stond de vaststelling dat Trx het effect van uv B op de reductie van collageen type alfa 1 teniet doet (104). Daarnaast werd in de studie vastgesteld dat de protectieve effecten van Trx op het effect van uv A-geïnduceerde opregulatie van MMP-1 afhankelijk was van nucleaire factor-kappa B (NF-κB) (104). Daarvoor werd reeds al aangetoond dat Trx de DNA binding         24      

van de p50 subunit van NF-κB verbetert en dat de blokkade van thioredoxine reductase de Trx NF-κB binding inhibeert en de expressie van een aantal anti-apoptotische genen reduceert (105, 106). Verder wordt gesuggereerd dat een verbeterde binding van Trx op de p50 subunit van NF-κB de subunit compositie van het NF-κB complex zou kunnen veranderen en resulteren in activatie van een ander subset van NF-κB target genen (104). Deze studie toont dus aan dat MMP-1 en collageen typ 1 alfa 1 deels gereguleerd worden door verschillende pathways en dat uv A en uv B verschillende pathways induceren. 2.4. Involucrine/β-1 integrine ratio Reeds hierboven werd de invloed van uv-radiatie op involucrine en β-1 integrine in de cel besproken. Uit de waarnemingen werd gesuggereerd dat proliferatie en adhesie van verouderde keratinocyten als gevolg van fotoaging significant afgenomen is (11). Een studie omtrent deze twee proteïnes had als doel de involucrine/β-1 integrine ratio te valideren om dienst te doen als moleculaire merker van epidermale fotoaging (107). De expressie van β-1 integrine bleek significant gereduceerd in door fotoaging verouderde huid (107). De involucrine/β-1 integrine ratio bleek alleen in de oudere populatie van de studie 2,6 keer groter (107). Daarnaast werd nog een afwijkend resultaat vastgesteld in de β-1 integrine expressie op de basale laag en een significant groter aantal Ki-67-positieve cellen gezien dan in de huid die werd beschermd door de zon (107). Involucrine is een goeie merker voor keratinocyten differentiatie, opregulatie ervan in de door fotoaging verouderde huid is het gevolg van een gewijzigde terminale differentiatie van keratinocyten (108). In tegenstelling tot het aantal β-1 integrines dat daalt in keratinocyten met de leeftijd. Daarnaast hebben keratinocyten lage zelfvernieuwende capaciteiten en veranderde adhesie eigenschappen (109). Een verhoogde involucrine/β-1 integrine ratio door chronische blootstelling aan de zon wordt gezien als een verstoring van de epidermale homeostase en zou bijgevolg een goede moleculaire merker van epidermale fotoaging zijn (108). Aangezien de ratio significant is verhoogd bij de oudere populatie in de studie, maakt het de involucrine/β-1 integrine ratio als biomerker voor fotoaging bruikbaar (107). Daarnaast bleek dat de verhouding keratinocyt stamcellen tot de ‘transit amplifying’ cellen omgekeerd evenredig was in de aan de zon blootgestelde huid in vergelijking tot de huid die werd beschermd tegen de zon (107). De studie suggereert dat het aantal keratinocytstamcellen lager is in door fotoaging aangetaste huid in vergelijking met huid die enkel onder invloed staat van intrinsieke huidveroudering. Deze bevindingen suggereren dat in verouderde huid als gevolg van fotoaging, het proliferatief vermogen van de keratinocyten verminderd is en een alteratie aanwezig is in de 2 proliferatieve cel fracties (107).

     

 

 

 

25  

2.5. Hyaluronidase (HYAL) Hyaluronzuur is overvloedig aanwezig in de huid, vooral in de dermis (110). Daarnaast is het ook in hoge concentraties aanwezig in de epidermis (110). Ter hoogte van de epidermis wordt hyaluronzuur gesynthetiseerd door de keratinocyten (110). Hyaluronzuur heeft een rol in de water homeostase, in de weefsel visco-elasticiteit en draagt bij tot de flexibiliteit en stevigheid van de epidermis (111). Afbraak van hyaluronzuur gebeurt door middel van ROS en/of hyaluronzuur degraderende enzymes: HYALs (112). Er werd reeds gezien dat een chronische lage dosis van uv-radiatie de vorming van rimpels induceert door eerst de epidermis te beïnvloeden, door middel van modificatie van het transepidermale verlies van water en van de waterinhoud van het SC (113). Deze twee modificaties staan in directe relatie met de inhoud aan glycosaminoglycanen van de epidermis (112). Dus een verandering in

de

HYAL

expressie

in

de

epidermis

zou

direct

kunnen

betrokken

zijn

bij

het

huidverouderingsproces door fotoaging (112). Een studie bestudeerde de verandering in expressie van HYAL na uv B-radiatie (112). Hieruit bleek de HYAL1 mRNA expressie opgereguleerd te zijn, in tegenstelling tot de HYAL2 en HYAL3 mRNA expressie die downgereguleerd waren (112). Daarnaast was de hyaluronidase enzym activiteit gestegen in de cellen en in het cultuur medium (112). Immunohistochemie uitgevoerd op gereconstrueerde epidermis bestraald met uv B bevestigde dat de expressie van HYAL1, HYAL2 en HYAL3 op eiwitniveau verschillend gereguleerd werd door uv B (112). Naast de studie van de HYALs werd reeds aangetoond dat de hyaluron synthase (HAS) expressie, voornamelijk HAS-1, gereduceerd was in huid blootgesteld aan uv-radiatie (114). Toch is er nog nood aan verder onderzoek over de regulatie van HAS na uv B-radiatie in humane keratinocyten (112). Deze beide bevindingen suggereren dat het evenwicht van synthese en degradatie van hyaluronzuur in de bestraalde epidermis sterk wijst in de richting van hyaluronzuur degradatie (112). Ten slotte suggereren de gegevens hierboven beschreven een belangrijke rol van hyaluronidase in huidveroudering door uv-straling (112). 2.6. Samenvatting potentiële targets In Tabel 6 wordt er een samenvatting gegeven van potentiële targets voor RNAi. Pathways

Potentiële targets

Collageen homeostase EGF

-EGF/EGF-achtige liganden -EGF-receptor -intrinsiek tyrosine kinase -small GTP-bindende eiwitfamilies -SMases

     

 

 

 

26  

Pathways

Potentiële targets -ceramide -MAPK -Raf-1 -MEK1 -Erk -AP-1 -MMP

TGF-β

-Egr-1

IGF-1

-IGF-1 receptor -PI3K -PKB (Akt) -MMP1 -MMP2

CYR 61/CNN1

-AP-1 -CYR 61 -MMP1

ROS

-Raf

 

 

-Proteïne thyrosine fosfatases -MEKK1

TRX-1

-MMP1

Involucrine/β-1 integrine

-involucrine

Hyaluronidase

-HYAL1 Tabel 6: Potentiële targets voor RNAi.

 

3.

miRNA in aging

In de nematode C. Elegans werden reeds verschillende miRNA geïdentificeerd die geassocieerd zijn met veroudering (115). Zo leidt overexpressie van lin-4 miRNA in C. elegans tot een verlengde levensduur en leidt verlies ervan tot een verkorte levensduur (115). Lin-4 miRNA beïnvloedt lin-14 mRNA en de insuline-pathway (116). Ook bij de mens werden reeds verschillende miRNAs gevonden die geassocieerd zijn met veroudering. Artikels hieromtrent behandelen vooral miRNAs met betrekking tot algemene veroudering bij de mens. Resultaten van miRNAs specifiek gericht op de huid zijn echter schaars. Wel hebben verschillende miRNAs uit de algemene veroudering betrekking op een aantal pathways      

 

 

 

27  

hierboven beschreven: vb. miRNAs in de IGF-pathway en miRNAs in de inflammatoire pathway (waar NF-κB deel van uitmaakt). Meer specifiek met betrekking tot de huid werden miR-137 en miR-668 ontdekt (117). Ectopische overexpressie van deze miRNAs in snel prolifererende normale humane keratinocyten (NHKs) induceren veroudering, deze redenering wordt gestaafd aan de hand van een stijging van de activiteit van β-galactosidase, p16INK4A en p53 (117). Op humane diploïde fibroblasten hebben verschillende miRNAs effect: een stijging van miR-34 doet het c-Myc in deze cellen dalen (118) en doet net zoals een stijging van miRNA-182a die RARγ doet dalen (119), de veroudering versnellen. Een stijging van miR-146a en miR-146b doet IRAK1 dalen, dit zorgt voor een blokkage van de expressie van IL-6 en IL-8 (120). Een stijging van miR-183 zorgt voor een daling van β-1 integrine die op zijn beurt leidt tot een versnelling van de veroudering (121). Een daling van miR-155 en miR-20a leidt ook tot een versnelling van de veroudering (122). Een daling van miR-15b, miR-24, miR-25 en miR-141 zorgt voor een stijging van MKK4 (123), deze zorgen ook voor een versnelling van de veroudering. De potentiële mechanismen die mogelijk door miRNAs gereguleerd worden, zijn geïllustreerd in Figuur 13.

Figuur 13: Potentiële mechanismen van miRNAs in veroudering en hun mogelijkheden. De miRNAs hebben regulerende functies op verschillende vormen van veroudering door hun invloed op target genen die biologische pathways en processen regelen. Deze kunnen op hun beurt invloed uitoefenen op de gemeenschappelijke of unieke miRNAs, target genen, biologische pathways en processen. Het beïnvloeden van deze mechanismen kan een doel zijn van nieuwe behandelingen (124).

         

 

 

 

28  

4.

Topische behandeling (“gene cream”)

De huid is een gemakkelijk doelorgaan voor een topische behandeling met siRNA, aangezien het directe toegang verleent tot de doelcellen (125). Normaliter is een passieve diffusie van moleculen mogelijk tot een moleculaire massa van 500 dalton wanneer het een lipofiele molecule betreft (126). Voor grotere moleculen zijn er een aantal barrières. De eerste barrière bevindt zich ter hoogte van de epidermis. In de epidermis bevindt het grootste obstakel zich ter hoogte van het SC: de op elkaar gepakte corneocyten vormen er hydrofobe non-polaire intracellulaire lipiden (127). Volgend op de barrière ter hoogte van de epidermis, wordt er gestoten op de elektrondense structuur van de basale membraan (128). siRNA heeft een hoge moleculaire massa en is hydrofiel, passieve penetratie door de huid is dus onmogelijk (127). Voorts heeft naakt siRNA ook een aantal beperkingen die de mogelijkheid van diffusie bemoeilijkt. Naakt siRNA heeft een negatieve lading, is relatief groot (ongeveer 13 kDa) en is gevoelig aan degradatie door endogene enzymes (127). Als gevolg hiervan is er nood aan technieken die de penetrantie van siRNA via de huid verbeteren (127). Zowel chemische als fysische methodes kunnen worden gehanteerd om siRNA te begeleiden naar de gewenste locatie. Gezien het pijnloze karakter, de mogelijkheid tot ambulant gebruik en toepasbaarheid op grote gebieden van de huid, is deze topische behandeling het meest aangewezen wanneer het anti-aging betreft. Verschillende technieken die de penetrantie bevorderen worden weergegeven in Tabel 7. Methode Chemische enhancers/ combinaties van chemische enhancers

Beschrijving Disruptie van de sterk geordende dubbellagige structuren in SC

Voordelen -Gestegen permeabiliteit van de huid -Goedkoop -Gemakkelijk te gebruiken

Nadelen -Irritatie van de huid -Degradatie van de siRNAs

Lipide-gebaseerde systemen

Elastische vezels penetreren de intacte huid, gebruik makende van verschillende mechanismen (132) Helpt verhoornd epitheel te verwijderen

-Gemakkelijk te gebruiken -Toepasbaar op grote gebieden -Pijnloos -Goedkoop

-Lage werkzaamheid -Irritatie van de huid -Immuunrespons -Onstabiel

Chemische depilatie

Opmerkingen -Specifieke combinaties van chemische enhancers resulteren in een verbetering en minder huid irritatie

-Milder dan tape- -Degradatie van de stripping siRNAs (fysische -Immuunrespons/huid methode) irritatie Tabel 7: Chemische methodes voor levering van siRNAs aan de huid (127).

Referenties (129-131)

(133)

(134)

         

 

 

 

29  

Discussie Na het grondig bestuderen van de literatuur kunnen we concluderen dat er nood is aan een nieuwe behandeling voor fotoaging. Bestaande behandelingen zijn vaak ingrijpend en hebben heel wat bijwerkingen. Ze zijn overigens weinig efficiënt of weinig specifiek. Een therapie op basis van een “gene cream” kan een waardig alternatief bieden. Recente inzichten in de pathofysiologie van fotoaging met opheldering van belangrijke molecules in dit proces bieden talrijke mogelijkheden voor RNAi als een alternatieve, specifieke benaderingswijze in de behandeling van fotoaging. Regulatie van genexpressie door middel van RNAi gebeurt op posttranscriptioneel niveau door middel van exogene siRNAs of endogene miRNAs. Enderzijds zijn siRNAs korte dubbelstrengige (~21-23 bp) moleculen die via transfectie in de cel worden binnengebracht en die leiden tot sequentiespecifieke degradatie van het overeenkomstige mRNA (‘gene silencing’). Anderzijds zijn miRNAs endogeen in de cel aanwezig. Deze enkelstrengige oligonucleotiden (~22 nt) zorgen voor een downregulatie van genexpressie door te binden aan 3’-UTR van verschillende mRNAs. miRNAs kunnen op hun beurt beïnvloed worden door middel van specifiek gerichte antisense moleculen, zoals antimiRs, of hun effect kan nagebootst worden door het inbrengen van pre-miRs. Aangezien één miRNA een netwerk van meerdere genen kan reguleren, kan beïnvloeding ervan een krachtig therapeutisch effect veroorzaken. Een ideale target voor siRNA therapie moet voldoen aan een aantal voorwaarden. Er moet een opregulatie van de target zijn tijdens het proces van fotoaging en daarnaast moet deze een belangrijke rol spelen in de pathofysiologie. Voorts zijn de molecules bij voorkeur reeds uitgebreid bestudeerd, zodat ongewenste effecten door het uitschakelen van het gen op voorhand kunnen worden voorspeld. Omwille van deze voorwaarden dragen de volgende molecules onze voorkeur uit als target voor siRNA therapie: EGF/EGF-achtige liganden, EGF-receptor, intrinsiek tyrosine kinase, small GTPbindende eiwitfamilies, SMases, ceramide, MAPK, Raf-1, MEK1, Erk, AP-1 en MMP. Deze targets maken deel uit van de meest bestudeerde getriggerde pathway post-uv die tevens een belangrijk onderdeel van de collageen homeostase bevat, namelijk ‘EGF en EGF-achtige liganden’ (7). Verder onderzoek is nodig om de beste targets hieruit te filteren. AP-1 lijkt met zijn effecten op zowel de fibroblasten als de keratinocyten één van de belangrijkste potentiële targets te zijn. De potentiële targets voor silencing met siRNAs werden samengevat in Tabel 6. Over miRNAs in fotoaging is echter nog weinig bekend. Verder wetenschappelijk onderzoek naar target miRNAs is hiervoor noodzakelijk. Omwille van het cosmetisch karakter van een therapie voor fotoaging verdient een patiëntvriendelijke, niet invasieve toedieningswijze de voorkeur. Een gene cream zou hiervoor de oplossing kunnen bieden. Om de siRNAs, pre-miRNAs of anti-miRNAs op hun locatie te krijgen is nood aan eventuele chemische methodes die tot verbetering van de penetrantie kunnen leiden. In Tabel 7 werden      

 

 

 

30  

chemische methodes voor de levering van siRNAs in de huid beschreven. Deze kunnen ook gebruikt worden voor pre-miRNAs en anti-miRNAs. Verder wetenschappelijk onderzoek is noodzakelijk om deze alternatieve therapie op basis van een “gene cream” te realiseren.

     

 

 

 

31  

Referentielijst 1.

Quan T, He T, Kang S, Voorhees JJ, Fisher GJ. Solar ultraviolet irradiation reduces collagen

in photoaged human skin by blocking transforming growth factor-beta type II receptor/Smad signaling. The American journal of pathology. 2004;165(3):741-51. Epub 2004/08/28. 2.

Beylot C, editor. Vieillissement cutané: prévenir, corriger, rajeunir.: MED'COM; 2007.

3.

Beylot C. [Skin aging: clinicopathological features and mechanisms]. Ann Dermatol Venereol.

2009;136 Suppl 6:S263-9. Epub 2010/01/14. Vieillissement cutane: aspects cliniques, histologiques et physiopathologiques. 4.

Rittie L, Fisher GJ. UV-light-induced signal cascades and skin aging. Ageing Res Rev.

2002;1(4):705-20. Epub 2002/09/05. 5.

Yaar M, Gilchrest BA. Skin aging: postulated mechanisms and consequent changes in

structure and function. Clinics in geriatric medicine. 2001;17(4):617-30, v. Epub 2001/09/06. 6.

Rheinwald JG, Hahn WC, Ramsey MR, Wu JY, Guo Z, Tsao H, et al. A two-stage,

p16(INK4A)- and p53-dependent keratinocyte senescence mechanism that limits replicative potential independent of telomere status. Mol Cell Biol. 2002;22(14):5157-72. Epub 2002/06/22. 7.

Mukherjee S, Date A, Patravale V, Korting HC, Roeder A, Weindl G. Retinoids in the

treatment of skin aging: an overview of clinical efficacy and safety. Clin Interv Aging. 2006;1(4):32748. Epub 2007/12/01. 8.

Gilchrest BA. A review of skin ageing and its medical therapy. The British journal of

dermatology. 1996;135(6):867-75. Epub 1996/12/01. 9.

Yaar M, Eller MS, Gilchrest BA. Fifty years of skin aging. J Investig Dermatol Symp Proc.

2002;7(1):51-8. Epub 2003/01/10. 10.

Sachs DL, Voorhees JJ. Age-reversing drugs and devices in dermatology. Clin Pharmacol

Ther. 2011;89(1):34-43. Epub 2010/11/26. 11.

Makrantonaki E, Zouboulis CC. Molecular mechanisms of skin aging: state of the art. Ann N

Y Acad Sci. 2007;1119:40-50. Epub 2007/12/07. 12.

Gilchrest BA. Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs. 1990;2(2):79-82. Epub 1990/04/01.

13.

Macchie

di

melanina:

prevenirle

e

combatterle.

Available

from:

http://blooin.blogspot.com/2010/08/macchie-­‐di-­‐melaninaprevenirle-­‐e.html. 14.

Svobodova A, Vostalova J. Solar radiation induced skin damage: review of protective and

preventive options. Int J Radiat Biol. 2010;86(12):999-1030. Epub 2010/09/03. 15.

Draelos ZD. Cosmetic Dermatology: Products and Procedures: Wiley-Blackwell; 2010.

16.

Urbach F. Ultraviolet A transmission by modern sunscreens: is there a real risk?

Photodermatology, photoimmunology & photomedicine. 1992;9(6):237-41. Epub 1992/12/01.

     

 

 

 

32  

17.

Fisher GJ, Kang S, Varani J, Bata-Csorgo Z, Wan Y, Datta S, et al. Mechanisms of

photoaging and chronological skin aging. Archives of dermatology. 2002;138(11):1462-70. Epub 2002/11/20. 18.

Bernstein EF, Brown DB, Schwartz MD, Kaidbey K, Ksenzenko SM. The polyhydroxy acid

gluconolactone protects against ultraviolet radiation in an in vitro model of cutaneous photoaging. Dermatologic surgery : official publication for American Society for Dermatologic Surgery [et al]. 2004;30(2 Pt 1):189-95; discussion 96. Epub 2004/02/06. 19.

Berneburg M, Plettenberg H, Krutmann J. Photoaging of human skin. Photodermatology,

photoimmunology & photomedicine. 2000;16(6):239-44. Epub 2000/12/29. 20.

Darlington S, Williams G, Neale R, Frost C, Green A. A randomized controlled trial to assess

sunscreen application and beta carotene supplementation in the prevention of solar keratoses. Archives of Dermatology. 2003;139(4):451-5. 21.

Kligman LH, Akin FJ, Kligman AM. Prevention of ultraviolet damage to the dermis of

hairless mice by sunscreens. J Invest Dermatol. 1982;78(2):181-9. Epub 1982/02/01. 22.

Kligman LH, Akin FJ, Kligman AM. Sunscreens promote repair of ultraviolet radiation-

induced dermal damage. J Invest Dermatol. 1983;81(2):98-102. Epub 1983/08/01. 23.

Boyd AS, Naylor M, Cameron GS, Pearse AD, Gaskell SA, Neldner KH. The effects of

chronic sunscreen use on the histologic changes of dermatoheliosis. J Am Acad Dermatol. 1995;33(6):941-6. Epub 1995/12/01. 24.

Stern RS, Weinstein MC, Baker SG. Risk reduction for nonmelanoma skin cancer with

childhood sunscreen use. Arch Dermatol. 1986;122(5):537-45. Epub 1986/05/01. 25.

Antoniou C, Kosmadaki MG, Stratigos AJ, Katsambas AD. Photoaging: prevention and

topical treatments. Am J Clin Dermatol. 2010;11(2):95-102. Epub 2010/02/10. 26.

Redfern CP, Todd C. Retinoic acid receptor expression in human skin keratinocytes and

dermal fibroblasts in vitro. J Cell Sci. 1992;102 ( Pt 1):113-21. Epub 1992/05/01. 27.

Boehm N, Samama B, Cribier B, Rochette-Egly C. Retinoic-acid receptor beta expression in

melanocytes. Eur J Dermatol. 2004;14(1):19-23. Epub 2004/02/18. 28.

Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, Kang S, et al. Molecular basis of sun-

induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature. 1996;379(6563):335-9. Epub 1996/01/25. 29.

Weiss JS, Ellis CN, Headington JT, Tincoff T, Hamilton TA, Voorhees JJ. Topical tretinoin

improves photoaged skin. A double-blind vehicle-controlled study. JAMA. 1988;259(4):527-32. Epub 1988/01/22. 30.

Thielitz A, Abdel-Naser MB, Fluhr JW, Zouboulis CC, Gollnick H. Topical retinoids in acne--

an evidence-based overview. J Dtsch Dermatol Ges. 2008;6(12):1023-31. Epub 2008/05/16.      

 

 

 

33  

31.

Kurian A, Barankin B. Current effective topical therapies in the management of psoriasis. Skin

Therapy Lett. 2011;16(1):4-7. Epub 2011/02/05. 32.

Griffiths CE, Russman AN, Majmudar G, Singer RS, Hamilton TA, Voorhees JJ. Restoration

of collagen formation in photodamaged human skin by tretinoin (retinoic acid). N Engl J Med. 1993;329(8):530-5. Epub 1993/08/19. 33.

Geneesmiddelenbewaking Cv. Teratogeniteit van de retinoïden voor lokaal gebruik. 2005;

Available from: http://www.bcfi.be/Folia/2005/F32N06F.cfm. 34.

Bagatin E, Parada MO, Miot HA, Hassun KM, Michalany N, Talarico S. A randomized and

controlled trial about the use of oral isotretinoin for photoaging. International journal of dermatology. 2010;49(2):207-14. Epub 2010/05/15. 35.

Green BA, Yu RJ, Van Scott EJ. Clinical and cosmeceutical uses of hydroxyacids. Clin

Dermatol. 2009;27(5):495-501. Epub 2009/08/22. 36.

Stiller MJ, Bartolone J, Stern R, Smith S, Kollias N, Gillies R, et al. Topical 8% glycolic acid

and 8% L-lactic acid creams for the treatment of photodamaged skin. A double-blind vehiclecontrolled clinical trial. Arch Dermatol. 1996;132(6):631-6. Epub 1996/06/01. 37.

Thibault PK, Wlodarczyk J, Wenck A. A double-blind randomized clinical trial on the

effectiveness of a daily glycolic acid 5% formulation in the treatment of photoaging. Dermatol Surg. 1998;24(5):573-7; discussion 7-8. Epub 1998/05/23. 38.

Wolf P, Cox P, Yarosh DB, Kripke ML. Sunscreens and T4N5 liposomes differ in their ability

to protect against ultraviolet-induced sunburn cell formation, alterations of dendritic epidermal cells, and local suppression of contact hypersensitivity. J Invest Dermatol. 1995;104(2):287-92. Epub 1995/02/01. 39.

Yarosh D, Klein J, O'Connor A, Hawk J, Rafal E, Wolf P. Effect of topically applied T4

endonuclease V in liposomes on skin cancer in xeroderma pigmentosum: a randomised study. Xeroderma Pigmentosum Study Group. Lancet. 2001;357(9260):926-9. Epub 2001/04/06. 40.

Pedeux R, Al-Irani N, Marteau C, Pellicier F, Branche R, Ozturk M, et al. Thymidine

dinucleotides induce S phase cell cycle arrest in addition to increased melanogenesis in human melanocytes. J Invest Dermatol. 1998;111(3):472-7. Epub 1998/09/18. 41.

Gilchrest BA, Eller MS. The tale of the telomere: implications for prevention and treatment of

skin cancers. J Investig Dermatol Symp Proc. 2005;10(2):124-30. Epub 2005/12/21. 42.

Kurreck J. RNA interference: from basic research to therapeutic applications. Angewandte

Chemie. 2009;48(8):1378-98. Epub 2009/01/21. 43.

Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into

Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. The Plant cell. 1990;2(4):279-89. Epub 1990/04/01.      

 

 

 

34  

44.

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic

interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998;391(6669):806-11. Epub 1998/03/05. 45.

Mello CC. Return to the RNAi world: rethinking gene expression and evolution (Nobel

Lecture). Angewandte Chemie. 2007;46(37):6985-94. Epub 2007/08/23. 46.

Fire AZ. Gene silencing by double-stranded RNA (Nobel Lecture). Angewandte Chemie.

2007;46(37):6966-84. Epub 2007/08/28. 47.

Taroncher-Oldenburg G, Marshall A. Trends in biotech literature 2006. Nat Biotechnol.

2007;25(9):961. Epub 2007/09/12. 48.

Cejka D, Losert D, Wacheck V. Short interfering RNA (siRNA): tool or therapeutic? Clin Sci

(Lond). 2006;110(1):47-58. Epub 2005/12/13. 49.

Bartel

DP.

MicroRNAs:

genomics,

biogenesis,

mechanism,

and

function.

Cell.

2004;116(2):281-97. Epub 2004/01/28. 50.

Sharp PA, Dykxhoorn DM, Novina CD. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene

expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 2003;4(6):457-67. 51.

Haley B, Zamore PD. Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol.

2004;11(7):599-606. Epub 2004/06/01. 52.

Huang L, Liu Y. In vivo delivery of RNAi with lipid-based nanoparticles. Annual review of

biomedical engineering. 2011;13:507-30. Epub 2011/06/07. 53.

Rana TM. Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs.

Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(1):23-36. Epub 2006/12/22. 54.

Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the

initiation step of RNA interference. Nature. 2001;409(6818):363-6. Epub 2001/02/24. 55.

Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, Hannon GJ. Argonaute2, a link

between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science. 2001;293(5532):1146-50. Epub 2001/08/11. 56.

Caplen NJ, Parrish S, Imani F, Fire A, Morgan RA. Specific inhibition of gene expression by

small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. P Natl Acad Sci USA. 2001;98(17):9742-7. Epub 2001/08/02. 57.

Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-

nucleotide

RNAs

mediate

RNA

interference

in

cultured

mammalian

cells.

Nature.

2001;411(6836):494-8. Epub 2001/05/25. 58.

Rao DD, Vorhies JS, Senzer N, Nemunaitis J. siRNA vs. shRNA: similarities and differences.

Adv Drug Deliv Rev. 2009;61(9):746-59. Epub 2009/04/25. 59.

Doench JG, Petersen CP, Sharp PA. siRNAs can function as miRNAs. Genes & development.

2003;17(4):438-42. Epub 2003/02/26.      

 

 

 

35  

60.

Zeng Y, Yi R, Cullen BR. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA

expression by similar mechanisms. P Natl Acad Sci USA. 2003;100(17):9779-84. 61.

Bagga S, Bracht J, Hunter S, Massirer K, Holtz J, Eachus R, et al. Regulation by let-7 and lin-

4 miRNAs results in target mRNA degradation. Cell. 2005;122(4):553-63. Epub 2005/08/27. 62.

Lippman Z, Martienssen R. The role of RNA interference in heterochromatic silencing.

Nature. 2004;431(7006):364-70. Epub 2004/09/17. 63.

Lochmatter D, Mullis PE. RNA interference in mammalian cell systems. Horm Res Paediatr.

2011;75(1):63-9. Epub 2011/01/22. 64.

Zhang BH, Wang QL, Pan XP. MicroRNAs and their regulatory roles in animals and plants. J

Cell Physiol. 2007;210(2):279-89. 65.

Weiler J, Hunziker J, Hall J. Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs): ammunition to target

miRNAs implicated in human disease? Gene therapy. 2006;13(6):496-502. Epub 2005/10/01. 66.

Makrantonaki E, Zouboulis CC. William J. Cunliffe Scientific Awards. Characteristics and

pathomechanisms of endogenously aged skin. Dermatology. 2007;214(4):352-60. Epub 2007/04/27. 67.

Uitto J. Connective tissue biochemistry of the aging dermis. Age-related alterations in

collagen and elastin. Dermatol Clin. 1986;4(3):433-46. Epub 1986/07/01. 68.

Braverman IM, Fonferko E. Studies in cutaneous aging: I. The elastic fiber network. J Invest

Dermatol. 1982;78(5):434-43. Epub 1982/05/01. 69.

Kligman LH. Photoaging. Manifestations, prevention, and treatment. Clin Geriatr Med.

1989;5(1):235-51. Epub 1989/02/01. 70.

Bosset S, Bonnet-Duquennoy M, Barre P, Chalon A, Lazou K, Kurfurst R, et al. Decreased

expression of keratinocyte beta1 integrins in chronically sun-exposed skin in vivo. Br J Dermatol. 2003;148(4):770-8. Epub 2003/05/20. 71.

Gawkrodger DJ. Dermatology : an illustrated colour text. 4th ed. Edinburgh ; New York:

Churchill Livingstone Elsevier; 2008. vii, 135 p. p. 72.

Contet-Audonneau JL, Jeanmaire C, Pauly G. A histological study of human wrinkle

structures: comparison between sun-exposed areas of the face, with or without wrinkles, and sunprotected areas. Br J Dermatol. 1999;140(6):1038-47. Epub 1999/06/03. 73.

Epidermolysis

Bullosa

EB.

2008;

Available

from:

http://users.telenet.be/zeldzame.ziekten/List.e/EB.htm. 74.

Watson RE, Craven NM, Kang S, Jones CJ, Kielty CM, Griffiths CE. A short-term screening

protocol, using fibrillin-1 as a reporter molecule, for photoaging repair agents. J Invest Dermatol. 2001;116(5):672-8. Epub 2001/05/12. 75.

Bernstein EF, Chen YQ, Kopp JB, Fisher L, Brown DB, Hahn PJ, et al. Long-term sun

exposure alters the collagen of the papillary dermis. Comparison of sun-protected and photoaged skin      

 

 

 

36  

by northern analysis, immunohistochemical staining, and confocal laser scanning microscopy. J Am Acad Dermatol. 1996;34(2 Pt 1):209-18. Epub 1996/02/01. 76.

Bernstein EF, Fisher LW, Li K, LeBaron RG, Tan EM, Uitto J. Differential expression of the

versican

and

decorin

genes

in

photoaged

and

sun-protected

skin.

Comparison

by

immunohistochemical and northern analyses. Lab Invest. 1995;72(6):662-9. Epub 1995/06/01. 77.

Gonzalez S, Moran M, Kochevar IE. Chronic photodamage in skin of mast cell-deficient mice.

Photochem Photobiol. 1999;70(2):248-53. Epub 1999/08/26. 78.

Suwabe H, Serizawa A, Kajiwara H, Ohkido M, Tsutsumi Y. Degenerative processes of

elastic fibers in sun-protected and sun-exposed skin: immunoelectron microscopic observation of elastin,

fibrillin-1,

amyloid

P

component,

lysozyme

and

alpha1-antitrypsin.

Pathol

Int.

1999;49(5):391-402. Epub 1999/07/27. 79.

Brenneisen P, Oh J, Wlaschek M, Wenk J, Briviba K, Hommel C, et al. Ultraviolet B

wavelength dependence for the regulation of two major matrix-metalloproteinases and their inhibitor TIMP-1 in human dermal fibroblasts. Photochem Photobiol. 1996;64(5):877-85. Epub 1996/11/01. 80.

Quan T, Qin Z, Xia W, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher GJ. Matrix-degrading metalloproteinases

in photoaging. J Investig Dermatol Symp Proc. 2009;14(1):20-4. Epub 2009/08/14. 81.

Plastow SR, Lovell CR, Young AR. UVB-induced collagen changes in the skin of the hairless

albino mouse. J Invest Dermatol. 1987;88(2):145-8. Epub 1987/02/01. 82.

Campell.

Dermis.

Available

from:

http://neuromedia.neurobio.ucla.edu/campbell/skin/wp_images/161_dermis.gif. 83.

Ullrich A, Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell.

1990;61(2):203-12. Epub 1990/04/20. 84.

Fisher GJ, Voorhees JJ. Molecular mechanisms of photoaging and its prevention by retinoic

acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signal transduction cascades that induce Ap-1regulated matrix metalloproteinases that degrade human skin in vivo. The journal of investigative dermatology Symposium proceedings / the Society for Investigative Dermatology, Inc [and] European Society for Dermatological Research. 1998;3(1):61-8. Epub 1998/09/10. 85.

Quan T, He T, Shao Y, Lin L, Kang S, Voorhees JJ, et al. Elevated cysteine-rich 61 mediates

aberrant collagen homeostasis in chronologically aged and photoaged human skin. The American journal of pathology. 2006;169(2):482-90. Epub 2006/08/01. 86.

Maziere C, Conte MA, Leborgne L, Levade T, Hornebeck W, Santus R, et al. UVA radiation

stimulates ceramide production: relationship to oxidative stress and potential role in ERK, JNK, and p38 activation. Biochemical and biophysical research communications. 2001;281(2):289-94. Epub 2001/02/22. 87.

Modur V, Zimmerman GA, Prescott SM, McIntyre TM. Endothelial cell inflammatory

responses to tumor necrosis factor alpha. Ceramide-dependent and -independent mitogen-activated      

 

 

 

37  

protein kinase cascades. The Journal of biological chemistry. 1996;271(22):13094-102. Epub 1996/05/31. 88.

Massague J. How cells read TGF-beta signals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1(3):169-78.

Epub 2001/03/17. 89.

Chen SJ, Yuan W, Mori Y, Levenson A, Trojanowska M, Varga J. Stimulation of type I

collagen transcription in human skin fibroblasts by TGF-beta: involvement of Smad 3. The Journal of investigative dermatology. 1999;112(1):49-57. Epub 1999/01/14. 90.

Piek E, Heldin CH, Ten Dijke P. Specificity, diversity, and regulation in TGF-beta

superfamily signaling. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 1999;13(15):2105-24. Epub 1999/12/14. 91.

Du B, Fu C, Kent KC, Bush H, Jr., Schulick AH, Kreiger K, et al. Elevated Egr-1 in human

atherosclerotic cells transcriptionally represses the transforming growth factor-beta type II receptor. The Journal of biological chemistry. 2000;275(50):39039-47. Epub 2000/09/13. 92.

Choi SG, Yi Y, Kim YS, Kato M, Chang J, Chung HW, et al. A novel ets-related transcription

factor, ERT/ESX/ESE-1, regulates expression of the transforming growth factor-beta type II receptor. The Journal of biological chemistry. 1998;273(1):110-7. Epub 1998/02/07. 93.

Massague J. TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem. 1998;67:753-91. Epub

1998/10/06. 94.

Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, et al. Akt promotes cell survival by

phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell. 1999;96(6):857-68. Epub 1999/04/02. 95.

Carlsson P, Mahlapuu M. Forkhead transcription factors: key players in development and

metabolism. Developmental biology. 2002;250(1):1-23. Epub 2002/09/26. 96.

Van Der Heide LP, Hoekman MF, Smidt MP. The ins and outs of FoxO shuttling:

mechanisms of FoxO translocation and transcriptional regulation. The Biochemical journal. 2004;380(Pt 2):297-309. Epub 2004/03/10. 97.

Tanaka H, Murakami Y, Ishii I, Nakata S. Involvement of a forkhead transcription factor,

FOXO1A, in UV-induced changes of collagen metabolism. The journal of investigative dermatology Symposium proceedings / the Society for Investigative Dermatology, Inc [and] European Society for Dermatological Research. 2009;14(1):60-2. Epub 2009/08/14. 98.

Hannenhalli S, Kaestner KH. The evolution of Fox genes and their role in development and

disease. Nature reviews Genetics. 2009;10(4):233-40. Epub 2009/03/11. 99.

Quan T, Qin Z, Xu Y, He T, Kang S, Voorhees JJ, et al. Ultraviolet irradiation induces

CYR61/CCN1, a mediator of collagen homeostasis, through activation of transcription factor AP-1 in human skin fibroblasts. The Journal of investigative dermatology. 2010;130(6):1697-706. Epub 2010/02/19.      

 

 

 

38  

100. murine

Masaki H, Atsumi T, Sakurai H. Detection of hydrogen peroxide and hydroxyl radicals in skin

fibroblasts

under

UVB

irradiation.

Biochemical

and

biophysical

research

communications. 1995;206(2):474-9. Epub 1995/01/17. 101.

Yamamoto Y. Role of active oxygen species and antioxidants in photoaging. Journal of

dermatological science. 2001;27 Suppl 1:S1-4. Epub 2001/08/22. 102.

Hanson KM, Simon JD. Epidermal trans-urocanic acid and the UV-A-induced photoaging of

the skin. P Natl Acad Sci USA. 1998;95(18):10576-8. Epub 1998/09/02. 103.

Brenneisen P, Wenk J, Klotz LO, Wlaschek M, Briviba K, Krieg T, et al. Central role of

Ferrous/Ferric iron in the ultraviolet B irradiation-mediated signaling pathway leading to increased interstitial collagenase (matrix-degrading metalloprotease (MMP)-1) and stromelysin-1 (MMP-3) mRNA levels in cultured human dermal fibroblasts. The Journal of biological chemistry. 1998;273(9):5279-87. Epub 1998/03/28. 104.

Buechner N, Schroeder P, Jakob S, Kunze K, Maresch T, Calles C, et al. Changes of MMP-1

and collagen type Ialpha1 by UVA, UVB and IRA are differentially regulated by Trx-1. Exp Gerontol. 2008;43(7):633-7. Epub 2008/06/06. 105.

Matthews JR, Wakasugi N, Virelizier JL, Yodoi J, Hay RT. Thioredoxin regulates the DNA

binding activity of NF-kappa B by reduction of a disulphide bond involving cysteine 62. Nucleic acids research. 1992;20(15):3821-30. Epub 1992/08/11. 106.

Lan L, Zhao F, Wang Y, Zeng H. The mechanism of apoptosis induced by a novel thioredoxin

reductase inhibitor in A549 cells: possible involvement of nuclear factor-kappaB-dependent pathway. Eur J Pharmacol. 2007;555(2-3):83-92. Epub 2006/11/23. 107.

Kwon OS, Yoo HG, Han JH, Lee SR, Chung JH, Eun HC. Photoaging-associated changes in

epidermal proliferative cell fractions in vivo. Arch Dermatol Res. 2008;300(1):47-52. Epub 2007/10/31. 108.

Bosset S, Bonnet-Duquennoy M, Barre P, Chalon A, Lazou K, Kurfurst R, et al. Decreased

expression of keratinocyte beta1 integrins in chronically sun-exposed skin in vivo. The British journal of dermatology. 2003;148(4):770-8. Epub 2003/05/20. 109.

Le Varlet B, Chaudagne C, Saunois A, Barre P, Sauvage C, Berthouloux B, et al. Age-related

functional and structural changes in human dermo-epidermal junction components. The journal of investigative dermatology Symposium proceedings / the Society for Investigative Dermatology, Inc [and] European Society for Dermatological Research. 1998;3(2):172-9. Epub 1998/09/12. 110.

Agren UM, Tammi RH, Tammi MI. Reactive oxygen species contribute to epidermal

hyaluronan catabolism in human skin organ culture. Free Radic Biol Med. 1997;23(7):996-1001. Epub 1997/01/01. 111.

Girish KS, Kemparaju K. The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase: a

biological overview. Life sciences. 2007;80(21):1921-43. Epub 2007/04/06.      

 

 

 

39  

112.

Kurdykowski S, Mine S, Bardey V, Danoux L, Jeanmaire C, Pauly G, et al. Ultraviolet-B

irradiation induces differential regulations of hyaluronidase expression and activity in normal human keratinocytes. Photochemistry and photobiology. 2011;87(5):1105-12. Epub 2011/06/28. 113.

Kambayashi H, Odake Y, Takada K, Funasaka Y, Ichihashi M. Involvement of changes in

stratum corneum keratin in wrinkle formation by chronic ultraviolet irradiation in hairless mice. Exp Dermatol. 2003;12 Suppl 2:22-7. Epub 2004/02/06. 114.

Tzellos TG, Klagas I, Vahtsevanos K, Triaridis S, Printza A, Kyrgidis A, et al. Extrinsic

ageing in the human skin is associated with alterations in the expression of hyaluronic acid and its metabolizing enzymes. Exp Dermatol. 2009;18(12):1028-35. Epub 2009/07/16. 115.

Boehm M, Slack F. A developmental timing microRNA and its target regulate life span in C.

elegans. Science. 2005;310(5756):1954-7. Epub 2005/12/24. 116.

Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small

RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993;75(5):843-54. Epub 1993/12/03. 117.

Shin KH, Pucar A, Kim RH, Bae SD, Chen W, Kang MK, et al. Identification of senescence-

inducing microRNAs in normal human keratinocytes. Int J Oncol. 2011;39(5):1205-11. Epub 2011/07/05. 118.

Christoffersen NR, Shalgi R, Frankel LB, Leucci E, Lees M, Klausen M, et al. p53-

independent upregulation of miR-34a during oncogene-induced senescence represses MYC. Cell Death Differ. 2010;17(2):236-45. Epub 2009/08/22. 119.

Li G, Luna C, Qiu J, Epstein DL, Gonzalez P. Alterations in microRNA expression in stress-

induced cellular senescence. Mech Ageing Dev. 2009;130(11-12):731-41. Epub 2009/09/29. 120.

Bhaumik D, Scott GK, Schokrpur S, Patil CK, Orjalo AV, Rodier F, et al. MicroRNAs miR-

146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging (Albany NY). 2009;1(4):402-11. Epub 2010/02/12. 121.

Li G, Luna C, Qiu J, Epstein DL, Gonzalez P. Targeting of integrin beta1 and kinesin 2alpha

by microRNA 183. The Journal of biological chemistry. 2010;285(8):5461-71. Epub 2009/11/27. 122.

Wang Y, Scheiber MN, Neumann C, Calin GA, Zhou D. MicroRNA regulation of ionizing

radiation-induced premature senescence. International journal of radiation oncology, biology, physics. 2011;81(3):839-48. Epub 2010/11/26. 123.

Marasa BS, Srikantan S, Masuda K, Abdelmohsen K, Kuwano Y, Yang X, et al. Increased

MKK4 abundance with replicative senescence is linked to the joint reduction of multiple microRNAs. Sci Signal. 2009;2(94):ra69. Epub 2009/10/29. 124.

Lafferty-Whyte K, Cairney CJ, Jamieson NB, Oien KA, Keith WN. Pathway analysis of

senescence-associated miRNA targets reveals common processes to different senescence induction mechanisms. Biochimica et biophysica acta. 2009;1792(4):341-52. Epub 2009/05/08.      

 

 

 

40  

125.

Khavari PA, Rollman O, Vahlquist A. Cutaneous gene transfer for skin and systemic diseases.

Journal of internal medicine. 2002;252(1):1-10. Epub 2002/06/21. 126.

Bos JD, Meinardi MM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds

and drugs. Exp Dermatol. 2000;9(3):165-9. Epub 2000/06/06. 127.

Geusens B, Sanders N, Prow T, Van Gele M, Lambert J. Cutaneous short-interfering RNA

therapy. Expert Opin Drug Deliv. 2009;6(12):1333-49. Epub 2009/11/28. 128.

Basner-Tschakarjan E, Mirmohammadsadegh A, Baer A, Hengge UR. Uptake and trafficking

of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene therapy. 2004;11(9):765-74. Epub 2004/01/16. 129.

Williams AC, Barry BW. Penetration enhancers. Adv Drug Deliv Rev. 2004;56(5):603-18.

Epub 2004/03/17. 130.

Ahad A, Aqil M, Kohli K, Chaudhary H, Sultana Y, Mujeeb M, et al. Chemical penetration

enhancers: a patent review. Expert Opin Ther Pat. 2009;19(7):969-88. Epub 2009/06/26. 131.

Thong HY, Zhai H, Maibach HI. Percutaneous penetration enhancers: an overview. Skin

Pharmacol Physiol. 2007;20(6):272-82. Epub 2007/08/25. 132.

El Maghraby GM, Williams AC. Vesicular systems for delivering conventional small organic

molecules and larger macromolecules to and through human skin. Expert opinion on drug delivery. 2009;6(2):149-63. Epub 2009/02/26. 133.

El Maghraby GM, Barry BW, Williams AC. Liposomes and skin: from drug delivery to model

membranes. Eur J Pharm Sci. 2008;34(4-5):203-22. Epub 2008/06/24. 134.

Kanikkannan N, Singh J, Ramarao P. Transdermal iontophoretic delivery of bovine insulin

and monomeric human insulin analogue. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 1999;59(1):99-105. Epub 1999/04/22.

     

 

 

 

41