Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA)

RIJKSWATERSTAAT Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer

en Afvalwaterbehandeling

(RIZA)

Vergelijking van de HPLC-pigmentanalyse met de spectrofotometrische bepaling van chlorofyl-a (NEN 6520) en met de microscopische algendeterminaties (abundantie). Hel chlorofyl-a gehalte bepaald met de pigmentanalyse wordi vergeleken mei het chlorofyl-a gehalte bepaald met de NEN 6520. De procentuele fytoplanklonsamenslelling bepaald met de pigmentanalyse wordv vergeleken met de procentuele fyloplanktonsamenstelling bepaald mei de algentellingen.

Werkdocument

93.067X

D1ATOMEE

BLAUWWIER

GROENWIER

Hella Zwarter

Hogeschool van Amsterdam Afstudeerverslag voor het HLO-milieubiologie Uitgevoerd bij: Stagebegeleiders: Periode:

RIZA, afdeling IOLAM en IOLM te Lelystad Hans Ruiter, Ing. R.B. Geerdink juli 1992 - mei 1993

RIJKSWATERSTAAT Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA)

Vergelijking van de HPLC-pigmentanalyse met de spectrofotometrische bepaling van chlorofyl-a (NEN 6520) en met de microscopische algendeterminaties (abundantie). Het chlorofyl-a gehalte bepaald met de pigmentanalyse wordt vergeleken met het chlorofyl-a gehalte bepaald met de NEN 6520. De procentuele fyloplanktonsamensielling bepaald met de pigmentanalyse wordt vergeleken met de procentuele fytoplanktonsamenstelling bepaald met de algentellingen.

Werkdocument

93.067X

Hella Zwarter Hogeschool van Amsterdam Afstudeerverslag voor het HLO-milieubiologie Uitgevoerd bij: Stagebegeleiders: Periode: N.B.

RIZA, afdeling IOLAM en IOLM te Lelystad Hans Ruiter, Ing. R.B. Geerdink juli 1992 - mei 1993

De inhoud van dit werkdocument hoeft niet noodzakelijkerwijs in overeenstemming te rijn met de visie van het Ministerie van Verkeer en Waiersiaat

VOORWOORD Deze afstudeeropdracht is een onderdeel van mijn stage voor het HLO-milieubiologie aan de Hogeschool van Amsterdam. Hierbij wil ik iedereen van het RIZA bedanken, in het bijzonder de mensen van de afdelingen IOLAM en IOLM. Verder wil ik de mensen bedanken die hebben deelgenomen aan het pigmentoverleg en mij met raad en daad hebben bijgestaan met het tot stand komen van dit verslag. De stage-periode bij het RIZA heb ik niet alleen als een leerzame, maar ook als een gezellige periode ervaren.

Hella Zwarter Lelystad, mei 1993

SAMENVATTING Kwantificering van fytoplankton in oppervlaktewater kan plaatsvinden met: 1) 2) 3)

HPLC-pigmentanalyse spectrofotometrische bepaling van chlorofyl-a volgens de NEN 6520. microscopische algendeterminaties (abundantie).

In dit verslag wordt het chlorofyl-a gehalte bepaald met de pigmentanalyse vergeleken met het chlorofyl-a gehalte dat bepaald is met de NEN 6520 en wordt de procentuele fytoplanktonsamenstelling bepaald met de pigmentanalyse vergeleken met de procentuele fytoplanktonsamenstelling bepaald met de algendeterminaties. De conclusie van de vergelijking pigmentanalyse met de NEN 6520 is dat de methoden vergelijkbare resultaten geven. Dus de pigmentanalyse kan de NEN 6520 in principe vervangen. Een onzekerheid bij de pigmentanalyse is dat de concentratie chlorofyl-a, vermenigvuldigd moet worden met 2,5. Deze factor moet bij eventueel vervolgonderzoek nader uitgezocht worden. De extra informatie die met de pigmentanalyse wordt verkregen, namelijk de afzonderlijke scheiding van pigmenten, is in dit onderzoek niet betrokken. Op 66n monsterpunt echter, waar het chlorofyl-a gehalte, bepaald met de NEN 6520, een constante concentratie liet zien, gaf de pigmentanalyse een zeer duidelijke afname weer van chlorofyl-a en een oplopende chlorofylide concentratie. In de NEN wordt hier niet voor gecorrigeerd. De conclusie van de vergelijking pigmentanalyse met de algendeterminaties is dat de methoden niet vergelijkbare resultaten opleveren. Bij deze vergelijking zijn een aantal opmerkingen te plaatsen. In de eerste plaats zijn de resultaten van de beide methoden op verschillende principes gebaseerd. Bij de algendeterminaties zijn de percentages gebaseerd op aantallen en bij de pigmentanalyse op concentratie specifiek pigment, die met de ratio chlorofyl-a/specifiek pigment wordt omgerekend naar percentages. Deze ratio is niet constant en brengt dus een onzekerheid mee. Een betere vergelijking zou dan ook de vergelijking concentratie specifiek pigment met de algendeterminaties zijn. Deze vergelijking zou dan met zowel de abundantie als met het biovolume van het fytoplanktonmonster kunnen gebeuren. Verder is er voor de pigmentanalyse een aantal experimenten opgezet, die betrekking hebben op de herhaalbaarheid van de methode en de houdbaarheid van respectievelijk de filters en het extract. De belangrijkste conclusie van deze experimenten zijn: dat de herhaalbaarheid van de injectie en de methode zeer goed zijn en dat de filters, bij -20°C bewaard, langere tijd ( ± 10 weken) houdbaar zijn zonder duidelijke achteruitgang.

jTNHOUDSOPGAVE

VOORWOORD

1

SAMENVATTING

2

RIZA 1 1.1 1.2 1.3 2 2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

3 3.1 3.2

INLEIDING ALGEMEEN KWANTIFICERING VAN FYTOPLANKTON DOELSTELLING MATERIAAL EN METHODEN ALGEMEEN 2.1.1 Monstername 2.1.2 Filtratie CHLOROFYL-A BEPALING VOLGENS NEN 6520 2.2.1 Materiaal 2.2.2 Werkwijze 2.2.3 Berekeningen MICROSCOPISCHE ALGENDETERMINATIES 2.3.1 Materiaal 2.3.2 Werkwijze PIGMENTANALYSE 2.4.1 Materiaal 2.4.2 Werkwijze 2.4.3 Motivatie keuze specifieke pigmenten 2.4.4 Berekeningen 2.4.4.1 Berekening concentraties pigmenten 2.4.4.2 Bepalen van de ratio Abfrffcfn(l/Aetme,en van standaard chlorofyl-a 2.4.4.3 Berekenen van de procentuele fytoplanktonsamenstelling STATISTISCHE METHODEN 2.5.1 Doel van de vergelijking 2.5.2 Statistische vergelijking van pigmentanalyse met de NEN 6520 2.5.2.1 Achtergrond analyse en problemen 2.5.2.2 Eenweg variantie-analyse 2.5.2.3 Meerweg variantie-analyse en interaktie 2.5.3 Statistische vergelijking van de pigmentanalyse met de algentellingen RESULTATEN EN DISCUSSIE ALGEMEEN EXPERIMENTEN

5 6 6 6 7 9 9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 11 12 13 13 15 16 19 19 19 19 19 20 21 22 22 22

3.3

3.4

4 5 6 7

3.2.1 Experiment 1 ' 3.2.2 Experiment 2 3.2.3 Experiment 3 3.2.4 Experiment 4 3.2.5 Experiment 5 DE PIGMENTANALYSE VERGELEKEN MET DE 3.3.1 Voor- en nadelen van de pigmentanalyse en 3.3.2 Uitschieters 3.3.3 Statistische vergelijking 3.3.3.1 Variantie analyse DE PIGMENTANALYSE VERGELEKEN MET DE PISCHE ALGENDETERMINATIES 3.4.1 Voor- en nadelen van de pigmentanalyse en sche algendeterminaties 3.4.2 Staafdiagrammen 3.4.3 Statistische vergelijking 3.4.4 Relatieve spreiding tellingen CONCLUSIES AANBEVELINGEN LITERATUURLUST BIJLAGEN

NEN 6520 . . de NEN 6520

22 23 24 24 25 26 26 26 29 29

MICROSCO32 de microscopi32 32 33 34 36 37 38 39

RIZA Het Rijksinstituut voor Integraal Zoetwaterbeheer en Afvalwaterbehandeling (RIZA) te Lelystad is een technische wetenschappelijke dienst van Rijkswaterstaat. Het is haar taak gegevens te verzamelen, adviezen te geven en onderzoek te doen met betrekking tot het integrale beheer van het zoete water, plus het brakke water van de Nieuwe Waterweg. Waar het gaat om lozingen van verontreinigde stoffen strekt de zorg van de dienst zich uit over zowel zoet als zout water. Ook geeft de dienst adviezen aan de provincies over het beheer van hun grondwater. Goed waterbeheer is een belangrijke taak, zowel het kwantitatieve als het kwalitatieve beheer. Het kwantitatieve beheer zorgt voor bijvoorbeeld veilige waterkeringen en dijken, scheepvaartbelangen en de aan- en afvoer van water. De kwaliteit van het water moet aan steeds strengere (internationale) milieu-eisen voldoen. Ook vissen, waterplanten en andere organismen hebben recht op een schoon leefmilieu. Bovendien: ons eigen drinkwater wordt gemaakt uit water van onze rivieren en meren en uit grondwater. Kwaliteit en kwantiteit gaan samen in het waterbeheer. Het RIZA kent vier belangrijke taakgebieden: in winnen en verwerken van gegevens over het Nederlandse water, het geven van adviezen, het voorbereiden van het landelijke beleid over waterkwantiteit en -kwaliteit en het doen van onderzoek. Deze taken worden uitgevoerd door vier technische hoofdafdelingen. De hoofdafdeling Informatie en Ontwikkeling (IO) heeft als taak het verzamelen en het analyseren van gegevens. Dit afstudeeronderzoek is uitgevoerd bij twee subafdelingen van IO, namelijk op het laboratorium voor methoden-ontwikkeling (IOLM) en op het laboratorium van microbiologic (IOLAM). IOLM houdt zich bezig met de normalisatie (in nationaal, Europees en wereldwijd verband) en de ontwikkeling van bepalingsmethoden ten behoeve van andere laboratoria en heeft binnen het instituut een adviserende en ondersteunende functie. IOLAM doet bacteriologisch onderzoek van het oppervlaktewater. Hierbij wordt gecontroleerd op faecale verontreiniging en op verdachte plaatsen op Salmonella. Ook wordt hydrobiologisch onderzoek gedaan, chlorofyl-a bepaling volgens NEN 6520 en determinaties van macro fauna-, zooplankton- en fytoplankton monsters.

1

INLEIDING

1.1

ALGEMEEN

In een natuurlijk aquatisch ecosysteem komen verschillende algentaxa (groepen van algen1) voor. De soortenrijkdom en de kwantiteit van de algentaxa is een indicatie van de fysiologische gesteldheid van het oppervlaktewater. Dominantie van een bepaald algentaxon is afhankelijk van de tijd van het jaar. In een evenwichtig systeem zal in het voorjaar een diatomeeenbloei optreden. In de zomer zullen de groenwieren overheersen en in het najaar de blauwwieren. Naast deze drie dominante taxa, de diatomeeen, groenwieren en blauwwieren, is er ook nog een groep overige algen. Dit zijn algen die onder andere taxa vallen dan de drie dominante algentaxa zoals bijvoorbeeld; de flagellaten, pantserwieren en euglena's. Algen halen hun energie uit de fotosynthese. Bij de fotosynthese speelt het pigment chlorofyl-a een belangrijke rol. Chlorofyl-a zet zonlicht om in bruikbare energie voor de alg. Als er door eutrofiering te veel algen in het water aanwezig zijn, kan met name door de ademhaling ('s nachts) en bij verbranding (afbraak) het 02-gehalte in het water afnemen. Door afname van het 02-gehalte kan er bijvoorbeeld vissterfte optreden. Ook kunnen bepaalde algen toxische stoffen produceren. Het is dus belangrijk om te weten welke algen en hoeveel algen er in het oppervlaktewater aanwezig zijn. In de derde Nota waterhuishouding is een norm2 gesteld voor de algenbiomassa. De norm die gesteld is, wordt uitgedrukt in het chlorofyl-a gehalte dat maximaal aanwezig mag zijn en bepaald wordt met de NEN 6520. Dit gehalte is 100 /ig/1. 1.2

KWANTIFICERING

VAN FYTOPLANKTON.

Algen kunnen op verschillende manieren gekwantificeerd worden. Drie daarvan zijn:

-

chlorofyl-a bepaling volgens NEN 6520 (NEN = Nederlandse Norm) microscopische algendeterminaties HPLC-pigmentanalyse (HPLC = High Performance Liquid Chromatography)

A Chlorofvl-a bepaling volgens NEN 6520 De NEN 6520 (Nederlands Normalisatie Instituut, 1981) is een spectrofotometrische methode voor de bepaling van chlorofyl-a. Uitgangspunt is het feit dat alle algen chlorofyl-a bevatten. De algen worden afgefiltreerd en het chlorofyl-a wordt geextraheerd met ethanol. 1 2

algen = fytoplankton; wordt in dit verslag door elkaar gebruikt Waarbij afwijkingen van nature zijn toegesuan. De waarde is een zomergemiddelde waarde voor eutrofienngsgevoelige, stagnante wateren en geldt van april tot en met September.

Het verschil van de extincties van het extract, voor en na aanzuren, gemeten bij 665 nm en 750 nm is een maat voor het gehalte aan chlorofyl-a. Door het extract aan te zuren wordt er gecorrigeerd voor feofytine-a; feofytine-a is een afbraakprodukt van chlorofyl-a. Het chlorofyl-a gehalte wordt berekend met behulp van een formule waarin extinctie-coefficienten zijn opgenomen van chlorofyl-a en feofytine-a. Aan de hand van de hoeveelheid chlorofyl-a kan de algenbiomassa worden geschat. De totale algenbiomassa is een belangrijke waterkwaliteitsparameter. B Microscopische algendeterminaties De microscopische algendeterminatie is een visuele methode om algen te kwantificeren. Met de microscopische algendeterminaties kan de procentuele samenstelling op basis van aantallen bepaald worden van een fytoplanktonmonster. Verder kan het biovolume bepaald worden aan de hand van een uitgebreide soortensamenstelling mits de afmetingen van de algen bekend zijn. In dit onderzoek zijn alleen de procentuele algensamenstellingen gebruikt. C HPLC - pigmentanalyse Met Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie (HPLC) kunnen algenpigmenten, op basis van verschil in polariteit, gescheiden worden. Door de piekhoogten of de piekoppervlakten te bepalen kan de concentratie van een pigment berekend worden, zoals bijvoorbeeld van chlorofyl-a. De 3 dominante algengroepen, de groenwieren, blauwwieren en de diatomeeen, bevatten specifieke pigmenten die alleen in die groep voorkomen. Luteine en chlorofyl-b zijn pigmenten die specifiek zijn voor de groenwieren; fucoxanthine en chlorofyl-c zijn specifiek voor de diatomeeen en myxoxanthofyl en echinenone voor de blauwwieren. Aan de hand van de concentratie specifieke pigmenten kan de procentuele samenstelling van het fytoplanktonmonster bepaald worden. De specifieke pigmenten die in de algen aanwezig zijn, vormen als het ware een soort vingerafdruk voor een groep algen. 1.3

DOELSTELLING

De doelstelling van dit onderzoek is: Het vergelijken van de HPLC - pigmentanalyse met de chlorofyl-a bepaling volgens NEN 6520 en met de microscopische algendeterminaties. De chlorofyl-a gehaltes bepaald met de pigmentanalyse worden vergeleken met de chlorofyl-a gehaltes bepaald met de NEN 6520 en wordt de procentuele algensamenstelling bepaald met de pigmentanalyse vergeleken met de microscopische algendeterminaties.

Bij de vergelijking zullen de volgende aspecten beschreven worden: - welke resultaten leveren de verschillende methoden op - statistische vergelijking van de resultaten - bruikbaarheid van de methoden De HPLC-pigmentanalyse is een methode, om fytoplankton te kwantificeren, die veel mogelijkheden biedt. Als er een goede vergelijkbaarheid is, kan de HPLC-pigmentanalyse op termijn wellicht de routinematige methoden, NEN 6520 en/of de microscopische algendeterminaties, vervangen. Om de doelstelling te verwezenlijken zijn ca. 100 monsters genomen die zowel met de NEN 6520, de microscopische algendeterminaties als met de HPLC-pigmentanalyse zijn geanalyseerd. Voor de pigmentanalyse zijn tevens een aantal experimenten opgezet om de herhaalbaarheid van de injectie en van de methode te bepalen evenals de houdbaarheid van een extract en de houdbaarheid van de filters.

8

2

MATERIAAL EN METHODEN

2.1

ALGEMEEN

2.1.1

Monstername

Voor dit onderzoek zijn op verschillende lokaties (zie bijlage 1) , verspreid over Nederland, ca. 100 monsters genomen in de periode vanaf 1 juli tot medio november 1992. Voor alle drie de bepalingen zijn op dezelfde manier oppervlaktewatermonsters genomen. De monsters zijn genomen met behulp van een steekbuis en hierbij wordt de procedure gevolgd volgens het interne werkvoorschrift voor fytoplanktonbemonstering. De wijze van bewaren tot de bepaling/filtratie is voor elke methode anders. De monsters voor de NEN en de pigmentanalyse respectievelijk 2 liter en 1 liter zijn niet geconserveerd en worden bewaard in de koelkast (4°C) tot de filtratie. Voor de algendeterminaties worden 2 liter monsters genomen en geconserveerd met lugol. 2.1.2

Filtratie

Voor de NEN 6520 en de pigmentanalyse moeten de oppervlaktewatermonsters, binnen 24 uur, afgefiltreerd worden. Dit gebeurt met behulp van een vacuiimfiltratiesysteem over glasvezelfilters (voor bijzonderheden zie NEN 6520). Het kan gebeuren dat er zoveel fytoplankton in een monster aanwezig is dat er over meerdere filters gefiltreerd moet worden. Na filtratie worden de filters in aluminiumfolie ingepakt en bewaard bij -20°C. 2.2

CHLOROFYL-A BEPALING VOLGENS NEN 6520

2.2.1

Materiaal

ethanol 80% (V/V) schudbad: centrifuge: spectrofotometer: cuvet:

2.2.2

GFL RC-5 superspeed refrigerated centrifuge 55 IS UV/VIS spectrofotometer 50 mm cuvet

Salm & Kipp Dupont Instruments/Sorvali Perkin Elmer Hellma

Werkwijze

De chlorofyl-a bepaling wordt uitgevoerd volgens de NEN 6520. De filters worden in 25 ml ethanol 80% gedaan en worden 7 min. geextraheerd bij 75°Cin een schudbad. Daarna wordt het extract ca. 10 min. gekoeld. Vervolgens wordt er 10 min. (4000 rpm) gekoeld (tussen 0-10°C)gecentrifugeerd. Het extract wordt gedecanteerd en wordt meteen gemeten.

2.2.3

Berekeningen

Het chlorofyl-a en feofytine-a gehalte wordt berekend met behulp van een formule waarin de extinctie-coefficienten van chlorofyl-a en feofytine-a zijn opgenomen. Er worden geen standaarden gebruikt voor de kwantificering. De berekeningen worden uitgevoerd zoals vermeld staat in NEN 6520 (zie bijlage 2). 2.3

MICROSCOPISCHE

2.3.1

Materiaal

zoomstereomicroscoop bezinkingskamers

2.3.2

ALGENDETERMINATIES

Olympus

BH-2 ca. 0.5 ml

Werkwijze

Abundantie: Abundantie is de mate van voorkomen van een bepaalde soort of taxon in een steekproef. Bij de microscopische algendeterminaties wordt de mate van voorkomen bepaald van de verschillende algengroepen, groenwieren, blauwwieren, diatomeeen en de overige algen, in een fytoplanktonmonster Een bezinkingskamer wordt gevuld met een bepaalde hoeveelheid geconserveerd oppervlaktewater monster. Het monster in de bezinkingskamer moet eerst ± 4 uur bezinken voordat er gedetermineerd kan worden. Na 4 uur wordt de bezinkingskamer onder de zoomstereomicroscoop (vergroting 400 maal) gelegd en de bodem en de bovenlaag (drijflaagvormende fytoplankton) worden eerst globaal 'doorgekeken'. Dan worden er 100 algen geteld en genoteerd tot welke groep algen ze behoren. Als er meer dan 10% van een algengeslacht aanwezig is, moeten de afzonderlijke algensoorten, indien mogelijk, binnen dat geslacht tot op de soort gedetermineerd worden. Uit deze gegevens volgt de procentuele fytoplanktonsamenstelling. 2.4

PIGMENTANALYSE

2.4.1

Materiaal

Extractie: extractievaalje: veiligsheidssluiting: glasparels: celhomogenisator: C0 2 cilinder: filters vacuumfiltratiesysteem

70 ml met stop, nr. 854 120/5, nr. 854510 d> 1 mm, nr. 854 180/9 MSK K-50-H GF/C, 4.7 cm

10

Salm & Kipp Salm & Kipp Salm & Kipp Braun Hoekloos Whatman

Apparatuur en hulpmiddelen HPLC-analyse: pomp: ontgasser: detector: injectieloop: voorkolom: analytische kolom: kolomoven: injectiespuit:

High Precision pump model 480 ERC-3612 Waters 990 Photodiode Array Detector 7125 injector met 50LI1 loop Brownlee RP-18 newguard 15x3.2 mm, nr. G18-013 Vydac 201 TPB,250x4.6mm nr. 28320 Mistral Hamilton syringe 250 |il NEC powermate SX Waters 5200 printer/plotter Bernoulli box Waters Baseline 810

hardware:

software:

Spark Holland/Separations Betron Scientific Millipore Rheodyne Inacom Chrompack Separations Chrompack

Millipore Iomega Millipore

Vloeistoffen aceton methanol water eluens A eluens B

Baker, HPLC grade Baker, HPLC grade Millipore, Milli Q watersysteem 75% aceton : 25% water 80% aceton : 20% methanol

Standaarden: Sigma, nr. C-6144, eenheid van 5 mg

chlorofyl-a

2.4.2

Werkwijze

Extractie: Het bevroren filter (zie 2.1.2) wordt in reepjes gesneden en in het extractievaatje gedaan met een bepaalde hoeveelheid 80% aceton. De hoeveelheid is afhankelijk van het aantal filters dat gebruikt is voor de filtratie van het oppervlaktewater (zie bijlage 3, tabel 1). Het extractievaatje met filter(s) wordt in een celhomogenisator geplaatst en geschud gedurende 1 minuut onder koeling met C02. Daarna wordt het extract, met behulp van vacuumfiltratie, over een Whatman GF/C filter gefiltreerd om filter- en celresten te verwijderen. Het opgevangen extract is meteen klaar voor analyse. In de berekening van de pigmentconcentraties is de hoeveelheid aceton, die is toegevoegd voor de extractie, verwerkt.

11

Pigmentanalyse: De pigmentanalyse wordt uitgevoerd met 'reversed phase'-chromatografie. 'Reversed phase' houdt in een apolaire stationaire fase (C18 kolom) en een polaire mobiele fase. Doordat pigmenten relatief apolair zijn, hebben ze grote affiniteit voor de kolom. Door de samenstelling van het eluens te veranderen tijdens de analyse komen eerst de meer polaire pigmenten, als pieken, van de kolom en als laatste de minder polaire pigmenten. Door de pieken te integreren kan de concentratie van een pigment berekend worden. Het eluaat wordt gedetecteerd door een photodiode array detector (PDA). Een PDA neemt een totaal spectrum (350 nm - 700 nm) van het eluaat dat door een cuvet stroomt. De gegevens worden in de vorm van een 3-dimensionaal chromatogram geregistreerd door een computer. Opstelling HPLC

/ \

ontgasser •*-r-\ voorkolom H

analytisclut

koUrmT

kolomoven pomp

mjectie extract SO/Jl

PDA • Photodiode array detector A • eluens A (75% aceton : 25% B - .hums B (80% aceton : 20%

2.4.3

water) methanol)

Motivatie keuze specifieke pigmenten

Om de 3 dominante fytoplanktontaxa, de groenwieren, blauwwieren en de diatomeeen, goed te kunnen kwantificeren is het belangrijk dat de pigmenten die hiervoor gebruikt worden goed gescheiden worden van de andere pigmenten. Ook is het van belang dat deze specifieke pigmenten in alle algensoorten van het taxon aanwezig zijn. Door T.H. Helmerhorst (werkdoc. 89.121X) zijn uit de literatuur gegevens verzameld over de pigmentsamenstelling van de drie dominante algentaxa. Hieruit blijkt dat luteine en chlorofyl-b specifiek zijn voor de groenwieren, echinone en myxoxanthofyl voor de blauwwieren en chlorofyl-c en fucoxanthine voor de diatomeeen. Voor de kwantificering van de groenwieren wordt chlorofyl-b gebruikt. Chlorofyl-b is gekozen 12

omdat is gebleken dat de ratio chlorofyl-a/chlorofyl-b constanter is dan de ratio chlorofyl-a/luteine (zie 2.4.4.2) De blauwwieren worden gekwantificeerd met het pigment myxoxanthofyl. Echinone wordt niet gebruikt omdat dit pigment in zeer kleine hoeveelheden in de algen voorkomt en wordt door de HPLC vrijwel nooit gedetecteerd. Kwantificatie van de diatomeeen gebeurd met het pigment fucoxanthine, hier is niet voor chlorofyl-c gekozen omdat chlorofyl-c niet goed gescheiden wordt van chlorofylide. Chlorofylide is een afbraakprodukt van chlorofyl-a van afstervende diatomeeen en zal dus vaak in combinatie met chlorofyl-c voorkomen. 2.4.4

Berekeningen

2.4.4.1 Berekening concentraties pigmenten Om de HPLC gegevens te kunnen vergelijken met de NEN 6520 en de microscopische algendeterminaties moeten de gemeten piekoppervlakten omgerekend worden naar concentraties pigment. Omdat niet van elk pigment een standaard aanwezig is, worden de concentraties berekend met een formule (G. Torsi et al., 1992). Zie bijlage 10. IO4 *A*F '1%,1C«- y

-

T/

C

^

. ui;

inj

10 4 *F

V *"7^

.

*

A

(2)

E i%,um is de procentuele extinctiecoefficient van een bepaald pigment. A is het piekoppervlak in A(bsorptie) U(nits) * min. F is de flow in ml/min. Vinj is het injectievolume in ul. Clnj is de concentratie in mg/ml van het extract. 1 is de cuvetlengte in cm. In de literatuur kunnen we voor de pigmenten E 1% lcm waarden vinden, gemeten bij de golflengte met de maximale absorptie in een 1% oplossing, in een 1 cm cuvet in een bepaald oplosmiddel (AU * g"1 * l'1 * cm"1). De piekoppervlakten van de pigmenten, die worden omgerekend naar concentraties, zijn gemeten in een ander oplosmiddel en bij een andere golflengte geintegreerd. Daarom kunnen er andere E , %lcm waarden gelden en als dit het geval is, moeten de E l%Mm waarden worden omgerekend.

13

Tabel 1.

Literatuurwaarden (werkdoc.89.121X, T.H. Helmerhorst) van de procentuele extinctiecoefficienten met de bijbehorende golflengtes en oplosmiddelen.

Pigment

L

l%,lcm

Golflengte (nm)

Oplosmiddel

chlorofyl-a

911

663

aceton

chlorofyl-b

1400

456

aceton

fucoxanthine

1060

449

aceton

myxoxanthofyl

2160

478

aceton

Voor het berekenen van de concentratie met de pigmentanalyse worden de pieken van het specifieke pigment bij 452 nm, 511 nm of 666 nm geintegreerd. Chlorofyl-a wordt geintegreerd in het maximum bij 666 nm. Er wordt aangenomen dat dit hetzelfde maximum is als bij 663 nm, maar doordat er een ander oplosmiddel gebruikt wordt, is het maximum iets opgeschoven. Dus de E 1%,icm 663 „m = E 1%ilcm ^ „» = 911. Dit zelfde geldt ook voor fucoxanthine waarbij wordt geintegreerd in het maximum bij 452 nm in plaats van 449 nm. Voor chlorofyl-b en myxoxanthofyl wordt niet gemeten bij het maximum. Chlorofyl-b heeft in de gemeten spectra een maximum bij 460 nm, dit is hetzelfde maximum als bij 456 nm volgens de literatuur. Chlorofyl-b wordt echter gemeten bij 452 nm, dus niet het maximum, hier geldt een andere E l%Acm waarde. Myxoxanthofyl heeft bij 478 nm de maximale absorptie, maar myxoxanthofyl wordt bij 511 nm geintegreerd. Dit is een ander specifiek maximum dus moet de E micm bij 478 nm worden omgerekend naar de E .%-lcin waarde voor 511 nm. Er is niet gekozen voor 452 nm omdat voor de myxoxanthofylpiek een andere piek zit waardoor myxoxanthofyl moeilijk te integreren is. Deze piek absorbeert niet bij 511 nm. (voor spectra zie bijlage 3) De nieuwe E berekend:

1%-lcm

Chlorofyl-b: Myxoxanthofyl:

waarden voor chlorofyl-b en myxoxanthofyl worden als volgt

c.lcm 452 nm

E

l%Ma 5 n nn

= A452 nm'JA^ Md 5 6 nm *-• l%.lcra 456 nm = 1206 = AiUam/Ampm nm * I i«l%.lcm » . i478 nm = 3 7 s...

14

Tabel 2.

De te gebruiken procentuele extinctiecoefficienten met de bijhorende golflengtes.

Pigment

E i%,icm

Golflengte (nm)

chlorofyl-a

911

666

chlorofyl-b

1206

452

fucoxanthine

1060

452

myxoxanthofyl

2500

511

Als deze E i%,icm waarden (tabel 2) in formule (2) wordt ingevuld, volgt er voor elk pigment een formule waarmee de concentratie in het extract berekend kan worden.

Chlorofyl-a: Chlorofyl-b: Fucoxanthine: Myxoxanthofyl:

ciDj = c inj = c = C.»i =

0.22 * A 0.17* A 0.19* A 0.08 * A

Nu de concentraties van de pigmenten in het extract bekend zijn, moeten deze concentratie nog worden omgerekend naar concentraties aanwezig in het oppervlaktewater.

c0= Cj is de V, is de V0 is de C0 is de

c.*vx

concentratie hoeveelheid hoeveelheid concentratie

(3) gemeten. toegevoegde aceton (ml). oppervlakte water gefiltreerd (liter). pigment per liter oppervlaktewater (Mg/1)-

2.4.4.2 Bepalen van de ratio A^r.y.„j/At.m.,.n

van standaard chlorofyl-a

Uit vroegere experimenten is gebleken dat, wat er in de HPLC gestopt wordt er niet allemaal uit komt. Met andere woorden er verdwijnt pigment in de kolom. Dat er pigment verdwijnt in de kolom is vastgesteld door een 'iuivere' chlorofyl-a oplossing te meten in de spectrofotometer (A^^,,,-,) bij 666 nm en de verkregen extinctie te vergelijken met de verkregen extinctie na injectie over de kolom (AgenieIen). Het meten van de chlorofyl-a oplossing in de spectrofotometer {A^^^), d.w.z.de absorptie van zuiver chlorofyl-a en de absorptie van mogelijk aanwezige onzuiverheden, is hetzelfde als het uitvoeren van de NEN 6520.

15

Met de pigmentanalyse is vastgesteld dat er in het chromatogram bij 666 nm maar e£n piek zichtbaar is, namelijk chlorofyl-a. Er zijn geen onzuiverheden gedetecteerd. Dit betekent nog niet dat de chlorofyl-a ook echt zuiver is. De onzuiverheden zouden op de kolom achtergebleven kunnen zijn of komen geleidelijk van de kolom zodat er geen piek gemeten wordt. Maar het zou ook kunnen zijn dat de chlorofyl-a standaard wel redelijk zuiver is en dat er met het chlorofyl-a molecuul iets gebeurt in de kolom. Dat er met het chlorofyla molecuul iets gebeurt in de kolom is het meest waarschijnlijk omdat er geen onzuiverheden worden gedetecteerd, zoals bijvoorbeeld andere pigmenten en omdat het verschil tussen A , ^ , ^ en AgemeIen groot is. Het verschil kan ook niet verklaard worden door de zogenaamde chromatografische shift (maximum verschuift t.g.v.het oplosmiddel); met een diode array wordt continue het spectrum opgenomen, zodat verschuiving direkt kan worden gezien. Eventuele onzuiverheden zouden zouten en water kunnen zijn. Water is kleurloos en wordt dus niet gemeten. Om invloed op de absorptie bij 666 nm te hebben moeten de eventuele aanwezige zouten groen zijn hetgeen niet waarschijnlijk is. Voor het pigment chlorofyl-b wordt een ongeveer gelijke ratio gevonden als voor chlorofyl-a. Voor fucoxanthine en myxoxanthofyl is het experiment niet uitgevoerd omdat van deze pigmenten geen standaarden zijn. De juistheid van de extinctiemetingen via de PDA en de spectrofotometer is gecontroleerd met een oplossing van nikkelchloride; de PDA is gecontroleerd nadat de kolom is kortgesloten. Omdat het chlorofyl-a gehalte, bepaald met de pigmentanalyse, wordt vergeleken met het chlorofyl-a gehalte, bepaald met NEN 6520 is er besloten om de concentraties die gemeten worden te vermenigvuldigen met de ratio A^,^^/Aiemelea van standaard chlorofyl-a. Als Cinj * Vinj met de ratio A^^^JAgemeteil van chlorofyl-a wordt vermenigvuldigd wordt de werkelijke hoeveelheid geinjecteerde pigment verkregen. De ratio A^^JAgeraeIen blijkt ongeveer 2.5 te zijn. Alle specifieke pigmenten worden met 2.5 vermenigvuldigd. 2.4.4.3 Berekenen van de procentuele

fytoplanktonsamenstelling

Om de pigmentanalyse te vergelijken met de microscopische algendeterminaties moeten de resultaten van de pigmentanalyse omgerekend worden naar procenten. De totale hoeveelheid chlorofyl-a is opgebouwd uit concentraties chlorofyl-a afkomstig van de verschillende algentaxa, te weten de groenwieren, diatomeeen, de blauwwieren en de eventuele overige algentaxa. [chla]tot = [chla]^ + [ c h l a ] ^ + [chla]dial + [chla]x

16

(4)

[chla]IOI [chlaV [chla]^ [chla]diat [chla],

concentratie chlorofyl-a totaal aanwezig concentratie chlorofyl-a afkomstig van de groenwieren concentratie chlorofyl-a afkomstig van de blauwwieren concentratie chlorofyl-a afkomstig van de diatomeeen chlorofyl-a afkomstig van andere algentaxa dan de drie genoemde

Indien de concentratie chlorofyl-a afkomstig van de verschillende algensoorten kan worden bepaald, kan de procentuele bijdrage van de verschillende algentaxa tot de totaal aanwezige hoeveelheid chlorofyl-a worden geschat. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een constant veronderstelde ratio van de concentratie chlorofyl-a afkomstig van een taxon ten opzichte van de concentratie specifiek pigment. kchib myxo

= [chla]chlb/[chlb] = [chla]myxo/[myxo]

(5)

= [chla](uco/[fuco]

chlb myxo fuco Tabel 3.

ratio, [chla]/concentratie specifiek-pigment voor de verschillende algentaxa. chlorofyl-b specifiek pigment voor de groenwieren. myxoxanthofyl specifiek pigment voor de blauwwieren fucoxanthine specifiek pigment voor de diatomeeen. De gebruikte ratio's gebruikte ratio

Pigment chlorofyl-a/fucoxanthine

0.7

chlorofyl-a/chlorofyl-b

2.6

chlorofyl-a/myxoxanthofyl

3

In een mengsel van onbekende algensamenstelling kan de totale concentratie chlorofyl-a worden berekend met behulp van de concentratie specifieke pigmenten en de bijbehorende constanten uit formule (5) als er geen andere algen aanwezig zijn dan de groenwieren, blauwwieren en de diatomeeen. [chla]IO, = [chla]^ + [chla],

(6)

[chla]^ = W c h l b ] + kmyxotmyxo] + kfuco[fuco] + [chla]x

(7)

[chlak, [fuco]

de berekende concentratie chlorofyl-a concentratie fucoxanthine (diatomeeen) 17

[myxo] [chlb]

: :

concentratie myxoxanthofyl (blauwwieren) concentratie chlorofyl-b (groenwieren)

Als de gebruikt ratio chlorofyl-a/specifiek pigment juist is, is de berekende concentratie chlorofyl-a lager dan de gemeten concentratie chlorofyl-a als de drie dominante groepen en de groep overige algen in een monster aanwezig zijn en kan het percentage van de verschillende taxa als volgt worden berekend: [chla]dial / [chla]ber x 100 = k[UCO[fuco] / [chla]mel x 100 = %diatomeeen [chla]^.. / tenia]*, x 100 = kroyxo[myxo] / [chla]Be, x 100 = %blauwwieren [chla]gro / [chla]ber x 100 = kcniJmyxo] / [chla]meI x 100 = %groenwieren

(8)

100 - %diatomeeen - %blauwwieren - %groenwieren = %overige

(9)

[chla]meI

:concentratie chlorofyl-a bepaald met de HPLC analyse

Uit de praktijk is gebleken dat [chla]b(.r soms hoger is dan [chla]meI. Als dit het geval is wordt er in de formule (5) niet door [chla]meI gedeeld maar door [chla]*,. Hierdoor is de groep overige algen dan altijd 0. Dit verschijnsel is te verklaren doordat het getal k niet constant is binnen een taxon. Het getal k hangt af van welke algen er in een monster aanwezig zijn, in principe heeft elke alg een eigen k. Ook bestaat er een verschil tussen algen uit cultures en algen uit het veld. De ratio's die hier gebruikt zijn, zijn gemiddelden van een serie waarnemingen en vergeleken met de ratio's die T.H. Helmerhorst (werkdoc.91.146X) heeft gevonden en de ratio's blijken hetzelfde te zijn.

18

2.5

STATISTISCHE METHODEN

2.5.1

Doel van de vergelijking

Het onderzoek is gericht op de beantwoording van twee vragen: a. b.

Geeft de pigmentanalyse overeenkomstige resultaten als de NEN 6520 voor de bepaling van chlorofyl-a? Geeft de pigmentanalyse overeenkomstige resultaten als de tellingen voor de procentuele fytoplanktonsamenstelling?

Bij het vergelijken van resultaten hoeven de metingen niet precies gelijk te zijn. Een zekere spreiding rondom het gemiddelde is aanvaardbaar om te kunnen concluderen dat beide steekproeven gelijk zijn. 2.5.2

Statistische vergelijking van pigmentanalyse met de NEN 6520

2.5.2.1 Achtergrond analyse en problemen Bij de bepaling van chlorofyl-a zijn 19 lokaties betrokken en per lokatie is een verschillend aantal keren bemonsterd (van 2 tot 9 bemonsteringen per lokatie). Bij de vergelijking van de methoden kan per lokatie naar de gemiddelden en de spreiding worden gekeken, maar dit levert een aantal problemen op. Deze problemen zijn: bij elke statistische toets is er sprake van een kans op een beoordelingsfout (de beslissing is dat de gemiddelden niet gelijk zijn, maar in feite zijn de gemiddelden wel gelijk). Als er meerdere testen zijn, neemt de kans op fouten toe. Dit kan worden opgevangen door het significantieniveau te delen door het aantal testen. als op elke lokatie afzonderlijk getest gaat worden dan hoeft de conclusie allesbehalve duidelijk te zijn, want wat gebeurt er met het resultaat als op 10 lokaties de methoden gelijk zijn en op 9 lokaties de methoden van elkaar verschillen. Dit kan worden opgevangen door een toets te gebruiken die rekening houdt met alle gegevens, zoals variantie-analyse. bovendien is het mogelijk dat er een interaktie bestaat tussen methoden en lokaties, d.w.z.dat op een lokatie de methoden een ander patroon volgen. In variantie-analyse wordt er getest op interaktie tussen de verschillende factoren. 2.5.2.2 Eenweg variantie-analyse De aandacht bij 'Analysis of Variance' (anova) is gericht op de gemiddelde waarden voor de verschillende methoden, lokaties en data. Aan de variantie-analyse zijn een aantal voorwaarden verbonden: de error moet normaal verdeeld zijn met

19

gemiddelde 0 en variantie a 2 is onafhankelijk van andere fouten. Als aan de eisen niet voldaan is dan kan er een niet-parametrische variant van anova worden toegepast. Bij anova kunnen uit een aantal modellen gekozen worden: eenweg en meerweg anova. Bij eenweg-anova wordt er gekeken naar een indelingscriterium, bijvoorbeeld methoden. Het gemiddelde van methode 1 wordt vergeleken met het gemiddelde van methode 2. De gemeten concentratie met een bepaalde methode wordt uiteengerafeld in een aantal elementen, namelijk het algemene gemiddelde, de bijdrage van een bepaalde factor en de variantie die optreedt. Om een model te toetsen worden verschillende hypothesen geformuleerd. Uitgangspunt is de nulhypothese (H0) namelijk dat er geen verschil bestaat tussen de verschillende methoden. De alternatieve hypothese (H,) wordt algemener geformuleerd, namelijk dat de methoden niet gelijk zijn. De precieze berekeningswijze van variantie-analyse is niet van belang; het belangrijkste zijn de hypothesen. Als resultaat van een variantie-analyse wordt de F-ratio berekend en de kans ('probability') op die bepaalde F-waarde onder de F-verdeling. Er wordt gekeken of de steekproefgemiddelden meer van elkaar verschillen dan verklaard kan worden uit de residuele variatie. Deze verhouding wordt uitgedrukt in de F-ratio. Als er geen verschil bestaat dan varieert de F-waarde rond de 1. Als er wel verschil bestaat dan neemt de F-waarde grotere waarden aan. Uitgangspunt is de nulhypothese van 'geen verschil tussen de gemiddelden'. De kans op de F-waarde geeft dan aan hoe groot de kans is dat er geen verschil tussen de gemiddelden bestaat. Een veel gebruikte norm is 5 %, dat wil zeggen als de kans groter is dan 5 % dan luidt de beslissing dat er geen verschillen tussen de gemiddelden bestaan. Als de kans kleiner is dan 5% dan is de beslissing dat gegeven de verschillen in gemiddelden het onwaarschijnlijk is dat deze resultaten afkomstig zijn uit een populatie met gelijke gemiddelden en de beslissing is dan dat de gemiddelden niet gelijk zijn. Voor een nadere analyse kan anova uitgebreid worden naar meerdere factoren, zodat zowel een onderscheid gemaakt wordt naar zowel methode als datum en lokatie en eventuele interakties tussen de factoren. 2.5.2.3 Meerweg variantie-analyse en interaktie De resultaten worden be'invloed door meerdere factoren, naast de methode, ook de lokatie en de datum. Een grafisch beeld van de gegevens geeft een indicatie van het globale patroon en of er aan de voorwaarden is voldaan, maar voor meer gedetailleerde informatie zijn cijfers nodig. De invloed van meerdere factoren op het resultaat kan getest worden met een meerweg-anova model.

20

Met een twee-weg anova model kan getest worden op interaktie en de afzonderlijke effecten (hoofd-effecten) tussen bijvoorbeeld methode en locatie en tussen methode en datum. Interaktie zijn verschillende reacties voor elke combinatie van lokatie, methode en datum. Hoe sterk is het bewijs dat verschillende lokaties en verschillende methoden leiden tot een verandering in metingen chlorofyl-a? De nulhypothese (H0) luidt dat er gden interaktie is tussen de twee factoren. Als de interaktie niet significant is dan kunnen de hoofd-effecten van de factoren getest worden. In de anova-tabel wordt de totale variatie opgesplitst in hoofd-effecten, interaktie en residu. 2.5.3

Statistische vergelijking van de pigmentanalyse met de algentellingen

De resultaten van de procentuele algensamenstelling bepaald met de pigmentanalyse en de microscopische algentellingen zijn niet eenvoudig statistisch te vergelijken. Er is geen statistische test gevonden waar de percentages van de vier groepen bepaald met de pigmentanalyse te vergelijken zijn met de percentages van de vier groepen bepaald met de microscopische tellingen. Het onderscheid naar de afzonderlijke groepen algen kan niet worden gemaakt. Daarom zijn de algengroepen apart getest. Eerst zijn de resultaten, per algengroep, getest op een normale verdeling. Dit is gedaan met behulp van de Wilk-Shapiro test. Hoe dichter de uitkomst van de Wilk-Shapiro test bij 1 ligt des te meer lijkt de verdeling op een normale verdeling. Als de resultaten de normale verdeling volgen kan de gepaarde t-toets uitgevoerd worden. Als dit niet het geval is kan de niet-parametrische Wilcoxon signed rank test uitgevoerd worden.

21

3

RESULTATEN EN DISCUSSIE

3.1

ALGEMEEN

In het eerste gedeelte van dit hoofdstuk worden de resultaten besproken van de experimenten, die ter ondersteuning van de HPLC-pigmentanalyse zijn opgezet. In het tweede gedeelte van dit hoofdstuk wordt de pigmentanalyse vergeleken met respectievelijk de NEN 6520 en de microscopische algentellingen. Er wordt ingegaan op de voor- en nadelen van de drie methoden. De resultaten van de pigmentanalyse, de NEN 6520 en de tellingen staan in respectievelijk in bijlage 5 en 7 en de statistische beschouwingen in dit hoofdstuk. 3.2

EXPERIMENTEN

Het is van belang om te weten of er een homogeen fytoplanktonmonster genomen kan worden, hoe lang een filter bewaard kan worden en hoe betrouwbaar de analyse is. Voor experiment 3, 4 en 5 zijn drie 10 liter vaten gevuld met oppervlaktewater uit het Veluwemeer (Vel 8). Deze oppervlaktewatermonsters zijn verdeeld in 10 maal 1 liter en binnen 24 uur gefiltreerd en ingevroren bij of-20°C of-70°C afhankelijk voor welk experiment de filters later gebruikt zijn. Voor experiment 1 en 5 zijn monsters gebruikt van de afstudeeropdracht. Bij experiment 1 zijn de hoeveelheden pigment te vergelijken met het oppervlaktewatermonster Vel 8 die gebruikt is voor de andere experimenten. De resultaten waar hier een overzicht van gegeven is, komen gedeeltelijk uit het verslag van K. Dorhout, 1992. Zij heeft soms bij andere golflengten geintegreerd, meestal de maxima van de betreffende pigmenten, dan die gebruikt zijn voor het berekenen van de concentraties. Van experiment 2, 4 en 5 staan de uitgebreide tabellen in bijlage 4. 3.2.1

Experiment 1

Om de herhaalbaarheid van de injectie te bepalen wordt een extract acht keer, op dezelfde dag, geinjecteerd. Door deze resultaten te vergelijken met de resultaten van experiment 3 kan de bijdrage van extractie bepaald worden. De spreiding van de resultaten (tabel 4) ligt tussen de 3% en 7% voor het piekoppervlak en tussen de 2% en 5% voor de piekhoogte. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de herhaalbaarheid van de injectie hoog is.

22

Tabel 4.

De relatieve standaarddeviaties van het piekoppervlak en piekhoogte voor een aantal pigmenten bij een bepaalde golflengte (n = 8).

Pigment

RSD % (opp.)

RSD % (hoogte)

golflengte (nm)

fucoxanthine

7

5

452

myxoxanthofyl

4

2

480

chlorofyl-b

4

5

460

chlorofyl-a

3

3

666

3.2.2

Experiment 2

Het doel van dit experiment is het vast stellen of er achteruitgang waarneembaar is, van de pigmenten, in een extract dat een aantal dagen wordt bewaard bij -20°C. Het extract is dezelfde dag en de vier daarop volgende dagen geanalyseerd. Figuur 1.

Het piekoppervlak tegen de dag waarop het extract is geinjecteerd.

5

•

,«jCOK.nl1l«.

.

wy.ox.ntnofyi

o o

lutolno

a

zooxoninlno

X

chlorofyl-o

chlorofyl-a

Naar aanleiding van de resultaten kan worden geconcludeerd dat de HPLC-analyse van een extract tot drie dagen na de extractie uitgevoerd kan worden zonder dat het duidelijke verschillen oplevert in de resultaten. Voor tabel, zie bijlage 4. Na drie dagen neemt het piekoppervlak en piekhoogte van chlorofyl-a duidelijk waarneembaar af (zie figuur 1).

23

3.2.3

Experiment 3

Om de herhaalbaarheid van de methode te bepalen worden 10 deelmonsters (1 liter) uit 6£n 10 liter vat gehaald. Een eventuele grote spreiding van de resultaten kan liggen aan een slecht uitgevoerde extractie. Ook het nemen van een inhomogeen monster kan aanleiding geven tot een grote spreiding in de resultaten. Door het vat goed te mengen is geprobeerd de deelmonsters zo homogeen mogelijk te krijgen. De filters zijn ingevroren bij -20°Cen vervolgens, verdeeld over twee dagen, geextraheerd en geanalyseerd. Tabel 5.

De relatieve standaarddeviaties van het piekoppervlak en de piekhoogte voor een aantal pigmenten bij een bepaalde golflengte (n = 10).

Pigment

RSD % (opp.)

RSD % (hoogte)

golflengte (nm)

oscillaxan thine

8

6

500

fucoxanthine

11

6

452

myxoxanthofyl

8

7

510

zeaxanthine

8

6

452

chlorofyl-a

17

16

665

chlorofyl-a

15

16

430

De procentuele fout van + 10% voor het oppervlak en ± 6% voor de piekhoogte is zeer goed te noemen voor de pigmentanalyse. Chlorofyl-a wijkt af van de andere resultaten maar is acceptabel. De bijdrage van het extraheren aan de spreiding van een monster kan bepaald worden aan de hand van experiment 1 + 3 en bedraagt ongeveer 2 a 3% met de aanname dat de monstername homogeen is geweest. 3.2.4

Experiment 4

Het doel van experiment 4 is het vaststellen of een filter na langere bewaartijd in kwaliteit achteruit gaat, als het bewaard wordt bij -20°C. Voor dit experiment wordt ook weer een 10 liter vat gebruikt. Er wordt 10 keer 1 liter gefiltreerd en de filters worden bewaard bij -20°C. Elke week wordt er een filter geextraheerd en geanalyseerd. In figuur 2 zijn de resultaten (bijlage 4) grafisch weergegeven. De spreiding is iets groter dan bij experiment 3, maar er kan niet geconcludeerd worden dat het monster in kwaliteit achteruit gaat. De procentuele fout van het 24

piekoppervlak, chlorofyl-a uitgezonderd, loopt uiteen van 8-12% en de piekhoogte van 9-14%. Bij experiment 3 was dat zonder chlorofyl-a, voor het piekoppervlak 8-11% en de hoogte 6-7%. Chlorofyl-a heeft een procentuele fout van 24% voor zowel het oppervlak als de hoogte en is dus hoger dan de resultaten van experiment 3. Een achteruitgang van chlorofyl-a is niet duidelijk aanwezig, maar de laatste twee metingen laten wel een trend van lagere waarden zien. Om aan te tonen of deze trend doorzet had er langer gemeten moeten worden. Vooral de e^n na laatste meting is zeer laag ten opzichte van de andere metingen, maar dit zou een uitschieter kunnen zijn (zie figuur 2) Figuur 2. Het piekoppervlak tegen de week dat er gemeten is.

TuCOxmrtX'M rt* 5 *>, no* «rH hot* . V C h ( - « CG66 nm]

3.2.5

iul*ir«

X

ZMKanirMn*

Experiment 5

Het doel van dit experiment is een eventueel verschil te constateren van het effect op het bewaren van de filters bij -20°Cen bij -70°C. Er zijn 6 filters bij -20°Cen 6 filters bij -70°Cbewaard. Drie filters uit -20°Cen drie filters uit -70°Czijn na drie weken bepaald en de andere zes filters na drie maanden. Als deze resultaten (zie bijlage 4) in combinatie worden bekeken met experiment 4 kan geconcludeerd worden dat voor zowel de filters bewaard bij -20 "Cals bij -70 °C de resultaten binnen de spreiding vallen van de gevonden waarden bij experiment 4. Uit eerder uitgevoerde onderzoeken is gebleken dat de filters het best binnen 2 weken geanalyseerd worden als ze bewaard worden bij -20°C. Als de filters langer bewaard moeten blijven, kunnen ze het best bij -70°C bewaard worden.

25

3.3

DE PIGMENTANALYSE

VERGELEKEN

MET DE NEN 6520

3.3.1

Voor- en nadelen van de pigmentanalyse en de NEN 6520

Als voordeel van de pigmentanalyse kan worden gezien dat pigmenten gescheiden kunnen worden en afzonderlijk geidentificeerd en gekwantificeerd. Hierdoor wordt er veel informatie verkregen over een monster terwijl er maar 1 analyse wordt uitgevoerd. Er kan bijvoorbeeld de hoeveelheid pigment per ml worden berekend en door de aanwezigheid van een specifiek pigment kan een algentaxon worden aangetoond. Een ander voordeel van de pigmentanalyse is dat de methode gedeeltelijk goed te automatiseren is. De NEN heeft ook een aantal voordelen; de bepaling is al sinds 1981 gestandaardiseerd en de bepaling is eenvoudig uit te voeren. Uit ringonderzoeken blijkt dat de NEN goed reproduceerbare resultaten opleveren. Volgens de NEN 6520 zou bij een goede uitvoering een precisie van 5% haalbaar zijn. Afgaande op de resultaten van ringonderzoeken is dit ook het geval. Omdat de methode gestandaardiseerd is, wordt de NEN op veel laboratoria uitgevoerd. Hierdoor is er een historische reeks van resultaten ontstaan. Verder heeft de NEN 6520 een lage detectiegrens (2 Mg/1)Een grotere spreiding van de resultaten, ca. 10% (zie experimenten), kan als een nadeel van de pigmentanalyse beschouwd worden. Soms kan het een probleem zijn om een piek te integreren als de concentratie van het pigment lager dan 10 Mg/1 isVaak is de piek dan niet te onderscheiden van de ruis. Een nadeel van de NEN 6520 is dat de absorptie bij 665 nm niet specifiek is, ook andere pigmenten, meestal afbraakprodukten, absorberen bij deze golflengte. Dit is een nadeel omdat de NEN geen onderscheid kan maken tussen de afzonderlijke pigmenten. Als er bijvoorbeeld veel chlorofylide in een monster aanwezig is, dan wordt dat door de NEN meegemeten. Bij de NEN wordt alleen voor het afbraakprodukt feofytine-a gecorrigeerd en niet voor andere afbraakprodukten zoals chlorofylide. 3.3.2

Uitschieters

In bijlage 5 staan de resultaten vermeld van de pigmentanalyse en de NEN 6520 en in bijlage 6 zijn deze resultaten grafisch weergegeven. Uit de resultaten van de pigmentanalyse en de NEN 6520 valt te lezen dat bij een aantal monsters de chlorofyl-a gehaltes bepaald met de pigmentanalyse veel lager zijn dan de chlorofyl-a gehaltes die bepaald zijn volgens NEN 6520. In bijlage 5 worden deze aangegeven met een * . Bij de pigmentanalyse wordt chlorofyl-a geintegreerd bij 666 nm (specifiek maximum in 80% aceton). Bij deze golflengte absorberen ook andere pigmenten, vnl. afbraakprodukten van chlorofyl-a, zoals, chlorofylide en feofytine-a. In de chromatogrammen (666 nm) van de pigmentanalyse is te zien dat er bij deze monsters naast chlorofyl-a een grote hoeveelheid afbraakprodukt, chlorofylide,

26

voorkomt (zie figuur 3). Voor chlorofylide wordt bij de NEN niet gecorrigeerd. Dit betekent dat voor deze monsters de NEN een te hoge chlorofyl-a waarde geeft. Monsters die dit beeld vertonen worden als uitschieter beschouwd en niet meegenomen met de statistische vergelijking. Figuur 3.

Chromatogram van IJ23 (04/08/92) waarbij de chlorofylide-piek veel groter is dan de chlorofyl-a-piek. Hierdoor ontstaat er een groot verschil tussen de NEN-waarde (126 Mg/1) en pigmentanalyse-waarde (6 Mg/1)0.06

666 nm 0.05

i!

0-04

-£.

0.03

chlorofylide

0. <5

0.0J

0.0 I

chlorofyl-o ^m^J^jyMdS^^.y^li,,,,^

-0.01

,f, i i ^ l M l m U M H

15

20

25

30

35

40

tijd (min)

Per lokatie zijn van de resultaten grafieken gemaakt (bijlage 6). Als de resultaten overeen komen dan zou de pigmentanalyse de NEN moeten volgen, zoals bijvoorbeeld de lokaties G 125, K12 en KEI. Een aantal lokaties laten een afwijkend beeld zien. In figuur 4 wordt dit voor de lokatie UM 141 (Umeer) getoond. De NEN laat een vrij constante hoeveelheid chlorofyl-a zien en de pigmentanalyse een verloop van de chlorofyl-a concentratie. De concentratie begint op hetzelfde nivo, maar dan neemt de concentratie chlorofyl-a, bepaald met de pigmentanalyse, af en neemt vervolgens langzaam weer toe tot ongeveer hetzelfde nivo. Dit verschijnsel is te verklaren aan de hand van de chromatogrammen van de pigmentanalyse. Bij 666 nm is in het chromatogram te zien dat er in het monster van 13 augustus veel chlorofylide aanwezig is en het chlorofyl-a gehalte is afgenomen. Vanaf 27 augustus neemt het chlorofyl-a gehalte weer toe en de hoeveelheid chlorofylide af. Het piekoppervlak van chlorofylide staat vermeld in tabel 6. De concentratie ervan is niet bekend omdat er geen moleaire extinctie-coefficient van bekend is.

27

Hieruit kan geconcludeerd worden dat de pigmentanalyse beter weergeeft welke pigmenten er werkelijk absorberen bij 666 nm en dus in het water aanwezig zijn. De NEN 6520 maakt geen onderscheid tussen chlorofyl-a en afbraakprodukten zoals chlorofylide. Er wordt alleen gecorrigeerd voor feofytine-a. Daarom geeft de NEN 6520, als er andere afbraakprodukten dan feofytine-a aanwezig zijn, een hogere waarde voor chlorofyl-a dan er werkelijk aanwezig is. Verder wordt er bijna altijd feofytine-a bij de NEN gemeten, maar bij de pigmentanalyse wordt feofytine-a vrijwel nooit gemeten, terwijl er volgens de NEN voldoende feofytine-a aanwezig is om te kunnen meten met de pigmentanalyse. Een eventuele verklaring zou kunnen zitten in het verschil van extraheren van de beide methoden. Bij de pigmentanalyse worden de pigmenten uit de eel verkregen door middel van schudden (celdestructie) en dit gebeurt onder koeling met C0 2 . Bij de NEN wordt het filter verwarmd en geschud bij 75°C.Door de warmte diffundeert het chlorofyl-a uit de eel. Dit is een essentieel verschil en zou een verklaring kunnen zijn voor het ontbreken van feofytine-a bij de pigmentanalyse. Bij de NEN zou door de warmte een versnelde afbraak van chlorofyl-a kunnen plaatsvinden.

De grafische weergave van het chlorofyl-a gehalte bepaald met de pigmentanalyse en de NEN 6520 voor de lokatie IJM 141 (Umeer).

IJM 141 H

y-—_^_^^

•0

/

.15

3

:c -

n.

o Chlorofyl-

Figuur 4.

25

M

'5

10

5

1

30/07

* -

27/08

13/08

Datum HPLC

28

*

NEN

03/09

22/09

Tabel 6.

3.3.3

De hoeveelheid chlorofylide gemeten bij 666 nm, uitgedrukt in het piekoppervlak. Datum

Piekoppervlak (AU*min)

13/08/92

230

27/08/92

120

03/09/92

52

22/09/92

51

Statistische vergelijking

Voor de statische vergelijking van de pigmentanalyse en de NEN 6520 is de variantie analyse toegepast. Er zijn twee hypothesen opgesteld de nulhypothese (de methoden zijn gelijk) en de alternatieve hypothese (de methoden zijn niet gelijk). Als de kans groter dan 5% is, dan wordt de nulhypothese geaccepteerd. 3.3-3-1

Variantie analyse

Als eerste stap in de vergelijking is de eenweg anova toegepast. Er wordt hier alleen gekeken naar de methoden. Er wordt geen onderscheid gemaakt naar de lokaties en of datum; alle waarnemingen van de lokaties - van laag naar hoog - worden op 66n hoop gegooid. In tabel 7 staat de uitkomst van de eenweg anova. Tabel 7.

Uitkomst eenweg anova methode. EENWEG ANOVA METHODE F ratio

F prob

0.3068

0.5804

Voor de methoden bestaat er een kans van ongeveer 58% dat de nulhypothese - de gemiddelden zijn gelijk voor alle lokaties - waar is. Hieruit volgt dat de methoden gelijk zijn. Maar bij de eenweg anova wordt geen rekening gehouden met andere factoren , zoals de lokatie en de datum. De variabiliteit tussen de lokaties zou het verschil tussen de methoden kunnen maskeren. Voor een nadere analyse kan anova uitgebreid worden naar meerdere factoren, zodat zowel een onderscheid gemaakt wordt naar lokatie, datum als naar methoden en 29

eventuele interakties tussen de factoren. Voor de tweeweg anova worden de resultaten ingedeeld naar methode en lokatie en naar methode en datum. De datum is ingedeeld in 10 perioden. De maanden juni en juli zijn respectievelijk periode 1 en 2. Augustus is in tweeen gesplitst evenals de maanden September, oktober en november. Met de tweeweg anova wordt ook bepaald hoe groot de kans is dat er geen interaktie bestaat tussen de twee te testen factoren De uitkomsten van de tweeweg anova staan in tabel 8 en 9. Tabel 8.

Uitkomst tweeweg anova methode en lokatie. TWEEWEG ANOVA METHODE/LOKATIE F ratio

F prob

METHODE

0.612

0.435

LOKATIE

10.285

0

2-weg interaktie

0.681

0.825

hoofd-effecten

Tabel 9.

Uitkomst tweeweg anova methode en datum TWEEWEG ANOVA METHODE/DATUM F ratio

F prob

METHODE

0.323

0.571

DATUM

2.384

0.015

2-weg interaktie

0.561

0.827

hoofd-effecten

De kans dat er geen interaktie bestaat tussen methode/lokatie en methode/datum is ruim 80%. De interaktie is dus niet significant. Bij de opzet van het onderzoek is het de bedoeling geweest om totaal verschillende lokaties te nemen voor het onderzoek. Verschillend qua chlorofyl-a gehalte en algensamenstelling en aan deze opzet is ook voldaan. Uit de statistische vergelijking is ook af te leiden dat de lokaties de meeste invloed hebben op de vergelijking (hoge F ratio). Het chlorofyl-a gehalte en de algensamenstelling veranderen in de tijd. Uit de grafieken is niet duidelijk een tijdreeks te halen. De datum heeft ook een minder

30

grote invloed op de vergelijking dan de lokaties (lagere F ratio). De datum zou als een herhaling van een meting beschouwd kunnen worden. Om een goede tijdreeks te krijgen moeten er ongeveer 50 metingen gedaan worden voor 66n lokatie. Bij dit onderzoek zijn er hooguit 8 a 9 metingen per lokatie. Omdat er geen interaktie bestaat tussen de factoren mogen hoofd-effecten van afzonderlijke factoren bekeken worden. Uit de hoofd-effecten van de tweeweg anova is af te leiden dat de lokaties en datum significant verschillen (P<5%) en dat de methoden niet significant verschillen. Daarnaast zijn de drie factoren gezamenlijk getest (drieweg anova zonder interaktie) en naar de hoofdeffecten gekeken. De uitkomst van deze test staat in tabel 10 Tabel 10.

Uitkomst drie-weg anova methode, lokatie en datum. DRIEWEG ANOVA LOKATIE/METHODE/DATUM F ratio

F prob

LOKATIE

10.032

0

METHODE

0.684

0.410

DATUM

2.148

0.030

hoofd-effecten

Uit de tabel volgt dat de lokaties en de data verschillen, maar dat de methoden te vergelijken zijn. De kans dat de methoden gelijk zijn is 41%. Hiermee wordt de nulhypothese geaccepteerd. Bij de drieweg anova worden eventuele verschillen niet meer gemaskeerd door de verschillen tussen de lokaties. De factoren die van invloed kunnen zijn, zoals lokatie en datum, worden bij de variantie-analyse afzonderlijk beschouwd op hun effect. De conclusie is dan ook dat de chlorofyl-a bepaling volgens de pigmentanalyse te vergelijken is met de NEN 6520 en dat de pigmentanalyse de NEN 6520 zou kunnen vervangen. Hierbij wel de aantekening dat de resultaten van de pigmentanalyse vermenigvuldigd zijn met de factor 2.5 (zie 2.4.4.2).

31

3.4

DE PIGMENTANALYSE VERGELEKEN ALGENDETERMINATIES

MET DE MICROSCOPISCHE

3.4.1

Voor- en nadelen van de pigmentanalyse en de microscopische algendeterminaties

De microscopische algendeterminaties (tellingen) hebben een aantal nadelen. Ten eerste is de methode subjectief, de interpretatie van een monster is in grote mate persoonsafhankelijk. Het is soms moeilijk te bepalen in welke groep een alg thuis hoort. Verder is de methode arbeidsintensief; er wordt 1 xh uur uitgetrokken om een monster te determineren. Ook is het moeilijk om een monster representatief te krijgen, omdat er met een klein volume wordt gewerkt. Omdat de steekproef relatief klein (n = 100) is, is er een grote relatieve spreiding. Hoe groter de steekproef, hoe kleiner de relatieve spreiding. Een voordeel van de tellingen is: doordat een monster bekeken wordt, men weet welke soorten er aanwezig zijn en de soortenkennis wordt op deze manier bijgehouden. Binnen een algentaxon, zelfs binnen een geslacht, is er een grote variatie in de afmetingen. De hoeveelheid pigment varieert daarom dus ook binnen een algentaxon en/of geslacht. Hier zit een groot verschil tussen de pigmentanalyse en de tellingen. De resultaten van de pigmentanalyse zijn gebaseerd op concentratie specifiek pigment en de resultaten van de tellingen zijn gebaseerd op aantallen. De spreiding van de pigmentanalyse voor de concentraties is veel kleiner, ± 1 0 % , dan de spreiding van de tellingen. 3.4.2

Staafdiagrammen

De resultaten staan in de bijlage 7.1 en 7.2. De resultaten zijn in staafdiagrammen grafische weergegeven om een beter visueel beeld te krijgen (bijlage 8). Bij het bestuderen van de diagrammen vallen een aantal dingen op. Bij een aantal lokaties komen de resultaten aardig overeen. Deze lokaties zijn: BSLUIS, E 129, HVSLUIS, KEI, VEL 8, VZ 2, VZ 7, WOL 6 en ZM 15. Bij een aantal lokaties komen er 1 of 2 uitschieters voor. Na bestudering blijkt dat deze uitschieters een chlorofyl-a gehalte, bepaald met de pigmentanalyse, lager dan 10 Mg/1 hebben. Deze lokaties zijn: EYS, IJ 23, K 12, LOB, M 107 en M 111. Deze uitschieters zijn apart in een grafiek weergegeven (bijlage 9). Opvallend aan deze uitschieters is dat bijvoorbeeld de een groep algen bij de ene methode dominant aanwezig is en bij de andere methode veel minder of helemaal niet, bijvoorbeeld EYS (23-06) en M i l l (23-07). Dan zijn er nog twee lokaties over: G 125 en UM 141. Bij deze twee lokaties zijn de blauwwieren bij de tellingen systematisch hoger dan bij de pigmentanalyse. De conclusies die uit de grafieken getrokken kunnen worden zijn beperkt. Visueel lijken de resultaten voor een aantal lokaties aardig op elkaar, maar voor een aantal ook niet.

32

3.4.3

Statistische vergelijking

Om een uitspraak te kunnen doen over de vergelijkbaarheid van de pigmentanalyse en de tellingen, is er geprobeerd om met een statistische toets te testen of de methoden te vergelijken zijn of niet. Eerst zijn de resultaten getest of ze wel een normale verdeling volgen. De algen zijn per groep (groenwieren, blauwwieren, diatomeeen en overige algen) getest. De conclusie van de test is dat de resultaten niet normaal verdeeld zijn. Daarom zijn de resultaten getest met een niet-parametrische toets: de Wilcoxon signed rank test (per groep) Het uitgangspunt van deze toets is om te kijken hoe groot de kans is dat de twee series waarnemingen uit dezelfde verdeling komen. Als de kans kleiner dan 5% is dan is dat zeer onwaarschijnlijk en zijn de verdelingen niet gelijk. Bij de klassieke t-toets wordt veel meer informatie gebruikt, daar wordt ook de waarde van de waarneming betrokken in de berekening. De Wilcoxon signed rank test kijkt alleen naar het verschil tussen de waarden en niet naar de waarden zelf. Door te kijken hoe groot het positieve en het negatieve verschil is, kan afgeleid worden welke methode altijd hoger of lager scoort. De uitkomst van deze test: voor alle groepen geldt dat de kans kleiner dan 5 % is en dat de diatomeeen en de overige algen hoger scoren bij de pigmentanalyse en de groenwieren en blauwwieren hoger scoren bij de microscoop. De conclusie is dan ook dat de procentuele algensamenstelling bepaald met de pigmentanalyse niet gelijk is aan de microscopische algentellingen. Omdat deze test alleen naar het verschil kijkt van de percentages, is het de vraag of er aan de uitkomst van deze test grote waarde gehecht moet worden. Er wordt bij deze test geen rekening gehouden met de spreiding van de pigmentanalyse en de spreiding van de algentellingen. Niet alleen tussen de pigmentanalyse en de tellingen treden verschillen op, maar ook tussen algentellingen kunnen grote verschillen optreden. Dit blijkt uit ringonderzoeken en vergelijking van analisten (persoonlijke mededeling: A. de Hoog). De conclusie dat de methoden niet vergelijkbaar zijn is niet alleen met deze test bepaald. Er is ook lineaire regressie toegepast (per algen groep) en de uitkomsten zijn overeenkomstig met de uitkomsten van de Wilcoxon signed rank test. Met de lineaire regressie is hooguit aangetoond dat er een zeker positief verband aanwezig is voor de methoden.

33

3.4.4

Relatieve spreiding tellingen

De microscopische algendeterminaties (abundantie) hebben een zeer grote relatieve spreiding. Geillustreerd met berekening:

w=p±\i

w =

P = M

=

n =

(10)

PJIOO-P)

n

\

werkelijk te verwachten percentage percentage in de steekproef factor afhankelijk van de gewenste betrouwbaarheid de steekproefgrootte

Met deze formule kan het werkelijk te verwachten percentage berekend worden met een betrouwbaarheid van 95%. Als er bijvoorbeeld 4 blauwwieren in een abundantie telling (n = 100) worden geteld dan ligt het werkelijk te verwachten percentage tussen de 0.1% en de 7.9%. Dit geeft een relatieve spreiding van 98%. Hieruit is op te maken dat de tellingen een zeer grote relatieve spreiding hebben ten opzichte van de pigmentanalyse. Vooral bij lage aantallen algen. Tabel 11.

De relatieve spreiding bij een bepaald percentage met een steekproefgrootte van n = 100.

percentage in steekproef)

relatieve spreiding

1 5 10 25 50 75 99

199 87 60 35 20 12 1.1.

Er zit een groot verschil tussen de pigmentanalyse en de tellingen. De resultaten van de pigmentanalyse zijn gebaseerd op concentratie specifiek pigment en de resultaten van de tellingen zijn gebaseerd op aantallen. De hoeveelheid pigment is een fundamenteel een betere maat dan aantallen algen, die zeer verschillende afmetingen kunnen hebben. Bij de tellingen wordt e£n kleine groenwier even zwaar gerekend als een grote groenwier. Zodra de concentraties specifiek pigment wordt omgerekend naar procenten wordt de 34

ratio chlorofyl-a/specifiek pigment geintroduceerd. Deze ratio is niet constant en daarmee een onzekere variantie toegevoegd. Om de pigmentanalyse te vergelijken met de tellingen zou de concentratie specifiek pigment naast de tellingen bekeken moeten worden. Hiermee is de vertaalslag naar procenten verdwenen en daarmee de resultaten van de pigmentanalyse betrouwbaarder. Een betere vergelijking van de pigmentanalyse met de microscopische algendeterminaties zou de vergelijking van de concentraties pigmenten bepaald met de pigmentanalyse met het biovolume van het fytoplanktonmonster zijn. Dit is in eerste instantie ook de bedoeling geweest. Maar omdat de gegevens van het biovolume niet aanwezig waren, is deze vergelijking niet gemaakt.

35

4

CONCLUSIES

Uit dit onderzoek zijn twee belangrijke conclusies te trekken: - De pigmentanalyse geeft vergelijkbare resultaten als de NEN 6520 voor de chlorofyl-a gehalten. Hieruit kan worden geconcludeerd dat de pigmentanalyse in principe de NEN 6520 kan vervangen. Een aan tekening hierbij is dat de concentratie chlorofyl-a bepaald met de pigmentanalyse vermenigvuldigt is met een factor 2,5. - De procentuele algensamenstelling bepaald met de pigmentanalyse is statistisch niet te vergelijken met de procentuele algensamenstelling bepaald met de microscopische algendeterminaties. Vergelijking pigmentanalyse met de NEN 6520: - De pigmentanalyse geeft de werkelijke hoeveelheid chlorofyl-a. Andere pigmenten, die ook absorberen bij 666 nm, worden met de pigmentanalyse gescheiden. De NEN een te hoge waarde, als er veel afbraakprodukten (chlorofylide) aanwezig zijn Vergelijking pigmentanalyse met de microscopische algentellingen: - Door de resultaten grafisch weer te geven, wordt er een globaal beeld gevormd hoe de resultaten zich tot elkaar verhouden. Hiermee worden uitschieters snel gesignaleerd. Over het algemeen komen de resultaten van de pigmentanalyse aardig overeen met de resultaten van de algentellingen. Experimenten: - De herhaalbaarheid van de injectie is hoog. De spreiding van de resultaten voor het piekoppervlak ligt tussen de 3% en 7% en voor de piekhoogte tussen de 2% en 5%. - De herhaalbaarheid van de methode is zeer goed. Voor het piekoppervlak ligt de relatieve spreiding rond de 10% en voor de piekhoogte rond de 6%. - Een extract kan maximaal 3 dagen bewaard worden. - Er is geen duidelijke achteruitgang van de filters waarneembaar als deze 10 weken bij -20°C bewaard worden. - Het bewaren van de filters bij -20°Cof -70°C maakt weinig verschil. Het is aan te bevelen, als de filters langere tijd bewaard moeten worden, ze op te slaan bij -70°C.

36

5

AANBEVELINGEN

Algemene aanbeveling: - Bij zeer lage concentraties, bijvoorbeeld Lobith, is 1 liter oppervlaktewater te weinig om de pigmentanalyse uit te voeren. Om dit probleem te ondervangen zou voor de pigmentanalyse evenveel oppervlaktewater bemonsterd moeten worden als voor de NEN 6520, namelijk 2 liter. Vergelijking pigmentanalyse met de NEN 6520: - De geintroduceerde factor 2,5 zou bij vervolg van het project gecontroleerd moeten worden op de juistheid van de factor. Dit kan worden uitgevoerd door chlorofyl-a, dat over de kolom geweest is, dus zuivere chlorofyl-a, op te vangen en de factor te te berekenen, door het eluaat te meten door een spectrofotometer en vervolgens nog een keer te injecteren over de kolom. Als de factor dan nogmaals gevonden wordt, vindt er omzetting of afbraak plaats in het systeem ( de analytische kolom). Wordt de factor niet nogmaals gevonden dan betekent dit waarschijnlijk dat de uitgangsstof chlorofyl-a niet zuiver was. - De detectiegrens van chlorofyl-a is niet precies bekend. Dit zou bepaald kunnen worden bij een vervolgonderzoek. Een voorstel is om dit te bepalen volgens: Standaard aanwijzing voor het opstellen van analyse karakteristieken van chemische parameters (Detectie Limiet Methode), SA 8141. Vergelijking pigmentanalyse met de algentellingen: - De vertaalslag van concentratie specifiek pigment naar procenten brengt een bepaalde onzekerheid met zich mee, omdat de ratio chlorofyl-a/specifiek pigment niet constant is. Daarom zou de concentratie specifiek pigment met de tellingen vergeleken kunnen worden. Als met de tellingen het aantal groenwieren toeneemt, neemt dan ook de concentratie chlorofyl-b toe? Deze vergelijking zou kunnen gebeuren met de dataset van dit onderzoek. - Een betere vergelijking van de pigmentanalyse met de microscopische algendeterminaties is de vergelijking van de pigmentanalyse met het biovolume van de monsters. Dit is in dit onderzoek niet gebeurd omdat de gegevens van het biovolume nog niet aanwezig waren. Dit kan alsnog gebeuren met de aanwezige dataset, als het biovolume van de monsters aanwezig zijn.

37

LITERATUURLUST Bepaling van de procentuele fytoplankton samenstelling met behulp van algenpigmenten. Thea Helmerhorst, RIZA werkdocumentnr. 91.146X, augustus 1991. Cursus inleidende statistiek. Hetty Klavers en Hans van Twuiver, RIZA werkdocumentnr. 92.001X, augustus 1992. Experimenten voor de HPLC-analyse van algenpigmenten. Katinka Dorhout, stageverslag RIZA, december 1992. Identificatie en kwantificering van groenwieren, cyanobacteria en diatomeeen met behulp van HPLC-pigmentanalyse. T.H. Helmerhorst, RIZA werkdocumentnr. 89.12IX, november 1989. Laboratorium handleiding voor de analyse van algenpigmenten met HPLC. Thea Helmerhorst, RIZA werkdocumentnr. 91.139X, augustus 1991. Methoden van onderzoek (biz 256-257). M.L. Wijvekate, 1971. Photosynthetic pigments of algae. Kingsley S. Rowan, 1989. RIZA informatieboekje Quantition without calibration curves using high performance liquid chromatography with nondestructive detectors. G. Torsi, G. Chiavari and M.T. Lippolis. LC-GC INTL. vol.5 nr. 1,37-39.

38

7

BULAGEN BIJLAGE 1:

CODES EN LOKATIES MONSTERPUNTEN

40

BIJLAGE 2:

BEREKENING

41

BIJLAGE 3:

TABELLEN

CHLOROFYL-A VOLGENS NEN 6520 . . .

EN FIGUREN

HOREND

BIJ MATERIAAL

EN METHODEN

42

BIJLAGE 4:

TABELLEN EXPERIMENT 2. 4 EN 5

43

BIJLAGE 5:

CHLOROFYL-A

GEHALTE (up/1) BEPAALD

PIGMENTANALYSE

MET DE

EN DE NEN 6520

45

BIJLAGE 6:

GRAFIEKEN PIGMENTANALYSE

BIJLAGE 7: 7.1 7.2 BIJLAGE 8:

PROCENTUELE FYTOPLANKTONSAMENSTELLING .. PIGMENTANALYSE TELLINGEN STAAFDIAGRAMMEN VAN DE PROCENTUELE FYTOPLANKTON-SAMENSTELLING STAAFDIAGRAMMEN PROCENTUELE FYTOPLANKTONSAMENSTELLING MET CHLOROFYL-A GEHALTE <10uG/L

BIJLAGE 9:

BIJLAGE 10:

EN NEN

ARTIKEL UIT GC/LC INTERNATIONAL NR.l G. Torsi et al.

39

46

VOLUME

49 49 52 54

58

5 59

BIJLAGE BSLUIS E 129 EYS G 125 HVSLUIS IJ 23 IJM 141 K 12 KEI LOB

1:

CODES EN LOKAT Bovensluis Eemmeer Eysden Gooimeer Haringvlietsluis IJsselmeer Umeer Ketelmeer Keizersveer Lobith

ONSTERPUNTEN Markermeer Markermeer Nuldemauw Veluwemeer Volkerak-zoommeer (Dintel) Volkerak-zoommeer (Philipsdam) Kreekkrak-zoommeer Wolderwijd Zwarte meer

M 107 M 111 NUL 9 VEL 8 VZ 2 VZ 4 VZ 7 WOL 6 ZM 15

KAARTJE VAN NEDERLAND MET DE LOKATIES

40

BIJLAGE 2:

BEREKENING

CHLOROFYL-A VOLGENS NEN 6520

Gecorrigeerde extinctie onaangezuurd extract: E„ = E, - E,, Gecorrigeerde extinctie aangezuurd extract: Ez = E' x - E' 0 Formule voor het berekenen van het chlorofyl-a gehalte: 296(ElrW

Pchl=-

V

waann: E„ HE\, Eo E'j, E' 0 pch, V0 V, /

is de extinctie bij 750 nm is de extinctie 750 nm is de extinctie is de extinctie is de extinctie is de extinctie is het gehalte is het volume is het volume is de lichtweg

van het onaangezuurde extract, gecorrigeerd voor de extinctie van het aangezuurde extract, gecorrigeerd voor de extinctie bij van van van van aan van van van

het onaangezuurde extract bij 665 nm het onaangezuurde extract bij 750 nm het aangezuurde extract bij 665 nm het aangezuurde extract bij 750 nm chlorofyl-a, in mg/m 3 het gefiltreerde analysemonster, in 1 voor extractie toegevoegde ethanol, in ml de gebruikte cuvet, in mm

100 !7 =° ' 296 8,16//(g*mm) 1,7-1 waarbij: 8,161/(g*mm) de extinctie-coefficient van chlorofyl-a isen de extinctie-coefficienten van chlorofyl-a en feopigment.

41

l,7de verhouding tussen

BIJLAGE 3:

TABELLEN EN FIGUREN EN METHODEN

HOREND

Tabel 1 ml aceton nodig voor extractie met x aantal filters

BIJ MATERIAAL

Ta/je/ 2

Gradient pigmentanalyse

aantal filters

ml aceton

tijd (min)

% eluens B

1

4

0

0

2

5

20

25

3

6

31

80

4

6

35

80

5

7

40

0

6

7

7

8

SPECTRA SPECIFIEKE PIGMENTEN

.

OJM

0.11

•

1

A

:o»

ai

iii

00* locctrum

j". i

chkxofyl-Q

/ /

*!

IM OO!

I

UO

MO

OO

|

1A *'0

S10

9o*l."qt.

MO

WO

UO

0.04

a 0-0«

9p«Ct,l*n ei*»i>>y,-b

,

s o OU OM

• V

Ml

' V 1 V ^—'

0

»>0

»o

/

»o

1

oo

«ro

/

sio

w

I M

HO

•70

qofftenqt* ( n m )

(nm)

Specifiek voor de groenwieren

Alle algen

oo:*

Ml

/ \A

a w

Mtt /

1

/

*

OflU

$

0.000

/

\ \

ji

8

1-

tp«eO"t»jm,foco-ontmn*

%

\

CSV

I 0.004

fp«ft»wm my • o «onlHOryi

/

x-

/

• \

i—\

«

0 UO

MO

OO

CO

310

UO

tMO

^

030

J90

«T0

"! 1

OO

SW

MO

i j o H k n q t * (nm 1

qot(*->qi« ( i m )

Specifiek voor de blauwwieren

Specifiek voor de diatomeeen

42

VK

BIJLAGE 4:

TABELLEN EXPERIMENT 2. 4 EN 5

Tabel bi| experiment 2 Pigment

f-0

tvcomnthine (492 nm)

piek O D D . piek h o o g t e

(mV.) (mV)

123 8.4

mymjanthotrl (511 n m |

piek ooo. piekhoogte

(mVt) (mV)

lutein* (452 nm)

piekopp piek hoogte

zemjmnthlne (452 nm)

t-t

t-2

<-a

•vet-

f-4

Xt-d.

7 3

134 - 3

128 8.7

131 8.8

8 0.33

5 5

87 3

73 28

76 3 1

79

77 3

5 0.13

8 4

(mV.) (mV)

48 1.7

56 i a

56 1 9

60 i a

87 2

7 0.11

12 B

piek O D D . piek hoogte

(mV.) (mV)

87 2.1

71 22

H 22

66 23

72 2.3

3 0.09

4 4

chlorofyl-b (452 nm)

piek o p p . piek h o o g t e

(mV.) (mV)

22 0.5

21 05

20 0 7

2d 0.7

22 0.7

1.5 0.11

7 IB

ctikjrofyl-m (666 nm)

piekopp. piek h o o g t e

(mVs) (mV)

184 8

IM 86

•39 3

172 7 5

150 7.1

19 0.57

11 7

(25-9)

2 (2-10)

3 (9-10)

4 (16-10)

5 (23-10)

6 (30-10)

7 (6-11)

(13-11)

9 (20-11)

10 127-11)

Tabel bij experiment 4 metingen Pigment

1

a

gem.t

%etd.

oscillaxenthine (500 nm)

piek ODD. piek h o o g t e

(mVt) (mV)

587 31

473 23

644 35

621 28

580 28

6'3

838 32

584 30

553 27

107 31

588 1 29 l

9% 11%

tucomnthinm (452 nm)

piek opp. piek h o o g t e

(mV.s) (mV)

44 29

49 26

49 3 2

44 2.3

54 3.4

47 23

49 27

45 2 5

48 2.4

58 2.9

48 l 2.T*

9% 14%

mYdOxmnthotvl (480 nm)

piek ooo piekhoogte

(mV.»| (mV)

KM 28

819 28

965 3-1

968 30

959 30

1013 31

984 33

953 31

848 27

919 31

929 I 302

8% 9%

luteine (450 nm)

piekopp. piek h o o g t e

(mV.t) (mV)

128 4

110 3.4

•29 4 4

138 39

133 4.1

112 34

128 37

12: 3a

91 2 7

107 3 4

1201 3.7 l

12% 13%

ze&xanthine (452 nm)

piek ODD. piek h o o g t e

(mVi)

530 14

487 12

555 15

564 14

574 14

568 14

579 19

549 14

466 12

484 14

9381 14 1

8% 3\

ctitorotyl—a (666 nm)

piek opp. piek h o o g

(mV.»)

1084 48

735 31

1045 42

1205 45

1223 45

997 39

1130 44

1037 39

481 •8

858 37

977 1 38 -

24% 24%

(mV)

(mV)

43

Tabel I: Na drie weken bij - 2 0 gr. C (experiment 5) metingen Pigment oscillaxanthine (500 nm) fucoxanthine

piek O D D . piek hoogte

t - o (mV.t) (mV)

555 31

piekopp

1

2

3

600

604

605

30

28

28

gem

, d

t l O

603 29

3 1

0.4 4

41

44

43

1

piek hoogte

(mV)

2.8

24

42 23

44

(452 nm)

2.3

2.3

0.1

3 3

myxoxanthofyl ( 4 8 0 nm)

piek ooo. piek hoogte

(mVs) (mV)

840 29

887

868

904

29

29

29

880 29

21 0

2 0

luteine ( 4 5 0 nm)

olek O D D . piek hoogte

(mVs) (mV)

125 4

124 3 9

139 39

135

131

6

5

3.9

39

0

0

zeaxanlhine (492 nm)

piek ooo. piek hoogte

(mV.l) (mV)'

528 14

990 14

931 13

585 14

549 14

17 1

3 4

chlorofyl—a ( 8 8 8 nm)

piek O D D . piek hoogte

(mV.s) (mV)

1119

940 40

904 40

939 43

928 41

21 2

2 4

47

Tabel II: Na drie maanden bij - 2 0 gr. C (experiment 5) metingen Pigment

t - 0

1

2

3

gem.

a.d.

%a.d.

553 28

570 29

668 34

598

81

10

30

3

10

id

31 2

33 2

5

14

2 1

29 1 9

0.1

5 10

oscillaxanthine ( 5 0 0 nm)

piek ooo. p i e k hoogte

(mV.s) (mV)

595

fucoxanthine ( 4 5 2 nm)

piek O D D . p i e k hoogte

(mV.l) (mV)

41 2 8

myxoxanthofyl ( 4 8 0 nm)

piek o o o . piek hoogte

(mV.l)

840

773 27

805

79

29

748 26

895

(mV)

31

28

3

9

piek ooo.

(mV.)

125 4

99 2 3

120 35

117 3.6

112 3 3

11 0.4

10 13 2 a

luteine

31

( 4 9 0 nm)

piek hoogte

(raVj

zeaxanth/na ( 4 5 2 nm)

piek ooo. piek hoogte

(mV..|

528 14

485 13

469

9

12

471 14

475

(mV)

13

1

chlorofyl—a (666 nm)

piek O D D . p i e k hoogte

(mV.e) (mV)

1115 47

970 41

1000 42

1180 51

1090 49

114 6

ii 13

Tabel III: Na drie weken bij - 7 0 gr. C (experiment 5) metingen t

Pigment oscillaxanthine (500 nm)

piek O D D . piek hoogte

(mV.e) (mV)

piekoop.

1

2

3

gem.

ad.

%a.d.

555 31

586 29

667

824 28

629 29

36 2

6 5

48 2 4

51 2.8

3 0.4

5 13

35

4 4

" 0

31

(mV.»)

41

p i e k hoogte

(mV)

28

50 3

54

(452 nm) myxoxanthofyl ( 4 8 0 nm)

piekopp. pick hoogte

(mV.t)

840 29

912 29

957 31

889 29

919 30

luteine ( 4 5 0 nm)

piek ODD. piek h o o g t e

(mVi)

125 4

ISO 4 7

•43 4 ?

148 4.3

149 4.6

1

1

02

5

zemxanthine ( 4 5 2 nm)

oiek O D D . piek h o o g t e

(mV.«) (mV)

526 14

590 14

813 19

598 14

600 14

12 1

2 4

chlorofyl—a

piek O D D .

(mV..) (mV)

1119 47

1020 49

958 4!

929 39

969 42

46

5 7

fucoxanthine

( 8 6 6 nm)

piekhoogte

(mV)

<m V)

3

1

3

Tabel IV: Na drie maanden bij - 7 0 gr. C (experiment S) metingen Pigment oscillaxanthine (500 nm) fucoxanthine ( 4 5 2 nm)

piek ooo

t ' O

f

2

3

B«jn.

811 31

597

613 31

17

30

1

2

4 02

12 8

(mVi)

999

p i e k hoogte

(mV)

31

831 31

piek O D D . p i e k hoogte

(mV..) (mV)

41 28

36 24

31 22

39 2 5

36 2.4

piek O D D .

t.d.

Xt.d. 3

848

606

20

29

29

28

810 27

822

p i e k hoogte

(mV.t) (mV)

840

( 4 8 0 nm)

28

1

luteine ( 4 5 0 nm)

piek O P D . piek hoogte

(nV.t) (mV)

129 4

•33 4

•20 3 6

133 4

129 3 9

7 02

8

zeaxanlhine ( 4 9 2 nm)

piek O D D . piek hoogte

(mV.$) (mV)

928 14

52' 13

512 13

512 13

915

5 0

1 0

chlorofyl—a

piek ooo.

(mVi)

1115 47

942

1060

841

948

4!

48

39

42

110 4

12 10

myxoxanthofyl

(886 nm|

p i e k hoogte

(mV)

44

13

3 4

6

CHLOROFYL-A GEHALTE (ue.fi) BEPAALD MENTANALYSE EN DE NEN 6520

BIJLAGE 5 HPLC

NEN

BSLUIS 11/08 08/09

20 16

17 12

EYS 21/07 18/08 01/09 15/09

27 26 14 15

21 17 36 10

HVSLUIS 11/08 24/08 29/09

24 \9 8

16 2^ 7

HPLC

NEN

E 129 13/08 22/10 19/11

90 •71 28

146 52 30

G 125 30/07 27/08 22/09 22/10 19/11

82 89 119 82 73

66 73 91 56 55

U 23 21/07 04/08 18/08 01/09 29/09

103 6 36 33 56

97 126 107 140 56

K 12 25/08 21/09 20/10

26 9 3

18 6 3

LOB 24/06 22/07 19/08 16/09

0 1 19 4

25 17 11 5

I J M 141 30/07 13/08 27/08 03/09 22/09

32 5 22 41 36

31 41 38 32 38

KE] 21/07 04/08 18/08 01/09 15/09

29 19 27 13 24

15 12 15 4 7

M 107 23/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

12 15 27 22 5 28

18 25 20 35 12 15

M 111 23/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

3 23 33 21 14 35

15 71 26 47 44 24

41 7 4>

38 55 51 45

VEL 8 11/08 25/08 08/09 24/09 20/10 03/11 17/11

6 12 22 22 72 35 87

38 42 45 39 55 52 49

VZ4 13/07 06/08 24/08 21/09

30 37 59 44

21 27 35 37

NUL 9 15/07 12/08 28/08 09/09 23/09 07/10 21/10 04/11 18/11 VZ2 13/07 06/08 2-1,08 21/09

29 38 31 35 61 121

4! 44 68 63

37 35 50 58 35

37 23 4! 47

HPLC

* • *

' •

•

45

NEN

VZ7 13/07 06/08 24/08 21/09

39 63 63 34

33 35 57 41

WOL6 15/07 12/08 28/08 09/09 23/09 07/10 04/11 17/11

47 34 20 23 48 44 54 90

33 53 47 48 39 66 58 57

Z M 15 25/08 16 21/09 66 14 20/10

113 48 8

MET DE PIG-

GRAFIEKEN PIGMENTANALYSE EN NEN E 129

BSLUIS

i»/oe

ie/M

G 125

EYS

>

nToT

ia/OS

01/09

»/07

IV09

27/04 .

DATUM •

HPLC

•

17/09

01/10

22/n QATUU HPLC • NEN

"EN

IJ 23

HVSLUIS

IO

03/11

17/11

rt/oi

K 12

IJM U 1 H 22

i.

\^

s 2,0 5

I

' ^

-iT/oi OfllUM

OJTS

21/01

1 »/oe

ZVOr

.

46

DATUM HPLC •

"EH

-

T 20/W

21/09

VZ 7

U/07

o»/oe •

WOL 6

2«/oe

s/07

21/09

DATUM HPLC • HEN

i 2 / o « 2a/oa 09/09 23/09 07/10 o » / n DATUM MPLC •

ZM 15

48

NEN

17/1

BIJLAGE 7:

PROCENTUELE

7.1

PIGMENTANALYSE chla bcr/chla met

BSLUIS 11/08 08/09 E129 13/08 08/10 22/10 05/11 19/11 EYS 23/06 21/07 04/08 18/08 01/09 15/09

%groen

FYTOPLANKTONSAMENSTELLING

%blauw

%diat

%overig

1.3

23

15

63

0

0.9

27

19

47

7

0.8

o,s

0.6

13 9 5

1.8 1.1

11 28

57 49 43 54 38

6 17 13 35 34

24 25 39 0 o

1.9 0.9 1.7 0.7

0 56 87

100 30 13

14

1.0 0.7

0

0 o 0 0

25 44 43

0

o 0

44 56 27

31

3

39 65 58

0 .30

G125 30/07 27/08 22/09 22/10 19/11

0.6 03 0.4 0.6 0.7

5 4 7

27 19 26 39 38

HVSLUIS 11/08 24/08 29/09

0.8 0.6 0.5

43 16 31

2 0 11

30 44 8

25 40 50

0.5 3.0 0.96 0.9 0.9 0.6

32 21 34 36 53 22

3 10 18 19 IS 7

14 69

51

UM141 30/07 13/08 27/08 03/09 22/09

0.4 1.6 0.6 0.5 OJ

21

7

27 26 18 20

0 2 22 28

K12 25/08 21/09 20/10

0.6 0.6 IJ

16 31 81

U23 21/07 04/08 18/08 01/09 15/09 29/09

31

3

-

13 11 17 27

44 30 18 32

o

0 0

49

41

29

0 4 15 12 39

10 73 31 10 6

62 0 41

42 31

42 38

19

0

50 46

•

KEI 21/07 04/08 04/08 18/08 01/09 15/09 29/09

0.6 0.8 0.8 0.6 0.6 0.5 1.0

27 37 45 2'.' 32 25 33

8 0 0 0 0 0 31

21 43 36 34 32 29 36

44 20 20 37 36 46 0

LOB 22/07 19/08 16/09

0.7 0.6 1.3

0 23 54

0 0 0

100 64 46

0 13

M107 23/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

0.7 0.6 0.3 0.8 1.6 0.5

47 41 19 52 61 36

8 12 4 0 20 11

13 11 7 30 18 5

31 36 69 18 0 48

Mill 23/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

1.2 1.1 0 4 0.9 0.8 0.5

39 41 31 40 39 33

0 0 5 17 9 8

61 59 38 31 5

0 0 58 6 21 54

NUL9 15/07 12/08 28/08 09/09 23/09 07/10 21/10 04/11 18/11

0.5 IS 0.6 0.8 0.8 0.8 0.9 0.9 0.7

34 22 36 33 28 44 17 9 6

1 o 6 28 45 27 73 77 60

12 78 21 19 7 7 3 3 3

53 0 37 19 20 22 7 11 31

VEL8 11/08 25/08 08/09 24/09 20/10 03/11 17/11

2.2 1.2 1.3 2.3 1.4 2.7 1.3

43 38 24 7 8 7 4

38 46 70 91 92 89 93

19 16 6 2 0 5 3

0 0 0 o

VZ2 13/07 06/08 24/08 21/09

0.7 0.4 0.3 05

8 18 11 8

0 7 11 6

64 14 12 34

28 61 66 52

VZ4 13/07 06/08 24/08 21/09

05 0.4 0.3 0.4

6 19 9 11

0 8 11 11

47 12 1? 1?

48 62 67 64

Cl

50

o

o 0 0

VZ7 13/07 06/08 06/08 24/08 21/09

1

29 11 11 7 21

SO 69 48

8

56

19

8 6

5 16 24 46 51 73 89 69

7 3 3

51 18 7 20 0 0 22

30 28 35

66 9 18

4 33 17

0 29 30

05 0.3 0.5 0.3 0.5

21 11 27 10 15

0 9 14 14

WOL6 15/07 12/08 28/08 09.09 23/09 07/10 04/11 17/11

0.4 0.5 0.8 0.9 0.8 1.1 1.1 0.8

31 14 33 32 24 20

ZM 15 25/08 21/09 20/10

3.0 0.7 0.7

11

24 15

5

51

68 52

7.2

TELLINGEN %diat

%overig

%groen

%blauw

BSLUIS 11/08 08/09

20 28

1 4

65 42

14 26

E129 22/10 19/11

18 13

61 59

9 16

12 12

40

37 39

1 0 0 3 1 14

33 19 36 41 51 28

26 26 27 3 12 14

7 2 1 2 6

91 86 91 91 69

1 8 6 3 16

1 4 2 4 9

30

43

57 43

49 55 60 37 32 29

10 1 7 14 10 24

6 1 2 0 I 4

UM141 30/07 27/08 03/09 22/09

48 52 22 32

35 28 66 35

3 7 4 1

14 13 8 32

K12 25/08 21/09 20/10

17 13 18

6 6 11

59 42 24

IS 39 47

KEI 21/07 04 08 18/08 01/09 15/09

20 32 45 46 33

3 3 3 2 1

19 31 35 19

58

LOB 22/07 19/08 16/09

5 16 20

3 1 0

76 66

EYS 23/06 21/07 04/08 18/08 01/09 15/09 G125 30/07 27/08 22/09 22/10 19/11

55 37

53

HVSLUIS 11/08

22

U23 21/07

35

04/08 18/08 01/09 15/09 29/09

43 31

49

25

44

52

34 17 33 41

16 17 36

M107 23/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

45 51 40 61 46 36

31 28 41 26 29 32

4 4 5 9 4 0

20 17 14 4 21 32

Mill 13/07 06/08 20/08 03/09 17/09 01/10

49 58 60 69 65 25

15 25 20 24 15 64

0 3 3 3 9 1

36 14 17 4 11 10

VEL8 11/08 25/08 08/09 24/09 20/10 03/11 17/11

53 35 41 18 14 20 10

38 53 55 78 78 75 79

7 7 3 0 5 3 4

3 5 0 4 3 2 7

VZ2 13/07 24/08 21/09

13 15 13

4 30 53

57 15 23

26 35 11

30 15

n

4 38 42

32 26 25

34 19 18

WOL6 15/07 12/08 28/08 09/09 23/09 07/10 04/11 17/11

77 52 26 42 26 34 26 13

13 32 61 34 59 60 70 80

6 12 8 23 10 3 1

4 4 5 1 5 2 4 7

Z M 15 25/08 21/09 20/10

11 27 25

66 16 26

18 40 16

VZ7 13/07 24/08 21/09

o

Dc resultaten van NUL 9 en VZ 4 ontbreken.

53

5 17 33

BIJLAGE 8:

STAAFDIAGRAMMEN VAN DE PROCENTUELE FYTOPLANKTONSAMENSTELLING BSLUIS

E129

EYS

EYS

)

f B

|»—f

rt-\C 1\X 2?/0«

r»\C >XL **>\C TH 22/« U/*0 0*ruy

ty/sl

»IIO"ll*

CJC-3 •W."** a***"

HVSLUIS

G125

»•« *L X/07

GSJ k-M***V«n

rtr\C TO. H/M *m

54

S5£3 o-wji-we*^

"/oe OATUU g ^ wwn • • •

E S I •-*>»• «

IJ23

IJ23

'V •»•"

K12

IJM 14 1

«W» | ynrmmim,

-"2,/o.^^Svo.-

"""W

(22

P ^ l b*w«W«i

LOB

KEI

•-R.C

TO.

-«.C

04/e-i

i«/o« twruu

C^?S B*J1

P//23 «

55

M107

M107

M111

M111

»/oe ' r-_J h«v—<w

"_J

r w ^ H

(%?-?• +*mwr-mm*

E 3

VEL8

VEL8

Fl??] b l » W > T —

P7S1 bksmrmm.

QZSI * * * V

*?•"

56

<*•!•'>——

CZSJ M *

»Srt

VZ2

VZ7

"st. a/v to.

"PLC

,„„,

TO.

DATUM

S H rm*. m~~

W0L6

W0L6

I I/O. 1

fcHw-ww

OAIVM E7T51 J w l , " • • • .

fWI «

ZM15

57

BIJLAGE 9:

STAAFDIAGRAMMEN PROCENTUELE FYTOPLANKTONSAMENSTELLING MET CHLOROFYL-A GEHALTE <10tfG/L

CHLOROFYL-A < 10 G/L

CHLOROFYL-A < 10

58

G/L

BIJLAGE

10:

ARTIKEL

UIT G C / L C INTERNATIONAL

VOLUME

5 NR.l

Quantitation without Calibration Curves Using High Performance Liquid Chromatography with Nondestructive Detectors

Q UV-vis detectors were used to determine the absolute quantitative value ol an analyte using high pedormance liquid chromatography without resorting to a specilic calibration. The method allows the calculation ol the number of moles ol an analyte present relative to a peak using the area ol the peak, the molar absorptivity, the How rate, and the pathlength ol the cell. 01 the live commercially available instruments that wete used in the study, lour gave results that were in agreement with the model presented.

uantitation of any analyte in high performance liquid chromatography (HPLC) is usually obtained from a calibration curve or other methods that rely on the use of standard materials. It has been shown, however, that it is possible to make absolute quantitative analyses using nondestructive detectors: that is. to give the absolute number of moles (/V0) passed through a detector when certain experimental conditions are met (1.2). The theoretical treatment and the validation of the model have been made for UV-vis detectors, and its extension to other detectors is generally very simple.

Because this is an absolute method, many parameters in the instrument must be carefully controlled or the systematic errors that the instrument can introduce will be transferred to the final results, which is not the case with a calibration curve. For this reason, such calibrations in present-day commercial instruments are often not easy to make. M B The final equation in this article is not new and can be found in a number of articles and books. A possible reason why it has never been used can be found in its derivation. This equation is always associated with Gaussian peaks, thus giving the incorrect impression G. Torsi, G. Chiavari, and M.T. Llppolis that the method is only applicable with GaussDepartment ol Chemistry G. Ciamician, Via F. ian peaks. However, this is not true, and in Selmi 2, 40126 Bologna, Italy practice, the area of a peak is used almost universally as a measure of the quantity of the .address correspondence to G. Torsi. analyte that has been injected with the proportionality constant independent of the peak shape.

LC-OC INTL. H X i H O I

37

This article is intended to show that it is possible to identify a substance and to calculate
This article was developed because of the inquiries about the proposed method from a number of researchers and also as a result of a series of articles (see references in reference 3) about automatic qualitative analysis us-ing LC and gas chromatography with UVvis diode-array detectors (4). Most of what THE MODEL has been suggested in mese articles has been The Lambert-Beer law for nonhomogeneous implemented in a commercially available sys- systems is the starting equation. In a typical tem (5). With this system it is possible to UV-vis cell (Figure I) used in an HPLC deguess, with a given level of certainty, what tector, the concentration of the analyte is not type of substance is giving rise to a particu- always constant along the light beam. Therelar peak in a chromatogram in a way similar fore, the absorbance (A) can be more convento other spectroscopic techniques. If factor iently expressed in terms of the number of analysis is used (6). unresolved peaks can be moles per square centimetre (/V). In addition treated in such a way that the overlapping to assumptions pertinent to the Lambert-Beer peaks can be analysed and the components law, a new assumption must be introduced separated for a qualitative and quantitative for the validity of this equation. The assumpanalysis without resorting to better, but often tion is that the solution is homogeneous in the difficult, chromatographic separations.

59

38

10GC INTL. VOL. S NO I

TABLE 1:

Spectroscopic Characteristics of Toluene, p-Nltroanillne, and Potassium Chromate

Soiunon

Toluene

Opncl J

Y• u;

Mem

c (cm: x 10"a)

Potassium Chromate

p-Nltroanillne 228 5.50

7.20

373

376 15.6

4.82

\SoluHon out

I

TABLE II: Technical Data abo t the Instruments

Figure 1: Diagram showing the geometry o l a Z cell.

Varian 2550

planes perpendicular to the light beam. Taking into account that both A and iV are timedependent functions, it is possible to express their relationship as (8) A, = KPejV,

• ,V, = l/ScjSr *,_, di'

[2]

where S, and /?( are the functions that express die number of moles entering and leaving the cell, respectively, per unit of time, t' is the dummy variable, and Sc is the cross section of the cell (measured in cm : ) (8.9). The integral of equation 2. from 0 to =•=. gives

\R,dt

[3]

or

[N,dt

= N0r,ISz

[4]

where xr is the average time spent by one mole of the analyte in the light beam (measured in min). N, can be expressed through equation 1. thus obtaining

i

N,dt = (l/lCPejJA, dt = (l/10 3 e)A; [5] or A, = 103ejV0 r r /5 c

[6]

where A, can also be expressed as the product of A and time (measured in min). If F and 5C are constant. Tr can be expressed by the ratio between the volume of the cell (V. measured in cm3) and F. V can be expressed by multiplying 5C by /. Thus, the final equation becomes A/

= I03e//V0

8 ±2 ±0.3 D, lamp

5 ±1 ±0.5 Djlamp

8

4.5

9.96

9.85

10

10

HewlettPackard HP 1090

4 t1

D, lamp

4.5 5.9 5

Jasco 875 UV

8 ±2 ±0.3 D2 lamp

Waters Lambda Max Model 481

5 ±2 ±0.5 D2 lamp

8

14

9.68

10.1

10

10

[l]

iV, can be expressed through a convolution integral of the type

[ N,dt = l/sjs,dt

Spectral bandwidth (nm) Wavelength accuracy (nm) Wavelength reproducibility (nm) Light source Nominal flow cell volume (|iL) Measured pathlength (nm) Nominal pathlength (nm)

Perkin-Elmer LC-95

[7]

All the components in equation 7 can be checked easily.

The validity of equation 7 has been checked using three analytes and five commercial HPLC instruments. One analyte, potassium chromate. was chosen because it is used as a standard in many spectroscopic calibrations. The other two analytes chosen were pnitroaniline and toluene. Their choice was based on the wavelength of their peaks (in order to span the 200-400 nm interval), the width of their absorption bands, and their chromatographic characteristics. The HPLC instruments used in the experiment were those that were readily available: a model 2550 (Varian Analytical Instruments, Walnut Creek. California, USA); a model LC-95 (Perkin-Elmer, Norwalk. Connecticut. USA): a model 1090 with photodiode-array detector (HewlettPackard. Waldbronn. FRG); a model 875 UV (Jasco. Tokyo. Japan); and a model 481 Lambda Max (Waters Chromatography, Milford, Massachusetts. USA). EXPERIMENTAL

The first point is of paramount importance because it gives an indication of the spectrometer's performance, e and the linearity of the plot are linked to the spectral bandwidth of the instrument. Ideally, the instrument's spectral bandwidth should be a tenth of the analyte bandwidth (11-13). If this is the case, e must coincide with the value in the literature (if available). The spectral bandwidth was not low. given the small cell volume (in order to reduce unwanted integration effects) and cross section (to increase the sensitivity). This can be seen in Table II. Another problem is the variation of the refractive index with concentration gradient present during the chromatography. This effect can either increase or decrease the absorption of light if the beam is not perfectly parallel (14). The analyst must be aware of these problems even if. in practice, little can be done to correct them when the best optical setup has been achieved. The details for the calibrations described above have been published (1.2), and it is hoped that in future they will be performed automatically together with a control of the absorbance.

The significant characteristics of the analytes are summarized in Table I. and the main features of the commercial instruments used in the tests are shown in Table II. The calibrations made on the instruments before each series of measurements were to check • the linear relationship between A and the RESULTS AND DISCUSSION The results are presented in Figure 2. The quantity of the analyte; • /. taking the value of e from the literature number of moles calculated according to equain the case of chromate (10). or measured tion 7 are plotted against the number of with a UV-vis spectrometer with a 2-nm moles injected. Perfect agreement with the theory is represented by a straight line of slope passband for p-nitroaniline and toluene; • the proportionality between A and the direct 1. All analytes should give experimental current output of the amplifier being fed to points on the same line, and no influence of wavelength, volume injected, and F should the integrator: • the correction factor required to express the be apparent. The results show that this aspeak area as Aj. from the data given by the sumption is valid for the wavelengths used. Only one F and one injection volume have integrator or the computer, been used in all the experiments presented • F: and • the voiume effectively injected.

60

LC-OC INTL. VOL 5 NO I

39

•yjlel te. Jtfl-^L-ij

•]

|e)

u.

/// ///

- , 20

< -

20

/// s/f /

M

/

/

•

•

_ ->

m

a a I 10

c

I -

LU

10

# ' ^

/ 10

20

0

NumDer ol moles injected (NJ

10 20 Number ol moles injected (NJ

10 20 Number ol moles injected (NJ

id) 20

•

10

• '

i

. / .'-

• 10

20

0

Number ol moles injected (NJ

5

10

15

Number of moles injected (NJ

Figure 2: Graphs showing the experimentally calculated values of N plotted against W0 for the five instruments tested: (a) model 2550, (b) model LC-95, (c) model 1090, (d) model 875 UV, and (e) model 481 Lambda Max. • = Potassium chromate, Q = p-nitroaniline at 376 nm, A = p-nitroaniline at 228 nm, ^ = toluene. Dashed line of slope 1 shows perfect agreement with the theory.

here because it has already been shown that these two parameters have little, or no. influence on the final results (1). It can be seen that three out of five instruments give results that are in almost perfect agreement with the theory, but two have a systematic error of approximately 20%. The results from the model 2550 were obtained on two instruments located in different laboratories. There has not been a detailed investigation of this error because the possible causes are numerous and difficult to pinpoint. Recently, however, after changing the lamp and the cell, one of the two model 2550 instruments used has given results that are in agreement with the theory, thus confirming previous observations that the optical arrangement is of paramount importance. Another of the instruments with this error is the model 481 Lambda Max. which has a cell with a variable cross section that is assumed to be constant in the modei. The manufacturer was asked to comment on the error. They found the positive deviation from the normally expected linear response unusual. They also suggested that inaccurate electronic or optical calibration were possible causes. For example, the model 2550 performed well when the deuterium (DO lamp was changed. The company also felt that a negative response would have been easier to explain. The detector

model on which the evaluation was carried out was replaced several years ago. and the manufacturer suggests trying the same methods on one of the newer models. CONCLUSION

From the data presented, it can be concluded that by carefully choosing the instrument used, it is possible to calculate the total number of moles passed through a UV-vis detector. Also, a quantitative analysis can be obtained in the case of a diode-array detector, in which the qualitative analysis has already been implemented, by inputting / into the computer as a constant and F for a specific experiment. If variable-wavelength detectors are used and the identity of the peak is already known through its retention time, or it is derived through capacity factors, similar methods can be devised. ACKNOWLEDGEMENT The authors would like to thank CNR (Centro Nazionale deile Ricerche — Contributo n. 89.03539.03) for their financial support. REFERENCES (1) O. Torsi. G. Chiavari. C. Laghi. A.M. Asmundsdoitir. F. Fagioli. and R. Vecchietn. J. Chromawgr. 492. 207 (1989). (2) G. Torsi. G. Chiavin. C. Laghi. and A.M. Asmundsdoitir. J. Chromatogr. in press.

61

(3) K. Jinno. M. Hayashida. and T. Wannabe. J. Chromaio%r. JW. 28. 367 (1990). (4) V. Lagesson and J.M. Newman. Anal. Chem. 6 1 , 1249(1989). (5) A. Cole. Int. Lab. 20(4). 33 (1990). (6) R. Aries. D. Lidiard. and R. Spragg. Spectroscopy Int. 2(3). 41 (1990). (7) E.V Dose and G. Guiochon. Anal. Chem. 61, 2571 (1989). (8) S.L. Paveri-Fontana. G. Tessari. and G. Torsi. Anal. Chem. 46. 1032 (1974). (9) M.G.T. van der Broek and L. de Galan. Anal. Chem. 49. 2176(1977). (10) R.W Burke. E.R. Deardogg. and O. Menis. J. Res. Natl. Bur. Stand. 76A, 469 (1972). (11) A. KnowlesandC. Burgess. Eds.. Practical Absorption Spectrometry (Chapman and Hall. London. 1964). (12) F.C. Strong. III. Anal. Chem. 48. 2155 (1976). (13) J.R. Edisbury. Practical Hints on Absorption Spectrometry (Hilger. London. 19661. (14) K. Peck and M.D. Morris. J- Chromaio%r. 448. 193(1988). •

We value your opinion. You can attract the editor's attention by noting your opinions about this article on the Reader Service card. e I found this article very useful Cltcle 184: useful Cltcle 185, not useful Circle 186

• I'd like to read more on this topic Cltcle 187 * I'd like to wnte about this topic Cltcle 188