Rezisztenciagénekkel kapcsolt DNS-markerek azonosítása szőlőben
Diplomamunka
Készítette: Takács Attila biológus hallgató
Témavezető: Dr. Putnoky Péter PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2006.
1
TARTALOMJEGYZÉK
BEVEZETÉS
3
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
4
1. 1. Mikrobiális kórokozók
4
1. 1. 1. A lisztharmat
4
1. 1. 2. A peronoszpóra
5
1. 2. DNS markerek a genetikai térképezésben 1. 2. 1. RFLP markerek
9 9
1. 2. 2. RAPD és SCAR markerek
10
1. 2. 3. AFLP markerek
11
1. 3. A szőlő genetikai térképe
11
1. 3. 1. Lisztharmat rezisztencia
12
1. 3. 2. Peronoszpóra rezisztencia
13
2. ELŐZMÉNYEK
14
3. CÉLKITŰZÉSEK
16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
17
4. 1. Szőlő DNS izolálása
17
4. 1. 1. Nagy mennyiségű DNS izolálása
17
4. 1. 2. Kis mennyiségű DNS izolálása
18
4. 2. A DNS minőségének ellenőrzése
18
4. 3. A PCR reakció
19
4. 4. Gélelektroforézis
20
5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
21
5. 1. Csoportszegregációs analízis RAPD segítségével
21
5. 2. Lisztharmat rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD markerek
23
5. 3. Peronoszpóra rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD marker jellemzése
24
5. 4. Lisztharmat és peronoszpóra rezisztencia vizsgálata primer párokkal
28
6. ÖSSZEFOGLALÁS
32
7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK
33
KÖSZÖNETNYILYÁNÍTÁS
35
2
BEVEZETÉS A szőlő az emberiség egyik legrégebbi és legfontosabb kultúrnövénye, ezáltal történetének hű kísérője. Élvezi a világ nagy vallásainak tiszteletét. Széles körű, sokoldalú felhasználhatóságát gazdag fajtaválasztéka és rendkívüli változatossága teszi lehetővé. A szőlő- és bortermelés természetesen elsősorban gazdasági tevékenység. Ennél azonban többről van szó, mivel a szőlő és a bor a társadalomban nemcsak gazdasági, hanem kulturális és civilizációs szerepet is betölt. A szőlőt már a neolitkorban, mintegy 6-8 ezer évvel ezelőtt termesztették a Kaukázustól délre eső területeken. A Transzkaukázia néven is ismert térségből a szőlő útja dél felé haladt. Szőlőművelés elsőként Mezopotámiában és Palesztina területén alakult ki. A szőlőkultúra legősibb gyökerei Egyiptomba vezetnek (Kr. e. 4000), majd a szőlő főníciai közvetítéssel az égei-tengeri szigetekre, valamint a mai Görögország területére kerül (Kr. e. 3000). A főníciaik megalapítva Karthago városát megnyitották az utat a Vitis vinifera típusú szőlő észak-afrikai terjedése előtt egészen Gibraltárig, az Ibériai-félsziget déli részéig. Itália és Gallia területén görög gyarmatosítók telepítették be az első szőlőtőkéket (Kr. e. 800). A kerti szőlő eljutott Nyugat-, majd Közép-Európába. Az ókori szőlőkultúra fejlesztésében, a szőlő elterjesztésében a görögök mellett a rómaiak is kulcsfontosságú szerepet játszottak. Amerika felfedezése után, az 1500-as évek második felében az európai szőlő a spanyol hódítók közvetítésével először Dél-Amerikában (Argentína, Chile, Peru), majd Közép-Amerikában (Mexikó) terjedt el. Észak-Amerika keleti partvidékén Virginia államban Delaware lord honosította meg az első V. vinifera fajtákat (1619). A peronoszpóra, a lisztharmat, és a filoxéra ottani jelenléte miatt kezdeményezése sikertelen maradt, az ültetvények rövid időn belül kipusztultak. Mintegy 8000 évre volt tehát szükség, hogy a szőlő termesztése és ezzel együtt a V. vinifera fajták mindegyik kontinensre eljussanak.
3
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
1. 1. Mikrobiális kórokozók A szőlő két legveszedelmesebb mikrobiális kórokozója a peronoszpóra (Plasmopara viticola) és a lisztharmat (Uncinula necator), melyek megfelelő időjárási körülmények között az érzékeny fajtákban jelentős terméskiesést, ezáltal hatalmas gazdasági kárt okozhatnak. A betegségek elleni védekezés többnyire megoldható vegyszerek felhasználásával, de több szempontból sem a legtökéletesebb megoldás. Megemlítendő például, hogy nagy anyagi terhet jelentenek a gazdáknak, környezetkárosító hatásukkal is számolni kell és járványos esetekben nem mindig a leghatékonyabbak. Továbbá a fungicidekkel szemben kialakulhat a gombáknál rezisztencia is, ami nagymértékben befolyásolja a kártevők elleni védekezés eredményességét. Előrelépést jelentene a betegségek megelőzésében és a kórokozók legyőzésében a rezisztens fajták termesztése, ami mind gazdaságilag, mind környezetvédelmileg mérföldkő lehetne. 1. 1. 1. A lisztharmat A lisztharmat a szőlő egyik legismertebb kórokozója, mely XIX. század közepén, fertőzött szőlővesszőkkel kelkerült be Európába és hamarosan hazánk területén is megjelent. Kezdetben csak az ivartalan, „konídiumos” alakját ismerték, ennek alapján az Oidium tuckerii nevet kapta, majd megtalálva az ivaros alakot más rendszertani csoportba sorolták és ma az Uncinula necator nevet viseli. A gomba képes a gazdaszervezet összes zöld szövetét megfertőzni, de ellentétben a peronoszpórával, szaporodásához nem igényel vizet. A megtámadott levél felszínén lisztszerű, fénytelen, szürkésfehér, kézzel letörölhető, kellemetlen penészszagú bevonatot hoz létre. Ezek a tünetek a gombafonalak (hifák) megjelenésének köszönhetők, melyek konidiofórokat és konídiumokat növesztenek a növényi szövetek felszínén. Itt fontos kiemelni, hogy a hifák csak a bőrszöveteken élősködnek. Lebenyszerű appresszóriumokat hoznak létre, melyekből tapadókorongok (penetration peg) nőnek ki, és ezek behatolva az epidermális sejtek közé tápanyagot vonnak el a gazdaszervezettől (Bouquet et. al., 2001). A szőlő lisztharmat betegségét okozó gomba már virágzás előtt fertőzhet. A kórokozó ivaros alakja a kleisztotécium és ivartalan tenyészteste a hifaszövedékből álló micélium is képesek a leghidegebb tél átvészelésére a szunnyadó rügyekben illetve a kéreg repedéseiben. Tavasszal az aszkospórák kiáramlanak a kleisztotéciumokból (primer inoculum) és megfertőzik a fejlődő gazdanövény összes zöld felszínét. Ezt a folyamatot elsődleges fertőzésnek hívjuk. Az aszkospórák kirajzása kedvező feltételek mellett 4-8 óra alatt lezajlik és a szél által szállítva a kiindulási helytől nagy távolságokra is eljuthatnak. A penészkolóniák egyszerű szaporodási formákból épülnek fel, és sugárirányban osztódnak 5-9 napig, mielőtt elkezdik termelni a konídiospórákat (secunder inoculum), amik a másodlagos fertőzés kiindulópontjai a hátralévő tenyészidőszakban. Fontos megjegyezni, hogy minden egyes aszkospórából akár 100ezer konídiospóra is keletkezhet, melyek mindegyike alkalmas a szőlő fertőzésére. 20-25 C az optimális hőmérséklet a fertőzéshez és a betegség kialakulásához, de 15-32 C között előfordulhat. 35 C -on a konídiospórák csírázása már gátolt, 40 C-on pedig
4
elpusztulnak. Magas relatív páratartalom előnyős a fertőzés szempontjából, viszont a folyamat nem igényel vizet, ellentétben a peronoszpórával. Ha az optimális feltételek adottak, a fertőzéstől a konídiospórák kialakulásáig általában 7 nap telik el. Ezekből az következik, hogy olyan meleg és száraz tenyészidőszakokban okoz nagy pusztítást a lisztharmat, ami a többi mikrobiális kórokozónak nem kedvez. A fertőzés során fellépő tünetek nagyon jellegzetesek. Kicsi fehér vagy szürkésfehér foltok jelennek meg a levél mindkét felszínén. Ezek a foltok általában addig nőnek, míg egy lisztszerű bevonat ki nem alakul a levél felső felszínén. Súlyos fertőzés esetén, forró, száraz időben a levelek összepöndörödnek és torzzá, alaktalanná válnak. A fiatal sarjak fertőződésekor sötétbarna vagy fekete pettyek jelennek meg, melyek később a vesszőkön sötét foltként maradnak vissza. A fertőzött virágok nem kötődnek, lehullanak, ezért ez a legnagyobb gazdasági kárt okozó tünet sok esetben rejtve marad. A fertőzés a fürtkocsányokon gyakran észrevétlen, de nagy károkat tud okozni. A gomba által megtámadott fürtkocsányok elhervadnak, elszáradnak és a bogyók eldobása következik be. A megtámadott bogyókon a leveleken levő foltokhoz hasonló képződmények jelenhetnek meg, majd a gyümölcs felszínén is kialakul egy szürkésfehér, lisztszerű bevonat; a bőrszövet elparásodik, nem növekszik megfelelően, és a bogyó héja felreped, sérves lesz. A sérves bogyón kilátszanak a magok, de a húsa nem barnul meg, zöld marad. A felrepedt termésen azután másodlagosan megtelepszik a szürkepenész, és egy sor más szaprofita penészgomba, és a fürtöt elborítja a penészgyep. A lisztharmatos szőlőfürt jellegzetesen gomba szagú. Védekezés hiányában, a kórokozóra kedvező időjárási körülmények esetén a lisztharmat betegség 100 %-os termés veszteséget is okozhat. 1. 1. 2. A peronoszpóra A peronoszpóra kórokozóját (Plasmopara viticola) Amerikából szállított, szőlővessző-kötegekbe kötözött szőlőlevelekkel hurcolták be Európába. Franciaországban 1878-ban, Magyarország nyugati határszélén 1880-ban tűnt fel, azóta is folyamatos a küzdelem ellene. A leveleket ért fertőzések során keletkező első tüneteket mindig a fonáki részen találjuk meg, hiszen az esővízzel felverődő spórák leghamarabb és legbiztosabban oda jutottak el. Az idő múlásával a levelek felszínén szabálytalan alakú, világos-sárga, sárgászöld foltok jelennek meg, közvetlenül a fertőzés helye felett. Ezek az úgynevezett olajfoltok a klorofill bomlása miatt jönnek létre. Ezt követően a fonákon a sztómákon keresztül kinövő gombafonalak mikroszkópikus, fa-alakú, elágazó sporangiofórokat hoznak létre, melyek végein sporangiumok találhatóak, és ezek képezik a másodlagos
fertőzések
kiindulópontját.
A
megtámadott
levelek
fokozatosan
sötét-barnává,
szabálytalan alakúvá és törékennyé válnak, súlyos esetekben pedig kiszáradnak, összepöndörödnek és lehullanak. A szőlő fürtvirágzata esős időben a peronoszpóra-fertőzésre szintén nagyon fogékony. A betegség hatására a virágzati kocsány, a virágok és a bogyók sárga színűek, áttetszők lesznek, majd elhalnak. A bogyók fertőződésük során áttetszővé válnak, olajos-sárgára, szürkére, majd kékesszürkére színeződnek. A bogyókon is képződhet sporangiumtartó gyep, majd töppednek, héjuk lilás színű lesz, belsejük megbarnul. Később a bogyók összezsugorodnak, belsejük megkeményedik, elszáradnak.
5
Az elsődleges fertőzéseket a lehullott levelekben áttelelő oospórák okozzák. Tavasszal kedvező feltételek hatására sporangiumokat hoznak létre, melyek szél által terjednek. Ha a növényi részek felszínén összefüggő folyadékfilm található, akkor ezekből a sporangiumokból kétostoros zoospórák rajzanak ki. A spórák a folyadékban úszva megközelítik a sztómákat, amiben a gazdanövény által termelt faktoroknak is fontos szerepe van. A gázcserenyíláshoz érve a zoospórák elveszítik flagellumaikat és betokozódnak. Ezt követően egy csíratömlő emelkedik ki belőlük, mely a gázcserenyíláson keresztül a szubsztomatális üregbe hatol, és itt infekciós vezikulát hoz létre, melyből egy primer hifa nő ki. A kialakuló gombafonalak (micéliumok) a levél szövetein belül, többnyire a szivacsos parenchima intercelluláris terében fejlődnek és az általuk létrehozott hausztóriumok a gazdaszervezet sejtjeibe hatolva tápanyagot vonnak el a növénytől. A kórokozó 12 és 30 C között képes fertőzni, de 18-25 C az optimális hőmérséklet a betegség kialakulásához. A fertőzés első jelei általában 7-12 nap után jelennek meg. Magas páratartalmú és körülbelül 13 C hőmérsékletű éjszakák során a gombafonalak a fertőzőtt szövetek sztómáin keresztül kinőve létrehozzák a fa alakú, elágazó sporangiofórokat. Ezek végén található sporangiumok pedig a már fent említett másodlagos fertőzés kiváltói megfelelő környezeti feltételek mellett.
1. ábra : A Plasmopara viticola fertőzési ciklusa
6
Kiefer és társai (Kiefer et al., 2002) vizsgálták a peronoszpóra korai fejlődésének időbeli
és
morfológiai változásait gazdaszervezet nélküli rendszerben (petri-csészében) és gazdaszervezeten belül úgy, hogy szőlőleveleket fertőztek meg a kórokozóval. Kísérleteiket 3 szempont alapján állították be. •
Bebizonyították, hogy az érett sporangiumokból a zoospórák kiáramlását a gazdaszervezet által termel faktorok gyorsítják. Megfertőzték a két rendszert és a fluoreszcein-diacetáttal (FDA) vizualizált ostoros spórákat detektálva mérték a fertőzés után eltelt időt.
2. ábra A grafikonon jól látható, hogy a gazdaszervezet nélküli rendszerben a zoospórák 1-2 óra elteltével jutnak csak ki a sporangiumokból. Ezzel szemben a gazdaszervezeten belül a kirajzás már 40 perc után bekövetkezik, amiből arra tudtak következtetni, hogy a növény által termelt faktoroknak tényleg szerepük van a zoospórák kirajzásának gyorsításában. 90 perc elteltével figyelhető meg a legtöbb ostoros spóra, majd az idő múlásával ezek száma fokozatosan csökken.
•
Vizsgálták a gazdaszervezet hatását a csíratömlő és az infekciós vezikula morfogenezisére. Megfigyelték, hogy a zoospórák a sztómához kapcsolódva eldobják flagellumaikat, betokozódnak, és csíratömlőt kezdenek növeszteni. Közben a rajzóspórák citoplazmája és sejtmagja áthelyeződik a csíratömlő apikális részébe. Ezt követően a csíratömlő behatolva a növény szöveteibe, a csúcsi részénél szeptumot, majd infekciós vezikulát hoz létre, melyből a primer hifa nő ki, ami később primer micéliummá fejlődik. A kísérletek során nátrium-kloriddal sikerül indukálni a csíratömlőt és az ezt követő fázisok növekedését. Azt tapasztalták, hogy a gazdaszervezet nélküli rendszerben a rajzóspórák elágazó, duzzadt csíratömlőt fejlesztenek, míg a gazdanövényben elágazásmentes csíratömlő keletkezik. Ezen kívül morfometriai paraméterek segítségével is próbálták igazolni a gazdaszervezet hatását a fertőzés korai szakaszára. Meghatározták a csíratömlő hosszát a zoospórából való kiemelkedési pont és a szeptum között. Mint kiderült, a gazdaszervezetben sokkal kisebb ez az érték, és kisebb szórást is mutat (159±0.6 µm). Ezzel ellentétben a gazdaszervezet nélküli rendszerben nagyobb méretet detektáltak (232 ±16 µm). Ezek is azt támasztják alá, hogy a gazdaszervezet indukálja és koordinálja a csíratömlő fejlődését.
7
3. ábra: Gazdaszervezet nélküli rendszer elágazó csíratömlője (b), egyenes csíratömlő a gazdaszervezetben (c). •
Az utolsó vizsgálati szempont a nyitott sztómán keresztül felszabaduló faktorok hatásainak vizsgálata volt. Igazolták, hogy a zoospórák irányításában fontos szerepük van. Növekvő koncentrációjú abszcizinsavat adtak a rendszerhez a fertőzés előtt, ami sztómazáródást okozott. Az eredmények alapján bebizonyosodott a faktorok szerepe, ugyanis 3µM-os koncentráció már gátlólag hatott a zoospórák célbaérésére, 10µM pedig 40%-kal visszavetette a rajzóspórák kapcsolódását a sztómához (4. ábra/b). A sztómákhoz való kapcsolódás időbeli lefolyását követve érdekes eredményt kaptak. 5 perc után a sztómákhoz még csak egy, Blankophor-ral vizualizált betokozódott rajzóspóra kapcsolódott. A 20-dik percnél következett egy platófázis, amikor is 4 zoospóra kapcsolódott egy gázcserenyíláshoz. Ezt követően 35 percnél ismét egy emelkedés volt megfigyelhető, majd 40 perc körül következett egy második platófázis 6 zoospórával sztómánként.
4. ábra: A gázcserenyílásokhoz kapcsolódó rajzóspórák számának időbeli változása (a), abszcizinsav (ABA) gátló hatása a zoospórák sztómához való kapcsolódásához (b).
8
Végezetül pedig a kórokozóval kapcsolatban érdemes megemlíteni Jókai Mór 100 éve lejegyzett tanácsait, melyek a mai napig megállják a helyüket a védekezés terén: „Szőlővirágzás előtt a szőlősgazdának minden nap körül kell járni a szőlőjét s vizsgálni, hogy nem találja-e valami jelenségét a levélpenésznek. Akkor, ha csak egy helyen találta is azt föl, rögtön permeteztetni kell. A szőlő elvirágzása után pedig, akár mutatkozik peronoszpóra, akár nem, be kell permeteztetni bordói lével az egész szőlőtelepet istenesen. Amely szőlősgazda elkésik a permetezéssel, az aztán permetezhet háromszor is egy évben, mégis kétes marad a sikere. Ha pedig valami szőlősgazda azzal a lamentálással kerül elém, hogy a peronoszpóra tönkre tette a szüretjét, annak én azt mondom: úgy kell neked! Már most igyál vizet.”
1. 2. DNS markerek a genetikai térképezésben 1913-ban Sturtevant volt az, aki a kísérletei során kapott eredményekből arra következtetett, hogy a gének a kromoszómákon lineáris elrendeződést mutatnak. Ebből következően a genetika térképezés két fő szempont alapján történik. Egyrészt a gének lineáris sorrendjének a meghatározása a cél, majd ezen gének közötti relatív távolság (géntávolság) megállapítása. Két tulajdonság kapcsoltsági viszonyba kerül, ha génjeik azonos kromoszómán helyezkednek el. Nyilvánvaló, hogy minél távolabb helyezkedik el a kromoszómán két gén, annál valószínűbb, hogy rekombináció lép fel közöttük. A kapcsoltság elemzésénél a tulajdonságok, ill. markerek közötti rekombináció gyakoriságát veszik alapul, egysége a centimorgan (cM). 1 cM egység 1 %-os rekombinációs gyakoriságnak felel meg. Ez alapján lehetőség nyílik a gének egymástól való távolságának becslésére, azaz a lókuszok térképezésére. A térképezés genetikai markerekkel történik. A genetikai markerek különböző tulajdonságokat meghatározó változatok (allélok), amelyek megkülönböztethetők egymástól a klasszikus értelemben vett fenotípus (morfológia, fiziológia) vagy molekuláris szinten, a fehérjék vagy a DNS jellemzésével. Tanksley (Tanksley and Orton, 1983) molekuláris markereknek nevezte el azokat a markereket, amelyek fehérje és/vagy DNS-szinten különböztetik meg az egyes alléleket egymástól. Ezen változatok jelenléte általában nem okoz az egyed szintjén észrevehető fenotípusos változást, a legtöbb DNS-marker nem is géneken belüli különbségeket jelez, ezért az ilyen allélek közötti eltérést polimorfizmusnak nevezzük. A DNS-szintű markerek vizsgálatát a Southern-blot technika, az ezen alapuló RFLP módszer, majd a polimeráz láncreakció (PCR) kidolgozása tette lehetővé. 1. 2. 1. RFLP markerek Kan és Dozy (Kan and Dozy, 1978), valamint Botstein (Botstein et al., 1980) ismerték fel, hogy az úgynevezett hasítási fragmentumhossz polimorfizmusokat (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) markerként lehet használni teljes genetikai kapcsoltsági térképek készítésére. Az RFLP markerek kodominánsak, azaz mindkét DNS-szál által kódolt szakasz kimutatható. Ha
9
inszerció, deléció vagy báziseltolódás hatására a DNS-szekvencia egy bizonyos szakaszon módosul, akkor ez megváltoztathatja egy adott enzim hasítási mintázatát. A restrikciós enzimekkel emésztett fragmenteket elektroforézissel választják szét. Mivel rendkívül sok, eltérő hosszúságú DNS-szakasz van az elegyben, az elektroforézis nem eredményez világosan elkülöníthető sávokat, mint az izoenzimek esetében, ehhez külön jelölő DNS alkalmazása szükséges. A Southern-hibridizálás során az emésztőenzimmel kapott szakaszokat denaturálják, egy szűrőpapírra viszik át, majd egy radioaktív izotóppal jelölt, ugyancsak egyszálas DNS-szakasszal tesztelik (hibridizációs próba). Homológ szakaszok esetén a minta a próbával hibridizál, azaz kettős szálat alkot, és ezt röntgen filmen sávok formájában detektálhatjuk. Az RFLP markerek véletlenszerűen oszlanak el a genomban és nagyon gyakoriak. Restrikciós endonukleázok segítségével szinte korlátlan mennyiségű polimorfizmust lehet találni. Ennek két oka is van. Az egyik, hogy kis változások is RFLP-k létrejötté eredményezik, a másik pedig, hogy az exonokon kívül az intronokban is keletkezhetnek. A módszer hátránya, hogy nagy mennyiségű DNS-re van szükség, és az eljárás nem automatizálható, aránylag drága és munkaigényes. Ennek ellenére számos felhasználási területe van. Alkalmazzák például DNS ujjlenyomat készítésére (rokonság megállapítása, fajtaazonosítás, genetikai tisztaságvizsgálat), monogénes és kvantitatív tulajdonságok térképezésére. 1. 2. 2. RAPD és SCAR markerek A
RAPD
(Random
Amplified
Polymorphic
DNA)
DNS-szekvenciák
specifikus
megsokszorozásán alapuló módszer, melyet Williams (Williams et al., 1990) és Welsh (Welsh Et al., 1990) írtak le. Ezzel a módszerrel a genom ismeretlen szekvenciáit lehet felszaporítani egy vagy két önkényesen választott, általában 10 nukleotidból (dekamer) álló primerekkel. Az amplifikáció kiindulását képező primerek véletlenszerűen kötődnek a genomi DNS két különböző helyén a komplementer szálakhoz. Ha a reakció során egy primert használunk, akkor a kötődési helyeknek megfelelően kis távolságra (100-2000 bp) kell elhelyezkedniük egymástól. Ennél egymástól nagyobb távolságra lévő kötődési helyek csak két primerrel amplifikálhatók. Ekkor olyan mintázatot kapunk, ami eltér bármelyik egyes primerrel létrehozott mintázattól. Primer párok alkalmazásánál fontos szempont, hogy ne legyenek egymással komplementerek. A reakció során keletkezett DNS-szakaszok gélelektroforézis segítségével történő elválasztásával a vizsgált egyedek közötti polimorfizmus kimutatható. A RAPD markerek használata egyszerű és gyors, általában domináns öröklődésűek, a fajok széles skáláján alkalmazható. A módszer hátránya, hogy érzékeny a PCR reakció körülményeinek megváltozására. Ennek következtében fontos a körülmények és összetevők pontos megválasztása és ennek következtében a reakció reprodukálhatóságának növelése. Mindezek ellenére a módszert széleskörűen alkalmazzák: egyedek DNS-ujjlenyomatának elkészítésére, genetikai különbözőség és/vagy rokonság megállapítására, specifikus fenotípushoz kapcsoltható fragmentumok jelenlétének vagy hiányának kimutatására. A RAPD primerek megbízhatóságának javítása érdekében, Paran és Michelmore (Paran and Michelmore, 1992) a SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) markerek kifejlesztését. Ezek markerek a RAPD módszerrel kimutatott és polimorfizmust jelző DNS-szakaszok további jellemzéséből származnak. Miután a kérdéses RAPD fragmentumot klónozták és végeinek
10
szekvenciáját meghatározták, olyan specifikus primer páros tervezhető, amely segítségével nagy biztonsággal vizsgálható egy adott polimorfizmus. A SCAR primereket speciális DNS régiók sokszorozására használják. Használatuk kedvezőbb, mint a RAPD markereké, mert általában csak egy szakaszt jelölnek, és a PCR reakció körülményeinek változtatására kevésbé érzékenyek. A SCAR markereket géntérképezésre, marker alapú klónozásra, vagy markeren alapuló szelekcióra (MAS, Marker-Assisted Selection), valamint közel rokon fajták azonosítására használják. 1. 2. 3. AFLP markerek Az amplifikált fragmenthossz polimorfizmus (AFLP, Amplified Fragment Lenght Polymorphism) markereket alkalmazó technikán ismeretlen szekvenciájú kromoszómális restrikciós fragmentumok PCR segítségével történő megsokszorozását értjük (Vos et al., 1995). Az amplifikáció előtt a genomiális DNS-t két restrikciós endonukleázzal hasítják, és a DNS-fragmentumok végeire hely specifikus kettős szálú adaptereket ligálnak. A reakció alatt csak azok a restrikciós fragmentumok amplifikálódnak, amelyekben a hasítási hely utáni nukleotidok összeillenek a primer végeken lévő szelektív nukleotidokkal. Az RFPL módszertől annyiban különbözik, hogy a restrikciós fragmentumok detektálása Southern blot hibridizációval, az AFPL-nél pedig PCR módszer segítségével történik. Az AFLP nagy felbontóképességű technika, genetikai térképezésre, csoport szegregációs analízisre, nemesítési anyagok genetikai különbözőségének vizsgálatára használják.
1. 3. A szőlő genetikai térképe A szőlő genetikai térképezésében úttörő munkát végeztek Lodhi és munkatársai (Lodhi et al., 1995). Ők a ’Cayuga White’ és ’Aurore’ szőlőfajták keresztezésből létrejött interspecifikus hibrid populáció felhasználásával készítették el a Vitis (2n=38) kapcsoltsági genetikai térképét. Ez eredetileg 422 RAPD marker felhasználásával készült el, melyek közül 16 RFLP és izoenzim marker volt. A térképen belül a markerek közötti átlagos távolság 6.1 cM volt. A ’Cayuga White’ térképét 214 marker segítségével készítették el, melyek 1196 cM távolságot fednek le, és az ’Aurore’ térképét 225 marker alkotja 1477 cM távolságot lefedve. A ’Cayuga White’ térképe 20 kapcsoltsági csoportból, az ’Aurore’ térképe 22 csoportból épül fel. Az egyes kapcsoltsági csoportok az ’Aurore’ esetében 14-135 cM, a ’Cayuga White’ esetében 14-124 cM nagyságúak. A térkép elkészítésével további kvantitatív tulajdonságok térképezését (QTL), vagy marker alapú gén klónozását (MAS) tették lehetővé. Dalbo és munkatársai a ’Horizon’ (’Seyval’ x ’Schuyler’) és Illionis 547-1 (V.cinerea B9 x V.rupestris B38) szőlőfajták keresztezéséből származó populáció segítségével alkották meg a Vitis genetikai térképét. A térkép 277 RAPD marker segítségével készült el (Dalbó et al., 2000). A ’Horizon’ térképét 153 marker alkotja 1199 cM távolságot lefedve, és az átlagos távolság a markerek között 7.6 cM. Az Illinois 547-1 térképét 179 marker alkotja 1470 cM távolságot fedve, átlagos 8.1 cM markerek közötti távolsággal. Mindkettő térkép 20 kapcsoltsági csoportból épül fel. A térkép szintén felhasználható QTL és MAS vizsgálatok elvégzéséhez.
11
Grando és munkatársai Muscato bianco (Vitis vinifera L.) és Vitis riparia keresztezéséből származó 81 egyedből álló utódpopuláció vizsgálatával hoztak létre kapcsoltsági térképet (Grando et al., 2003). A térképezéshez AFLP, SSR(Simple Sequence Repeat) és SSCP (Single Strand Conformation Polimorphism) markereket alkalmaztak. A Moscato bianco (anya) térképe 20 kapcsoltsági csoportból épül fel és az egyes csoportok átlagos mérete 81,9 cM, míg a V. riparia (apa) esetében 19 kapcsoltsági csoportot különböztettek meg, melyek átlagos mérete 79,9 cM. Meghatározták a markerek közti átlagos távolságot is, mely a M. Bianco esetében 9,3, a V riparia-nál pedig 6,9 cM. Az anya térképét összesen 338 marker alkotja 1639 cM távolságot lefedve, az apáét pedig 429 marker 1518 cM távolságot lefedve. 1. 3. 1. Lisztharmat rezisztencia A lisztharmat rezisztencia tulajdonságot a Muscadinia rotundifolia genomból öt keresztezéssel sikerült egy V.vinifera fajtába juttatni (Pauquet et al., 1998). A fenotípus mögött álló feltételezett Run1 (Resistant for Uncinula necator) teljes rezisztenciát biztosított a lisztharmattal szemben, ami azonos módon nyilvánul meg a lombon, bogyón és a vesszőn. Érdekes módon a Run1 gént hordozó egyedek a peronoszpórával szemben is mutattak ellenállást, de nem bizonyított, hogy ez a Run1 gén jelenlétének tulajdonítható. Az első térképezési munkákat csoport szegregációs analízis (BSA, Bulked Segregant Analysis) technikával végezték, amely számos Run1 közeli molekuláris marker meghatározását eredményezte. A munka célja a Run1 génnel kapcsolt molekuláris markerek azonosítása, és egy helyi térkép szerkesztése volt. A szegregációs populációt 1995-ben hozták létre, és a vizsgálatok során marker alapú szelekciós programot (MAS, Marker Assisted Selection program) alkalmaztak. A tesztek elvégezése és a csoportok analízise megerősítette a rezisztencia monogénes öröklődését. A munka során 56 primer kombinációs tesztelését végezték 10 rezisztens és 10 fogékony növényen. A primerek közül 16 kombináció eredményezett 9 polimorf DNS-fragmentumot, és a populáció további 68 egyedét ezekkel tesztelték. Összesen három egyed volt rekombináns, amit sikerült egy vagy kettő markerrel kimutatni. A vizsgálatok eredményeként kiderült, hogy több egyedet kell több markerrel tesztelni, hogy pontosabban meg lehessen szerkeszteni a Run1 régió genetikai térképét. Pauquet és munkatársi később Cabernet Sauvignon x Grenache x Aubun keresztezésből származó populációt használták fel, olyan AFLP markerek kiválogatására, amelyek kapcsoltak a Run1 génnel (Pauquet et al., 2001). Ezek közül 13 AFLP markert választottak ki a térkép elkészítéséhez. A munka során 157 (74 rezisztens és 84 szenzitív) egyedet teszteltek. 17 primerkombináció eredményezett 19 polimorf markert a két csoport között. A markerek közül 13 egyértelműen megjelent mindegyik rezisztens utódban és hiányzott a Cabernet-Sauvignonból. Kettő közülük mindig megjelent a Grenache (Emhb11, Emff1) és Aubun (csak Emhb11) fajtákban. Mivel az AFLP markerek nem specifikusak, kettő ugyanolyan méretű fragmentum a két különböző genotípusban nem jelentheti feltétlenül ugyanazt a szekvenciát. De az Emhb11 markernek megfelelő fragmentumot klónozták mind a VRH3082-1-42 és Grenache fajtába és meghatározták a bázissorrendjét. Csak három nukleotidban volt eltérés a két fragmentum szekvenciája között, ami azt jelentette, hogy ezek megfelelnek ugyanannak a régiónak. Végül a térkép megalkotásához 11 AFLP primer kombinációjából létrehozott
12
13 polimorf marker tesztelését végezték el az Mtp3294 populáció 157 egyedén. Ezzel elkészítették a Run1 gén környezetének térképét (5. ábra).
5. ábra: A Run1 gén térképe (Pauquet et al, 2001, Donald et al, 2002).
1. 3. 2. Peronoszpóra rezisztencia Erőteljes élősködő támadása esetében, úgy tűnik, hogy a Run1 gént hordozó genotípusok részleges peronoszpóra rezisztenciát mutatnak. Egyenlőre nem tudható, hogy ez a rezisztencia a Run1 gén indirekt hatásának köszönhető, vagy egy nagyobb introgressz kromoszóma részének. A M. rotundifolia peronoszpóra rezisztenciája, szemben a lisztharmat rezisztenciával, nem monogénikus. Akárcsak a lisztharmat esetében, a peronoszpóra rezisztenciagén kimutatására is alkalmazták a BSA módszerét érzékeny és rezisztens növények populációinál, különböző RAPD anonim és más típusú marker segítségével. A rezisztenciához kötődő markerek kapcsolódási csoportokhoz tartoztak, amiből arra következtettek, hogy a peronoszpóra rezisztencia egyetlen gén ellenőrzése alatt áll. Luo és munkatársai csoport szegregációs analízis, RAPD és SCAR módszerek alkalmazásával próbálták megtalálni a szőlő peronoszpóra rezisztenciagénjét (Luo et al., 2001). 280 Operon primer közül 160 adott polimorf fragmentumot. Egy RADP marker, az OPO06-1500, nagyon erősen kapcsolódott a P.viticola rezisztencia feltételezett fő génjéhez (RPv-1, Resistant of Plasmopara viticola). Mapmarker software analízist használva, kiszámították, hogy az RPv-1 és az OPO06-1500 közötti távolság 1.7 cM. A markert izolálták, klónozták és SCAR markert fejlesztettek belőle (SCO061500).
13
2. ELŐZMÉNYEK Magyarország jelentős sikereket mondhat magáénak számos értékes szőlőfajta előállításában. A különböző nemesítő műhelyekben a hagyományos módszerek alkalmazásával állítottak elő új fajtákat, fajtajelölteket. Ki kell emelni az 1996-2000 között a Magyar-Amerikai Kutatási Alap által támogatott szőlőnemesítési és genetikai kutatási programot, mely során az észak-amerikai Vitis fajok származékait (franko-amerikai hibridek), a V. amurensis hibrideket használták fel rezisztencia forrásként. A peronoszpóra és lisztharmat rezisztenciát általában több gén határozza meg, ezért nehéz egy genotípusba kombinálni a magas fokú rezisztenciákat a poligenikusan öröklődő minőséggel. 1996-ban magyar-francia fajtacsere keretében került Magyarországra a M. rotundifolia x V. vinifera BC4 hibrid, amelyet egy 1974-ben indított szőlőnemesítési programban állítottak elő, a M. rotundifolia rokonnemzetségből egy domináns lisztharmat rezisztenciagént tartalmaz, mely lehetővé teszi a folyamatos visszakeresztezést az igen magas fokú rezisztencia elvesztése nélkül. 1999-2002 között hibridcsaládokat állítottak elő a francia anyag felhasználásával, amelyben kombinálták a M.rotundifolia x V. vinifera BC4, a Franko-amerikai hibrideket és a V. amurensis x V. vinifera fajtákat.
6. ábra: 99-1 populáció eredete Zöld szín jelzi a lisztharmat rezisztens (Run1) egyedeket, míg a piros a peronoszpóra rezisztencia öröklődését mutatja. A sárga egy mind lisztharmatra, mind peronoszpórára gyengébb rezisztenciát mutató fajtát jelez, amelyet szintén szülőként szerepelt a nemesítés során.
14
A rendelkezésre álló szőlőleveleket a pécsi FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet telephelyén gyűjtöttük. Itt korábban a családba tartozó (99-1 Kozma jr.,1999) egyedek leveleit mesterséges és természetes fertőzésekkel tesztelték, illetve értékelték az ellenálló képességük szerint (Kozma, 2002; Kozma and Dula, 2003). 1. táblázat A lisztharmat és a peronoszpóra rezisztencia megoszlása a 99-1 populációban a levéltesztek alapján. Lisztharmat rezisztens (1), lisztharmat érzékeny (4), peronoszpóra rezisztens (1), peronoszpóra érzékeny (5).
Rezisztencia fokozata
Total (pcs)
P1
P2
P3
P4
P5
L1
22
36
39
23
27
147
L2
0
1
3
3
4
11
L3
6
10
17
9
36
78
L4
1
12
18
12
46
89
29
59
77
47
113
325
Összes
165
160
A lisztharmat ellenállóságát 4, a peronoszpóra ellenállóságát 5 fokozat szerint értékelték. A vizsgálatok megerősítették azt a vélekedést, hogy a magas fokú lisztharmat rezisztencia kapcsolatban lehet a magas fokú peronoszpóra rezisztenciával. Ezért a két csoport helyett (lisztharmat immunis, lisztharmat érzékeny) négy csoportot választottak ki a különböző fenotípusú kategóriákból (1. táblázat).
15
3. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során a lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciát meghatározó génekhez kapcsolt markerek keresését tűztük ki célul, a Magyarországon létrehozott 99-1 hibridcsalád felhasználásával.
1) Első megközelítésben RAPD kísérletek segítségével kívántuk jellemezni a biológiai tesztekben lisztharmat illetve peronoszpóra rezisztensnek vagy érzékenynek talált egyedek csoportjait (BSA, Bulk
Segregant
Analysis), hogy ezen tulajdonságok
valamelyikével kapcsolt
polimorfizmust találjunk. 2) Az előzetes tesztekben talált RAPD markerek jelenlétét a teljes 99-1 populáción (325 egyed) kívántuk levizsgálni a kapcsoltság pontosabb meghatározása érdekében.
16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
4. 1. Szőlő DNS izolálása Levélmintákat gyűjtöttünk a két szülő egyedről (apa: Pannonija, anya: Roti BC4) és az utódpopuláció
mintegy
140
tagjáról,
amelyek
lisztharmat
és
peronoszpóra
érzékenységét
levéltesztekben és a szabadföldi körülmények között is meghatározták. Ennek eredményét foglalja össze az 1. táblázat (2. fejezet). A fiatal, egészséges levelek DNS-ét először DNAeasy Plant Mini Kit módszer (Quiagen) segítségével izoláltuk, de ezzel a módszerrel viszonylag kis mennyiségű DNS-t sikerült nyerni, ami kevés RAPD analízisre lett volna elegendő. Ezért nagyobb mennyiségű növényi anyagból indultunk ki. A fagyasztással, szétdörzsöléssel és CTAB segítségével történő feltárást, PVP és kloroform segítségével való tisztítási lépések és alkoholos kicsapás követték. Az izolált DNS-t koncentrációmérés, gélelektroforézis és PCR kísérletek alapján minősítettük. Átlagosan az 1 g-nyi levélből kiindulva 50-100 mg DNS-t sikerült izolálnunk. A RAPD mintázatok összehasonlíthatósága és kiértékelhetősége érdekében minden mintából egyenlő koncentrációjú oldatokat higítottunk, amelyekben a koncentrációt 5 µg/ml-ben határoztuk meg. 4. 1. 1. Nagy mennyiségű DNS izolálása A DNS izoláláshoz 1g fiatal szőlőlevelet folyékony nitrogénben dörzsöltük szét és 20 ml CEP pufferbe tettük, amihez 100 mg polyvinylpolypyrrolidont (PVP, Sigma P6755) adtunk (1g levél/100mg PVP). Mindezt jól összeráztuk és 1 órán keresztül 65°C vízfürdőbe inkubáltuk, mialatt többször összekevertük. Az egy óra elteltével 20 ml kloroformot (1:1arányban) adtunk hozzá, óvatosan összeráztuk és 30 percig állni hagytuk, közben sűrűn forgattuk. Ezután 10 percig centrifugáltuk (4400 rmp, IEC Centra rotor No 7231). A felülúszót új csőbe mértük és 0,5 térfogatnyi nátrium-klorid oldatot (5M, pH:7.0) és 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá. Óvatosan összeráztuk. Következő lépésben 5 percig centrifugáltuk (4400 rmp), majd felülúszót leöntöttük, alaposan lecsurgattuk és 1ml TE (50:20) oldatban oldottuk fel, amihez 10µl 10 mg/ml DNáz mentes (forralt) RNázt adtunk és 1-2 óráig szobahőmérsékleten oldódni hagytuk. Ezek után a mintákat három részre osztottuk szét, hogy Eppendorf csövekben folytathassuk a munkát. 300µl DNS oldathoz 300µl TES puffert adtunk és 10 perc jégen való inkubálás után 300µl NH4Ac (7,5M, 0°C) oldatot adtunk hozzá. Alapos összekeverés után 10 percig -20°C-ra tettük a csöveket, majd a keletkezett csapadékot ülepítettük (5 perc, 12000 rpm). A felülúszót 500µl-ként új csövekbe óvatosan átpipettáztuk és 0,6 térfogat i-propanollal kicsaptuk a benne lévő DNS-t (20 perc -20°C). Ezután 5 percig centrifugáltuk (12000 rmp) mintákat. A csapadékot 70%-os etilalkohollal mostuk, szárítottuk mintákat és 100µl ioncserélt vízben oldottuk fel (Arnedo-Andres et al., 2002).
17
4. 1. 2. Kis mennyiségű DNS izolálása Az izoláláshoz 0,1g levelet mértük ki, ezt dörzsmozsárba tettük és 1,2 ml CEP-PVP oldatban szétdörzsöltük, majd 2,2 ml-es Eppendorf csőbe öntöttük. Mindezt jól összeráztuk és 65 °C-on 1 órán át inkubáltuk. Az egy óra elteltével 1 ml kloroformot adtunk hozzá, 10 percig állni hagytuk, közben néhányszor megforgattuk. Ezután 5 percig centrifugáltuk (12000 rpm). A felülúszót új csőbe pipettáztuk, 1 ml kloroformot adtunk hozzá és ismét 5 perig centrifugáltuk (12000 rpm). Ezt követően 800 µl felülúszót új csőbe pipettáztunk, majd 0,5 térfogatnyi nátrium-klorid oldatot (5M, pH:7.0) és 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá, és óvatosan megforgattuk a csöveket. Ezután ismét 5 perc centrifugálás következett (12000 rpm). A felülúszót leöntöttük és 400 µl 70 %-os etanollal mostuk, majd 5 percig centrifugáltuk (12000 rpm). A felülúszót ismét leöntöttük, alaposan lecsurgattuk, majd a csapadékot 200 µl TE (50:20) oldatban oldottuk fel, amihez 2 µl RNázos desztillált vizet (10mg/ml) adtunk. A mintákat 20 percig hagytuk oldódni, közben összekevertük. Az idő letelte után a mintákhoz 0,1 térfogatnyi 10 %-os SDS-t adtunk ,majd megkevertük őket. Ezután 1 térfogatnyi NH4Ac (7,5M, 0°C) oldatot mértünk be a csövekbe. Alapos összekeverés után 20 percig -20°C-ra tettük a csöveket, majd a keletkezett csapadékot ülepítettük (5 perc, 12000 rpm). Ezt követően 400 µl felülúszót új csőbe pipettáztunk és 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá, majd 5 percig centrifugáltuk (12000). A felülúszót leöntöttük és a mintákat 400 µl 70%-os etanollal mostuk, 5 percig centrifugáltuk (12000), szárítottuk, majd 50 µl ioncserélt vízben oldottuk fel.
Oldatok: CEP: 2% CTAB (cetyltrimethyl-ammonium bromide), 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 0,5% β-ME (betamerchapter-etanol) TES: TE-ben 10mM Tris (pH:7.5), 1 mM EDTA1% SDS TE (50:20): 50 mM Tris (pH:7.5), 20 mM EDTA
4. 2. A DNS minőségének ellenőrzése A DNS-koncentráció meghatározásához spektrofotométerrel (GeneQuant II) megmértük az oldatok hígításainak optikai denzitását 260 és 280 nm hullámhosszon, és ebből számítottuk ki a koncentrációkat, valamint a fehérje szennyezettség mértékét. Az OD260/OD280arány mindig 1,6 és 2,0 között volt. A DNS preparátumokból vett mintákat kezelés nélkül, és EcoRI enzimmel emésztve agaróz gélen is elválasztottuk, hogy az RNS, és az enzimreakciót gátló esetleges más szennyezést kimutassuk.
18
4. 3. A PCR reakció A rezisztenciagénekhez kapcsolt markerek keresésének elvégzésére PCR alapú módszereket használtunk fel. 2. táblázat A munkánk során használt RAPD2 PCR program
RAPD2 1.
2 min. 94°C
2.
10 sec. 94°C
3.
30 sec. 36°C
4.
1 min. 72°C
5.
GOTO 2 35x
6.
2 min. 72°C
7
END
A kísérletek során az Operon cég (http://oligos.qiagen.com/stock/rapd_10mer_price.php). dekamer primersorozataival azonos primereket szintetizáltattunk (MTA SZBK Szekvenáló Laboratórium) és végeztük a reakciókat.
Primer
Szekvencia
OPN05
CTGACCAGCC
OPP02
ACTGAACGCC
OPH19
TCGGCACGCA
OPB01
GTTTCGCTCC
3. táblázat Az alkalmazott fontosabb primerek A reakciók végtérfogata általában 24µl volt, ami magában foglalja a 2µl DNS-t, 2µl dekamer primert és 20µl PCR mixet, amit közvetlen a reakció összemérése előtt készítettünk el (F-buffer). A puffer a 4. táblázatban leírtak alapján állítottuk össze.
19
4. táblázat Az F-buffer elkészítése Az F-buffer alkotóelemei
Mennyiség(µl)
100 mM dNTP
3-3
25mM MgCl2
144
10X Taq Buffer
150
3x H2O
762
4. 4. Gélelektroforézis A fragment elválasztására 1% vagy 1.5%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztani kívánt DNS mintához, STOP oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat 1/5-ét). Gélelektroforézist minigél esetén 60 V-on, fragmentizoláláskor 40 V-on, nagy gél esetén 120 V-on végeztük. Kontrollként PstI enzimmel emésztett lambda-DNS-t és 100 bp GeneRuler Ladder DNS kontrollt (Fermentas) alkalmaztunk. M
Kiértékelést BioDoc-It fotodokumentációs rendszer (BioImaging system, www.uvp.com) segítségével végeztük.
20
5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
5. 1. Csoportszegregációs analízis RAPD segítségével A munkánk során a csoportszegregációs analízis (BSA, Bulk Segregant Analysis) módszerét alkalmaztuk a RAPD kísérletekben. A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens illetve szenzitív csoportokból (L1P1 és L4P5 csoportok) 10-10 egyedet választottunk ki. Ezek DNS preparátumából 5 µg/ml koncentrációjú oldatot készítettünk, majd egyenlő térfogatokat mértünk össze, a kialakított csoportoknak megfelelően. A tesztelések során egy harmadik csoportot is alkalmaztunk, amely lisztharmatra rezisztens és peronoszpórára szenzitív egyedeket foglalt magába (L1P5 csoport), annak érdekében, hogy a csoportok közötti különbségeket ezzel tovább jellemezhessük. Ezzel a módszerrel kívántuk kimutatni azokat a RAPD markereket, amelyek a rezisztens vagy szenzitív egyedek többségében előfordulnak, azaz kapcsoltak-e tulajdonságok valamelyikével. Kísérleteinket a szülők tesztelésével kezdtük, mely során dekamer primereket alkalmaztunk. A munkánkhoz RAPD2 PCR programot használtunk. A primerek többsége jól működött és a legtöbbel sikerült eltérő mintázatot kimutatni a két szülő között (7.a, b ábra).
7.a ábra
21
7. b ábra A szülők eltérő mintázata RAPD kísérletekben. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A tesztelt primerek elnevezése a gélkép alján látható. A teszteléseket ezután az utód populáción folytattuk azokkal a primerekkel, melyek a szülőkön eltérő mintázatokat eredményeztek. Ezzel azt a célt tűztük ki magunk elé, hogy különbséget találjunk a rezisztens és szenzitív csoportok között. A kísérletek során a várt eredményt kaptuk, vagyis a tesztelt primerekkel csak néhány esetben tudtunk különbséget kimutatni a vizsgált csoportok között (8.ábra).
8. ábra Csoport szegregációs analízis (BSA) P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), A= L1P1 (lisztharmat és peronoszpóra rezisztens csoport) B= L1P5 (lisztharmat rezisztens és peronoszpóra szenzitív csoport), C= L4P5 (szenzitív csoport), L=100 bp DNS ladder kontroll. A tesztelt primerek elnevezése a gélkép alján látható.
22
Munkánk során eddig mintegy 460 szintetizált (dekamer) primer tesztelését végeztük el a RAPD kísérletekben. Ebből 148 mutatott ki polimorfizmust a szülők között, a csoportok között pedig 21. Azaz 21 esetben találtunk valamiféle kapcsoltságot a polimorfizmus és az egyik rezisztenciagén között. A polimorfizmust mutató primerekkel további tesztelést végeztünk a csoportokat alkotó egyedi DNSmintákon. Az elemzések alapján 3 primer esetében tűnt a kapcsoltság olyan szorosnak, hogy ezekkel érdemesnek találtuk mind a 140 egyed tesztelését elvégezni. A tesztelések során kapott eredményekből arra következtettünk, hogy a csoport szegregációs analízis nem mindig megbízható. Sok esetben eltért a csoporttal kapott eredmény az azt követő egyedszintű vizsgálat eredményétől, mert a csoportok között volt eltérés, de ezt az egyedi tesztnél nem lehetett kimutatni. Ebből következően az egyedszintű tesztelést biztosabbnak tartottuk így a primerek
tesztelését
3
rezisztens,
illetve
3
szenzitív
egyedből
származó
egyedi
DNS-
mintasegítségével folytattuk. 5. 2. Lisztharmat rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD markerek A tesztelések során két primerrel sikerült olyan polimorfizmust kimutatni, mely szorosan kapcsolódik a lisztharmat rezisztencia génhez. Az eredményt az egyedszintű vizsgálatok is alátámasztották, hiszen a csoport szegregációs analízis során kapott különbségek az egyedek tesztelésénél is jól látszottak. Az egyik primer az OPP02 volt, mely tipikus esete volt a csoportos elemzések bizonytalanságának, ugyanis a BSA analízis során nem lehetett a csoportok között különbséget mutatni, míg az ezt követő egyedszintű teszteléskor a primerek jól látható különbséget eredményeztek a rezisztens és a szenzitív egyedek között. A 9. ábrán megfigyelhető, hogy a különbséget adó fragmentum minden rezisztens egyedben megtalálható, míg a szenzitívekből hiányzik.
9. ábra: Az OPP-02 primer egyedszintű tesztelése A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek polimorfizmusa. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll, M1=L1P1mix, M2=L4P5 mix. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentet jelzi.
23
A másik primer az OPH19 volt, mely a lisztharmat rezisztenciával szoros kapcsoltságot mutató polimorfizmust eredményezett. A csoportszegregációs analízis itt is az egyedszintű tesztelés követte és amint a 10. ábra mutatja, a rezisztens egyedeknél a fragment jól látható, míg a szenzitívek esetében nem jelenik meg.
10. ábra OPH19 primer egyedszintű tesztelés A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentumot jelzi, ami egyik L4P5 egyedben sem látható. A további munkát (a populáció összes egyedének letesztelés, fragment izolálása, SCAR marker tervezése) diákkörös társam, Kuczmog Anett végezte, ezért az általa kapott eredményeket a dolgozatomban tovább nem részletezem. 5. 3. Peronoszpóra rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD marker jellemzése A peronoszpóra rezisztencia vizsgálatát két oldalról közelítettük meg. Az első módszer a szőlő genetikai térképénél már említett Lou és munkatársai (Lou et al.,) által végzett kísérletekből indul ki. Ők ugyanis találtak egy primert (OPO06), mely nagyon erősen kapcsolódott a P.viticola rezisztencia fő génjéhez (RPv-1). Mind a három csoportból kiválasztottunk 2-2 egyedet, majd ezeken és a két szülőn leteszteltük az OPO06-os primert. Nem a cikkben szerepelt eredményt kaptuk, amire számítottunk is, mivel Lou és munkatársai Vitis quinquangularis x Muscat Rose keresztezésből származó utódpopuláció egyedeit tesztelték. Ezzel szemben mi a 2. fejezetben leírt 99-1 populáció tagjait vizsgáltuk, mely populáció teljesen más keresztezés eredménye. A 11. ábrán megfigyelhetjük, hogy az általunk végzett kísérlet során az OPO06 primerrel nem sikerült rezisztenciához kapcsolható markert kimutatni.
24
11. ábra Az OPO06 egyedszintű tesztelése A dupla rezisztens (L1P1), lisztharmat rezisztens és peronoszpóra szenzitív (L1P5), lisztharmat és peronoszpóra szenzitív (L4p5) egyedek. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A másik megközelítés a csoportszegregációs eredményekből adódik. A tesztelések során az OPN05 primer olyan polimorfizmust eredményezett, melyről azt feltételezhettük, hogy kapcsolatban áll a peronoszpóra rezisztenciával. A 12. ábrán nagyon jól látható, hogy a megjelölt fragmentumok csak a dupla rezisztens csoport egyedeinél és a peronoszpórára rezisztens apánál jelennek meg. Ebből arra következtethetünk, hogy a marker kapcsolatban lehet a peronoszpóra rezisztencia génjével. Ezért tovább folytattuk a munkát és a populáció többi egyedét is igyekeztünk letesztelni az OPN05-ös primerrel.
12. ábra: Az OPN05 egyedszintű tesztelése A dupla rezisztens (L1P1), lisztharmat rezisztens és peronoszpóra szenzitív (L1P5), lisztharmat és peronoszpóra szenzitív (L4p5) egyedek. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll.
25
A munkánkat azzal kezdtük, hogy kiválasztottunk az egyes csoportokból néhány egyedet és ezekkel elvégeztük a teszteléseket. Az eredmények biztatóak voltak, hiszen sikerült polimorfizmust kimutatni immár több egyedre nézve. A 13. ábrán a nyíllal jelzett fragmentum a kettős rezisztens (L1P1) minták mindegyikében megtalálható, míg a csak lisztharmat rezisztens (L1P5) egyedek mintáiban egyben sem mutatható ki, azonban a kettős érzékenységet mutató egyedek közül is megjelenik néhányban.
13. ábra: Az OPN-05 primer egyedszintű tesztelése A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek, és a csak lisztharmat rezisztens (L1P5) egyedek polimorfizmusa. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentumot jelzi, ami egy esetben egy L4P5 egyedben is látható A munka során célul tűztük ki a populáció összes egyedének tesztelését és esetleges peronoszpóra rezisztenciához kapcsolható polimorfizmus igazolása esetén a fragment izolálását és SCAR marker tervezését. Először az L1P1 és L1P2 csoport vizsgálatát végeztük el. 4. Táblázat Az OPN05 tesztelésének eredménye az L1P1 és L1P2 csoport egyedein
Vizsgált utódok száma
DNS-markert tartalmaz
DNS-markert nem tartalmaz
L1P1 csoport
18
18
0
L1P2 csoport
12
10
2
26
Mindkét csoport szinte összes tagja tartalmazta a polimorfizmust adó fragmentumot, kivéve két L1P2 csoportba tartozó egyedet. A 14. ábrán a nyíllal jelölt fragment jól láthatóan megjelenik az összes mintánál, azonban felvetésein beigazolásához el kellett még végeznünk a peronoszpórára érzékeny egyedek vizsgálatát is.
14. ábra L1P1 és L1P2 csoportok egyedeinek tesztelése az OPN05 primerrel L= 100 bp DNS ladder kontroll, a nyíl a polimorfizmust mutató fragmentet jelzi, ami jelen esetben mindkét csoport összes egyedében megjelenik.
A szenzitív egyedek tesztelésekor azonban ismét szembesültünk a munka elején elvégzett kísérlet eredményével, miszerint a fragment nemcsak a rezisztens, hanem a szenzitív csoportok egyedeinél is megjelenik. (Ez is azt igazolja, amit már a csoportszegregációs vizsgálatoknál említettünk, miszerint a BSA analízis során megfigyelt eredmények nem mindig megbízhatóak és nem mindig egyeznek meg az egyedek tesztelésekor kapottakkal). A kísérlethez a peronoszpórára érzékeny csoportokból kiválasztottunk néhány egyedet és rajtuk teszteltük le az OPN05 primert. Mint ahogy az a 15. ábrán megfigyelhető, az összes tesztelt minta esetében megjelenik a fragment.
27
15. ábra: A szenzitív csoportok egyedeinek tesztelése az OPN05-ös primerrel A gélfotón látható, hogy a nyíllal jelölt fragment a szenzitív csoportokból kiválasztott egyedek mindegyikében megjelenik
Összefoglalva elmondhatjuk, hogy tesztelések során mintegy 60, különböző csoportba tartozó egyeddel elvégeztük az OPN05 primer tesztelését. A csoportszegregációs analízis során kapott polimorfizmus a peronoszpóra rezisztenciával kapcsoltnak tűnt, azonban a további egyed szintű tesztelések során a kérdéses fragment mind a rezisztens, mind pedig a szenzitív csoportok egyedeinek többségében megjelent. Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy egy olyan markert sikerült kimutatnunk a kísérletek során, mely rendkívül érzékeny a RAPD reakció körülményeire.
5. 4. Lisztharmat és peronoszpóra rezisztencia vizsgálata primer párokkal A munkánk során nemcsak egy primert használtunk az amplifikációhoz, hanem primer kombinációk segítségével is igyekeztünk a lisztharmat, illetve peronoszpóra rezisztenciához kapcsolható polimorfizmust kimutatni. Két tetszőleges primer alkalmazásakor olyan reprodukálható mintázatokat kapunk, amelyek különböznek bármelyik egyetlen primerrel létrehozott mintázattól, valamint a primer kombinációk alkalmazása növeli a RAPD analitikai feloldóképességét is. Két primer együttes alkalmazásakor arra azonban ügyelni kell, hogy ne legyen közöttük komplemetaritás. A tesztelések kezdetekor kiválasztottunk egy primert (OPB01), melyet a RAPD reakciók során kombináltunk a többi primersorozat tagjaival. A vizsgálatokat először itt is a szülők tesztelésével kezdtük. A primer kombinációk többsége -hasonlóan az egy primerrel végzett csoportszegregációs analízishez- itt is különbséget eredményezett a minták között. A 16. ábrán látható, hogy az OPB01
28
kombinálása az OPI07 →OPI17 primerekkel három esetben is polimorfizmust mutatott. Két esetben a lisztharmat rezisztenciát mutató anya, egyben pedig a peronoszpóra rezisztens apa DNS mintájában vehetünk észre különbséget adó fragmentet, melyet az ábrán bekarikázva figyelhetünk meg.
16. ábra Lisztharmat és peronoszpóra rezisztencia vizsgálata primer kombinációkkal szülők DNSmintáin. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. Bekarikázva a polimorfizmust mutató fragmentek láthatók.
A polimorfizmust eredményező primer párral ezután egyedszintű tesztelést végeztünk. A dupla rezisztens (L1P1), a lisztharmat rezisztens és peronoszpóra szenzitív (L1P5), valamint a mindkét kórokozóval szemben érzékeny csoportból kiválasztottunk két-két egyedet és velük végeztük el a RAPD2 reakciót. Az utódoknál már nem tudtuk kimutatni azt a polimorfizmust, melyet a szülők esetében találtunk. Ha az általunk vizsgált marker az U. necator elleni rezisztencia génhez közel lenne, akkor az anya esetében megjelent fragmentet mind az L1P1, mind pedig az L1P5 csoportból származó egyedek esetében meg kellett volna kapnunk. Ha pedig a peronoszpóra rezisztencia génjével lenne kapcsolt, akkor az L1P1 csoport tagjainál figyelhetnénk csak meg. Ezt azonban a 17. ábrán nem láthatjuk, ezért kijelenthetjük, hogy a megjelölt fragmentek az utódpopuláció egyedeinél nem mutatnak szoros kapcsolatot egyik mikrobiális kórokozóval szembeni rezisztenciával sem.
29
17. ábra A különböző csoportba tartozó egyedek tesztelése OPB01-OPI07, OPI16, OPI17 primer kombinációkkal A 13 és 36-os minták az L1P1-, 2 és 50-es minták az L1P5-, a 76 és 81-es minták pedig az L4P5csoport egyedei.
A munkánkat tovább folytattuk, és még több primer kombinációt alkalmazva teszteltük a szülőket. A fent említettekhez hasonló eredményeket kaptunk, vagyis a szülők esetében kapott polimorfizmusok az egyedszintű tesztelések során már nem Az OPB01-es primert kombinálva az OPG sorozattal a 18. ábrán látható mintázatot kaptuk. Ebből kitűnik, hogy három esetben találtunk különbséget a szülők között. Jelen esetben mindegyik polimorfizmust a peronoszpóra rezisztens apa mutatta.
18. ábra A szülői minták tesztelése primer kombinációkkal P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll.
30
A különbséget adó primer párokkal ismét leteszteltünk BSA analízis során használt három csoportból kiválasztott két-két egyedet, azonban jelen esetben sem sikerült a rezisztenciához szorosan kapcsolódó polimorfizmust kimutatni. A 19. ábrán ezt meg is figyelhetjük, ahol a körrel megjelölt fragmentek csak az apában jelennek meg, és így megállapíthatjuk, hogy ezekkel a primer kombinációkkal kapott polimorfizmus sem kapcsolódik szorosan a P. viticola rezisztenciáért felelős génhez.
19. ábra Egyedszintű tesztelés azOPB01- OPG02, OPG09, OPG10 primer párokkal A 13 és 36-os minták az L1P1-, 2 és 50-es minták az L1P5-, a 76 és 81-es minták pedig az L4P5csoport egyedei. A munkánk során az OPB01-es primerrel kombinálva eddig 16 primersorozat tagjait teszteltük le, melyek mindegyike 20-20 primert tartalmaz, vagyis összesen több mint 300 variációt alkalmaztunk eddig a RAPD reakcióink során. A kombinációkat először mindig a szülőkön teszteltük, majd a polimorfizmust mutató primer párokkal egyedszintű tesztelést végeztünk, kiterjesztve ezzel a vizsgálatokat. Az eddigi kísérleteinkben az utód populáció tesztelése során nem sikerült olyan polimorfizmust kimutatnunk, mely szorosan kapcsolódna akár a lisztharmat, akár a peronoszpóra rezisztenciához. Ennek ellenére a primer kombinációk tesztelését folytatjuk és bízunk benne, hogy sikerül olyan markert(eket) kimutatni, melyek(ek) valamelyik kórokozó elleni rezisztenciáért felelős génhez közel helyezkednek el.
31
6. ÖSSZEFOGLALÁS A szőlő jelentős mikrobiális kórokozói a lisztharmat és a peronoszpóra, amelyek ellen hosszú idők óta vegyszeres védekezést kell folytatni. Hagyományos nemesítés útján képesek vagyunk rezisztens szőlőfajták létrehozására, azonban a molekuláris biológia fejlődése ennek a területnek is segítséget hozott a természetes rezisztenciagének a hozzájuk kapcsolódó DNS-markerek megkeresésével és genetikai térképezésben való felhasználásával. Munkánkkal a szőlőnemesítők számára szeretnénk segítséget nyújtani, a rezisztenciagénekhez kapcsolt DNS-markerek azonosítása révén. Vizsgálatainkat egy M. rotundifolia x V. vinifera x Franko-amerikai származású hibridcsaládon végeztük. A családot mesterséges és természetes fertőzéssel tesztelték mindkét kórokozóra. Az így jellemzett utódokkal kezdtük el a munkát. A növények leveleiből DNS-t izoláltunk, majd dekamer primerek segítségével RAPD (random amplifikált polimorf DNS) elemzést végeztünk. A szülőkön tesztelve a primereket arra a következtetésre jutottunk, hogy azok nagy része működik és a legtöbb RAPD kísérlet eltérő mintázatot eredményez. Ezek után csoportszegregációs analízis módszerét alkalmaztuk. Először mindkét betegséggel ellenálló (L1P1), illetve szenzitív (L4P5) csoportokat alakítottunk ki az egyedekből nyert DNS felhasználásával, és ezeken teszteltük a szülők esetében különbségeket eredményező primereket. Eddig mintegy 460 primerrel végeztük el ezt a kísérletet, csoportok között eltérő mintázatot mutató primerekkel. Ahol a polimorfizmus megjelenése az egyik rezisztenciagénnel való kapcsoltságot jelez, az egyedszintű tesztelést is elvégeztük (140 egyed). Munkánk során három olyan polimorfizmust találtunk, melyek a kórokozókkal szembeni rezisztenciával kapcsoltak lehetnek. Ezekből kettőnél egyedszintű tesztelésekkel sikerült igazolni, hogy a lisztharmat rezisztenciagénjével kapcsoltak. A harmadik polimorfizmus a peronoszpórával szemben ellenálló csoportot jellemezte, itt azonban az egyedek tesztelése során arra a következtetésre jutottunk, hogy egy olyan markert sikerült kimutatnunk, mely rendkívül érzékeny a RAPD reakció körülményeire. Primer párok alkalmazásával is megkezdtük a 99-1 populáció vizsgálatát. A szülők tesztelése után azokkal a kombinációkkal dolgoztunk tovább, melyek polimorfizmust eredményeztek. A csoportszegregációs analízis során alkalmazott három csoportból kiválasztottunk két-két egyedet és ezeken is elvégeztük a teszteket a polimorfizmust eredményező primerekkel. A munka során az OPB01 primert variáltuk a többi primersorozat elemeivel. A szülők esetében viszonylag sok esetben tudtunk különbséget kimutatni, viszont az egyedeknél eddig nem sikerült olyan polimorfizmust találni, mely szoros kapcsolatban állna valamelyik kórokozó elleni rezisztencia génnel.
32
7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK Arnedo-Andres, M.S., Gil-Ortega, R., Luis-Arteaga, M., and Hormaza, J.I. (2002) Dvevelpoment of RAPD and SCAR markers linked to the Pvr4 locus for resistance tp PVY in pepper ( Capsicum annuum L.). Theor Appl Genet 105: 1067-1074. Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., and Davis, R.W. (1980) Construction of a genetis linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Amer J Human Genet 32: 314-331. Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M., and Reisch, B.I. (2000) A gene contolling sex in grapvines placedon a molcular marker based genetis map. Genom 43: 333-340. Donald, T.M., Pellerone, F., Adam-Blondon, A.-F., Bouquet, A., Thomas, M.R., Dry, I.B. (2002) Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapvine. Theor appl Genet 104: 610-618. Gadoury, D.M., Seem, R.C., and Wilcox, W.F. (1997) Early ontogenic resistance to dowdery moldew in Chardonnary and Riesling grapes. Phytopathology 87: 31. Hajósné-Novák, M. (1999) Genetikai variábilitás a növénynemesítésben. Budapest: Mezőgazda Kiadó. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28. Ish-Horovicz, D., and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 29892998. Kan, Y.W., and Dozy, A.M. (1978) Polymorphism of DNA sequence adjacent to human b-globin structural gene:relationship to sickle mutation. PNAS 75: 724-732. Kiefer, B., Riemann, M., Büche, C., Kassemeyer, H.-H., and Nick, P. (2002) The host guides morphogenesis and stomatal tardeting in the grapvine pathogen Plasmopara viticola. Planta 215: 387-393. Kozma, P. (2002) Goals and methods in grape resistance breeding in Hungary. Int J Hort Sci 8: 41-46. Kozma, P., and Dula, B. (2003) Creating of new grape hybrids with complex resistance. In 1th Int. Symp on Grapevine: growing, commerce and research Lissbon, pp. 121. Lodhi, M.A., Daly, M.J., Ye, G.N., Weeden, N.F., and Reisch, B.I. (1995) A molecular marker based linkage of Vitis. Genom 38: 786-794.
33
Luo, S.L., He, P.C., Zhom, P., and Zhung, X.Q. (2001) Identification of molecular genetis markers tightly linked to downy mildew resistant genes is grape. Acta Genet Sin 28: 76-82. M. S. Grando, D. Bellin. K. J. Edwards, C. Pozzi, M. Stefanini, R. Velasco (2003) Molecular linkage maps of Vitis vinifera L. and Vitis riparia Mchx. Theor appl Genet 106: 1213-1224. Paran, I., and Michelmore, R.W. (1992) Sequence characterized amplified regions (SCARs) as a codominant genetic marker in Lactuca spp. Theor appl Genet 85: 985-993. Pauquet, J., Adam-Blondon, A.-F., Rousseau, S., Peros, J.-P., and Bouquet, A. (1998) Tagging a Muscandia rotundifolia originated powdery mildew resistance gene in Vitis vinifera. In Preceedings of 7th International Symposion on Grapevine Genetics and Breeding Montpellier, France. Pauquet, J., Bouquet, A., This, P., and Adam-Blondon, A.F. (2001) Establishment of a local map of AFLP markers around the powdery mildew resistance gene Run1 is grapvine and assessment of their usefulness for marker assisted selection. Theor Appl Genet 103: 1201-1210. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tanksley, S.D., and Orton, T.J. (1983) Isozymes in plant genetics and breeding. Amsterdam, Oxford, New York: Elsevier. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Rijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., and Zabeau, M. (1995) AFLP: a new techique for DNA fingerprinting. Nucleis Acids Res 23: 4407-4414.
34
KÖSZÖNETNYILYÁNÍTÁS Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek, és Dr. Kocsis Mariannának munkám irányításáért, önzetlen segítségéért, bírálataiért és a problémák megoldásában nyújtott segítségéért. Köszönetet mondok Dr. Hoffmann Gyulának értékes megjegyzéseiért és bíztatásáért. Külön köszönettel tartozom Dr. Kozma Pálnak, a pécsi FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet igazgatójának a munka során biztosított növényi anyagokért és értékes tanácsaiért. Köszönöm diákkörös társamnak, Kuczmog Anettnek és a tanszéken dolgozó laboránsoknak, Miklósvári Zoltánné Maricának, Keidl Zoltánné Juditnak és Garai Ktisztinának a kísérletek technikai hátterének biztosítását.
35
