Diplomamunka (BMEVEMKU999)

A Mycobacterium tuberculosis His145Trp mutáns dUTPáz enzimének karakterizálása, antagonista jelöltek sz rése

Diplomamunka (BMEVEMKU999)

A dolgozatot készítette : Nagy Péter, biomérnök hallgató (PDY7SZ)

BME-VBK Témavezet :

Dr.Vértessy Beáta , MTA doktora MTA-SZBK, Enzimológiai Intézet, Genom metabolizmus és javítás labor

Bels konzulens:

Dr. Suhajda Ágnes, tudományos munkatárs BME-VBK, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék

Budapest, 2007. december

Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás

4

Rövidítések jegyzéke

5

1. Célkit zések

6

2. Irodalmi áttekintés 2. 1.

A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája

2. 2.

A dUTPáz, mint ígéretes célfehérje

7

2. 2. 1. A dUTPáz szerepe az él szervezetben

10

2. 2. 2. A dUTPáz, mint új gyógyszeripari célmolekula

14

2. 3.

A dUTPáz szerkezete és reakciómechanizmusa

17

2. 4.

Európai Uniós pályázati stratégia

21

2. 4. 1 Sz r vizsgálati lehet ségek

22

2. 4. 2 Szekvencia analízis, munkahipotézisünk

23

2. 4. 3 Antagonisták és a dUPNPP-szubsztrátanalóg

24

3. Anyagok és módszerek

27

3. 1. Az M. tub. dUTP-áz és a His145Trp mutáns M.tub. dUTP-áz klónozása

27

3. 2. A fehérjék expressziója és feltárása

2

3. 3. Fehérjék tisztítási lépései 3. 3. 1.

Ni-ion oszlop affinkromatográfia

30

3. 3. 2.

Dialízis

32

3. 3. 3.

Membránsz rés

32

3. 4. Fehérje vizsgálati módszerek 3. 4. 1.

Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis

32

3. 4. 2.

Fehérjekoncentráció meghatározása

34

3. 4. 3.

Enzimaktivitás mérése két módszerrel

35

3. 4. 4.

Fluoreszcens spektrofotometria

38

3. 5. Sejtkultúrás kísérletek az antagonistákkal

2

41

4. Eredmények és kiértékelésük

4. 1.

43

A fehérjék el állítása 4. 1. 1. A His145Trp dUTPáz fehérje aminosav összetétele

46

4. 1. 2. A fehérjék koncentrációja 4. 2.

Enzimaktivitás mérése két módszerrel

47

4. 2. 1. Aktivitásmérés fenilvörössel

48

4. 2. 2. Aktivitásmérés MESG-gel

50

4. 3.

Az antagonisták és a dUPNPP hatása az enzim aktivitására

50

4. 4.

Az antagonisták köt désének fluoreszcens spektrometriai mérése

54

4. 5.

Sejtkultúrás kísérletek eredményei

61

5. Eredmények összefoglalása

62

Irodalom

63

3

Köszönetnyilvánítás Els ként szeretnék köszönetet mondani témavezet mnek Dr. Vértessy Beátának, aki lehet vé tette számomra, hogy kutatócsoportjában dolgozhassam, megismertetett a téma alapjaival és irányította a munkámat. Továbbá szeretném megköszönni Takács Enik nek, Varga Balázsnak, hogy a klónozási munkálatokban és az egyéb felmerül problémák megoldásában a segítségemre voltak. Friedrich Péter professzor úrnak, az Enzimológiai Intézet igazgatójának, szintén köszönöm, hogy engedélyezte munkámat az intézetben. Köszönöm az ELTE kutatóinak: Prof. Hudecz Ferencnek, Dr. B sze Szilviának, Horváti Katának ill. az Országos Korányi TBC- és Pulmonológiai Intézet munkatársának Dr. Nagy Nórának a munkáját. Végül köszönöm az egész kutatócsoportnak, hogy munkám során támogattak, mindvégig a segítségemre voltak és, hogy a felmerül problémákkal mindig fordulhattam hozzájuk.

4

Rövidítések jegyzéke ATP-áz BSA dNTP DTT dTTP dUDP dUMP DMF DMSO dUPNPP dUTP dUTPáz EGTA FPLC HEPES IPTG IPP IPP MES M. tub.

adenozin trifoszfatáz Bovine Serum Albumin (marhaszérum albumin) dezoxinukleotid-trifoszfát ditio-treitol dezoxitimidin-trifoszfát dezoxiuridin-difoszfát dezoxiuridin-monofoszfát dimetil-formamid dimetil-szulfoxid , -imino-dezoxiuridin-trifoszfát dezoxiuridin-trifoszfát (dezoxiuridin-trifoszfát)-nukleotid hidroláz etilénglikol-bisz-(b-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraecetsav Fast Protein Liquid Chromatography (gyors fehérje folyadékkromatográfia) N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etán-szulfonsav) izopropil-tio-galaktozid inorganikus pirofoszfatáz inorganikus pirofoszfatáz 2-amino-6-merkapto-7-metilpurin Mycobacterium tuberculosis

MESG PEG MMEE PNP PNP NaPi

2-amino-6-merkapto-7-metilpurin-ribonukleozid polietilén-glikol monometil-éter purin-nukleozid foszforiláz purin-nukleozid foszforiláz nátrium-foszfát puffer

PEG PMSF SDS TES TRIS

polietilén-glikol fenil-metil-szulfonil-fluorid nátrium-dodecil szulfát N-trisz(hidroximetil)metil-2-amino-etán-szulfonsav trisz-(hidroximetil)-aminometán

A dolgozatban a drog, ligandum, inhibitor jelölt molekula, és az antagonista szavakat szinonimaként használom!

5

1. Célkit zéseink a következ k voltak:

Diplomamunkám témáját egy Európai Uniós pályázati munka hívta életre, melyben az MTA Enzimológiai Intézetén kívül még hat intézmény vesz részt. A pályázat két évre szól és célja a Mycobactérium tuberculosis dUTPáz enzimének karakterizálása és olyan sz r módszerek kidolgozása, melyek közepes illetve nagy átereszt

képesség ek, így

segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk sz rni az M. tub. dUTPáz enzime ellen ható lehetséges antagonistákat. A lehetséges molekulák szerkezetét a SZTAKI és az ELTE Számítógép-tudományi Tanszékének informatikusai tervezik meg, számítógépes modellezés segítségével. Ebben a modellezési munkában a kiindulási adatbázis felöleli mindazokat a hatóanyag molekulákat, melyeket a gyógyászatban használnak napjainkban.

1. A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz vad típusú és mutáns enzim génjének klónozása és a fehérjék expresszáltatása, preparatív el állítása

2. Az M. tub. dUTPáz enzim enzimológiai és fehérjeszerkezeti karakterizálása, UV-VIS és floureszcens spektrofotometriával.

3. Enzimkinetikai mérések végzése arra vonatkozóan, hogy gátolják-e az M. tub. dUTPáz enzimet az antagonisták .

6

2. Irodalmi áttekintés 2. 1. A Mycobacterium tuberculosis jelenlegi kemoterápiája

A bakteriális és vírusos járványok még mindig nagy egészségügyi kockázatot jelentenek az emberiségre nézve. A rezisztens kórokozók következtében azok a gyógyszerek, amelyek hosszú ideig hatékonynak bizonyultak, egy id után hatástalanná válnak. Az antibakteriális és antivirális hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerek használata a baktériumtörzseket fokozott, egyedfejl désre ösztönzi. Így az egyes baktériumok képesek a jelenleg használt gyógyszerek jelenlétében is életképesek maradni. Ezért fontos a folyamatosság az antibakteriális szerek fejlesztésében. A mutációk kijátszásához összetett gyógymódok szükségesek, amelyek eltér hatásmechanizmussal rendelkeznek, és hatásuk egyértelm en és gyorsan összehasonlíthatóak. Mindez lehet vé tenné, hogy a lehetséges molekuláris célpontok között valódi választási lehet ség álljon fel. A néhány molekuláris célpontra való összpontosítás helyett, eredményesebbnek bizonyulhat, ha kombinált terápiával egyszerre több célpontot támadunk. E tekintetben, a fehérjék, mint célmolekulák széleskör lehet séget biztosíthatnak. A célfehérje azonosítása nagy kihívást jelent a molekuláris biológusoknak, genetikusoknak és enzimológusoknak. Kutatásunk legfontosabb célja, hogy új módszereket keressünk a célpontok azonosításához, valamint, hogy potenciális ellenszereket keressünk. Ebben a munkában számos tudományterület ill. határtudomány is szerephez jut: a számítástechnika, a bioinformatika, a biofizika, a fizikai-kémia, valamint molekuláris biológia. Jelen esetben az M. tub. dUTPáz enzimén végezzük a kísérleteket. A Mycobacterium tuberculosis

a tuberculosis (TBC) nev betegség kórokozója,

ami egy Gram-pozitív baktérium, amely a fejlett és fejl d országokban egyaránt súlyos egészségügyi problémát jelent. A hordozókban jó néhány évig vagy akár évtizedig is lappanghat a kórokozó anélkül, hogy tüneteket okozna, így a hordozó tudta nélkül, el segíti a betegség légutakon keresztül való terjedését, hiszen ezek a páciensek már bármerre utazhatnak a világban. Az els terápia elég gyakran sikeresnek ígérkezik, mert a súlyosabb tüneteket gyorsan kezeli. Ahhoz azonban, hogy a baktérium teljesen elt njön a beteg szervezetéb l, egy jóval hosszabb komplex gyógyszeres kezelésre van szükség. Azok, akik nem tartják be a szigorú gyógyszeres kezelést, el segítik a multirezisztens törzsek kialakulását, amelyeket aztán nehezebb

7

elpusztítani. Nem véletlen, hogy számos országban hosszú ideig kötelez volt a tüd baj (Mycobacterium tuberculosis-al való fert zöttség) sz rése. A betegség terjedését sikerült az 50-es évekre megállítani ill. a széleskör

sz réseknek köszönhet en kordában tartani,

azonban a XX. század második felében újra növekedésnek indult. A WHO az elkövetkezend évtizedre 200 millió TBC-s beteget prognosztizál. (forrás:WHO). A fert z betegségek között a halálozási arányát tekintve az AIDS után a tuberculosis a legsúlyosabb. A M. tub. legf bb DNS polimeráza olyan enzim, ami a DNS-hibákat jól tolerálja, így lehet séget ad a mutációk kifejl désének. Ez az enzim fontos szerepet játszik a baktérium gyors evolúciójában (1), (2). Ezen okokból kifolyólag a baktériumnak kiemelked en nagy a mutációra való hajlama és a nem megfelel gyógyszeres kezelés következtében a multirezisztens M.tub törzsek könnyebben kifejl dnek. A M.tub genomját napjainkra szekvenálták és leközölték (3). Néhány M.tub. fehérjét nagy felbontó képesség szerkezeti vizsgálatnak vetettek alá és jelenleg 72 darab különböz háromdimenziós fehérje (többségében enzim) szerkezet érhet el a fehérje adatbankból, ami jóval több támadási felületet jelenthet, mint amit a jelenleg alkalmazott 4 db TBC ellenes szer lefed. Napjainkban a következ

négy gyógyszert alkalmazzák a tuberculosis elleni

kezelésekben: streptomycin, rifampicin, isoniacid és pyrazinamid. A streptomycin a bakteriális riboszómát támadja meg (5). Köt helye a riboszómális alegységek határfelületén található.

A rifampicin szintén elterjedt a tuberculosis elleni

gyógyászatban. A legtöbb rezisztens mutáns esetén a mutáció az RNS-polimeráz béta alegységét érinti (6). Az izoniacid támadási pontja az enoil-reduktáz enzim, amelynek a mikolsav bioszintézisében van szerepe. A mikolsav származékok a Mycobacterium sejtfal szintéziséért felel sek (7). Az izoniacid rezisztencia hátterében a kataláz-peroxidáz inaktivációja áll. A kataláz-peroxidáz felel s az izoniacid el anyagának biológiailag aktív anyaggá való átalakításáért (8). A kataláz-peroxidáz hiánya együtt jár egy emelkedett alkilhidroxi-peroxidáz termeléssel. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitás a kataláz-peroxidáz hiányában védelmet nyújt az antioxidánsok ellen. Az alkilhidroxi-peroxidáz aktivitásért felel s enzimek szintén újszer célpontok lehetnek az új Mycobacterium elleni ellenszerek kifejlesztésében (9). A pyrazinamid, ami szintén egy prodrog az izoniacidhoz hasonlóan, in vivo célpontját eddig még nem sikerült azonosítani de számos, az emberiséget sújtó betegség esetén figyelemre méltó hatékonysággal alkalmazzák. A pyrazinamid elleni rezisztenciáért legf képpen a pncA gén mutációja felel s. Ez a gén egy olyan fehérjét kódol, amelynek pyrazinamidáz aktivitása van. A pyrazinamidáz enzim alakítja át a prodrog pyrazinamidot az aktív hatóanyaggá (10),(11). 8

Az egyik f probléma a fent említett gyógyszerekkel, hogy léteznek olyan M.tub. ágensek, amelyekre teljesen hatástalanok. Másodsorban ezeknek, a gyógyszereknek a használata egyfajta átfogó ismeretet és orvosi rutint igényel. A kezelést nem könny követni fert zött populációban f leg abban az esetben, ha a betegek nem értik meg, hogy a gyógyszereket akkor is szedni kell, ha már a közérzetük javuló tendenciát mutat. Harmadszor ezek a meglehet sen hosszú és komplex gyógyszeres

terápiák

nagyon

drágák.

Negyedszer

különböz

mellékhatások

is

jelentkezhetnek, (a közepes rizikófaktorúaktól a magasig, mint például a májgyulladás) legf képpen érzékeny betegek esetén, akik legyengült immunrendszerrel rendelkeznek és/vagy nincsenek optimális tápláltsági állapotban. Végül ötödször a gyógyszeres kezelést hetenkénti vérvétellel és májfunkció vizsgálattal kellene összekötni, ám ezek a tesztek költségesek továbbá az aktív együttm ködés az orvos és a páciens között elengedhetetlen. Mindebb l jól érzékelhet , hogy az újszer gyógyszeres kezelések rendkívül fontosak (12).

2. 2. A dUTPáz, mint ígéretes célfehérje 2. 2. 1. A dUTPáz szerepe az él szervezetekben

A dezoxiuridin trifoszfát nukleotidhidroláz (dUTPáz) enzim a dUTP hidrolízisét katalizálja dUMP-vé és inorganikus pirofoszfáttá az alábbi reakció alapján: dUTP + H2O

dUMP + PPi + 2H+

A reakcióban a dUTPáz enzim kofaktora a Mg2+ ion (13),(14). A reakció a nagy energiájú foszfát hidrolízise miatt gyakorlatilag irreverzibilis. Ezzel a reakcióval az enzim lecsökkenti a sejtben a dUTP szintet, miközben termeli a dUMP metabolitot, ami a dTTP bioszintézisének alapvet prekurzora (a timidilát szintáz szubsztrátja). A dUTPáz így m ködésével szabályozza a dUTP/dTTP szintet, alacsonyan tartva a dUTP koncentrációját a sejtben. A DNS megkett z dés hibátlan kivitelezéséhez elengedhetetlen a nukleotidok megfelel arányának és koncentrációjának szabályozása, ezért a dUTPáz élettani szerepe kiemelked en fontos és nélkülözhetetlen (15). A DNS-polimeráz adeninnel szemben azonos valószín séggel épít be uracilt és timint, mivel a két bázis közti különbséget -a metilcsoport meglétét, illetve hiányát- nem érzékeli.

9

Ezért a dUTPáz enzim hiányában kialakuló magas dUTP koncentráció uracilbeépülést eredményez a DNS-be. A DNS szekvenciában számos környezeti hatás változást, mutációt eredményezhet. A mutációk kiküszöböléséhez a génállomány folyamatos ellen rzésére és javítására van szükség. Erre a DNS-ben több javítómechanizmus is kialakult (pl.: a timidin dimerek kivágása, a nem komplementer bázispárok kivágása, stb.), melyek a már bekövetkezett módosítást észlelik és kijavítják, de megel zni nem képesek. Így a DNS-ben megjelen uracilt a sejtek hibaként érzékelik, és a báziskivágáson alapuló javítómechanizmus segítségével távolítják el. Ez a gyakori hiba kétféle folyamat eredményeként jelenhet meg a DNS-ben (16): a már említett magas dUTP koncentráció miatti timin helyére történ beépülés, valamint a citozin spontán, oxidatív dezaminálása révén (17,18). A citozinból képz d

uracil (1. ábra) káros, mivel a következ

replikáció alkalmával guanin helyett

adeninel alkot bázispárt és így örökletes pontmutáció jelenik meg a genetikai anyagban. Mivel a sejt nem tudja, hogy a DNS-be beépült uracil ártalmatlan (timin helyettes), vagy mutagén (citozinból képz dött) (19), (20), (21), ezért minden uracil eltávolítása szükséges a genetikai információ meg rzéséhez.

N

H

N H

C N

C C

C N

C N

O N C

H

H

H

C C

C N

H

oxid atív d ez am in álás

C 1'

O H

H

N

g u an in

C H3 H N H

C N C 1'

C C

N C N

O

H

H

N C

C N

C C

C N

H C 1'

O H

ad en in

tim in (5 -m etil-u rac il)

1. ábra Citozin dezaminálása és a bázisok bázispárosodási tulajdonsága

10

C

C N

u rac il

c itoz in

H

C 1'

N

C

O

O

H

C

H C 1'

Ezért a timin helyére való uracilbeépülést a dNTP szintek pontos szabályozásával kell a sejtnek kivédenie, amit a dUTPáz enzim kétfel l is biztosít. A dUTPáz enzim hiányában, az osztódó sejtben a magas dUTP/dTTP arány jelent s uracil tartalmú DNS szintézisét okozza. Ez aktiválja az uracil kivágásán alapuló javítómechanizmust. A javítás azonban a továbbra is fennálló magas dUTP/dTTP arány mellett nem lehet sikeres, mert a DNS-polimeráz a kivágott uracil helyére újra uracilt épít be. Az így megnövekedett uracil tartalom feler síti a hiábavaló javítómechanizmust (hiperaktív m ködés), és kett sszál törésekhez, kromoszóma fragmentálódáshoz, majd a sejt halálához vezet (15), (22). Ezt a jelenséget más néven timinmentes sejthalálnak nevezik (2. ábra) (22).

2. ábra A dUTPáz szerepe a dTTP bioszintézisében és a DNS uracil mentességének biztosításában.

A dUTPáz enzim tehát kett s szerepet játszik a sejt normális m ködéséhez szükséges DNS integritás meg rzésében (3. ábra). Egyrészt megel zi a hibásnak min sül , ártatlan uracil tartalmú DNS létrejöttét, vagyis preventív hibajavító-funkcióval rendelkezik (11). Másrészt szerepe van a DNS hibajavításához és a DNS szintéziséhez egyaránt szükséges

11

nukleotid épít elemek megfelel

arányának biztosításában: részt vesz a dTTP szint

szabályozásában.

3. ábra A dUTPáz kulcsszerepe a dTTP de novo szintézisében és a dUTP szint csökkentésében (12)

A de novo útvonal els dleges metabolitja az UMP (középszürke háttéren), mely glutamin, bikarbonát és ATP kiindulási anyagokból, hat enzim segítségével jön létre (az ábrán nincs jelölve). Az UMP képezi a kiindulási anyagot a többi pirimidin ribo- és dezoxiribonukleotid szintézise számára. A kinázok általában a foszfátlánc hosszára, a reduktázok pedig a cukorra nézve specifikusak csupán, míg a bázisok átalakítását katalizáló enzimek a cukor, a foszfát és a bázis részre egyaránt specifikusak. A pontozott vonallal jelölt útvonal csupán egyes prokariótákban (pl. E. coli) létezik, míg a szaggatott nyíllal jelölt dCMP dezamináz enzim az enterobaktériumokból hiányzik, de eukariótákban megtalálható. A dUTP/dTTP arány szabályozásának két kulcsenzime: a dUTPáz és a timidilát szintáz (sötétszürke háttérrel, bekarikázva látható).

12

2. 2. 2. A dUTPáz, mint új gyógyszeripari célmolekula

A dUTPáz enzim szerepe alapvet

fontosságú az aktív DNS szintézist folytató

sejtekben (23),(24). Ennek megfelel en az enzim jelenléte és aktivitása a sejt ciklusától és a szövet fejl dési állapotától függ

módon szabályozódik (25),(26). A dUTPáz enzim

specifikus gátlásának lehet ségével sejtpusztulás indukálható, amellyel terápiás hatást érhetnek el a rákos, vagy egyes bakteriális és vírusos, fert z megbetegedések esetén. A rákellenes terápiákban, széles körben alkalmazzák a timidilát bioszintézisért felel s enzimeket gátló gyógyszereket. Mivel már a rákos sejtek kialakulása is nagyrészt annak tudható be, hogy a programozott sejthalál (apoptózis) útvonala bennük jelent s részben gátolt folyamat (27). Ezek közül is a legismertebb a timidilát szintetázt blokkoló fluorouracil, valamint a dihidrofolát- reduktáz gátlásáért felel s methotrexát, amelyek jelent s mértékben növelik a sejtben található dUTP/dTTP szintet (4. ábra), (28). Ez a hatás az aktív DNSszintézist folytató - például tumoros, illetve vírus által fert zött - sejtek esetében timinmentes sejthalálhoz vezet. Megfigyelték, hogy az említett gyógyszerek alkalmazása estén rezisztencia alakulhat ki, ami összefüggésbe állhat a kezelt sejtvonalakban kimutatható er sen megemelkedett dUTPáz aktivitással. Az is bizonyítást nyert, hogy a dUTPáz-szint genetikai manipulálással el idézett növelése egyes humán tumoros sejtvonalakban fluorouracil rezisztenciát vált ki (29),(30), valamint a dUTPáz hiánya érzékenyebbé teszi a sejteket a timidilát szintázt gátló szerekre (31). A legújabb kutatási eredmények szerint a dUTPáz enzim, a multidrog rezisztencia kialakulásában is részt vehet (32). A dUTPáz antagonizmus esetleges kemoterápiás hatására utal az a tény is, hogy szubsztrát analóg inhibitorok humán rákos sejtvonalakon ugyancsak szelektív gátló hatással rendelkeznek, in vitro (33). A legfrissebb szakirodalomban publikált eredmények szerint a timin mentes sejthalál útvonala független a p53 fehérjét l (30), (34), így az apoptózis e formáját indukáló szerek p53 mutáns sejtekben is gyógyulással bíztató eredményeket produkáltak. A dTTP bioszintézis els

lépését gátló dUTPáz antagonista hatékony alternatívát

nyújthat a p53 funkció vesztett, valamint a fluorodezoxiuridinre rezisztenssé vált daganatok esetében is.

13

dUTPáz antagonisták

dUTP

dUTPáz

dUMP

Fluorouracil (FdUMP)

DNS dTTP

dTDP

TS dTMP

THF DHF reduktáz

Methotrexát

dihidrofolát

4. ábra

Timin metabolizmus. Timin-mentes sejthalál a kemoterápiában. Timin-mentes sejthalál indukálásával ható napjainkban alkalmazott kemoterápiás szerek és célpontjaik a timin metabolizmusban. A dUTPáz gátlása kiegészít vagy önálló terápiaként ígéretes.

A dUTPáz tehát fontos célpont a kemoterápiás gyógyszermolekula tervezések számára is, ezért szükséges az enzim minél pontosabb strukturális és funkcionális megismerése. A különböz kísérletekbe bevont fajok dUTPáz enzimének karakterizálása, az aktív centrumban szerepet játszó aminosavak pontos térbeli elhelyezkedésének megismerése, mind hozzásegíti a kutatókat a kés bbi terápiás alkalmazásokhoz.

A Mycobacterium tuberculosis evolúciója során szoros kapcsolatot alakított ki az emberi szervezettel ill. a humán szervekkel, amelyeken kívül nagymértékben életképtelennek tekinthet . Jelen dolgozatomban azonban csak a dUTPáz enzimének és annak kapcsolatrendszerét vizsgálom. Az 5. ábrán nukleotidok átalakulása figyelhet

meg. Az

emberi szervezetben a sejtek a dTMP t több úton is el állíthatják úgymint: dCMP-b l, dUTP-b l, timinb l, ezzel szemben a M.tub. csak a dUTP-b l képes a dTMP-t szintetizálni, amit kizárólag a dUTPáz enzim szintetizál dUTP-b l. Tehát a M. tub. dUTPáz enzimének esetleges gátlása esetén, az egyetlen útvonal is elzáródhat a dTMP szintetizálódása el tt. Így nem is alakulhat ki dTTP, ami a DNS szintézisekor hiányozni fog. Ez végül a baktérium pusztulásához vezethet.

14

DNS polimeráz

Nukleozid difoszfát kináz és dTMP kináz

deamináz

dUTPáz útvonal Timidilát szintáz

deamináz

Timidin kináz timidin 5.ábra

A M. tub. genomja sem a dCMP deamináz sem pedig a timidin kináz génjét nem tartalmazza, így nincs alternatív útvonal a dUMP keletkezésére, csak a dCTP deamináz és a dUTPáz által meghatározott dCTP

dUTP

dUMP útvonal létezik.

15

2. 3. A dUTPáz szerkezete és reakciómechanizmusa

A dUTPáz enzimek negyedleges szerkezetük alapján legáltalánosabban homotrimer szervez dés ek, megtalálhatók a prokariotákban, az eukariótákban és a legtöbb vírusban egyaránt (36),(37) (6. ábra). Minden dUTPáz enzimben öt konzervált szekvencia motívum található, melyek az aktív centrumban, vagy annak közelében helyezkednek el. Különféle fajokból származó dUTPáz enzimek szekvenciája nagy hasonlóságot mutatnak az aktív centrum felépítésében és a magas szubsztrát-specifitásban (38).

Monomer B

Monomer C

Monomer A 6. ábra A trimer dUTPáz szerkezete.

Az enzim egy szimmetrikus trimer, amelynek alegységei 152 aminosavból állnak (38), (39). A különböz enzimek alegységeit alkotó peptid láncok hosszúsága különböz lehet, de szerkezetük mégis jól fedésbe hozható egymással, néhány huroktól eltekintve. A különböz organizmusokból származó dUTPázok között a korlátozott szekvencia azonosság a jellemz , mégis minden igazoltan dUTPáz aktivitással rendelkez és dUDP hidrolízist nem katalizáló fehérjében megtalálható az öt konzervált szekvencia motívum (38). A dUTPáz enzimek többsége homotrimer enzim, azaz három teljesen azonos polipeptid láncból áll. Ez a trimer szervez dés viszonylag ritka az enzimek körében. További

16

érdekessége a szerkezetnek, hogy három szimmetrikus aktív hely található benne, és mindegyik kialakításában mindhárom fehérjealegység részt vesz (6. ábra). A fehérje alegységek harmadlagos szerkezete egy nyolcszálas ún. lekváros tekercs (jelly roll) -hordó, melyben az egyes szálakat -kanyarok kötik össze. (7. ábra).

7. ábra

A tekercsszer szervez dés ideális esetben (A) és dUTPázoknál (B).A: a -szálak összerendez dése ideális esetben, B: a -szálak kapcsolódása dUTPázoknál.

Az aktív centrumok, a kristályszerkezetek alapján, az alegységeket elválasztó felszíni mélyedésben találhatók, kialakításukban a három alegység a következ módon vesz részt; (8. ábra): Az egyik fehérjealegység a 3. szekvencia motívumból származik (8. ábra, a kék Tyr82), az a torzult antiparalell

-hajt , ami az uracil koordinálásáért felel s. Az uracil

beékel dik a -hajt be és a DNS-ben megszokott bázispárosodási hajlamnak megfelel en hidrogén-hidakkal kapcsolódik a f lánc-atomokhoz. Ez a bázis felismerési mechanizmus nagymértékben specifikus (40).

17

Asp26 Arg62

Gln108

Asp79

Arg130

Tyr82 Phe135

8. ábra

Az , -imino-dezoxiuridin-trifoszfát (dUPNPP) szubsztrátanalóg köt dése a dUTPáz aktív centrumába A három alegység polipeptidláncát a zöld, kék és sárga szalagmodell mutatja. A centrumba köt d ,

, -imino-

dezoxiuridin-trifoszfát molekulát pálcika modell mutatja (atom szerinti színezés: C: szürke; N: kék; O: piros; P: narancs). A Mg2+ kofaktor -ami a három foszfát csoportot koordinálja-lila van színnel jelölve.

A másik fehérjealegység -hélix régiójának arginin és szerin aminosav oldalláncai, hidrogénkötéseket létesítenek a szubsztrát

-foszfát csoportjának oxigénjével (8. ábra, 2.

konzervált szekvenciamotívum, sárga Arg62). A harmadik alegység a C-terminális végével az aktív hely fölé hajlik, létrehozva ezzel az enzim zárt konformációját. Ez a C-terminális (kar) régió - ami minden alegységb l kilógva a másik alegységhez nyúlik át - a legtöbb kristályszerkezetben nem látszik, mivel az enzim ezen része flexibilis, és ezért nem lokalizálható. Itt helyezkedik el az 5. szekvencia motívum (8.ábra, zöld alegység). A jelenlegi irodalmi adatok szerint ez a szegmens a - és -foszfát csoportok pontos koordinálásában és az

-

foszfátkötés hasításában játszik valamilyen,

részleteiben egyel re ismeretlen szerepet (40),(41).

18

Az enzim katalitikus mechanizmusáról szolgáltatnak fontos információt a 2004-ben közölt kristályszerkezeti elemzések (42). Ezekben a szerkezetekben azonosítható volt az a vízmolekula, amely a reakció indításáért felel s nukleofil támadásban vesz részt. Ezt a vízmolekulát (melyet 10. ábrán nucleophilic water elnevezéssel, és 336-os sorszámmal van jelölve), egy szigorúan konzervált aszpartát oldallánc koordinálja (Asp83 a 8. ábrán). A reakció sematikus lejátszódását szemlélteti a 9. ábra.

Mg2+ Mg2+

+ 2H+ +

Apo-enzim

E-P

E-S

E

Nukleofil támadás

Reakció termékek

9. ábra A vízmolekula nukleofil támadása és szubsztrát átalakulása látható.

19

10. ábra Az M. tub. dUTPáz katalitikus mechanizmusa kristályszerkezeti eredmény alapján. (a) Az aktív centrum sztereo ábrázolása. Az , -imino dUTP atomok színei a megfelel atomok színei szerint vannak jelölve (C-fehér, O-piros, N-kék, P-sárga). Az aminosavak a konzervált motívum szerint vannak színezve. 1. számú motívum- kék, 2. számú motívum- zöld, 3. számú motívum- sárga, 4. számú motívumnarancssárga és az 5. számú motívum- piros. Az aktív helyet a három alegység együtt alkotja. Az 1, 2 és 4-es motívum kialakításában az A alegység m ködik közre, a 3. motívum felépítésében a B alegység, az 5. motívumban a C alegység. (b)-Elektrons r ségi térkép a ligand, Mg2+ és a koordinált víz molekulákra. (c)-A dUTPáz reakció mechanizmusának sematikus ábrája. Az -foszforatomon a nukleofil támadást indító 336. sorszámú vízmolekula oxigén atomjáról sematikus nyíl indul ki.

20

2. 4. Az Európai Uniós pályázat stratégiája

Ebben a részben vázlatosan mutatom be a diploma dolgozatom alapját nyújtó Európai Uniós pályázatot, és utalok a kapcsolódási pontokra.

A pályázat legfontosabb célja egy olyan protokoll kifejlesztése, melynek segítségével lehet ség nyílik újszer

gyógyszermolekula köt helyek és gyógyszer-fehérje komplexek

azonosítására a Mycobacterium tuberculosis fehérjéken keresztül.

Jelenlegi tudásunk az emberi genomról és a fehérjeállományról új kombinált keresést tesznek lehet vé a gyógyszermolekulák között. A felfedez átbocsátó képesség

technikákat gyakran nagy

módszerekként emlegetik. Ám kizárólag ezeknek, a kísérleteknek

(megfelel en szilárd biológiai háttér nélkül) a lefolytatása alkalmatlan a gyógyszerkutatáshoz. Az EU-s pályázatban egy olyan eljárást szeretnénk kidolgozni, amelynek két f összetev je van. 1.) Olyan módszer kidolgozása, melynek középpontjában egy algoritmikus megoldás áll, amely arra képes, hogy feltérképezze a fehérje felületét, lehetséges köt helyeket keresve, a fehérje háromdimenziós képének segítségével. A legújabb adatokra és információkra támaszkodva, nagy átereszt

képesség

módszert használunk, amely páronként végzi a

vizsgálatot. A két legfontosabb fázisban várunk ellenszer-fehérje párokat; az érdes felület els fázisban (Silico 1) és a még durvább második fázisban, a dokkoló mérésben (Silico 2). Ezt a programot a pályázat matematikus és informatikus résztvev i (ELTE, SZTAKI) hajtják végre. 2.) Egy szerkezeti és molekuláris biológiai eljárás kidolgozása, annak érdekében, hogy a gyógyszer-fehérje párok minél jobban illeszkedjenek. Az eljárásban variáljuk a közepes és alacsony átereszt

képesség

módszereket. Minden javasolt fehérjéhez körülbelül 1000

javasolt antagonista (=inhibitor jelölt molekula, drog, ligandum) van. Ezen párokra, az Enzimológiai Intézet enzimológiai és funkcionális sz r vizsgálatokat tervez és hajt végre.

21

2. 4. 1. Sz r vizsgálati lehet ségek

1.) Gyors és kvantitatív enzimaktivitási mérési módszer kidolgozása ligandumok hatásának vizsgálatára.

A folyamatos mérésekhez egy UV-VIS spektrofotométert alkalmazunk, amellyel a spektrális jelek hiányában az enzim reakciókat páronként futtatjuk. Az enzim reakciók többsége pH változással jár. Ezért ha enyhén pufferolt indikátoros próbát alkalmazunk, akkor a változásokat nagyon érzékeny módszerekkel is követni lehet. Ha az egyes gyógyszerek er s bázisos vagy savas karakter nek bizonyulnak, akkor a só formájuk indikátor alapú enzim vizsgálatokhoz használható fel. Körültekint en megtervezett, kikísérletezett és nagy átereszt képesség tesztek segítségével a Mycobacterium tuberculosis aktív fehérjéi elérhet vé válnak a lehetséges gátló szerek tesztelésére. Ahhoz, hogy a nagy átereszt képesség tesztek eredményeit meger sítsük, a kiválasztott összetev k különálló tesztelésre kerülnek, az izolált fehérjéket, már korábban kikísérletezett tesztek segítségével vizsgáljuk. Jelenleg 72 nem homológ fehérje háromdimenziós szerkezete érhet el a Fehérje adat bankból (Protein Data Bank). A legtöbb (59 darab) ezek közül enzim, néhány ilyen enzimfehérje esetén korábbi tanulmányok alapján valószín síthet , hogy ezek támadása hatékony, újféle gyógyszermolekulák, kifejlesztéséhez vezethet. (EMBL Hamburg, Combinature Biopharm AG, Berlin). Ezek közé tartozik a dUTPáz enzim is.

2.) Érzékeny módszer kidolgozása ligandum-dUTPáz komplex kialakulásának vizsgálatára, kompetitív gátlószerek alkalmazásával.

Ezzel a módszerrel azt tudjuk követni, hogy egy feltételezett, vizsgálandó antagonista molekula kompetitív módon gátolja-e a dUTPáz enzim m ködését. A kompetitív gátlás itt arra utal, hogy az adott antagonista valószín leg, bár nem egyértelm en, az enzim aktív centrumába köt dik, a szubsztrátot onnan kiszorítva. Reményeink szerint a kompetitív gátlási kísérletekben az antagonista köt désén kívül, annak módjáról is további információt nyerünk.

22

2. 4. 2. Szekvencia analízis, munkahipotézisünk A M. tub. dUTPáz enzim primer szerkezete ( aminosavak egybet s kódjával), szürke háttérrel kiemelve az 5. konzervált szekvencia látható alább: 1 MSTTLAIVRL DPGLPLPSRA HDGDAGVDLY SAEDVELAPG RRALVRTGVA VAVPFGMVGL 61 VHPRSGLATR VGLSIVNSPG TIDAGYRGEI KVALINLDPA APIVVHRGDR IAQLLVQRVE 121 LVELVEVSSF DEAGLASTSR GDGGHGSSGG HASL

A M. tub. dUTPáz aminosavsorrendjének összevetését elvégeztük több más faj analóg szekvenciájával (1.táblázat). Szerkezetét tekintve a dUTPáz enzim aminosav szekvenciájának vannak konzervált régiói, amelyek nagy hasonlóságot mutatnak számos fajban. Ezen régiók közül is az ötödik a legérdekesebb a M. tub. szempontjából.

Mycobacterium tub.

"RGDGGHGSSG"

Esherichia coli

"RGEGGFGHSG"

Homo sapiens s.

"RGSGGFGSTG"

Drosophila melanogaster

"RGEAGFGSTG"

1. táblázat Néhány faj dUTPáz enzimének 5. konzervált szekvánciájának aminosavsorrendje

A kutatócsoport korábbi kutatási eredményei alapján az bebizonyosodott, hogy ezen 5. konzervált szekvencia kék színnel kiemelt aminosavak: a 145. H (hisztidin) és a F (fenilalanin) elég közel vannak az enzim aktív centrumához. Az aktív centrumban több aminosav vesz részt közvetlenül Van der Waals ill. ionos kötésekkel a dUTP szubsztrát rögzítésében. Az általunk kiszemelt hisztidin esetében a szubsztráttal való kölcsönhatás szempontjából csak az aromás gy r k közötti átlapolás jöhetett szóba a hisztidin imidazol gy r je és a dUTP uracil gy r je között. Emiatt lehet érdekes a szerepe az enzim aktivitásában. A fenti szekvenciaszakaszokból kiderül, hogy a M. tub. dUTPáz kékkel kiemelt hisztidinje helyett számos faj esetében F (PHE) szerepel. Erre alapoztuk egyik feltevésünket, miszerint: az M. tub. ezen hisztidinje részben felel s lehet az enzim alacsony aktivitásáért.

Az aktivitásban a magnéziumion jelenléte, más dUTPázokhoz hasonlóan segíti az enzim katalitikus funkcióját, ugyanakkor a kinetikai mérésekben meghatározott kcat értékek jóval alacsonyabb enzimaktivitást jeleznek, mint amit más forrásokból származó dUTPázoknál tapasztaltak. Máshol; a kcat=8-15 1/s, itt kcat=0,5 1/s (2.táblátat).

23

Enzim forrás E. coli Human Ecetmuslica(Drosophila melanogaster) Mason-Pfizer majomvírus (retrovírus) M. tub.

kcat [1/s] 10-15 8-10 7-10 1-2 0,5-1,5 2. táblázat

kcat értéke több dUTPázra (1997 Proteins, 2004, J. Biol. Chem., 2003, J. Biol. Chem)

Ahhoz, hogy a

fluoreszcens spektrofotometria számára láthatóvá, detektálhatóvá

tegyük a fehérjénket a 145. hisztidint (His) pontmutáció segítségével kicseréltük triptofánra (Trp), ezt a pontot a 145.hisztidin ideális sztérikus elhelyezkedése miatt választottuk. A tervezés során abban bíztunk, hogy a His145Trp mutáns enzim segítségével képesek leszünk a kutatásba bevont inhibitor jelölt molekulákat aszerint sz rni, hogy milyen mértékben köt dnek az aktív centrumhoz. A köt dés mértékére a gerjesztett triptofán jelintenzitás-változásából következtethettünk.

2. 4. 3. Antagonisták és a dUPNPP- szubsztrátanalóg

Az ELTE-SZTAKI munkatársai által a Silico1 és Silico2 módszerekkel meghatározott molekulák közül 48 inhibitor jelölt molekulát (antagonistát) vontunk be a vizsgálatba.

A

kés bbiek során az inhibitor jelölt molekulákra csak sorszámaikkal fogok utalni (53-52. oldal, 7/a, b táblázat). Az inhibitor jelölt molekulák általános tulajdonságai közül azt emelném ki, hogy f leg DMSO (dimetil-szulfoxid) és DMF (dimetil-formamid) oldószerekben oldódnak, bonyolult többségében aromás szerves vegyületek, molekulatömegük 300-450 g/mol tartományba esik és 10-100 mM-os a maximális oldhatóságuk.

24

Méréseket végeztem továbbá a dUPNPP ( , -imino-dUTP) molekulával. A reakció els lépésének tanulmányozásához fiziológiásan releváns enzim-szubsztrát komplex szerkezet el állítása érdekében els ként el állítottunk egy olyan szubsztrát analóg ligandumot, amely a természetes szubsztráttal várhatóan analóg módon, és hasonló er sséggel köt dik az enzim aktív helyén, az enzimmel Mg2+ jelenlétében alkotott komplexének élettartama viszont lényegesen hosszabb a természetes szubsztráténál. Az

, -imino-dUTP a dUTP-hez

hasonlóan dezoxi-uridin trifoszfát származék, de hasadó P O kötés helyett P N kötést tartalmaz.

N

11. ábra - Az , -imino-dUTP szubsztrátanalóg szerkezeti képlete

A nitrogénatom oxigénénél kisebb elektronegativitása következtében a foszfátészterek imino analógjai jelent sen kisebb reaktivitással rendelkeznek, mivel általában az ezeket bontó enzimek a P N kötést jóval nehezebben, vagy egyáltalán nem hasítják a P O kötéshez képest. A foszfátészter kötést hidrolizáló enzimek többsége egyáltalán nem hidrolizálja az iminoanalógokat, mivel ezek az analógok ugyanúgy köt dnek az enzimekhez, mint azok természetes szubsztrátjai, kompetitív inhibitorként viselkednek.

A 3. táblázat összefoglalva mutatja a dUTPáz katalizált dUTP és , -imino-dUTP hidrolízis reakciókra vonatkozó kinetikai és ligandumkötési állandókat.

25

Nukleotid dUTP , -imino-dUTP

kcat (s-1)

KM ( M)

kcat/KM (M-1s-1)

11

0,5

1,4x107

2 x10-5

1,0a

20b

3. Táblázat dUTPáz katalizált dUTP és , -imino-dUTP hidrolízis reakciók kinetikai és ligandumkötési állandói

A bemutatott adatok 3-5 független mérés átlagolásából származnak. A kcat és KM meghatározások átlagos hibája 12% illetve 17% volt. a

Az

, -imino-dUTP hidrolízis reakciót jellemz

nagyon alacsony kcat érték, a KM

meghatározását megbízhatatlanná tette, ezért itt a korábban meghatározott Kd érték szerepel. Feltételezve, hogy a szubsztrát köt dése és a termékek távozása gyors a kémiai reakcióhoz képest, a KM-re és Kd-re azonos értékek várhatók. E feltételezés jóságát a dUTPázra egy korábbi kinetikai analízis igazolta. b

kcat/Kd A dUTP-re és imino analógjára vonatkozó nagyon hasonló köt dési állandók (KM, Kd,

lásd 3. táblázat) a két hidrolizálható nukleotidra hasonló köt dési pozíciót és konformációt valószín sítenek, annak ellenére, hogy a hidrolízis sebessége majdnem 6 nagyságrenddel különbözik. E kinetikai és ligandumköt dési paramétereknek megfelel en az , -imino-dUTP is a dUTPáz enzim szubsztrátjának tekinthet .

26

3. Anyagok és módszerek

3. 1. Az M. tub. dUTP-áz és a His145Trp mutáns M. tub. dUTP-áz klónozása

A dUTPáz fehérjét kódoló 0.47 kb nagyságú génszakaszt a Mycobacterium tuberculosis H37Rv jelölés

genomiális DNS-éb l, forward és reverz oligonukleotid

primerekkel szaporítottuk fel PCR technika segítségével. Az N-terminális végre még hat hisztidinb l álló láncolt is terveztünk, hogy a fehérje tisztítást megkönnyítsük. A felszaporított dUTPáz génszakaszt NdeI és BamHI enzimekkel emésztettük. A pET3a plazmidot, amibe a mi génünket klónozni akartuk, kétféle módon emésztettük. Ez a vektor tartalmaz egy ampicillin antibiotikum rezisztenciát kódoló génszakaszt, melynek közepén van egy PstI restrikciós enzim hasító hely. Az egyik emészt elegyben (I. emésztés) BamHI és PstI enzimekkel, a másikban (II. emésztés) NdeI és PstI enzimekkel vágtuk el a plazmidot. (12.ábra) Az emésztés lejátszódását agaróz gélen ellen riztük, majd gélb l kivágtuk és eluáltuk a megfelel fragmenseket. Az I. emészt elegyben ez a kisebb fragmenst jelentette, míg a II. emészt elegyben a hosszabb DNS fragmenst. Ezek után a három DNS szakaszt összeligáltuk, majd ezt a plazmidot BL21 (pLysS) E. coli törzsbe transzformáltam fehérje termeléséhez. Ezzel a plazmiddal termelt fehérjét nevezzük vad típusúnak. Els re nagy kihívást jelentett volna a His145Trp M.tub. dUTPázt tartalmazó plazmid elkészítése, ezért ezt a m veletet is a csoport többi tagjával közösen végeztük. A mutációt a QuikChange Mutagenesis Kit segítségével végeztük, amely esetben szintén meg kellett tervezni az oligonukleotid primereket ( reverz és forward) amelyek már tartalmazták a hisztidin bázisbármasa helyett a triptofán bázishármasát, komplementer végeket (hat bázisból álló részek ).

27

ill. a primerek végére a

12. ábra A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz klónozási sémája. A színes téglalapok a jelölt restrikciós enzimek vágóhelyeit azonosítják.

A mutáció kivitelezéséhez szintén PCR ( polimeráz láncreakció) reakciót alkalmaztam amihez: egy 0,5 ml-es PCR-cs be a következ ket mértem össze 50 µl reakcióelegyhez: 5 µl puffer + 38,5 µl deszt.víz + 1 µl plazmid ( a 6 hisztidinnel ellátott M. tub. .dUTPáz génjét tartalmazó plazmid) + 1-1 µl reverz ill. forward oligomer, amelyek a Trp (triptofán) bázishármasát tartalmazták + 1µl dNTP mix és a végén pfu turbo és Taq polimerázt. Maga a h reakció programozható melegít s vízfürd n zajlott, egy ciklus a következ lépésekb l állt : denaturáció (95°C)- 30s, primerköt dés (55°C)-60s, DNS-szintézis (72°C)-60s, Ezt a folyamatot 19-szer ismételtettem meg. A reakció eredményeként vélhet en el állt a His145Trp mutáns M.tub dUTPáz génjét tartalmazó plazmid, amelynek eredményességét megtisztítása után a szekvenáltatás igazolt, így tovább folytathattam a munkám.

28

3. 2. A fehérjék expressziója és feltárása

Az M. tub. dUTPáz vad típusú és a His145Trp mutáns enzim génjét tartalmazó pET plazmidokkal E. coli BL21 (pLysS) sejteket transzformáltam. Ampicillin és klóranfenikol antibiotikumok alkalmazásával biztosítottam, hogy csak a plazmidot felvett sejtek szaporodjanak. Az ampicillin rezisztenciáért felel s gén a pET vektoron volt, a klóranfenikol rezisztencia génje pedig a pLysS plazmidon, amelyet a BL21-es sejtek már tartalmaztak. A pLysS plazmid továbbá tartamazza a T7 RNS polimerázt gátló lizozim génjét, hogy elkerüljük az esetleges dUTPáz enzim IPTG hozzáadása el tti termel dését. A sejtek növekedését 500 ml Luria-Bertani tápoldatban az exponenciális növekedési szakasz eléréséig követtem. A növekedést a turbiditás mérésével (600 nm-n mért abszorbancia) követtem. Az exponenciális növekedés elérésekor a sejtkultúrát 0,5 mM izo-propil-tio-galaktozid hozzáadásával indukáltam, majd 4 óráig tovább növesztettem. A sejteket lecentrifugáltam, majd lízis pufferben feltártam. A feltárás során célunk, hogy megbontsuk a sejtfalat, és a plazmában található, oldható fehérjéket

f leg a dUTPázt

sértetlenül oldatba vigyük. A sejtfal megbontásával azonban

bizonyos proteázok m ködésbe lépnek, és rongálják a fehérjéket, ezért szükséges, hogy ezeket hatástalanítsuk, amit a lízis pufferbe adagolt EDTA-val és EGTA-val (amik a metalloproteázokat gátolják), valamint PMSF-fel érünk el (fenil-metil-szulfonil-fluorid, ami a szerin oldallánccal m köd enzimeket

pl. tripszin, kimotripszin- specifikusan gátolja úgy,

hogy velük kovalens komplexet képez). Továbbá adtam még DNázt, RNázt és DTT-t (ditiotreitol), amely megvédi az

SH csoportokat az oxidálástól azáltal, hogy maga a DTT

oxidálódik és lizozimot a sejtfal bontásához. A fenti adalékokkal és üvegreszelék együtt az oldatomat (a hatékonyabb sejtroncsolás érdekében) jégben állva 30 percig kevertettem mágneses kever vel, majd 3*2 perc szonikálás következett ekkor ultrahangos készülékkel szétroncsoltam a maradék sejttörmeléket. Újból jégben állva 30 perc kevertetés, majd 20 perc cenrifugálás 12000 rpp (rotáció/ perc) következett. Az itt keletkezett felülúszó a fehérjém oldata, ami rengeteg egyéb fehérjét, DNS-t tartalmazott, de ezt az oldatot már lehetett felvinni a Ni ion affinkromatográfiás oszlopra.

29

3. 3. Fehérjék tisztítási lépései

3. 3. 1. Ni-ion oszlop affinkromatográfia A

plazmidunk

tervezésénél

figyelembe

vettük,

hogy

a

fehérjetisztítást

megkönnyíthetjük, ha

a fehérje szekvencia N-terminális végére tervezünk még egy hat

hisztidinb l (14.ábra)

álló (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-) aminosavszakaszt, melynek

eredményeképpen sokkal nagyobb valószín séggel fog megköt dni a hordozóhoz. Ebben a kromatográfiás gélben ugyanis Ni2+ ionok vannak rögzítve a hordozóhoz, amelyek koordinációs kötésre képesek az imidazol gy r kkel, így a hisztidinnel (13. ábra).

H N

H N

O NH2

N

Imidazol

N

hisztidin 13. ábra

Az alábbi folyamatot kétszer hajtottam végre külön-külön a két fehérjeoldattal (vad típus és mutáns). A mintegy 4 cm magas Ni ionokat tartalmazó gyantára felvittem a sz rt tömény fehérje oldatomat. A számtalan egyéb fehérjével szennyezett oldatom az oszlopon elszínez dést okozott, és ezzel párhuzamosan megtörtént a koordinációs kötések kialakulása a fehérjém 6 hisztidinje és az oszlop Ni ionjai között (14.ábra). Az oszlopról a lassan lecsöpög átes t gy jtöttem. Ezután következett a mosás, erre két puffert használtam:

HS (50 mM Hepes +300 mM KCl pH 7.5) LS (50mM Hepes + 30 mM KCl pH 7.5)

A pufferekkel azokat a szennyez fehérjéket lehet leoldani, amelyek egyéb ionos kötéssel kapcsolódtak a Ni ionhoz ( izoelektromos pontjuktól függ en). A mosás menete a következ volt: El ször 2 térfogatrész LS pufferrel mostam az oszlopom, ami jelent s mennyiség egyéb fehérjék mellett a célfehérjémb l is leoldott egy kis mennyiséget, ez mindig el fordul ennek mértékét a kés bbi gélelektroforézissel állapítottam meg. Az átmosódott oldatból egy-

30

egy cseppet rendszeresen tettem a korábban Eppendorf csövekbe el készített 500 µl Bradford reagenshez, ami kék elszínez dét mutat fehérje jelenlétében. A kék szín árnyalatából lehet tájékozódni, hogy a leoldódóban lév fehérje koncentrációja hogyan alakul. Esetemben az LS puffer által lemosott oldat mélykék színe és annak halványodása a mosás során jelezte, hogy a szennyez fehérjék többsége távozott. Ezután a HS pufferrel folytattam a mosást. Itt már közel sem volt annyira nagy a leoldott fehérje mennyisége. A sós mosás befejezéseként még egy térfogatrész LS-sel mostam, ekkorra már a Bradford reagens semmilyen elszínez dést nem jelzett, így elkezdhettem a mosási folyamat következ fázisát.

14. ábra

A sós mosást követ en, az

imidazol két, egy nagyságrenddel eltér

oldatát

alkalmaztam, hogy kompetitíve kiszorítsa a hisztidint a Ni ionnal való ligandkötéséb l, emellett még el fordulhattak hisztidin tartalmú szennyez fehérjék is az oszlopon, de ezek közel sem annyira er s kötéssel rögzültek, mint az én hat hisztidines célfehérjém. Ezért el ször 2 térfogatrész híg imidazol oldattal (50mM imidazol, LS az oldószer) ezeket a szennyez , legalább egy hisztidinnel tapadt, fehérjéket távolítottam el. Ebben az esetben is volt egy jelent s leoldódó fehérje gradiens, ami bizonyította, hogy nagy mennyiségben maradt még a sós mosás után szennyez fehérje a célfehérje mellett. Az imidazolos mosási fázis következ lépése a 3 térfogatrész 0,5 M imidazol oldat volt, ami már képes a 6 hisztidint tartalmazó célfehérjém leoldására. A 0,5 M imidazol hozzadását követ en még gyakrabban kellett a Bradford reagenssel ellen rizni a leoldódott oldat fehérje tartalmát. Amint elkezdett mélyülni a kék szín, jelezvén, hogy megindult az oszlopról lefele a célfehérjém, megkezdtem gy jteni a leoldódott fehérjeoldatot egészen addig, amíg nagy fehérje koncentrációt mutatott az elkékült Bradford reagens. A mosási

31

folyamat végére el állt a célfehérjém híg oldata, ami jelent s mennyiség

imidazollal

szennyez dött. Az oszlopot végül 5 térfogatrész desztillált vízzel és 1,5 térfogatrész etanollal mostam.

3. 3. 2. Dialízis

A dialízis célja, hogy a fehérje tisztítása során az oldatba bekerült imidazolt eltávolítsuk. Ehhez olyan membránt vettem igénybe, melyek desztillált vízzel való átmosás, és desztillált vízben történ felforralás után aktiválódtak. A membránokba belemértem a His145Trp mutáns fehérje oldatát (5ml), illetve a másikba vad típus 8ml-ét. Légmentesen lezártam a membránok mindkét végét és a 2 liter dialízis pufferbe ( 20 mM Hepes, 2 mM MgCl2, 0,1 mM PMSF, 1 mM DTT ) helyezetem ket és egy éjszakára 4°C-on hagytam.

3. 3. 3.

Membránsz rés

Ehhez Amicon membránsz r t alkalmaztam. A m ködésének lényege, hogy 4,5 bar N2 gáz által biztosított túlnyomás hatására, keverés és h tés mellett, a fehérjeoldat, víz, ion valamint 10 kDa-nál kisebb fehérje tartalma átprésel dik

egy membránon. Ezáltal

betöményedik a fehérjeoldat.

3. 4. Fehérjevizsgálati módszerek

3. 4. 1. Gélelektroforézis, poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE, SDS-PAGE)

A fehérjék méret szerinti elválasztására alkalmazott gyakori módszer az elektroforézis. Adott pH-n a különböz

fehérjék meghatározott számú pozitív vagy negatív töltéssel

rendelkeznek. A molekulák töltésüknek megfelel en adott irányban el kezdenek vándorolni, az egyenárammal m köd elektródok között létrejött feszültségkülönbség miatt. Az egyes fehérjék különböz sebességgel mozognak relatív töltésük miatt, e különbség miatt lehet elválasztani ket egymástól.

32

Az akrilamid vizes oldatban gyökös polimerizációra képes megfelel katalizátorok jelenlétében. A reakció során nagy mólsúlyú lineáris polimer, poliakrilamid keletkezik. Amennyiben a megfelel

keresztköt

ágenst alkalmazzuk, a hosszú poliakrilamid láncok

között hidak képz dnek, és térhálós szerkezet gél jön létre. Ebben a gélben vándoroltatjuk a fehérjéket az elektroforézis során. Az poliakrilamid

SDS-PAGE

(sodium-dodecil-szulfátos-poliakril-amid-gélelktroforézis)

gélelektroforézis

fehérjék

alegységszerkezetének,

a

molekulatömeg-

eloszlásuknak vizsgálatára felhasznált változata. Az SDS (nátrium-dodecil-szulfát) egy er sen anionos detergens. A fehérje mintákat SDS-sel és diszulfid hidakat bontani képes redukálószerrel kezelve, magas h mérsékleten radikális konformáció változások következnek be. A fehérjék közti kölcsönhatások megsz nnek, az alegység szerkezet felbomlik és a fehérjék denaturálódnak. Az SDS

kitekeri

a fehérjéket apoláros részével azok bels ,

hidrofób magját fellazítva. Mivel az SDS anionos detergens, a fehérjéket negatív töltéssel látja el, a fehérje saját töltését maszkírozza, így az SDS- fehérje komplexek töltés/tömeg aránya állandó lesz, függetlenül a fehérje eredeti fajlagos töltéss r ségét l. A köt dött SDS mennyisége egyenesen arányos a lánc hosszával, vagyis a fehérjék molekulatömegével. Ez a módszer kiválóan alkalmas preparált, illetve tisztított fehérje minták tisztaságának ellen rzésére. Gélelektroforézissel beazonosíthatóak a dUTPázt tartalmazó frakciók, és azok tisztasága az enzimre nézve. SDS-PAGE esetén két különböz koncentrációjú gélt alkalmaznak. Az elválsztó gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid tartalma a futtató gélnél jóval alacsonyabb, annyira, hogy itt a molekulasz r hatás még nem érvényesül. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a töltéssel rendelkez fehérje és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe és a fehérjék vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A 12%-os poliakrilamid gél készítését azzal kezdtem, hogy az elválasztó gél oldatát (0.05 ml 10%-os SDS, 1.25 ml elválasztó puffer, 1.5 ml 40%-os akrilamid, 0,04 ml 40%-os N, N -metilén-bisz-akrilamid, 50 µl 10%-os APS, 10 µl TEMED két álló helyzetben lév üveglap közé öntöttem. Az elválasztó gél polimerizációja után rárétegeztem a tömörít gél oldatát (0.025 ml 10%-os SDS, 0.625 ml tömörít puffer, 0.25 ml 40%-os akrilamid, 25 µl 10%-os APS, 5 µl TEMED. Ebbe egy fés t helyeztem,amellyel kialakítottam a mintafelvitel számára a zsebeket a tömörít gélben. A gélelektroforézis esetén a gél megszilárdulása után, a gélt a futtató kádba tettem majd a fés t óvatosan kihúztam. A futtatókádat futtató pufferrel töltöttem fel. A mintákhoz velük 33

azonos mennyiség mintakoktélt adtam (3,55 ml desztillált víz; 1,25 ml, 0,5 M Tris-HCl pH=6.8; 2,5 ml glicerin; 2,0 ml 10 % SDS; 0,2 ml 0,5 % brómfenolkék; 350 mM DTT-t kell belerakni) aminek feladata, hogy denaturálja a mintát, kitekerje a fehérjét, valamint tartalmaz egy kék festéket, aminek segítségével nyomon lehet követni az elválasztást a gélen. A futtatás után a fehérjéket a gélben láthatóvá kellett tennem ehhez

Coomassie

Brilliant Blue-t használják, segítségével a gél keresztmetszetét l és az adott fehérje speciális fest dési tulajdonságaitól függ en akár már 1 µg fehérje is jól detektálható.

3. 4. 2. Fehérje koncentráció meghatározása

A fehérjék mennyiségi meghatározására sokféle módszert alkalmaznak; Biuret, Lowry, Folin-Ciocalteau, abszorbanciás mérések a Lambert-Beer ( A

c

l ) törvény alkalmazásán

alapulva, pl. Bradford módszere. Én az UV-VIS spektrofotometriás módszert alkalmaztam, amelynek lényege, hogy a fehérjékben általában lév tirozin (Tyr) ill. triptofán aromás aminosavaknak 280 nm-nél mérhet elnyelése van. A mérés két kvarc küvettát igényelt. Az egyikbe a gélsz réshez használt puffert ( referenciának ), a másikba a fehérje oldatom 10-szeres hígítása került. Majd felvettem a fehérje oldat spektrumát 230-400 nm között. 280 nm-nél és 325 nm-nél leovastam az abszorbanciákat és ezek különbségével számoltam tovább. A koncentráció számításhoz még szükségem volt a fehérjém extinkciós koefficiensére ( ), amely M-1cm-1 mértékegység , a fehérjeoldat elnyelését adja meg (http://au.expasy.org/cgi-bin/protparam), l =1 cm a küvetta átmér je. A számítást a Lampert Beer törvény alapján számítottam 3.4.2.1. cvad

A280

A325 hígítás l

3.4.2.1

A mérési eredményemet még egy automatizált analizátorral NanoDropTM ND-1000-el is meger sítettem.

34

3. 4. 3. Enzimaktivitás mérése két módszerrel

A kinetikai vizsgálatokban a dUTPáz által katalizált dUTP

dUMP + PPi +H+

reakció lefolyását spekrofotometriásan követhetjük. Egyrészt, a reakció során protonok is szabadulnak fel, és ezek mennyisége egyenesen arányos a képz d

termék (dUMP)

mennyiségével. Az aktivitásméréshez használt elegy összetétele: 1mM TES/HCl, pH=7.5, 150mM KCl, 40 M fenolvörös sav-bázis indikátor. Az elegy tehát csak gyengén pufferolt (alacsony a pufferként használt TES és fenolvörös koncentrációja). Így a dUTP hidrolíziséb l felszabaduló protonok a közeget mérhet mértékben savanyítják. A pH változást az indikátor színváltozásának segítségével követjük, 559 nm-en mérve az oldat abszorbanciáját. A méréseket JASCO-V550 spektrofotométeren, 10mm-es küvettákban, 25oC-on végeztem, 1 µM enzim koncentrációt és 40 µM dUTP koncentrációt használva. A reakciót a dUTP hozzáadásával indítottam (megfelel

mennyiség

dUTP oldatot adagoltam az 1 mM-os

törzsoldatból). A kezdeti reakciósebességet a mérési görbe els 10 másodpercére illesztett egyenes iránytangenséb l határoztam meg. A katalitikus sebességi állandót (kcat) a mért görbéken az els

10 másodpercben észlelt meredekségb l ( A/sec) és a

Ateljes-b l

számítottam ( A: abszorbanciaváltozás, sec: másodperc) a 3.4.3.1. és a 3.4.3.2. összefüggések alapján (a szögletes zárójel a benne foglalt anyag koncentrációját jelenti). [dUTP] sec

k cat

[dUTP] teljes A teljes

[dUTP] sec [dUTPáz]

A sec

3.4.3.1.

3.4.3.2.

Az enzimkinetikai paramétereket, vmax (maximális sebesség) és KM (Michaelis állandó), a teljes mért görbékb l számítottam az integrált Michaelis-Menten egyenlet felhasználásával. Michaelis és Menten után az enzimreakciók általános mechanizmusa: E + S k-1

k1

ES

k2

E + P (E szabad enzim, S szabad szubsztrát, k sebességi állandó, ES enzim-

szubsztrát komplex, P termék). A Michaelis-Menten egyenlet abban az esetben érvényes, ha k2<
ES egyensúly nagyon gyorsan beáll a következ

lépés sebességéhez képest (rapid equilibrium). A Michaelis-Menten egyenlet a v = vmax * [S] / (KM + [S]), ahol v reakciósebesség, [S] a szubsztrátkoncentráció, KM enzim-szubsztrát

35

komplex

disszociációs

állandója,

szubsztrátkoncentrációknál mérhet

más

néven

Michaelis

állandó.

A

reakciósebesség értékét egy derékszög

különböz hiperbola

egyenlete írja le. Amennyiben a reakciósebesség a maximális reakciósebességnek a fele, akkor: KM = [S]. A fentiek alapján számolt katalitikus sebességi állandóra kapott érték ellen rzésére a kcat = vmax / [dUTPáz] egyenletet alkalmaztam. (Fontos megjegyezni, hogy a Michaelis-Menten modell és az ennek felhasználásával levezetett egyenlet a létez legegyszer bb enzimreakcióra vonatkozik. Az enzim esetleges allosztérikus viselkedést nem veszi figyelembe, csupán egyetlen szubsztrát átalakulásának a katalízisét jellemzi. Itt szeretnék utalni arra, hogy míg az azonos és független aktív helyekkel rendelkez E. coli dUTPáz-t jellemz KM értékek megfelelnek a valóságnak, addig az ecetmuslica dUTPáz esetében kapott KM értékek feltehet en csupán megközelít adatok.)

Másrészt, az enzimreakció más enzimekhez való kapcsolása szintén módot nyújthat arra, hogy spektrofotometriával követhet

jelet kapjunk. Az irodalmi adatok szerint a

pirofoszfát terméket két további enzim felhasználásával egy nukleozid származékra vihetjük át (45). A kapcsolt reakció sémáját mutatja a következ (14. ábra):

1.) dUTP + H2O

2.) PPi

dUTPáz

IPP

dUMP + PPi +2H+

2 Pi

(inorganikus pirofoszfatáz)

+ ribóz-1-foszfát

PNP 3.) Pi +

MESG 2-amino-6merkapto-7metilpurinribonukleozid

(purin-nukleozid foszforiláz) 14. ábra

36

MES 2-amino-6-merkapto-7metilpurin

Tehát a 3 reakcióegyenlet egymásután kapcsolt enzimreakciók: SdUTP + EdUTPáz

PPi + EIPP

2 Pi + EPNP + 2MESG

2 MES + 2 ribóz-1-foszfát

ahol SdUTP: az iniciáló szubsztrát E: enzim

A reakció el nye a proton-detektáláshoz képest az, hogy nagyobb érzékenységet tesz lehet vé, és alacsonyabb kiindulási dUTP szubsztrátkoncentráció mellett is alkalmazható, továbbá, pufferolt közegben történik, így stabilabb alapvonalat ad. Hátránya, hogy két további segédenzim meglétét igényli, és szükség van a MESG molekulára is. A kapcsolt enzimreakciókban mindig biztosítani kell, hogy az általunk vizsgálni kívánt enzim legyen a sebességmeghatározó. Ehhez a segédenzimeket megfelel feleslegben kell használni. Ezen körülményeket beállítva, az alábbi összetétel elegyben mérhet a dUTPáz reakció:

-dUTP - 5 µM (ennek hozzádásaval indítjuk a reakciót) - MESG - 100 µM -dUTPáz -150 nM -pirofoszfatáz - 5 U/ml -purin nukleozid foszforiláz - 5U/ml -puffer: 20 mM TRIS HCl, 150 mM NaCl, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH=7,5

A MESG

MES átalakulás során a módosított purin elnyelése 360 nm-en

nagymértékben megn

(az extinkciós koefficiensek különbsége 11000 M-1cm-1), ezt a

változást detektáljuk.

37

3. 4. 4. Fluoreszcens spektrofotometria

Az UV-VIS fénnyel gerjesztett molekulák relaxációja fényemisszióval járhat. Ezt a jelenséget, az azt létrehozó elektronátmenetekt l függ en fluoreszcenciának (S1 nem jár elektronspin-változással), vagy foszforeszcenciának (T1

S0 átmenet,

S0, elektronspin-

változással nem járó átmenet) nevezzük. A fluoreszcens fény intenzitása arányos az elnyelt fény mennyiséggel, ennek megfelel en a fényintenzitás csökkenésével:

F = K (I0-I) Ahol I0 a besugárzó fény intenzitása, I pedig az átes fény intenzitása. A K állandó magába foglalja a besugárzó fénynek fluoreszcens fénnyé való átalakulási valószín ségét (kvantumhasznosítási tényez ), valamint azt, hogy a minden irányban kisugárzott fénynek hanyadrésze jut a mér rendszerbe. A Lambert-Beer törvényb l I értékét kifejezve és behelyettesítve:

F = K I0 (1-e- cl). Ahol

az extinciós koefficiens, c a minta koncentrációja, l pedig a fényút, vagyis a

küvetta hossza. ex ~ 1 X, ha X abszolút értéke nem nagyobb 0,005-nél; így híg oldatban:

F=K cl Ahol

K = K I 0. A fluorimetriás vizsgálatokhoz kett s monokromátorral ellátott spektrofotométert használtam. Az analitikai eljárás kidolgozásához el ször a gerjeszt

monokromátorral a

gerjeszt sugárzás energiáját (hullámhosszát) változtatva megállapítottam, mikor jelent meg fluoreszcencia. A gerjeszt sugárzás hullámhosszának erre az értékre történ beállítása után az emissziós monokromátor segítségével rögzíthet

a minta emissziós spektruma. Ezt

követ en az emissziós monokromátort a maximális emisszióhoz tartozó hullámhosszra beállítva, a gerjeszt

monokromátorral detektálható a gerjesztési spektrum. Mivel a

megvilágító fény intenzitása nagyságrendekkel nagyobb, mint a kisugárzott fluoreszcens

38

fényé, az észlelés iránya nem eshet egybe a megvilágítás irányával. Az észlelés iránya általában mer leges a megvilágító fény irányára. A fehérjék többségében f ként a triptofán (Trp) gerjeszthet . Emellett a tirozin (Tyr) is viselkedhet még fluoreszcensként, de jóval kisebb az általa kibocsátott fény intenzitása. Így ha a fehérjében nincs triptofán, és a tirozinok száma is csekély, fluoreszcenciás analízis nem adhat megbízható eredményt (Ottman, 1995). Fontos megjegyezni, hogy a triptofán fluoreszcensként való viselkedését fehérje molekulában jelent sen befolyásolja a körülötte kialakult mikrokörnyezet. Így amikor a fehérje kitekeredésével a triptofán kikerül a fehérje belsejében eltemetett hidrofób magból, az oldószernek jobban kitett környezet hatására megváltozik az emissziós spektrum jellege. A méréseket JOBIN YVON HORIBA Fluoromax-3 spektrofluoriméterrel, 10 mm-es, küvettában, 25°C-on a számítógépen az Excitation

Acquisition programot használva

végeztem. A mérés kezdetén el ször a felhasznált puffernek (25 mM Hepes, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 8) a gerjesztési ill. emissziós spektrumát mértem, majd a triptofános mutáns fehérjét 295 nm-en gerjesztettem és az emissziós spektrumát 300-400 nm között vettem fel. (15. ábra) - ez 6µM pufferben higított His145Trp dUTPáz enzim emissziós spektruma.

A His145Trp dUTPáz és a puffer emissziós spektruma 80000 70000 60000 50000 Int. 40000 30000 20000 10000 0 300

puffer Trp-mut dut 6µM

310

320

330

340

350 nm

360

370

380

390

15. ábra Az ábrán látható, hogy a His145Trp dUTPáz enzimnek elnyelési maximuma van 354 nm-nél

39

400

His145 Trp dUTPáz enzim fluoreszcens jelintenzitása 354 nm-en

Intenzitás 354 nm-en 140000 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 0

1

2

3 4 5 6 7 8 9 enzim koncentráció µM

10

16. ábra

A 16. ábra jól mutatja, hogy a triptofán jelintenzitása és a koncentrációja között lineáris a kapcsolat ebben a tartományban. A mérési adatok úgy álltak el , hogy 1 és 10 µM közötti His145Trp dUTPáz oldatoknak vettem fel az emissziós spektrumát és 354 nm-nél leolvastam az intenzitás értéküket és ezeket ábrázoltam a koncentráció függvényében.

3. 5. Sejtkultúrás kísérletek az antagonistákkal A sejtkultúrás kísérletet az Országos Korányi TBC- és Pulmonológiai Központ munkatársai végezték közvetlenül M. tub. baktériumokkal. Az elvégzett vizsgálatok célja az volt, hogy megállapítsuk, hogy a számítógépes szimulációval megjósolt fehérje-antagonista köt déseknek van-e olyan hatása, amelyek az M.tub. baktériumok szaporodását meggátolják, illetve megölik-e azokat. A feltevés az volt, hogy ha megfelel helyre (pl. enzim esetében az aktív centrum közelébe) er sen köt d ligand

annyira

megváltoztathatja

a

fehérje

harmadlagos

szerkezetét,

hogy

az

m ködésképtelenné válik. A baktériumok SULA táptalajába különböz

koncentrációkban adagolt anyag

bakteriosztatikus, illetve baktericid hatását mérik, az alábbi (17. ábrán) vázolt módon:

40

Determination of minimum inhibitory concentration (MIC)

M. tuberculosis H 37RV

17. ábra A Korányi intézet munkatársai a fenti munkam veleteket végezték el

A M. tub. sejtkultúrából készítettek egy hígítási sort (0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32-szeres hígítást). A különböz sejtszámú hígításokhoz, a 0,5-szöröst l a 32-szeres hígítási tag felé egyre nagyobb koncentrációban adtak hozzá az éppen vizsgált drogból. Majd egy meghatározott ideig, ami a M. tub-nál hetek, hónapok is lehetnek, 37°C-on növesztették a sejteket. Ezt követ en az els hígítási tagnál elért bizonyos turbiditás értéknél sejtszélesztést készítettek a hígítási tagokból. Azt a bemért drog koncentrációt nevezzük MIC koncentrációnak, amely használata esetén már alig n tt ki M.tub. telep,

MIC: a drog

minimális koncentrációja, amely már gátolja a sejtnövekedést, ha az érték 50 µg/ml alatt van akkor a drog ígéretes, lehet a kés bbi kutatásokhoz. A drogot a MIC érték mellett a kin tt kolónia számával jellemzik (CFU), ez annál a hígítási tagnál van értelmezve, amelynél már sejtnövekedést nem tapasztaltak az inkubációs id alatt. Tehát, ha egy drog esetén a MIC pl. 8 µg/ml és ezt a 8-szoros hígításnál értük el (17. ábra) elképzelhet , hogy ebb l a hígítási tagból 13 telep n ki a szélesztést követ en ebben az esetben a CFU=13, de lehet, hogy nem n ki egy sem, akkor a CFU=0.

41

4. Eredmények és kiértékelésük 4. 1. A fehérjék el állítása

A Mycobacterium tuberculosis vad típusú és His145Trp mutáns dUTPáz génjének klónozását az anyagok és módszerekben leírt módon végeztem el. A 19.-22. ábrák a fehérjék expressziójának (termeltetésének) és tisztításának lépéseit mutatják. vad 1. IPTG +

-

2. + -

His145Trp 1. 2. + - + 66 kDa 45 36 29 24 20,1

19.ábra A Mycobacterium tuberculosis vad és His145Trp dUTPáz expressziója E. coli BL21(pLysS) sejtben (SDSPAGE gél képe) A gélen látható minták sorrendje a következ : két párhuzamos ( 1, 2 ) expressziót csináltam mindkét enzimb l, a sejtextraktum IPTG hozzáadása után, el tt (+, -). A célfehérjék a (+) jellel jelölt sávok 20,1 kDa-os magasságánál jelentkeztek

Az expressziós gélen (19.ábra) látható, hogy a 20,1 kDa os jelzéssel egyvonalban jelentkeznek a célfehérjék, jelent s mennyiségben. A gélek elfogadható mérték termelést mutatnak, így hozzáláthattam a Ni ion oszlopon történ kitisztításukhoz, melynek menetét is az anyagok és módszerek fejezetben taglalok részletesen.

42

Ni-ion oszlopos tisztítás

átes

LS

HS , LS

50 mM imidazol

50 mM imidazol

4.

5.

6.

0,5 M imidazol 20. ábra

A 20.ábra 1,5 ml-es Eppendorf csövekben (ez konkrétan a His145Trp- dUTPáz) a Ni-ion oszlopról lecsöpög sós illetve imidazolos mosófolyadékokból vett minta eredményei érzékelhet k. Az els sor els két csövében az átes és LS puffer által lemosott fehérje magas koncentrációja érzékelhet a mély kék színb l, aztán látható, hogy a HS, ill LS már több fehérjét nem oldott le. (21.ábra) Majd az els sor végén az 50 mM-os imidazol fehérje gradiense látható, a második sorban csúcs utáni állapotok láthatók. A harmadik sorban kezdtem a 0,5 M-os imidazolt adagolni az oszlopra, itt is jól érzékelhet a leoldódott fehérjék koncentráció maximuma a 4. 5. és 6. Eppendorf csövekben. Nyilván ezen tartományt gyüjtöttem, hiszen ez tartalmazta a célfehérjém. A tisztítás egyértelm en jónak nevezhet (21. és 22. ábra) a célfehérjém tisztasága 95% fölötti.

43

1

2

3

4

5

6

7

66 kDa 45 36 29 24 20,1 14,2 21. ábra A His145Trp- dUTPáz enzim Ni ion oszlopon történ mosásának fázisai, a célfehérjém a nyíllal egyvonalban jelentkezik 20,1 kDa-nál 1. átes - van némi veszteség, 2.sz rés el tti oldat, 3,. LS,HS mosás, 4,5,6. 50 mM imidazol, 7. 0,5 M imidazol

1

2

3

4

5

6

7

66 kDa 45 36 29 24 20,1 14,2

22. ábra A vad típusú M.tub. dUTPáz enzim Ni ion oszlopon történ mosásának fázisai, a célfehérjém a nyíllal egyvonalban jelentkezik 20,1 kDa-nál 1. átes - van némi veszteség, 2,3. LS,HS mosás, 4,5,6. 50 mM imidazol, 7. 0,5 M imidazol

44

4. 1. 1. A His145Trp- dUTPáz fehérje aminosav összetétele (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) Aminosavak Ala A Arg R Asn N Asp D Cys C Gln Q Glu E Gly G His H Ile I Leu L Lys K Met M Phe F Pro P Thr T Trp W Tyr Y Val V

db 17 13 2 10 0 2 7 23 11 7 19 1 3 2 10 6 1 2 20

% 9,8 7,5 1,1 5,7 0,0 1,1 4,0 13,2 6,3 4,0 10,9 0,6 1,7 1,1 5,7 3,4 0,6 1,1 11,5

His145Trp- dUTPáz:

Extinkciós koefficiens ( )= 8480 M-1cm-1 M His145Trp- dUTPáz =18015,3 g/mol Vad típus esetén: Extinkciós koefficiens ( )= 2980 M-1cm-1 Mvad=17966,3 g/mol Ami érdekes, hogy ciszteint nem tartalmaz az M.tub. dUTPáz! Tehát ciszteint l származó kénhídak ( S-S-), nem merevítik harmadlagos szerkezetét.

4. 1. 2. A fehérjék koncentrációja

Lampert-Beer törvény alapján

cvad

A280 vad

325

l

hígítás

1,44 10 4 M 17996,3

0,086 2980 M 1cm

mg mmol

2,59

1

1cm

5 1,44·10-4 M = 144µM

mg ml

45

ctrp

A280

325

mut trp mut

l

1,9 10 4 M 18015,3

0,161 10 1,9·10-4 M= 190µM 1 1 8480 M cm 1cm

hígítás

mg mmol

3,42

mg ml

4. 2. Enzimaktivitás mérése Az enzimkinetikai méréseket tehát két módszerrel vizsgáltam az egyik a fenilvörös, amelyik a felszabaduló hidrogén ion által okozott pH változáson alapszik, ezt 559 nm-en detektáltam. A másik pedig a MESG-et és két további enzimet alkalmazó módszer, amely a felszabaduló inorganikus foszfátra épül, 360 nm-en detektáltam. Látható lesz, hogy az el bbinél abszorbancia csökkenés, míg az utóbbinál abszorbancia növekedés tapasztalható.

4. 2. 1. Aktivitásmérés fenilvörössel:

A mérés kezdetén felveszek egy alapvonalat, amely a fenilvörös abszorbanciáját jelzi 559 nm en. Majd pár másodperc múlva hozzáadom a vad típusú dUTPáz enzimet és ezzel megkezd dik a reakció (23.ábra).

Aktivitás mérés Abszorbancia

A0

0,84

Ae

0,82 0,8

5µl dUTPáz

0,78

10µl dUTPáz

0,76 0,74 0,72

A

0,7 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

t(s) 23. ábra A fenti ábrán egy példát mutatok a fenilvörössel történ mérésre az abszorbancia-id függvényt látjuk 5-10 µl enzim hatására. A görbe szakadása a dUTP szubsztrát hozzadása miatt alakul ki, A=0,1, A0- alapvonal Aereakció kezdete, A a reakció vége, a f kinetikai paraméter az egyenes meredeksége (v0)

46

A méréseket különböz dUTP koncentrációkkal végeztem (4.táblázat), a

Atotál olyan

mértékben növekedett (lineárisan), mint amennyire a dUTP koncentrációt növeltem (24.ábra), de úgy ítéltük meg, hogy túl nagy a vo paraméter szórása (pedig az enzim koncentrációja állandó volt) a párhuzamos mérések között ahhoz, hogy pl. egy 15%-os aktivitásgátlást produkáló drog vo csökkentését észrevegyük és ez

kevésbé megbízhatóvá teszi a (pH

változásán alapuló) módszert. Abszorbancia változás a növekv dUTP koncentráció esetén y = 0,0017x + 0,0093 0,225 0,2

Atotál

0,175 0,15 0,125 0,1 0,075 0,05 0,025 0 0

20

40

60

80

100

120

140

dUTP µM 24. ábra Az egyenest a 4. táblázat szürkével kiemelt adatsorára illesztettem

Vad típus M.tub. dutpáz

Trp-mut M.tub. dutpáz

dUTP (µM) 20 40 60 20 40 60 80 100 120 40 40 40 40 40

enzim (µM) 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 0,8 1,7 1,7 3,3 3,3

totál

A0

Ae

A

0,91 0,83 0,86 0,90 0,84 0,87 0,71 0,69 0,65 0,94 0,92 0,91 0,96 0,93

0,88 0,82 0,86 0,87 0,83 0,76 0,71 0,69 0,66 0,89 0,87 0,84 0,87 0,84

0,83 0,71 0,70 0,84 0,75 0,65 0,56 0,51 0,48 0,78 0,76 0,74 0,78 0,75

A 0,05 0,11 0,16 0,04 0,08 0,11 0,15 0,18 0,21 0,12 0,11 0,10 0,08 0,09

v0(10-3) (1/s) 5,4 5,9 4,4 6,7 3,9 4,9 4,2 4,5 5,4 2,4 2,8 3,5 5,6 5,3

t

(s) 15 21 40 9 26 26 39 43 44 52 40 37 23 20

kcat(1/s) 0,6 0,5 0,4 0,9 0,5 0,7 0,6 0,6 0,9 1,0 0,6 0,9 0,8 0,7

4. táblázat Az M. tub. dUTPáz enzim kinetikai analízise, a táblázatban szerepl 14 aktivitásmérés, paramétereit tartalmazza a kcat számításánál 3.4.3.2. képlet alapján történt. A vo oszlopban kijelöltem (zöld,sárga színnel) néhány párhuzamost, látható a jelent s eltérés, pedig a vo adott körülmények között csak az enzim koncentrációjától függ

47

4. 2. 2 Aktivitásmérés MESG-gel A mérest 360 nm-en követtem, el ször felvettem egy alapvonalat (24.ábra), majd kb. 20 s múlva hozzáadtam az iniciáló szubsztrátot, a dUTP-t az 500µl reakcióelegyhez, amely tartalmazta a három enzimet : IPP, PNP, dUTPáz , a MESG-et és a puffert.

aktivitásmérés MESG-gel 0,6

abszorbancia

0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0

10

20

30

40

50

60

70

t(s)

25. ábra A görbe szakadása a dUTP hozzáadása miatt alakul ki, a szakadás után a reakció végbemegy, amelynek f kinetikai jellemz je az ábrán látható 26 - 40 s közötti egyenes meredeksége (v0)

Kiszámítható, hogy milyen abszorbancia változás ( A) várható ezzel a módszerrel. 1 mol dUTP-b l 2 mol inorganikus foszfát szabadul fel, amely 2 mol MESG-gel reagál, vagyis az alkalmazott 8,5 µM dUTP (5.táblázat) , 17µM MESG-gel lép reakcióba, vagyis 17 µM MES keletkezése lesz felel s az összes abszorbancia változásért. A MES extintciós koefficiense (

MES

=11.000 M-1cm-1)(45) és a Lampert-Beer törvény ismeretében számolható

a várható elméleti abszorbancia változás:

A

dUTP (µM) 8,5 8,5 8,5

MES

c MES l

dUTPáz (nM) 154 154 154

11.000M 1cm

A0

A

0,25 0,28 0,28

0,43 0,47 0,52

1

17 10 6 M 1cm

A 0,18 0,17 0,23

t(s) v0(10 30 30 35

5. táblázat 3 párhuzamos mérési eredmény: MESG-gel

48

5,4 5,3 5,6

0,17

-3

)

kcat(1/s) 1,6 1,7 1,3

Az 5.táblázatban bemutatott három párhuzamos aktivitásmérés A értékei láthatóan 0,17-0,23 között változik. Az átlag 0,19, ami +12%-os pontossággal igazolta az elméleti értéket. A mérést számtalan tényez befolyásolja, amelyek közül a dUTP ill. MESG h hatására történ

bomlása a legjelent sebb. Azonban a módszer ennek ellenére is jól

reprodukálható, és precízebb mérést tesz lehet vé a fenilvörössel történ méréssel szemben. A precizitás jól megfigyelhet a v0 értékek kicsi szórásában. A precizitásnak nagy jelent sége lesz majd a drogokkal történ aktivitásméréseknél.

4. 3. Az antagonisták (drogok) és a szubsztrátanalóg dUPNPP hatása az enzim aktivitására A dUPNPP vel kíválóan csökkenthet a dUTPáz enzim aktivitása (5. táblázatból, 26.ábra). Mérési adatok M.tub. dUTPáz (µM) 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

dUPNPP (µM) 0 20 40 80 120

v0 * (10-3) (1/s) 9,6 8,6 5,4 3,8 2,9

A0

A

0,236 0,229 0,241 0,230 0,264

0,371 0,373 0,395 0,360 0,417

A teljes 0,135 0,144 0,153 0,129 0,153

5. táblázat dUPNPP titrálás 11 10 9 8

vo

7 6 5 4 3 2 1 0 0

20

40

60

80

100

dUPNPP µM

26. ábra Az 5. táblázat adatsora alapján

49

120

140

A MESG-gel történ aktivitásmérés-sorozatba 41 inhibitor jelölt molekulát (drogot) vontunk be, hogy kiderítsük, vannak-e ezek között olyan drogok, amelyek gátolják a vad típusú M.tub. dUTPáz enzim aktivitását. El ször 10-100 mM-os törzsoldatokat készítettem a többségében 5mg-os kiszerelés drogokból, egyszerre csak kb. 0,5 mg-ot oldottam be. A törzsoldatok elkészítéséhez oldószerként desztillált víz, DMSO, DMF, acetonitril jöhetett számításba ebben a sorrendben. Tehát kezdtem a desztillált vízzel, ha abban nem oldódott az aktuális drog, akkor a következ

oldószerrel próbáltam oldani. Egyetlen drog volt, amelyik oldódott desztillált

vízben a többi DMSO vagy DMF-ben oldódott, de 8 db egyikben sem (7. táblázat). Más oldószert nem próbálhattunk ki, ugyanis ezek azok az oldószerek, amelyeket a M.tub. baktérium

sejtkultúrája

még

elvisel.

Valamint

fehérjekicsapó

oldószereket

sem

alkalmazhattunk, hiszen a mérés során a szerves oldószerben feloldott drogot adom hozzá a fehérje tartalmú reakcióelegyemhez és az enzimeknek tökéletesen kell m ködniük. A törzsoldatok elkészítése után következett az oldáspróba a pufferben. A droggal történ

aktivitásmérés csak annyiban különbözik a drog nélkülit l, hogy mérés el tt a

reakcióelegyhez ( IPP, PNP, dUTPáz , MESG , puffer) még hozzáadtam

50-500µM

koncentrációban a vizsgált inhibitor jelölt molekulából és egy pár perc inkubációt követ en kezdtem velük a mérést ( dUTP hozzáadását). Az oldáspróba egy vizuális ellen rzése volt a drogok pufferben való oldódásának, amelyet úgy végezetem, hogy a DMSO-ban oldott drog törzsoldatából 0,5 µl-t, 499,5 µl pufferhez adtam (1000-szeres hígítás), homogenizálást követ en pedig megnéztem, hogy tapasztalható-e bármilyen mérték kicsapódás. Ezt mind a 41-8 vagyis 33 drogra végig kellett próbálgatni, hogy meghatározzam, mennyi a maximális oldhatóságuk pufferben (7/a,b. táblázat). Ezt követ en 50 µM-os oldatokkal mérve felvettem a spektrumukat (230- 800 nm között) UV-VIS spektrofotométerrel és mivel a MESG-es mérést 360 nm-en detektálom, a spektrumokból a 360 nm-nél detektált abszorbancia értékük volt nagyon lényeges. Ha ugyanis A360 > 0,3, akkor a mérés lehetetlenné válik, mert drog nélkül az A0 = 0,3-0,4 közötti, A = 0,5-0,6 közötti és ha ehhez hozzáadódik +0,3 , akkor A0=0,6-0,7 és A

= 0,8-0,9 lesz, ami

már veszélyeztetheti az általam használt spektrofotométerben a jel intenzitását. El fordult, hogy A

jóval 1 fölött volt kimérhet (és kb. 1,2 felett az abszorbancia érték már nem

megbízható) (7/a,b.táblázat). A 33 db drogot, ezen szempont alapján végignézve (27. ábra), 21 db maradt mérhet .

50

A mérések során a v0- kezdeti sebesség volt a f

paraméter, a gátlás tényének

megállapításában. A 6. táblázatban szerepl 63, 65, 67 es drogokat a legnagyobb oldható koncentrációjuk mellett mértem, amelyek az abszorbancia szempontjából is megfelel ek voltak, itt is három párhuzamos mérést végeztem. A vo-ak átlaga adja a kiértékelés alapját vagyis a droggal együtt kivitelezett mérésnél mért és számolt vo átlagát arányítom a drog nélküli mérés vo átlagához vagyis a hányadosukból adódott a maradék aktivitás %-os értéke (6. és 7/a,b. táblázatok). Ezek csak els dleges adatok, amelyek további analízist igényelnek. Drog (µM)

63.drog

65.drog

67.drog

0 0 0 50µM 50µM 50µM 250µM 250µM 250µM 150µM 150µM 150µM

dUTP (µM)

8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5 8,5

dUTPáz (nM)

154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154 154

A0 A 0,37 0,67 0,28 0,47 0,28 0,52 0,76 0,98 0,71 0,94 0,68 0,91 0,87 1,09 0,91 1,11 0,89 1,08 0,91 1,09 0,88 1,05 0,90 1,06 6. táblázat

A 0,28 0,17 0,23 0,22 0,22 0,22 0,22 0,20 0,19 0,18 0,17 0,17

t(s) 30 30 35 43 45 45 35 36 35 38 37 38

v0(10-3) v0 átlag 5,4 5,4 5,3 5,6 4,9 4,9 4,8 4,9 5,3 5,1 5,0 5,1 4,8 4,6 4,6 4,5

% 100

90

93

85

63, 65, 67-es drogokkal történ aktivitásmérés eredménye

abszorbancia

69-es drog spektruma 2,25 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 nm

27. ábra A 69-es drog spektrumához hasonlatos azon drogok spektruma is, amelyekkel szintén lehetetlen volt mérni, hiszen a 26. ábrán példaként hozott 69-es drog (50µM-os oldata) 360 nm-en mért abszorbanciája 1,20

51

Inhibitor jelölt molekulák (drogok) adatai törzsoldat koncentráció, oldószer

No.

1. 2./a 3./a 4. 5. 6. 9. 16. 20. 27. 28. 29. 30. 34. 36. 37. 38. 41. 42. 44./a 45. 48. 49. 53. 56. 57. 62. 63. 65. 66. 67. 69. 71. 72. 73. 74. 77. 78. 79. 83. 84.

30 mM DMF 21 mM DMSO 25 mM DMF 99 mM desztvíz nem oldódott 8 mM DMF nem oldódott 34 mM DMSO 36 mM DMSO nem oldódott 49 mM DMF nem oldódott 92 mM DMF 25 mM DMF 50 mM DMSO 26 mM DMSO 7 mM DMSO nem oldódott 70 mM DMSO 41 mM DMSO nem oldódott 40 mM DMSO 47 mM DMSO 42 mM DMSO 13 mM DMF 35 mM DMSO 23 mM DMF 51 mM DMSO 74 mM DMSO 14 mM DMSO 74 mM DMSO 30 mM DMSO 19 mM DMF 37 mM DMSO nem oldódott 70 mM DMSO 21 mM DMSO 16 mM DMSO nem oldódott 30 mM DMSO 36mM DMSO

maximális oldódás mér pufferben 500µM 500µM 500µM 1000µM

Abszorbancia 360nm-nél v0+drog/v0 (50µM oldott *100 drog koncentrációnál) 0,350 100%(120µM) 0,060 127%(500µM) 0,304 0,000 100%(1000µM)

500µM

0,004

100%(500µM)

< 200µM < 100µM

0,071 0,230

100%(200µM) 100%(50µM)

500µM

0,505

100%(50µM)

< 100µM < 50µM 500µM 150µM 200µM

0,804 0,703 0,765 0,380 0,000

500µM 500µM

0,001 0,755

88% (150µM)

105%(500µM)

< 50µM 500µM 500µM < 50µM 500µM 50µM 150µM 250µM 500µM 250µM 300µM 500µM 500µM

0,836 0,318 0,278 0,054 (74µM) 0,004 0,175 (74µM) 1,200 0,453 0,497

500µM 500µM 300µM

0,118 0,713 0,340

100%(250µM) 100%(50µM) 92%(150µM)

0,340 0,033 (72µM)

73%(100µM)

300µM 500µM 7/a. táblázat

0,400 0,018

100%(500µM) 100%(50µM) 90%(50µM) 93%(250µM) 100%(500µM) 85%(150µM) 100%(50µM) 100%(50µM)

Szám szerint 6 db droggal sikerült valamilyen mérték enzimaktivitás csökkenést kimérnem (7/a. táblázat sárgával kiemelt tagjai, 3 db drog (/a) jelzéssel kaptak megkülönböztetést a 7.b táblázatban szerepl ugyanazon számmal jelölt drogoktól)

52

4. 4.

Az antagonisták köt désének fluoreszcens spektrofotometriai vizsgálata

Ez az a mérési módszer, ami miatt elkészítettem a His145Trp mutáns M.tub. dUTPáz enzimet. A mérés során a triptofánt 295 nm-en gerjesztettem és 300-400 nm között követtem az emisszióját, mert a triptofánnak 354 nm-nél (28.ábra) van emissziós maximuma és számomra ez volt a kés bbiek során a mérések kiértékelésének alapja. A szükséges m szer és enzim koncentráció beállító méréseket követ en, kezdhettem a drogok emissziós spektrumát felvenni a fenti paraméterek mellett 50-100 µM-os oldatukból. Annak eldöntésében ugyanis, hogy a fluoreszcens méréssorozatba szám szerint mennyi drog vonható be, az emissziós spektrumok felvétele elengedhetetlen volt. Mivel a drogok többségének szerkezete rendelkezik aromás gy r kkel, fél volt, hogy a 48 drog közül, ill. a nem oldódókat nem számítva a 40 drog közül, csak néhánnyal tudunk mérni. (amib l 7 drog már egy évvel korábban be lett vonva a kutatásba és amelyek nem szerepelnek a 7/a. táblázatban, azonban a 7/b. táblázat tartalmazza. A drogok emissziós spektruma sajnos visszaigazolta félelmeinket, mert a többségnek nagyon jelent s emissziós jelintenzitása volt a His145Trp dUTPázhoz képest (28. ábra).

No.

törzsoldat koncentráció, oldószer

2 3 13 14 26 32 44

25 mM DMF 42 mM desztvíz 24 mM DMF 44 mM DMF 44 mM DMF 3 mM DMF 30 mM DMSO

maximális oldódás mér pufferben

Abszorbancia 360nm-nél (50µM oldott drog koncentrációnál)

500µM 860 µM < 50µM < 50µM < 50µM 150µM 200µM 7/b. táblázat

v0+drog/v0 *100

0,010 100%(160µM) 0,250

0 100%(160µM) 0,700

A 7/a. táblázattal analóg módon itt is (7/b. táblázat) a MESG-es mérés eredményei láthatóak, ezek a drogok egy korábbi besorolás alapján vannak számozva, mert az ELTE matematikusai több ízben generáltak drog listákat, el ször nem vették figyelembe a vizes közegben való jósolható oldhatóságukat, a második alkalommal viszont eleve kizárták azon drogokat, melyek jósolható oldhatósága bizonyos határérték alatt van, (7/a. , 7/b. táblázat)

53

Trp-m utáns em issziós spektrum a 80000 70000 60000 Int

50000 40000 30000 20000 10000 0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 nm 3. drog emissziós spektruma 450000 400000 350000 300000 Int 250000 200000 150000 100000 50000 0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 nm

28. ábra A (6µM) His145Trp dUTPáz enzim jelintenzitását hasonlítom össze a 3.drog (50µM) intenzitásával. Látható, hogy a 3.drog 354 nm-nél észlelt intenzitása többszöröse a His145Trp dUTPázhoz képest.

A 28. ábrán tapasztalható probléma jelentkezett sajnos a legtöbb drog esetén is, tehát ellehetetlenült a mérés. Csak 2db droggal (2, 44) sikerült áttörést elérnem, mert a 2, 44-es drogok nem voltak fluoreszcensek (7/b.táblázat), (29. ábra). 44.drog emissziós spektruma

Intenzitás 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 300

310

320

330

340

350

360

370

380

390

400

nm

29. ábra Zöld színnel a 44. drog (50µM) , a másik görbe a puffer jele. 354 nm-nél gyakorlatilag 0-nak tekinthet a drog jelintenzitása a His145Trp dUTPázhoz képest intenzitásához képest (27. ábra), ehhez hasonlatos a 2. drog emissziós spektruma is

54

A mérés úgy zajlott, hogy egy kvarcküvettába bemértem a puffert (800µl a végkoncentráció), a His145Trp dUTPáz enzimet 6µM koncentrációt elérve, majd ehhez adtam a drogból az aktuálisan mérend koncentrációt (0, 3, 6, 12, 25, 50, 100, 200µM drog ) rövid inkubálás és homogenizálás után megmértem külön-külön minden drog koncentrációnál az emissziós spektrumokat (30. ábra). A 2. drog esetében 100 µM-ig mehettem el az oldódási küszöb miatt. Látható, hogy fokozatosan csökken az enzim jelintenzitása az egyre nagyobb mértékben hozzáadott drog mennyiség hatására, mindkét (2, 44. drog) esetben. Ez egyrészt bizonyíték arra, hogy a triptofánt sztérikusan jó helyre terveztük, ill. az inhibitor jelölt molekulák a számítógépes modellezésnek megfelel en dokkolnak az aktívcentrumba vagy annak közelébe, mert képesek arra, hogy részben kioltsák a triptofán fluoreszcenciáját. Ha az emissziós spektrumok 354 nm-nél lév maximális jelintenzitásokat ábrázolom a drog koncentráció függvényében, akkor egy másodfokú függvényillesztést eszközölhetek mindkét drognál (31, 32. ábra els diagram).(13, Vertessy, B. G., Larsson, G., Persson, T., Bergman, A. C., Persson, R., and Nyman, P. O. (1998) FEBS Lett. 421(1), 83-88)

Ezt a függvényt aztán telítési (szaturációs) görbévé alakítottam (31, 32. ábra második diagram), amely az enzim droggal való telítettségének mértékét adja meg % -ban. 100% az a drog koncentráció, amelynél a His145Trp dUTPáz jelintenzitása 0-vá válik. A telítési pontokra illesztett görbe egyenletéb l ki lehet számolni az enzim-drog disszociációs állandóját ( Kd ). Kd 2 = 14 µM, Kd 44= 48 µM értkéket számoltam az Origin 7.5. program segítségével. Természetesen a floureszcens titrálást elvégeztem a dUPNPP szubsztrátanalóggal is, amely szintén sikeres volt és fel tudtam venni a szaturációs görbéjét (Kd dUPNPP= 0,25 µM) (33, 34. ábra). A dUPNPP egyértelm en nagyobb mértékben csökkenti az enzimaktivitást, a 2. droghoz képest két nagyságrenddel, a 44. droghoz képest három nagyságrenddel.

55

Titrálási emissziós spektrumok a 2.drog kontra 6 µM His145Trp dUTPáz Intenzitás 80000 0

70000

2 mikroM 6

60000 50000 40000

12 30000 20000

50

10000

100

0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 nm

Titrálási emissziós spektrumok a 44.drog kontra 6 µM His145Trp dUTPáz

Intenzitás

0

100000 90000

3 mikroM drog No.44.

80000

6

70000

12

60000 50000

25

40000

50

30000 100

20000

200

10000 0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 nm 30. ábra

A 2-es és 44-es droggal is sikeresen csökkentettem a 6µM His145Trp dUTPáz enzim emissziós spektrumának intenzitását

56

2.drog titrálási görbéje 70000

60000

Intenzitás

50000

40000

30000

20000

10000 0

20

40

60

80

100

drog (µM)

2.drog telítési görbéje 80

%

60

40

20

0

0

20

40

60

80

100

drog (µM)

31. ábra 2.drog titrálási és telítési görbéje 6µM His145Trp dUTPáz mellett, Kd-re 14 µM-t számoltam

57

44.drog titrálási görbéje

100000

80000

Intenzitás

60000

40000

20000

0

0

50

100

150

200

drog (µM)

44.drog telítési görbéje 100

80

60

% 40

20

0 0

50

100

150

200

drog (µM)

32. ábra 44.drog titrálási és telítési görbéje 6µM His145Trp dUTPáz mellett, Kd-re 48 µM-t számoltam

58

His145Trp dUTPáz titrálása dUPNPP-vel

6

Fluoreszcens intenzitás

2,0x10

dUTPáz 145.Trp mutant

6

1,8x10

6

1,6x10

6

1,4x10

6

1,2x10

6

1,0x10

5

8,0x10

+ 32 M - -imido-dUTP

5

6,0x10

5

4,0x10

5

2,0x10

0,0 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430

nm 33.ábra 6 µM His145Trp dUTPáz enzim és 32µM dUPNPP jel intenzitás csökkenése

dUPNPP titrálási görbéje 80 70 60

Int %

50 40 30 20 10 0 -10 -5

0

5

10

15

20

dUPNPP (µM)

34. ábra Kd-re 0,25 µM-t számoltam

59

25

30

35

4. 5. Sejtkultúrás kísérletek eredményei

A mérés menete részletesen az anyagok és módszerek fejezetben olvasható. Ennek a kísérletnek (9. táblázat) a célja annak kiderítése volt, hogy egyes drogok milyen minimális koncentrációban okoznak a M.tub. bakteriális rendszerben növekedés gátlást. Egyértelm en az az ígéretesebb gyógyszerjelölt molekula, amelyiknek MIC értéke a legkisebb, hiszen nem mindegy, hogy milyen koncentrációval (µg/ml) érhet

el a sejtek pusztulása. Ebb l a

szempontból a 3-as és 69-es molekula szép eredményt mutatott.

Ligandum száma

MIC (µg/ml)

CFU

4.

25

0

3.

5

5

13.

15

42

32.

30

0

44.

25

2

63.

25

20

56.

45

7

67.

45

0

69.

<1

0

78.

45

70

83.

45

2

9. táblázat

Ami számunkra nagyon lényeges információ, hogy a 44, 63, 67, 78 as molekulákkal nekünk is sikerült gátlást kimutatni a baktérium dUTPáz enzimén (7.a,b táblázat). Ebb l persze nem tanácsos levonni azt a következtetést, hogy a sejtkultúrás kísérletben is a dUTPáz enzimet gátolta az adott drog, de feltétlenül értékes lehet a két egymástól független kísérleti eredmény, egy esetleges kés bbi klinikai kutatásban.

60

5. Eredmények összefoglalása Munkám célja a Mycobacterium tuberculosis baktérium dUTPáz enzimének karakterizálása, valamint olyan sz r módszerek kidolgozása volt, melyek közepes illetve nagy átereszt képesség ek, így segítségükkel gyorsan és hatékonyan tudjuk sz rni a TBC dUTPáz-a ellen ható lehetséges antagonistákat.

Az eredmények a következ k:

5. 1. Sikerült a pontmutáció és az expresszálás is elfogadható volt.

5. 2. Sikerült az enzimeket a His-tag-nek köszönhet en kitisztítani, amelyek ezt követ en a mérések során aktívnak bizonyultak, aktivitásuk 1,5 1/s lett.

5. 3. A MESG-es sz rési módszerrel sikerült 7 db drogot találni a 48-ból, amelyek gátolták valamilyen mértékben az M. tub. dUTPáz enzimét.

5. 4. A fluoreszcens sz rési módszerrel sikerült 2 olyan drogot találni, amelyek köt dnek az aktív centrumhoz és lehet ség nyílt a köt dés mértékének meghatározására.

5. 5. A Korányi Intézet munkatársai találtak 11 olyan drogot, amelyek bizonyítottan gátolják a M. tub. baktériumok növekedését.

5. 6. A legfontosabb viszont, hogy a 5. 3. , 4. és 5. pontokban említett drogok között átfedés is van. Vagyis találtunk 4 olyan inhibitor (jelölt) molekulát, amelyekr l két egymástól független mérési módszer is igazolja gátlásuk tényét.

44. drog ( floureszcens módszer és sejtkultúrás kísérlet ),( 7/b. és 9.táblázat) 63. drog (MESG-es aktivitásmérés és sejtkultúrás kísérlet ) ,( 7/a. és 9.táblázat) 67. drog (MESG-es aktivitásmérés és sejtkultúrás kísérlet ) ,( 7/a. és 9.táblázat) 78. drog (MESG-es aktivitásmérés és sejtkultúrás kísérlet ) ,( 7/a. és 9.táblázat)

61

Irodalom 1. 2. 3.

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19.

20. 21. 22. 23. 24.

Boshoff, H. I., Reed, M. B., Barry, C. E., 3rd, and Mizrahi, V. (2003) Cell 113(2), 183-193 Friedberg, E. C., and Fischhaber, P. L. (2003) Cell 113(2), 139-140 Cole, S. T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S. V., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, C. E., 3rd, Tekaia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Moule, S., Murphy, L., Oliver, K., Osborne, J., Quail, M. A., Rajandream, M. A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, J. E., Taylor, K., Whitehead, S., and Barrell, B. G. (1998) Nature 393(6685), 537-544 Kana, B. D., and Mizrahi, V. (2004) Tuberculosis (Edinb) 84(1-2), 63-75 Ruiz, P., Rodriguez-Cano, F., Zerolo, F. J., and Casal, M. (2002) Microb Drug Resist 8(2), 147-149 Wu, X., Zhang, J., Zhuang, Y., Zhang, X., Li, G., and He, X. (1999) Chin Med J (Engl) 112(6), 524-528 Schroeder, E. K., de Souza, N., Santos, D. S., Blanchard, J. S., and Basso, L. A. (2002) Curr Pharm Biotechnol 3(3), 197-225 Slayden, R. A., and Barry, C. E., 3rd. (2000) Microbes Infect 2(6), 659-669 Nunn, C. M., Djordjevic, S., Hillas, P. J., Nishida, C. R., and Ortiz de Montellano, P. R. (2002) J Biol Chem 277(22), 20033-20040 Zhang, Y., Wade, M. M., Scorpio, A., Zhang, H., and Sun, Z. (2003) J Antimicrob Chemother 52(5), 790-795 Cheng, S. J., Thibert, L., Sanchez, T., Heifets, L., and Zhang, Y. (2000) Antimicrob Agents Chemother 44(3), 528-532 Mitchison, D. A. (2004) Front Biosci 9, 1059-1072 Vertessy, B. G., Larsson, G., Persson, T., Bergman, A. C., Persson, R., and Nyman, P. O. (1998) FEBS Lett. 421(1), 83-88 Mustafi, D., Bekesi, A., Vertessy, B. G., and Makinen, M. W. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A 100(10), 5670-5675 Pearl, L. H., and Savva, R. (1996) Nat Struct Biol 3(6), 485-487 Lindahl, T. (1993) Nature 362(6422), 709-715 Tye, B. K., and Lehman, I. R. (1977) J Mol Biol 117(2), 293-306 Mosbaugh, D. W., and Bennett, S. E. (1994) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 48, 315370 Blount, B. C., Mack, M. M., Wehr, C. M., MacGregor, J. T., Hiatt, R. A., Wang, G., Wickramasinghe, S. N., Everson, R. B., and Ames, B. N. (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94(7), 3290-3295 Vassylyev, D. G., and Morikawa, K. (1996) Structure 4(12), 1381-1385 Goulian, M., Bleile, B., and Tseng, B. Y. (1980) Proc Natl Acad Sci U S A 77(4), 1956-1960 Traut, T. W. (1994) Mol Cell Biochem 140(1), 1-22 Gadsden, M. H., McIntosh, E. M., Game, J. C., Wilson, P. J., and Haynes, R. H. (1993) Embo J 12(11), 4425-4431 el-Hajj, H. H., Zhang, H., and Weiss, B. (1988) J Bacteriol 170(3), 1069-1075

62

25.

26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35.

36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49.

Bekesi, A., Zagyva, I., Hunyadi-Gulyas, E., Pongracz, V., Kovari, J., Nagy, A. O., Erdei, A., Medzihradszky, K. F., and Vertessy, B. G. (2004) J Biol Chem 279(21), 22362-22370 Ladner, R. D., and Caradonna, S. J. (1997) J Biol Chem 272(30), 19072-19080 Igney, F. H., and Krammer, P. H. (2002) Nat Rev Cancer 2(4), 277-288 Moertel, C. G. (1994) N Engl J Med 330(16), 1136-1142 Canman, C. E., Radany, E. H., Parsels, L. A., Davis, M. A., Lawrence, T. S., and Maybaum, J. (1994) Cancer Res 54(9), 2296-2298 Pugacheva, E. N., Ivanov, A. V., Kravchenko, J. E., Kopnin, B. P., Levine, A. J., and Chumakov, P. M. (2002) Oncogene 21(30), 4595-4600 Koehler, S. E., and Ladner, R. D. (2004) Mol Pharmacol 66(3), 620-626 Chano, T., Mori, K., Scotlandi, K., Benini, S., Lapucci, C., Manara, M. C., Serra, M., Picci, P., Okabe, H., and Baldini, N. (2004) Oncol Rep 11(6), 1257-1263 Zalud, P., Wachs, W. O., Nyman, P. O., and Zeppezauer, M. M. (1994) Adv Exp Med Biol 370, 135-138 Munoz-Pinedo, C., Oliver, F. J., and Lopez-Rivas, A. (2001) Biochem J 353(Pt 1), 101-108 Lerner, D. L., Wagaman, P. C., Phillips, T. R., Prospero-Garcia, O., Henriksen, S. J., Fox, H. S., Bloom, F. E., and Elder, J. H. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92(16), 7480-7484 Larsson, G., Svensson, L. A., and Nyman, P. O. (1996) Nat Struct Biol 3(6), 532-538 Prasad, G. S., Stura, E. A., McRee, D. E., Laco, G. S., Hasselkus-Light, C., Elder, J. H., and Stout, C. D. (1996) Protein Sci 5(12), 2429-2437 McGeoch, D. J. (1990) Nucleic Acids Res 18(14), 4105-4110 Cedergren-Zeppezauer, E. S., Larsson, G., Nyman, P. O., Dauter, Z., and Wilson, K. S. (1992) Nature 355(6362), 740-743 Mol, C. D., Harris, J. M., McIntosh, E. M., and Tainer, J. A. (1996) Structure 4(9), 1077-1092 Vertessy, B. G., Kovács, J., Löw, P., Lehotzky, A., Molnár, A., Orosz, F., and Ovádi, J. (1997) Biochemistry 36(8), 2051-2062 Barabas, O., Pongracz, V., Kovari, J., Wilmanns, M., and Vertessy, B. G. (2004) J Biol Chem 279(41), 42907-42915 Bloemendal, M., and Johnson, W. C., Jr. (1995) Pharm Biotechnol 7, 65-100 CCP4. (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-763 Webb, M. R. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(11), 4884-4887 Vagin, A., and Teplyakov, A. (1997) J. Appl. Crystallogr. 30, 1022-1025 Vertessy, B. G., Orosz, F., Kovács, J., and Ovádi, J. (1997) J Biol Chem 272(41), 25542-25546 Vertessy, B. G. (1997) Proteins 28(4), 568-579 Nord, J., Kiefer, M., Adolph, H. W., Zeppezauer, M. M., and Nyman, P. O. (2000) FEBS Lett 472(2-3), 312-316.

63

This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.