REUKLOZE VROUWEN T G SIMONE DE JONG & WENDEL PETERS Waarom hebben vrouwen met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom geen transpiratiegeur?

T G C

REUKLOZE VROUWEN

T

A A

Waarom hebben vrouwen met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom geen transpiratiegeur?

T G C

C G

A

T C

A T

G

C A

G T

SIMONE DE JONG & WENDEL PETERS

2011

REUKLOZE VROUWEN Waarom hebben vrouwen met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom geen transpiratiegeur?

S. M. J. de Jong en W.J. Peters NT/NG-profiel Stedelijk Gymnasium Nijmegen 6D/6E Nijmegen Begeleider Werner van Eck 19 december 2011

0 - Inhoudsopgave

Pagina 1

Inhoudsopgave 0. Inleiding .............................................................................................. 1 Hypothese ................................................................................................................. 3 1. AOS & zweet ........................................................................................ 4 1.1 Wat is AOS en wat is de oorzaak hiervan? ............................................. 4 1.2 Waaruit bestaat transpiratievocht en hoe ontstaat de geur hiervan? ...................................................................................................................... 7 1.3 Heeft een vrouw met AOS apocriene zweetklieren? ......................... 8 2. Opzet onderzoek................................................................................. 9 Deelneemsters ...................................................................................................... 10 Vrouwen met AOS ................................................................................. 10 Vrouwen zonder AOS ........................................................................... 10 1. Bacteriekweekjes............................................................................................. 11 Officiële bacteriekweekjes ................................................................. 11 Wattenstaaf bacteriekweekjes ......................................................... 12 2a. Afname van zweet van onderarm door middel van lokale zweetstimulatie .................................................................................................... 12 2b. Speeksel afgenomen .................................................................................. 14 Meettechniek onderdeel 2a en 2b ................................................................ 14 IMMULITE .................................................................................................. 15 ELISA ........................................................................................................... 15 3. Afname van zweet uit de oksel d.m.v. filtreerpapiertjes ................. 18 Meettechniek .......................................................................................... 18 3. Verwerking ........................................................................................ 19 3.1 Is er verschil in hormoonconcentratie van transpiratievocht uit de onderarm en van speeksel tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS? .......................................................................................................... 19 Zweet van vrouwen met AOS ........................................................... 19 Zweet van vrouwen zonder AOS ..................................................... 19 Speeksel van vrouwen met AOS ...................................................... 20 Speeksel van vrouwen zonder AOS................................................ 20 Analyse....................................................................................................... 21 3.2 Is er een verschil in (aanwezigheid van) bacteriën bij de verschillende groepen? ..................................................................................... 22 Soort en hoeveelheid ........................................................................... 22 Hoeveelheid............................................................................................. 23 Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

0 - Inhoudsopgave

Pagina 2

Verschillen ................................................................................................ 23 4. Conclusie ........................................................................................... 24 Hormoonconcentratie ....................................................................................... 24 Bacteriën ................................................................................................................. 24 5. Discussie ............................................................................................ 26 6. Bedankt ............................................................................................. 28 7. Samenvatting .................................................................................... 29 8. Bijlagen .............................................................................................. 30 Bijlage 1: Literatuurlijst ...................................................................................... 30 Bijlage 2: Deelneemsters bacteriekweekjes .............................................. 32 Bijlage 3: Resultaten bacteriekweekjes ....................................................... 33 Soort en hoeveelheid (officiële kweekjes) ................................... 33 Hoeveelheid............................................................................................. 34 Bijlage 4: Kweekjes .............................................................................................. 35 Zonder AOS .............................................................................................. 35 Met AOS..................................................................................................... 37

Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

0 - Inleiding

0.

Pagina 1

Inleiding Vrouwen hebben XX-chromosomen en mannen hebben XYchromosomen. Dat lijkt zó zeker dat ten minste twee Amerikaanse staten, Texas [23] en Kansas[16], bij hun strijd tegen het homohuwelijk chromosomen maatgevend laten zijn bij de vraag of twee mensen met elkaar mogen trouwen. Toch is al lang bekend dat de geslachtsdifferentiatie niet alleen afhankelijk is van chromosomen, maar ook van genen. Daarnaast spelen hormonen een belangrijke rol[10]. De geslachtsdifferentiatie heeft vele mogelijke uitkomsten. De in de maatschappij gehanteerde tweedeling man/vrouw, blijkt daardoor aan belangrijkheid te verliezen. Er bestaan, ook zonder geslachtsveranderende operatie, mannen met XX-chromosomen, mannen met XXY-chromosomen en zelfs XXXY-chromosomen. En er bestaan ook vrouwen met XYchromosomen. Aandoeningen waarbij de geslachtsdifferentiatie een rol speelt, worden tegenwoordig DSD’s (Disorders of Sex Development) genoemd.[11] Een van de DSD’s is Androgen Insensitivity Syndrome (AIS) of in het Nederlands Androgeen Ongevoeligheid Syndroom (AOS). In Nederland zijn naar schatting tussen de 160 en 600 vrouwen met AOS of een aanverwante aandoening.[1] De Nederlandse onderzoekster Annemie Boehmer stelde in 2001 dat het minimale voorkomen van AOS met genetische bevestiging van de diagnose in Nederland 1 op 99.000 bedroeg.[5] In werkelijkheid zal het aantal vrouwen met AOS dus hoger zijn. Vrouwen met AOS hebben enkele lichamelijke kenmerken die vrouwen zonder AOS niet hebben. Zij hebben geen baarmoeder en eierstokken, waardoor zij geen kinderen krijgen. Dit zien deze vrouwen vaak als een van de belangrijkste nadelen. Maar er zijn ook kenmerken die de vrouwen zelf als voordelen zien. Zo hebben zij geen last van jeugdpuistjes en hebben zij geen transpiratiegeur. [1] Dit laatstgenoemde fenomeen is nog niet eerder onderzocht en er is nog geen verklaring voor dit verschijnsel bekend. In dit profielwerkstuk proberen wij een antwoord te vinden op de vraag waarom de transpiratiegeur ontbreekt bij vrouwen met AOS. De hoofdvraag van ons onderzoek luidt daarom:

Waarom hebben vrouwen met AOS geen transpiratiegeur?

Voor dit onderzoek is begrip van twee onderwerpen belangrijk: het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom en transpiratie. Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

0 - Inleiding

Pagina 2

Om de hoofdvraag te kunnen beantwoorden, hebben we ook antwoorden gezocht op een aantal deelvragen:

Wat is AOS en wat is de oorzaak?

Waaruit bestaat transpiratievocht en hoe ontstaat de geur hiervan?

Heeft een vrouw met AOS apocriene transpiratieklieren?

Is er een verschil in de hormoonconcentratie van transpiratievocht uit de onderarm en van speeksel tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS?

Is er een verschil in (aanwezigheid van) bacteriën bij de verschillende groepen? Zo ja, welke bacteriën zijn bij de verschillende groepen aanwezig?

We hebben eerst literatuuronderzoek gedaan naar de oorzaak van transpiratiegeur. Daaruit bleek dat transpiratiegeur over het algemeen wordt veroorzaakt doordat bepaalde hormonen in het transpiratievocht een reactie aangaan met bacteriën in de oksel.[15] Op basis van deze informatie besloten we onderzoek te doen naar de soorten en hoeveelheid van aanwezige bacteriën en naar een mogelijk verschil in samenstelling van zweet tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS. Omdat de samenstelling van zweet mogelijk moeilijk te onderzoeken zou zijn, hebben we ook de hormoonconcentratie in speeksel onderzocht, als afspiegeling van de concentratie van enkele androgenen –waaronder testosteron– in bloed. Voor de beantwoording van deze vragen waren wij afhankelijk van zowel de vrouwen met AOS als de onderzoekers en analisten van het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam. Wij zijn hen dan ook erg dankbaar voor hun inzet. Dankzij de medewerking van de patiëntenvereniging AISNederland konden wij in contact komen met een grote groep vrouwen. Maar liefst twaalf vrouwen met AOS hebben aan het onderzoek meegewerkt.


Profielwerkstuk

0 - Inleiding

Pagina 3

Hypothese Wij denken dat bij vrouwen met AOS transpiratiegeur ontbreekt, doordat de reactie tussen bacteriën in de oksel en de hormonen in het transpiratievocht anders of niet (goed) verloopt. Dat kan veroorzaakt worden door de samenstelling van de huidflora (geen of andere bacteriën) of door een andere samenstelling van het transpiratievocht, wat betreft hormonen. Onze verwachting is dat de samenstelling van het zweet van vrouwen met AOS anders is dan het zweet van vrouwen zonder AOS. Meer specifiek: wij verwachten dat in het transpiratievocht de androgenen (mannelijke geslachtshormonen) ontbreken of in zeer lage concentraties aanwezig zijn. Wij baseren deze hypothese op de literatuur die wij als voorbereiding van ons PWS hebben gelezen. Daarin wordt ervan uitgegaan dat de androgenen een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van transpiratiegeur.


Profielwerkstuk

1 - AOS & zweet

1.

Pagina 4

AOS & zweet 1.1 Wat is AOS en wat is de oorzaak hiervan? Als een embryo zich ontwikkelt tijdens de zwangerschap is er sprake van geslachtsdeterminatie en geslachtsdifferentiatie. Bij geslachtsdeterminatie wordt door o.a. de geslachtschromosomen (XX of XY) en door een aantal autosomale genen, bepaald of het kind ovaria krijgt of testes. Bij geslachtsdifferentiatie wordt onder invloed van hormonen het lichaam [4] verder ontwikkeld. Deze hormonen zijn afkomstig van de geslachtsklier. Iemand met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom heeft XY-‐ chromosomen, maar is een vrouw. Door mutaties van het AR-‐gen (AR = Androgeen receptor) ontstaat namelijk een ongevoeligheid voor androgenen. Androgenen worden ook wel ‘mannelijke geslachtshormonen’ genoemd. Omdat ook vrouwen androgenen hebben, al is het in mindere mate, is deze aanduiding eigenlijk niet juist. Overigens maken mannen ook oestrogenen aan, de ‘vrouwelijke hormonen’. Tijdens de zwangerschap ontwikkelen de testes zich normaal (een normale geslachtsdeterminatie) en produceren zij androgenen. Door de ongevoeligheid voor androgenen kan het lichaam zich echter niet verder ontwikkelen tot een man (een stoornis van de geslachtsdifferentiatie). Het is niet helemaal juist om te zeggen dat het lichaam zich dan verder ontwikkelt tot vrouw – het vrouwelijk lichaam is eerder te beschouwen als de ‘standaardinstelling’ voor het menselijk lichaam. Bij ons onderzoek zijn we uitgegaan van vrouwen met Compleet AOS (CAOS). Dat wil zeggen dat zij geheel of nagenoeg geheel ongevoelig zijn voor androgenen. Ongeveer tien procent van de kinderen die geboren worden met AOS hebben toch nog zo’n gevoeligheid voor androgenen dat in bepaalde mate vermannelijking plaatsvindt (vergroting van de clitoris, gedeeltelijke vergroeiing van de labia majora, lagere stem, langer dan [17] gemiddeld). Er is dan sprake van Partieel AOS (PAOS). Met de Quigley-‐schaal wordt aangegeven welke gradatie van AOS men heeft. Quigley 1 staat voor Mild AOS, 2 tot en met 5 voor Partieel AOS en 6/7 voor Compleet AOS. Het verschil tussen graad 6 en graad 7 is de aanwezigheid van enige mate van beharing van de schaamstreek en de oksel bij graad 6. De genderidentiteit is bij Mild AOS mannelijk en bij Compleet AOS vrouwelijk. Bij Partieel AOS is de uiteindelijke genderidentiteit moeilijk te voorspellen[22][17]. De werking van het Anti-Müller Hormoon (AMH, vroeger ook bekend als Müller Inhiberend Hormoon - MIH), dat bij mannen voorkomt dat de


Profielwerkstuk

1 - AOS & zweet

Pagina 5

buizen van Wolff zich ontwikkelen tot eierstokken en baarmoeder, is bij vrouwen met AOS niet verstoord. Daardoor kunnen de interne vrouwelijke organen (eierstokken en baarmoeder) zich bij deze vrouwen niet meer ontwikkelen. Het lichaam produceert dus wel androgenen zoals testosteron en het krachtiger 5-dehydrotestosteron (DHT), maar is hier ongevoelig voor. [1] Door de ongevoeligheid voor androgenen werkt het negatieve feedbacksysteem niet; de androgeen receptor herkent het testosteron niet waardoor er een signaal komt dat leidt tot stimulatie van de testes tot productie van meer androgenen. Hierdoor hebben vrouwen met AOS waarbij de gonaden (geslachtsklieren, in dit geval dus de testes) nog niet zijn verwijderd vaak een hoger testosteronniveau dan een man. Vrouwen met AOS zullen niet vermannelijken door dit hoge androgeenniveau – juist het tegendeel is het geval. Door het enzym P450 aromatase worden androgenen omgezet naar oestrogenen. Hierdoor krijgen vrouwen met AOS waarbij de gonaden niet zijn verwijderd, zonder medicatie, borsten en een vrouwelijke vetverdeling. Figuur 1 Het zogenaamde ‘pathway’ dat aangeeft op welke wijze o.a. de androgenen androsteendion en testosteron worden geconverteerd naar oestradiol door (5) 17 hydroxysteroid dehydrogenase 3 en (6) P450 aromatase.[4]

Vrouwen met AOS hebben door de androgeenongevoeligheid een aantal lichamelijke kenmerken. Mensen zonder AOS krijgen door invloed van androgenen oksel-‐ en schaamhaar, jeugdpuistjes en transpiratiegeur. Vrouwen met AOS hebben hier geen last van en zijn vaak wat langer dan [21] gemiddeld.

Het Androgeen Receptor gen (AR-gen) Voor de werking van androgenen zijn androgeenreceptoren (AR-‐eiwitten) nodig. Het AR-‐gen ligt op het X-‐chromosoom. De hormonen, androgenen, werken als ligand op de receptor. Bij de synthese van eiwitten (in dit geval de androgeenreceptoren) treedt translatie op. Bij vrouwen met AOS is het AR-‐gen gemuteerd. De mutatie van het AR-‐gen kan een toevoeging of verwijdering of mutatie van een nucleotide inhouden. Daardoor gaat het na de transcriptie fout. Bij de translatie worden de codons anders afgelezen, waardoor de eiwitsynthese niet goed verloopt en de receptoren die hierbij worden ontwikkeld ook gemuteerd zijn. Hierdoor treedt niet of te weinig complexvorming op tussen de ligand (lees (5-dihydro)testosteron) en receptor. Hierdoor zijn vrouwen met AOS ongevoelig voor deze androgenen.[4][24] Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

1 - AOS & zweet

Pagina 6

Er bestaan honderden verschillende mutaties op het AR-‐gen die AOS veroorzaken (zie onderstaande illustratie). Niet al deze verschillende mutaties hebben direct invloed op de complexvorming tussen ligand en receptor, maar beïnvloeden kwantiteit, structuur en functie van het AR-‐gen, [14] waardoor ook AOS veroorzaakt wordt.

Figuur 2 Een niet compleet overzicht van bekende mutaties die kunnen voorkomen bij vrouwen met AOS[14]


Profielwerkstuk

1 - AOS & zweet

Pagina 7

1.2 Waaruit bestaat transpiratievocht en hoe ontstaat de geur hiervan? Mensen transpireren om hun lichaam op de juiste temperatuur te houden. Bij het produceren van zweet wordt de huid vochtig en koelt hierdoor af. Zweet bestaat voornamelijk uit water, zout en zuren. De concentratie van electrolyten in gestimuleerd zweet (zweet dat door middel van de zweettest geproduceerd is) staat in tabel 1. Tabel 1: Samenstelling zweet [2] Gestimuleerd

Na+

K+

Cl-

40 mmol/L

5 mmol/L

<30 mmol/L

Zweet wordt geproduceerd door twee soorten zweetklieren; eccriene en apocriene zweetklieren.

Eccriene zweetklieren (glandula sudorifera eccrina) Eccriene zweetklieren zijn al werkzaam vanaf de geboorte. Ze zitten verspreid over het hele lichaam en hebben als functie het regelen van de lichaamstemperatuur. Zodra de lichaamstemperatuur te hoog wordt, krijgen de eccriene zweetklieren een prikkel vanuit de hypothalamus waardoor er meer zweet wordt geproduceerd.[12][15]

Apocriene zweetklieren (glandula sudorifera apocrina) In de puberteit worden onder invloed van geslachtshormonen de apocriene zweetklieren ontwikkeld. Ze zijn vaak verbonden aan een haarzakje en zitten niet over het lichaam verspreid, maar zitten in de oksels, rond de tepels en de uitwendige geslachtsorganen. De werking van apocriene klieren staat onder invloed van het hormoon adrenaline.[15] Door emoties worden de apocriene klieren gestimuleerd en scheiden olieachtig geurloos zweet af. Dit zweet komt in aanraking met bacteriën op de huid, waarna bacteriën het zweet omzetten in substanties met de onaangename zweetgeur.[15] De bacteriën die dit doen zijn de zogenaamde grampositieve bacteriën. De in dit onderzoek gebruikte zweettest stimuleert zweet uit eccriene zweetklieren. Omdat zweetgeur volgens de literatuur ontstaat door zweet uit apocriene klieren, is ook zweet uit de oksel verzameld, dus uit apocriene klieren. Op deze manier kan worden vergeleken welke verschillen in samenstelling bestaan tussen zweet van eccriene en apocriene klieren.


Profielwerkstuk

1 - AOS & zweet

Pagina 8

1.3 Heeft een vrouw met AOS apocriene zweetklieren? In de literatuur is niet te vinden of een vrouw met AOS apocriene zweetklieren heeft, maar dat is ook niet zo vreemd omdat hiernaar nog geen onderzoek is gedaan. Het lijkt op het eerste gezicht aannemelijk dat bij vrouwen met de meest complete vorm van AOS geen apocriene klieren ontwikkeld zijn. Hierdoor wordt dan geen zweet geproduceerd dat wellicht geassocieerd is met het ontstaan van okselbeharing, dat in de puberteit ontstaat onder invloed van androgenen. Vrouwen met AOS zijn ongevoelig voor androgenen, maar zou dit ook kunnen verklaren waarom transpiratiegeur bij deze vrouwen ontbreekt? We hebben de vrouwen met AOS die meededen met de onderzoeken gevraagd of ze okselhaar hadden of niet. Hieruit bleek dat vrouwen met AOS meestal helemaal geen of soms een klein beetje okselhaar hebben. Maar ook de vrouwen met AOS die een lichte vorm van okselbeharing hebben, zeggen geen transpiratiegeur te hebben. Bovenstaand fenomeen zou echter ook verklaard kunnen worden door de gevolgen van een eventuele gonadectomie (verwijdering van gonaden). Lange tijd werd aangenomen dat de testes door de plaatsing in de onderbuik, gevoelig waren voor de vorming van kwaadaardige tumoren. Om die reden werden de gonaden zo snel mogelijk na het stellen van de diagnose AOS verwijderd.[8] Pas sinds kort is aangetoond dat het niet verwijderen van de gonaden tot aan de puberteit geen kwaad kan.[7] Daarom zullen kinderen die nu met AOS geboren worden een andere behandeling krijgen dan de vrouwen die nu aan het onderzoek hebben meegedaan. Bij de meeste vrouwen die aan het onderzoek hebben deelgenomen, zijn de gonaden verwijderd. Dit bemoeilijkt het onderzoek, aangezien wij er in de hypothese van uitgaan dat de vorming van zweetgeur (mede) veroorzaakt wordt door de aanwezigheid van androgenen in het zweet. Het verwijderen van de gonaden heeft gevolgen voor de hoeveelheid androgenen in het lichaam en daarmee ook op de vorming van zweetgeur. Een deelneemster heeft echter nog wel haar gonaden. Dit is van belang omdat we bij de vergelijking van de androgeenniveaus in het speeksel en het zweet dat is afgenomen van de onderarm en de oksel, bij haar mogelijk een verschil kunnen zien. Dat zou een aanduiding kunnen zijn dat bij haar apocriene zweetklieren aanwezig zijn.


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

2.

Pagina 9

Opzet onderzoek Omdat er verschillende mogelijkheden zijn waarom bij vrouwen met AOS de transpiratiegeur ontbreekt, hebben we drie verschillende onderzoeken gedaan.

Onderzoek naar bacteriën in oksels van de vrouwen met AOS. Daartoe hebben we bacteriekweekjes ingezet van de oksels van vrouwen met AOS en deze vergeleken met de kweekjes van vrouwen zonder AOS.

Onderzoek naar mannelijke hormonen in zweet, afgenomen : via de ‘zweettest’ op de onderarm, met behulp van filtreerpapier in de oksel.

Het eerste onderzoek is om te bepalen of de huidflora van vrouwen met AOS afwijkt van dat van vrouwen zonder AOS. Een andere mogelijkheid is dat de samenstelling van het zweet van vrouwen met AOS anders is dan de samenstelling van het zweet van vrouwen zonder AOS. Mogelijk zijn niet de juiste hormonen aanwezig om een reactie aan te gaan met de bacteriën in de oksels. Dat is de reden dat ook de samenstelling van zweet onderzocht is. Bij het uitvoeren van de zweettest en de filtreerpapiertest hebben we hulp gekregen van dr. Yolanda de Rijke, klinisch chemicus, en Joyce Marks, analiste, beiden van het ErasmusMC. Bij het inzetten van de bacteriekweekjes hebben we hulp gekregen van René Kuiper, analist bij het microbiologisch laboratorium van het Erasmus MC. Voorafgaand aan het onderzoek was de vrouwen gevraagd geen deodorant te gebruiken. We hebben de vrouwen met AOS een vragenlijst met onderstaande vragen laten invullen.

Heeft u AOS? Zo ja, Partieel of Compleet?

Heeft u wel eens last van transpiratiegeur?

Heeft u geen, weinig, of veel okselhaar?

Heeft u vandaag deodorant gebruikt?

Omdat we geen inzage hebben in medische dossiers, kunnen we niet met 100 procent zekerheid zeggen of de deelneemsters aan het onderzoek daadwerkelijk AOS hebben, maar aangezien okselhaar ontstaat onder invloed van androgenen, is de aan/afwezigheid van okselhaar een Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 10

indicator voor de werkzaamheid van androgenen. Het okselhaar van de vrouwen werd door ons visueel beoordeeld. Zie de bijlage. Omdat erg weinig mensen in Nederland AOS hebben en doordat zij in het verleden geadviseerd werden hun klinische conditie geheim te houden, was het moeilijk vrijwilligsters te vinden voor het onderzoek.[3][9][18] In dit onderzoek was het niet mogelijk herhaalmetingen te verrichten. Het aantal metingen in dit onderzoek is niet voldoende om statistisch onderbouwde conclusies te trekken, maar de verwachting is dat interessante resultaten gevonden worden waardoor het kan dienen als pilot onderzoek dat eventueel aanleiding kan zijn voor verder wetenschappelijk onderzoek.

Deelneemsters Voor het onderzoek is gebruik gemaakt van twee populaties. Een groep vrouwen met AOS en een groep vrouwen zonder AOS.

Vrouwen met AOS Voor ons onderzoek hebben wij de hulp gevraagd van patiëntenvereniging AISNederland. Voordat deelneemsters hun medewerking toezegden, hebben wij hen volledig inzicht gegeven in het doel en de werkwijze van het onderzoek. We hebben op drie verschillende manieren vrouwen met AOS benaderd voor ons onderzoek.

Eerst hebben we toestemming gevraagd aan Juliette Küling (voorzitster van AISNederland) om de testjes te mogen afnemen op de bijeenkomst van de vereniging op 1 oktober 2011. Zij heeft een door ons geschreven bericht via e-mail verspreid onder leden van AISNederland. Op deze manier kregen we onze eerste deelneemster.

Oud-voorzitster van AISNederland Miriam van der Have plaatste voor ons een oproep op de Facebook-pagina van AISNederland. Hiermee kregen we nog eens vier deelneemsters.

Tijdens de bijeenkomst van AISNederland op 1 oktober 2011 hebben we een presentatie gehouden over ons profielwerkstuk. We kregen veel positieve reacties en opeens hadden we meer vrijwilligers dan bacteriekweekstokjes.

Vrouwen zonder AOS Dr. Yolanda de Rijke heeft voor ons profielwerkstuk zweet verzameld van 3 vrouwen zonder AOS. Met deze vrouwen hebben we zelf geen contact gehad. Dr. Yolanda de Rijke heeft bij hen de beide samples afgenomen. De deelneemsters zonder AOS voor de bacteriekweekjes hebben we gevonden in onze eigen omgeving. Dit zijn dus niet dezelfde


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 11

deelneemsters als de vrouwen zonder AOS bij wie de zweet-samples zijn afgenomen. We zochten oorspronkelijk vrouwen boven de 18 jaar die nog niet in de overgang zitten, omdat de hormoonhuishouding bij hen stabieler is. Omdat het moeilijk bleek vrouwen met de juiste leeftijd te vinden, hebben we nagevraagd aan René Kuiper of we ook leeftijdsgenoten konden gebruiken voor ons onderzoek. Dit bleek geen bezwaar te zijn.

1. Bacteriekweekjes Als eerste onderzoek hebben we een kweek gemaakt van bacteriën uit de oksels van vrouwen met AOS. Zo kunnen we zien of er bacteriën aanwezig zijn. Deze bacteriën hebben we vervolgens vergeleken met bacteriën die voorkomen bij vrouwen zonder AOS. Figuur 3 Materialen bacteriekweekjes; v.l.n.r. voedingsbodem, witte en blauwe roerstaafjes voor verspreiding bacteriën, kweekstokjes.

We hebben twee soorten bacteriekweekjes gebruikt. Bij de eerste soort hebben we met de ‘officiële’ bacteriekweekstokjes gewerkt voor de soort en de hoeveelheid bacteriën. Dit zijn speciale wattenstaafjes die worden gebruikt om bacteriën af te nemen. Na de afname worden de kweekstokjes in een gel bewaard, zodat de bacteriën in leven blijven. Bij de tweede soort bacteriekweekjes hebben we gewerkt met normale wattenstaafjes voor de hoeveelheid bacteriën. We hebben gekozen voor twee soorten bacteriekweekjes, omdat we oorspronkelijk dachten dat met de eerste methode alleen de soort kan worden bepaald. Later werd duidelijk dat de eerste methode geschikt was om soort én hoeveelheid aan te tonen. De tweede methode was minder betrouwbaar, maar omdat dit onderzoek nog niet eerder was uitgevoerd, hebben we ervoor gekozen om ook deze methode te gebruiken.

Officiële bacteriekweekjes Voor de soort en hoeveelheid bacteriën is met een officieel kweekstokje kort (een paar seconden) over de oksel gestreken. Er is voor gezorgd dat de huid met alle kanten van het stokje is aangeraakt. De buisjes van de kweekstokjes bevat een gel, waardoor de verzamelde bacteriën blijven leven – de bacteriën houden immers van een vochtige omgeving. De


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 12

buisjes zijn in de koelkast bewaard tot het moment dat wij naar het Erasmus gingen om de kweekjes te zetten. Figuur 4 Voorbeeld kweekje met alle sectoren.

In het microbiologisch laboratorium is met ieder kweekstokje op een standaardvoedingsbodem een cirkel ‘getekend’. Daarna is dit twee keer verspreid met een blauwe plastic roerstaafje (1e en 2e sector). Met een nog kleiner wit roerstaafje is dit nog twee keer verspreid (3e en 4e sector). Dit resulteerde in vier verschillende sectoren (zie figuur 4) die uiteindelijk ieder een eigen mate van bacteriegroei zullen vertonen.

Wattenstaaf bacteriekweekjes Bij de tweede serie bacteriekweekjes (voor het bepalen van het aantal bacterie-kolonies) is kort in een draaiende beweging met een wattenstaafje over de oksel gedaan, zodat alle kanten van het stokje de huid hebben aangeraakt. Dit wattenstaafje is bewaard in een reageerbuisje met een druppeltje fysiologisch zout. Ook deze buisjes zijn een paar dagen in de koelkast bewaard voordat we naar het Erasmus gingen. In het laboratorium hebben we eerst vier druppels fysiologisch zout in het reageerbuisje gepipetteerd, omdat het oorspronkelijke fysiologisch zout al was opgenomen door het wattenstaafje. Vervolgens is ieder reageerbuisje een paar seconden machinaal geschud om de bacteriën goed met de vloeistof te mengen. Met een roerstaafje is een druppel uit het buisje op de voedingsbodem aangebracht en met een stokje over de gehele voedingsbodem verdeeld.

2a. Afname van zweet van onderarm door middel van lokale zweetstimulatie Voor onderzoek naar de zweetsamenstelling is zweet afgenomen bij vier vrouwen met AOS en bij vier vrouwen zonder AOS. Deze controlegroep is geregeld door dr. De Rijke.


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 13

Figuur 5 De elektroden worden door ons op de arm geplaatst.

Wij hebben de samples verzameld op de landelijke bijeenkomst van de AOS-vereniging op 1 oktober 2011 via de 'zweettest' die ook gebruikt wordt bij het diagnosticeren van taaislijmziekte. Bij de zweettest wordt via iontoforese de zweetproductie gestimuleerd. Dit gebeurt door twee elektroden en een lage spanning: door de zwakke stroom (1,5 mA gedurende vijf minuten) wordt pilocarpine, een stof die de zweetproductie stimuleert, meegenomen door de huid. De zweetklieren bevinden zich 2 tot 3 mm onder de huid en worden door het pilocarpine lokaal aangezet tot het produceren van zweet. Figuur 6 Structuurformule van pilocarpine

Hiervoor wordt allereerst de onderarm schoongemaakt en daarna gedroogd. Rondjes van gelei waar pilocarpine in zit en die de stroom goed naar de arm geleiden, worden via twee elektroden, een rode en een zwarte, op de arm gebonden. De zwarte boven, de rode onder. Zie figuur 5. Door de electroden aan te sluiten op een voeding loopt een zeer lage elektrische stroom tussen de elektroden, waardoor onder invloed van de pilocarpine de zweetproductie lokaal gestimuleerd wordt. De stimulatie duurt vijf minuten. Na deze tijd klinkt een geluidsignaal en wordt de voeding uitgeschakeld. Tijdens het afnemen van de samples bleek dat de huid na de stimulatie op beide plekken van de elektroden rood was geworden. Na het schoonmaken en drogen van de huid wordt op de plek tussen de elektroden een capillair gelegd, die strak wordt vastbonden met een band. In dit capillair word het zweet verzameld. Het capillair lijkt op een horloge en bestaat uit een dun buisje dat opgerold is als een slakkenhuis. Aan de onderkant zit een heel klein gaatje waar het zweet in gaat. Om er voor te


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 14

zorgen dat het zweet dat geproduceerd wordt, ook echt in het capillair wordt opgenomen, moet deze strak vastgebonden worden. Het zweet wordt zichtbaar in het capillair doordat bij de ingang van het capillair de kleurstof methyleenblauw zit. De kleurstof word door het zweet meegenomen het capillair in, waardoor zichtbaar is hoeveel zweet opgenomen is. In totaal duurde deze methode per vrouw ongeveer 45 minuten. Met deze methode wordt ongeveer 50 tot 60 microliter zweet verzameld. Dit is heel weinig, waardoor er een keuze gemaakt moet worden welke hormonen er bepaald zullen worden. Deze samples van de zweettest zijn direct na afname mee genomen naar Rotterdam en zijn daar ingevroren. In 2012 zal er op het endocrinologisch laboratorium nog een hormoonanalyse van het zweet plaatsvinden m.b.v. een zeer gevoelige detectietechniek, namelijk vloeistofchromatografie gekoppeld aan een massaspectrofotometer (LC-MS). Figuur 7 Linkerarm: elektroden; rechterarm: capillair.

2b. Speeksel afgenomen Als onderdeel van ons tweede experiment is de vrouwen met AOS gevraagd om ongeveer 1 cm3 speeksel af te geven. Dit is gevraagd omdat het zeker was dat het testosterongehalte hierin gemeten kan worden, terwijl dit in zweet niet zeker was. De gebruikte ELISA-methode (zie volgende pagina) is namelijk bedoeld voor speeksel. We verwachtten wel dat de concentratie van testosteron in speeksel waarschijnlijk lager zou zijn dan in het zweet, omdat we per dag meer speeksel aanmaken dan zweet en het dus meer verdund wordt.

Meettechniek onderdeel 2a en 2b Voor de bepaling van de samenstelling van het zweet en het speeksel van de vrouwen met AOS zijn twee methoden gebruikt: een geautomatiseerde immunoanalyzer (IMMULITE 2000, Siemens Diagnostics, VS) en ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, DRG Diagnostics, Duitsland). Wij werden hierbij geassisteerd door researchanalist Ronald van der Wal. Figuur 8 De IMMULITE 2000


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 15

Omdat relatief weinig microliters zweet met de zweettest worden verzameld, was het niet mogelijk het verzamelde zweet met beide methoden te onderzoeken. Bij persoon 2 hebben we wel beide methoden gebruikt, omdat we hiervan genoeg microliters zweet hadden. Bij de andere zweetsamples is gekozen voor de ELISA-methode, omdat deze betrouwbaarder is bij het meten van lage concentraties testosteron in het zweet. De IMMULITE werkt normaal gesproken met een hoger volume en een hogere concentratie, dus het was de vraag of deze methode voor ons onderzoek zou werken. Speeksel is wel met beide onderzoeksmethoden onderzocht, omdat hiervan voldoende beschikbaar was. Het speeksel zal later ook nog met de LC-MS worden geanalyseerd. Figuur 9 Het plaatje met welletjes gevuld met samples.

IMMULITE Het zweet van persoon 2 hebben we door de IMMULITE laten onderzoeken op de concentratie testosteron. Het speeksel van alle vier de vrouwen met AOS is getest op de hoeveelheid testosteron, androsteendion en dehydroepiandrosteron.

ELISA Met de ELISA-methode, is de testosteronconcentratie nauwkeurig te meten. Hiervoor moeten veel handelingen worden verricht. Allereerst is het zweet en het speeksel gecentrifugeerd, zodat het beter te pipetteren is. Omdat voor deze methode per sample 100 µl nodig is, is het zweet van de linkerarm en het zweet van de rechterarm van elke proefpersoon bij Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 16

elkaar gevoegd. In de ELISA-kit zitten zeven potjes met elk een standaardconcentratie testosteron (0, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 pg/mL) en twee controlevloeistoffen met een lage en een hoge concentratie testosteron. Het endocrinologisch lab van het Eramus gebruikt zelf altijd ook nog drie door het lab zelf vervaardigde controles. Voor ons onderzoek zijn deze nog 10x verdund, omdat de concentratie anders te hoog is. De standaarden de controlesamples zijn geschud. ELISA gebruikt een plastic plaatje met een onderlaag dat eiwitten adsorbeert. Op de onderlaag zitten antilichamen van testosteron. Deze plaat heeft 96 welletjes. De volgende stap is dat de monsters elk in een welletje worden gedaan. De eerste standaard (0 pg/mL) wordt in viervoud gedaan, de andere standaarden in duplo. Figuur 10 Schematische voorstelling van wat er in een welletje gebeurt.

De zweetsamples zijn niet in duplo gedaan, omdat hiervoor te weinig volume beschikbaar was. Elk welletje werd gevuld met 100 µL vloeistof, behalve B11, omdat hiervoor te weinig materiaal beschikbaar was. De computer werd hier speciaal op ingesteld. In het zweet en speeksel (1) gingen de antigenen testosteron zich binden aan de antilichamen (2) op de onderlaag van het plaatje. Zie de onderstaande tabel voor de vulling van het plaatje. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

0

0

0

0

1

1

2

2

3

3

4

4

B

5

5

6

6

L

L

M

M

H

H

Z1 (50)

-

C

Z2 (100) S4

-

Z3 (100) CL

-

Z4 (100) CH

-

S1

S1

S2

S2

S3

S3

Tabel 2: Vulling van het plaatje

D

S4

CL

CH

E F G

De volgende stap is dat in elk welletje 200 µL enzymconjugaat (3) wordt toegevoegd. Dit is testosteron met een enzym eraan. Ook dit testosteron Simone de Jong – Wendel Peters

Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 17

bindt zich aan de antilichamen op de onderlaag van het plaatje (4). Hierdoor ontstaat een competitie tussen het testosteron van de samples en het testosteron van het enzymconjugaat. Dit blijft een uur staan, terwijl het wordt geschud, omdat na een uur het evenwicht tussen de twee soorten testosteron is ingesteld. De twee soorten testosteron hebben zich dan verdeeld over de antilichamen in dezelfde verhouding als de verhouding enzymconjugaat-testosteron en testosteron uit de samples. Figuur 11 Wendel pipetteert

Na dit uur wordt het plaatje schoongespoeld, waardoor in elk welletje alleen de antilichamen en de daaraan gebonden antilichamen overblijven. Hierna wordt in elk welletje 200 µL substraat toegevoegd (5). Dit substraat bindt zich aan de enzymen op het testosteron (6), afkomstig uit het enzymconjugaat. Door het substraat krijgen de welletjes een blauwe kleur. Na dertig minuten wordt deze reactie gestopt door toevoeging van zoutzuur. Hierbij verandert de kleur in geel waarbij de lichtabsorptie in de spectrofotometer bepaald wordt. De computer kan vervolgens per welletje de concentratie testosteron bepalen. In een grafiek zet de computer de concentratie testosteron uit tegen de lichtabsorptie aan de hand van de standaardconcentraties. Hierdoor ontstaat de standaardcurve. In deze standaardcurve is de concentratie testosteron omgekeerd evenredig met de lichtabsorptie. Hoe meer enzym-substraat-complexen er op de onderlaag zitten, hoe groter de absorptie van het licht. Minder lichtdoorlating wijst op een lage concentratie testosteron uit de zweet- of speekselsample. Figuur 12 Zoutzuur wordt toegevoegd.


Profielwerkstuk

2 - Opzet onderzoek

Pagina 18

3. Afname van zweet uit de oksel door middel van filtreerpapiertjes Bij onze derde methode wordt bij de vrouwen met AOS een filtreerpapiertje in de oksel gelegd, dat wordt vastgeplakt met huidvriendelijke kleefpleister. Het filtreerpapiertje moet met een pincet in de oksel worden gelegd en weer met een pincet eronder vandaan worden gehaald. Dit omdat het filtreerpapiertje en het buisje waar het in gaat, van te voren zijn gewogen. Als het filtreerpapiertje of het buisje wordt aangeraakt, bestaat de kans dat het gewicht verandert. Vervolgens wordt het gewicht opnieuw bepaald, maar nu mét het zweet in het filtreerpapiertje. Zo is nauwkeurig te bepalen hoeveel zweet is verzameld.

Meettechniek Omdat niet veel zweet kan worden verzameld, moet het onderzoek worden uitgevoerd met gevoelige meettechnieken. Van tevoren hadden we gehoord dat voor ons onderzoek gebruik kan worden gemaakt HPLCMS. Bij deze scheidingsmethode wordt het scheidingsproces van highperformance vloeistofchromatografie gekoppeld aan een massaspectrometer voor identificatie. Naderhand is gebleken dat deze apparatuur niet voor de afronding van dit profielwerkstuk beschikbaar is gekomen. Dat is vooral jammer omdat wij hierdoor geen androgeen-niveaus in het zweet van de oksel hebben kunnen bepalen. Wij vermoeden dat door de aanwezigheid van apocriene zweetklieren in de oksel en het ontbreken daarvan op de onderarm, de androgeenniveaus in het zweet in de oksel hoger liggen dan in het zweet op de onderarm. Jammer genoeg kan de ELISA-methode niet gebruikt worden om het zweet uit het filtreerpapier te analyseren. De steroïden moeten namelijk eerst uit het papier geëxtraheerd worden, om vervolgens droog te dampen en weer op te lossen in methanol (CH3OH). Methanol kan alleen gemeten worden met behulp van de HPLC-MS-methode en niet met ELISA.


Profielwerkstuk

3 - Verwerking

Pagina 19

3.

Verwerking 3.1 Is er verschil in hormoonconcentratie van transpiratievocht uit de onderarm en van speeksel tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS? We bespreken de resultaten van de Immulite en de ELISA, maar de ELISAmethode is voor ons onderzoek betrouwbaarder, omdat de IMMULITE geen testosteronconcentraties kan meten < 5 nmol/L.

Zweet van vrouwen met AOS Alleen van proefpersoon 2 hebben we de concentratie van testosteron met behulp van de IMMULITE laten bepalen. De bovengrens van vrouwen zonder AOS is <3,0 nmol/L. Tabel 3

Deelneemster

Concentratie testosteron (nmol/L)

2

3,08*

* Mogelijk vals verhoogd omdat de hoeveelheid materiaal eigenlijk te weinig was voor de IMMULITE-test .

Met de ELISA-methode konden we wel van alle 4 de vrouwen met AOS het zweet onderzoeken. Tabel 4

Deelneemster


1

0,2864

2

0,1143

3

0,1185

4

0,0787

Bij deelneemster 1 valt de testosteronconcentratie hoog uit. Deze uitslag is waarschijnlijk niet betrouwbaar – de deelneemster zweette tijdens de afname weinig, waardoor mogelijk een hogere concentratie is ontstaan.

Zweet van vrouwen zonder AOS Het zweet van vrouwen zonder AOS hebben we niet zelf afgenomen en niet zelf getest. We hebben de resultaten gekregen die met behulp van de LC-MS verkregen zijn. Dit is de gemiddelde waarde van drie vrouwen


Profielwerkstuk

3 - Verwerking

Pagina 20

zonder AOS. Deze waarde kan vergeleken worden met de waarde verkregen met die van de ELISA. Concentratie testosteron (nmol/L) 0,065

Tabel 5 Vrouwen zonder AOS

Speeksel van vrouwen met AOS Het speeksel van vrouwen met AOS hebben we met de IMMULITE niet alleen op testosteron onderzocht, maar ook op androsteendion. M.b.v. een radioactieve immunoassay is achteraf nog dehydroepiandrosteron (DHEA) bepaald. Tabel 6

Deelneemster

Concentratie testosteron (nmol/L)*

Concentratie androsteendion (nmol/L)*

Concentratie dehydroepiandrosteron (DHEA) (nmol/L) in speeksel

1

1,69

1,75

<0,7

2

1,19

2,18

<0,7

3

2,09

6,58

<0,7

4

1,44

1,24

<0,7

* Mogelijke vals verhoogd

Met de ELISA-methode hebben we de testosteronconcentratie bepaald in het speeksel. Tabel 7

Deelneemster

Concentratie testosteron (nmol/L) meting 1

Concentratie testosteron (nmol/L) meting 2

Concentratie testosteron (nmol/L) gemiddelde

1

0,0458

0,0507

0,0482

2

0,1432

0,2001

0,1716

3

0,3994

0,3308

0,3651

4

0,0544

0,0787

0,0666

Vrouwen zonder AOS hebben volgens de literatuur gemiddeld speeksel testosteronconcentraties van 0,046 nmol/L (SD 0,019). Bij mannen wordt gemiddeld 0,300 nmol/L gevonden.[20] We zien tussen beide methoden een groot verschil in concentratie. Dit komt waarschijnlijk doordat de IMMULITE minder nauwkeurig is, omdat deze minder goed zulke lage concentraties kan meten. Daarom gaan we uit van de resultaten van de ELISA-methode.

Speeksel van vrouwen zonder AOS Deze resultaten hebben we verkregen van dr. Yolanda de Rijke. Zij heeft het speeksel van vrouwen zonder AOS onderzocht met LC-MS. Dit zijn de gemiddelde waarden van de vrouwen zonder AOS.


Profielwerkstuk

3 - Verwerking

Pagina 21


Tabel 7

Vrouwen zonder AOS

Concentratie androsteendion (nmol/L)

<0,15

<0,30

Concentratie DHEA (nmol/L) <3

Analyse Bij dit onderdeel van het onderzoek hebben we te weinig deelneemsters om met zekerheid te kunnen zeggen of er een significant verschil aanwezig is tussen de twee groepen bij de hormoonconcentraties, we kunnen daarom hierop geen statistiek toepassen. Wel kunnen we door te kijken of de afwijking van de verwachte waarde groter is dan twee keer de standaardafwijking zien of er mogelijk een significant verschil is, omdat we dan een betrouwbaarheidsinterval hebben van 95% volgens de standaardverdeling. De hormoonconcentraties van vrouwen zonder AOS beschouwen wij hierbij als de verwachte waarde.

Zweet De testosteronconcentratie in het zweet is bij vrouwen met AOS gemiddeld 0,15 nmol/L met een standaardafwijking van 0,093. Bij de vrouwen zonder AOS is dit gemiddeld 0,065 nmol/L. Er is dus een duidelijk verschil aanwezig.

Speeksel ELISA Testosteron De gemiddelde testosteronconcentratie bij vrouwen met AOS is 0,16 nmol/L met een standaard afwijking van 0,145. Bij vrouwen zonder AOS is dat <0,15 nmol/L. De standaardafwijking is zo groot, dat zelfs al zou de concentratie testosteron bij vrouwen zonder AOS 0,00 nmol/L zijn, dan zou de afwijking kleiner zijn dan twee keer de standaardafwijking, waardoor we dit als geen significant verschil beschouwen. Androsteendion De androsteendionconcentratie nemen we niet mee in onze analyse omdat waarschijnlijk de geautomatiseerde assay niet geschikt is voor speeksel en dus naar verwachting sterk vals verhoogde uitslagen geeft. Bij vrouwen zonder AOS is de concentratie <0,30 nmol/L. We kunnen niet aangeven of er verschil is tussen de twee groepen. Dehydroepiandrosteron Bij vrouwen met AOS was de dehydroepiandrosteron te laag om te meten met RIA (radioimmune assay), de concentratie was <0,7 umol/L (detectiegrens). Ook bij vrouwen zonder AOS was de concentratie te laag, het was < 3 umol/L (detectiegrens van LC-MS). We kunnen uit deze gegevens dus geen conclusie trekken.


Profielwerkstuk

3 - Verwerking

Pagina 22

3.2 Is er een verschil in (aanwezigheid van) bacteriën bij de verschillende groepen? Bij alle kweekjes zijn bacteriekolonies te zien, behalve bij personen 3 en 13. Deze personen hebben allebei deodorant gebruikt. Deodorant zorgt blijkbaar voor de afwezigheid van bacteriën op de huid. Deze personen laten we bij verdere verwerking om die reden buiten beschouwing. Bij alle kweekjes hebben we gekeken tot in welke sector de bacteriën terecht waren gekomen. Figuur 13 Een van de voedingsbodems een paar weken na het zetten.

Soort en hoeveelheid Zonder AOS Opvallend is dat bij alle kweekjes de bacteriën tot in sector 3 of 4 zijn gekomen. We hebben gekeken naar de kleuren van de bacteriekolonies om verschillende soorten te onderscheiden. Lichtgrijze bacteriekolonies kwamen voor op vijf van de negen kweekjes, donkergrijze kolonies op zes van de negen kweekjes en gele kolonies op vijf van de negen kweekjes. Ten slotte zagen we op één kweekje nog een witte kolonie. Witte kolonies kwamen dus bijna niet voor.

Met AOS Hierbij verschilde de sector tot waarin de bacteriën waren gekomen erg. Dit varieerde tussen 1 en 4. Bij twee kweekjes bleven de bacteriekolonies in sector 1; bij twee kweekjes in sector 2; bij vijf kweekjes in sector 3 en bij twee kweekjes in sector 4. Lichtgrijze bacteriekolonies kwamen voor op bijna alle kweekjes, op negen van de elf. Donkergrijze kolonies kwamen voor op vijf van de elf kweekjes; gele kolonies op vier van de elf en witte kolonies op drie van elf kweekjes.


Profielwerkstuk

3 - Verwerking

Pagina 23

Hoeveelheid Deze resultaten horen bij de bacteriekweekjes die we hebben gezet met de gewone wattenstaafjes in fysiologisch zout. Deze methode is minder betrouwbaar dan de methode hierboven.

Zonder AOS Bij dit onderdeel hebben we het aantal kolonies geteld die op de voedingsbodems te zien waren. Bij de vrouwen zonder AOS verschilde dit erg. Drie van de negen kweekjes, persoon 5, 19 en 22, vertoonden helemaal geen bacteriën. Op twee kweekjes waren maar één of twee kolonies te vinden; bij drie kweekjes liep dit van 10 tot 18 kolonies. Eén kweekje vertoonde naar schatting 455 kolonies.

Met AOS Opvallend bij dit onderdeel was dat het aantal kolonies onder de 10 bleef. Bij twee van de 11 kweekjes waren er geen bacteriekolonies te zien. Bij de rest verschilde dit van één tot negen kolonies.

Verschillen Volgens René Kuiper waren de bacteriën op de kweekjes ‘gewone huidflora’. Omdat er visueel geen verschil aanwezig is tussen de soorten bacteriën, hebben we besloten geen verdere determinering te doen. Als we meer tijd hadden gehad, zouden we met Photoshop een nauwkeurigere telling van de verschillende soorten hebben gemaakt. Maar zelfs als dat verschil oplevert, blijft het meest opmerkelijke resultaat overeind: vrouwen met AOS hebben huidflora waarvan de literatuur aangeeft dat deze bij mensen zonder AOS medeverantwoordelijk is voor zweetgeur. Bij de ‘officiële’ kweekjes was een verschil te zien in de sector tot waarin de bacteriën waren gekomen. Bij vrouwen zonder AOS was dit altijd sector 3 of 4, en bij vrouwen met AOS verschilde dit van 1 tot 4. Er was geen verschil te zien qua soorten bacteriën. Bij de tweede methode is een verschil te zien in het aantal kolonies. Bij vrouwen zonder AOS was dit gemiddeld hoger dan bij vrouwen met AOS. Wij hebben door middel van de chikwadraattoets gekeken of dit verschil in aantal kolonies significant is. Wij hebben voor een foutkans gekozen van 5%. Om een significant verschil te hebben, moet de χ2 groter zijn dan 14,07. Wij kwamen uit op 25,52 en hieruit bleek dus dat het verschil in kolonies wel degelijk significant is. Vrouwen met AOS hebben dus significant minder bacteriën in hun oksels dan vrouwen zonder AOS.


Profielwerkstuk

4 - Conclusie

4.

Pagina 24

Conclusie In dit profielwerkstuk hebben we interessant onderzoek gedaan naar het ontbreken van transpiratiegeur bij vrouwen met AOS. Hierbij hebben we de volgende onderzoeksvraag opgesteld:

Waarom hebben vrouwen met AOS geen transpiratiegeur?

We hebben om hierop antwoord te kunnen geven, twee* verschillende onderzoeken gedaan.

Hormoonconcentratie

Is er een verschil in hormoonconcentratie van transpiratievocht uit de onderarm en van speeksel tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS?

Uit ons onderzoek naar de samenstelling van transpiratievocht uit de onderarm en speeksel leek de hormoonconcentratie testosteron bij vrouwen zonder AOS lager te zijn dan bij vrouwen met AOS.

Bacteriën

Is er een verschil in (aanwezigheid van) bacteriën bij de verschillende groepen?

Het verschil dat we zagen bij de officiële kweekjes is de sector tot waarin de bacteriën kwamen. Bij vrouwen zonder AOS kwamen de bacteriën altijd in sector 3 of 4, maar bij vrouwen met AOS verschilde dit van sector 1 tot 4. Bij de tweede methode, waarbij we duidelijk de kolonies konden tellen, bleek een significant verschil te zijn tussen de twee groepen. De vrouwen met AOS hebben significant minder bacteriën in de oksel dan vrouwen zonder AOS. Dit zou het ontbreken van de transpiratiegeur kunnen verklaren; vrouwen met AOS hebben minder van de bacteriën die normaal gesproken de transpiratiegeur produceren. Het ontbreken van transpiratiegeur bij vrouwen met AOS kan dus mogelijk liggen aan de hoeveelheid bacteriën. Bij de uitgevoerde onderzoeken konden geen statistisch onderbouwde verschillen in hormoonconcentraties voor testosteron, androsteendion en dehydroepiandrosteron tussen vrouwen met AOS en vrouwen zonder AOS worden aangetoond. Mogelijk zijn er te weinig bacteriën om de reactie


Profielwerkstuk

4 - Conclusie

Pagina 25

tussen de hormonen en de bacteriën waarbij de transpiratiegeur wordt geproduceerd, goed te laten verlopen. * = We hebben samples verzameld voor drie onderzoeken. De samples voor het derde onderzoek konden niet geanalyseerd worden omdat we binnen het tijdframe van dit profielwerkstuk geen toegang hadden tot de benodigde apparatuur. In de discussie komen we hier op terug.


Profielwerkstuk

5 - Discussie

5.

Pagina 26

Discussie Onze verwachting was dat vrouwen met AOS geen transpiratiegeur hebben, doordat de samenstelling van het zweet anders is bij vrouwen met AOS dan bij vrouwen zonder AOS. We dachten dat de reactie tussen de bacteriën en de hormonen in het zweet, die normaliter de zweetgeur veroorzaakt, niet goed verliep, doordat de hormoonconcentratie anders is in het zweet van vrouwen met AOS. Door ons onderzoek weten we nu dat het ontbreken van transpiratiegeur mogelijk ligt aan de hoeveelheid bacteriën op de oksel. Daar bleek een significant verschil te zijn in het aantal kolonies bacteriën. Daarbij moet worden opgemerkt dat voor de bepaling van de hormoonwaarden gebruik is gemaakt van de samples vanaf de onderarm en van het speeksel. Omdat analyse van de samples van het derde onderzoek, waarbij zweet uit de oksel werd verzameld met filtreerpapier, niet binnen het tijdbestek van dit profielwerkstuk beschikbaar is gekomen, is niet bekend wat de invloed is van eventueel aanwezige (of juist afwezige) apocriene zweetklieren in de oksel. Vlak voor het afsluiten van het profielwerkstuk werd bekend dat in 2012 op het endocrinologische laboratorium nog een hormoonanalyse van het zweet plaatsvinden met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan een massaspectrofotometer (LC-MS) zal plaatsvinden. De uitkomst van deze veel nauwkeuriger test kan duidelijk maken of het zweet uit de oksel van vrouwen met AOS hogere steroïdconcentraties bevat dan dat van vrouwen zonder AOS, zoals ons onderzoek van speeksel nu lijkt aan te geven. Als dat zo is, is nader onderzoek naar de interactie tussen androgenen en huidflora, en het al dan niet ontstaan van zweetgeur als gevolg van die interactie, gewenst. Omdat apocriene zweetklieren in de puberteit ontstaan onder invloed van androgenen, is het mogelijk dat vrouwen met AOS geen apocriene zweetklieren hebben. Dat apocriene zweetklieren onderdeel uitmaken van de androgeenafhankelijke lichaamsbeharing en dat deze beharing bij vrouwen met AOS ontbreekt, maakt deze veronderstelling aannemelijk. Meer onderzoek is nodig om te bepalen of vrouwen met AOS werkelijk geen apocriene zweetklieren hebben. Bij zo’n vervolgonderzoek zou ook rekening moeten worden gehouden met het moment van de gonadectomie. Bij de meeste volwassen vrouwen met AOS heeft de gonadectomie op vroege leeftijd plaats gevonden. In dit verband is het opmerkelijk dat deelneemster nummer 7 van bijlage 2 (nummer 3 van de uitslagen in paragraaf 3.1) haar gonaden nog bezit, en a) een aanmerkelijk hoger androgeenniveau vertoont dan de andere vrouwen met AOS (en zelfs hoger dan vrouwen zonder AOS) en b) ook geen zweetgeur heeft.


Profielwerkstuk

5 - Discussie

Pagina 27

Hoewel dit op dit moment niet meer dan anekdotisch bewijs vormt, is het verband tussen wel of geen gonadectomie en het ontstaan van apocriene zweetklieren iets dat in een vervolgstudie de moeite van het onderzoeken waard is. Omstandigheden die de resultaten beïnvloed kunnen hebben:


Het resultaat van de bacteriekweekjes kan zijn beïnvloed door mogelijke onnauwkeurigheid bij de bacterieafname. Misschien zijn wij niet lang genoeg of niet constant op dezelfde manier met de wattenstaafjes en kweekstokjes over de oksel gegaan. Dit kan invloed hebben gehad op de hoeveelheid bacteriekolonies die ontstonden op de voedingsbodem.

Omdat we de resultaten hebben gebaseerd op een visuele vergelijking, is het mogelijk dat we de kleuren van de kolonies niet goed hebben onderscheiden of dat we de kolonies niet goed hebben geteld. Dit kan ook de resultaten van het bacterie-onderzoek hebben beïnvloed.

Het nadeel van de zweettest is dat de gebruikelijke plek waar de verzamelaar traditioneel wordt gebruikt, de arm, eccriene transpiratieklieren bevat terwijl zweet uit de apocriene transpiratieklieren verantwoordelijk is voor zweetgeur. Om die reden is ook zweet afgenomen uit de oksel, maar dit onderzoek kon uiteindelijk helaas niet binnen het tijdbestek van dit profielwerkstuk worden uitgevoerd.

Op basis van de beschikbare literatuur over zweetlucht en de tot onze beschikking staande apparatuur, is besloten alleen te kijken naar de hormoonniveaus voortestosteron, androsteendion en dehydroepiandrosteron. Het is mogelijk dat andere dan deze steroïden een rol spelen in het ontstaan van zweetlucht.

Op voorhand stond al vast dat de uitkomst van ons onderzoek niet tot harde conclusies zou kunnen leiden. Ten eerste is een populatie van 12 personen vanuit de statistiek gezien erg klein. En verder we kunnen niet met zekerheid zeggen of de vrouwen AOS hebben of een andere (gerelateerde) aandoening. Daar komt nog bij dat AOS niet gekoppeld is aan een enkele mutatie. Zie paragraaf 1.1.

Profielwerkstuk

6 - Bedankt!

6.

Pagina 28

Bedankt! Dit onderzoek was alleen mogelijk dankzij de inzet van heel veel mensen. Allereerst zijn dat natuurlijk de naamloze deelneemsters aan het onderzoek. Dames: heel erg bedankt! Maar onze dank gaat ook uit naar prof. dr. Sten Drop, dr. Yolanda de Rijke, Joyce Marks, Ad Luijendijk, René Kuiper, Ronald van der Wal, dr. Albert Brinkman, dr. Anton Grootegoed, Juliette Küling en Miriam van der Have. De hulp was divers: we werden geïntroduceerd bij mensen die ons weer verder hielpen en andere keren werd hardop met ons meegedacht. Weer andere mensen hebben geholpen bij het analyseren van onze samples of om ons op tijd in Rotterdam te krijgen. Maar van iedereen die hier genoemd is, willen we Yolanda extra bedanken voor het vele meedenken en het becommentariëren van dit verslag. De inspanning die ieder heeft verricht is niet voor iedereen gelijk geweest. Op sommige mensen hebben we meer beslag gelegd dan op anderen. Maar we weten dat iedereen onmisbaar was voor ons profielwerkstuk. We hopen dat we jullie, als we studeren, nog een keer tegenkomen. Een laatste woord van dank gaat natuurlijk aan onze docenten op school. Zonder jullie hadden we de vragen van Yolanda niet kunnen beantwoorden.

Simone de Jong & Wendel Peters, Nijmegen, december 2011


Profielwerkstuk

7 - Samenvatting

7.

Pagina 29

Samenvatting In dit profielwerkstuk hebben we onderzoek gedaan naar de vraag waarom vrouwen met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom (AOS) geen transpiratiegeur hebben. Daarvoor is bij 12 vrouwen met AOS en 10 vrouwen zonder AOS onderzoek gedaan naar de huidflora in de oksel. Verder is bij 4 vrouwen met AOS en 3 vrouwen zonder AOS zweet afgenomen vanaf de onderarm en vanaf de oksel, om zo de hormoonconcentratie te bepalen. Hierbij hebben wij specifiek gekeken naar de hormonen testosteron, androsteendion en dehydroepiandrosteron. Er bleek een duidelijk verschil te zijn in testosteronconcentratie. Vrouwen met AOS leken hogere concentraties testosteron te hebben dan vrouwen zonder AOS. Uit de bacteriekweekjes bleken vrouwen met AOS significant minder bacteriën te hebben dan vrouwen zonder AOS – de bacteriën van vrouwen zonder AOS kwamen uit in sector 3 en 4, terwijl dit bij de bacteriën van vrouwen met AOS verschilde van sector 1 t/m 4. Dat vrouwen met AOS hogere testosteronconcentraties lijken te hebben en ondanks de aanwezigheid van een schijnbaar normale huidflora geen transpiratiegeur hebben, is opmerkelijk en vraagt om verder onderzoek.


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

8.

Pagina 30

Bijlagen Bijlage 1: Literatuurlijst 1. The AIS Support Group (UK). AIS Factsheet. Via cd-‐rom van AIS Support Group (UK). 2. Albers, Y., Van der Schilden, A. (2007). Hyperhidrosis en voeding. Eindscriptie Hogeschool van Amsterdam, pag. 8-‐9 3. Anoniem. (1994), Once a dark secret. Br Med J 1994;308:542 4. Boehmer, A. (2000). Familial disorders of sexual differentiation: a clinical and molecular genetic evaluation. Proefschrift. 5. Boehmer, A. et al. (2001), Genotype Versus Phenotype in Families with Androgen Insensitivity Syndrome, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism September 1, vol. 86 no. 9 4151-‐4160 – Online: jcem.endojournals.org/content/86/9/4151.full 6. Cohen-‐Kettenis, P.T. (2010). Psychosocial and psychosexual aspects of disorders of Sexdevelopment. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism 24 (2010) 325–334 7. Cools, Martine et al. (2009), Disorders of sex development: update on the genetic background, terminology and risk for the development of germ cell tumors, World Journal of Pediatrics, Volume 5, Number 2, 93-‐102, DOI: 10.1007/s12519-‐009-‐0020-‐7 8. Cools, Martine et al. (2006), Germ Cell Tumors in the Intersex Gonad: Old Paths, New Directions, Moving Frontiers, Endocrine Reviews 27(5):468-‐84 (2006) PMID 16735607 9. Van der Have, M.J., Intven, I. C. A. H. and Barends, A., Patiënten, ouders, behandelaars en de patiëntenorganisatie, Tijdschrift voor Kindergeneeskunde, Volume 76, Number 3, 145-‐147, DOI: 10.1007/BF03078194 10. Hughes, I.A. (2001). Minireview: Sex Differentiation. Endocrinology 142(8):3281-‐3287 11. Lee P.A., Houk C.P., Ahmed S.F., Hughes I.A. et.al. (2006) Consensus statement on management of intersex disorders. International Consensus Conference on Intersex -‐ Pediatrics. 2006 Aug;118(2):e488-‐500. 12. Van Leeuwen, R.L. (…). Zweten. Retrieved from the web July 5, 2011. http://www.huidinfo.nl/zweten.html


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 31

13. Leyden, J. J., McGinley, K.J., Hölzle, E. et. al. (1981). The Microbiology of the Human Axilla and Its Relationship to Axillary Odor. The Journal of Investigative Dermatology, 77: 413-‐416 14. McGill University, The Androgen Receptor Gene Mutations Database World Wide Web Server, http://androgendb.mcgill.ca/, Retrieved from the web October 30, 2011 15. Van der Ploeg, Y. (2007). Zweetklieren. Retrieved from the web July 5, 2011. http://www.huidweb.nl/index.php?id=36 16. Preves, S.E. (2003), Intersex and Identity, Rutgers University Press, tweede druk 2005 -‐ pagina 38 17. Quigley CA, De Bellis A, Merschke KB, El-‐Awady MK, Wilson EM, French FS. (1995), Androgen receptor defects: historical, clinical and molecular perspectives. Endocr Rev 1995;16(3): 271 321. 18. Slijper FME, Drop SLS, Molenaar JC, Scholtmeijer RJ (1988) Pasgeborenen met gestoorde geslachtsontwikkeling die de vrouwelijk sekse toegewezen krijgen, advisering van de ouders, Nederlands Tijdschrift voor geneeskunde 1988; 132 nr. 41: 1892-‐ 196 19. Shedadeh & Kligman 20. Stanton, S.J., Mullette-‐Gillman, D.A., Huettel, S.A. (2011). Seasonal variation of salivary testosterone in men, normally cycling women, and women using hormonal contraceptives. Physiology Behavior 104, pag. 804-‐8 21. Vereniging AISNederland (2003). Vrouwen met xy-‐ chromosomen? AISNederland folder 22. De Vries, A.L. C ,Doreleijers, T. H. A. H. & Cohen-‐Kettenis, P.T. (2007) Disorders of sex development and genderidentity outcome in adolescence and adulthood: understanding genderidentity development and its clinical implications. Pediatric Endocrinology Reviews 2007; 4: 343–351. 23. WHA – Genomic resource centre | Gender and Genetics | Genetic Components of Sex and Gender http://www.who.int/genomics/gender/en/index1.html – Retrieved from the web October 30, 2011 24. Xiao, Y., Wang, D., Li, X. et. al. (2010). S578N mutation of the androgen receptor in an adolescent with complete androgen insensitivity syndrome. Chinese Medical Journal 123, pag. 1473-‐ 1476


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 32

Bijlage 2: Deelneemsters bacteriekweekjes


Deelneemster

Aandoening

Transpiratiegeur

Okselhaar

Deodorant gebruikt

1

-

+

+

-

2

-

+

+

-

3

-

+

+

+

4

-

+

+

-

5

-

+

+

-

6

CAOS

-

-

-

7

CAOS + gonaden

-

-

-

8

AOS

-

-

-

9

AOS

-

-

-

10

CAOS

-

-

-

11 12

CAOS CAOS

-

-

-

13

Gonadale dysgenesie

Weinig

Weinig

+

14

CAOS

-

Weinig

-

15

PAOS

-

-

-

16

CAOS

-

-

-

17

CAOS

-

-

-

18

-

+

+

-

19

-

+

+

-

20

-

+

+

-

21

-

+

+

-

22

-

+

+

-

Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 33

Bijlage 3: Resultaten bacteriekweekjes Soort en hoeveelheid (officiële kweekjes) Zonder AOS Deelneemster 1

Sector 3

Lichtgrijs -

Donkergrijs +

Geel +

Wit -

Opmerking Veel donkergrijs, 1x geel

2

4

+

+

+

-

3

0

-

-

-

-

4

3

+

-

-

-

5

4

+

-

+

-

18

3

-

+

-

-

19

3

+

+

-

-

In sector 3 is er een grote onverklaarbare bacteriekolonie te zien

20

4

+

-

+

-

In sector 1 en 2 lichtgrijs; in sector 4 3x geel

21

4

-

+

+

+

In sector 1 en 2 donkergrijs en 1x wit; in sector 4 geel.

22

3

-

+

-

-

Deelneemster 6

Sector 2

Lichtgrijs +

Donkergrijs +

Geel +

Wit -

Opmerking 1x geel in sect. 1

7

2

+

-

+

-

Alleen geel, in sector 2 1x lichtgrijs

8

3

+

+

-

-

9

3

+

+

-

-

10

3

+

+

-

-

11

3

+

-

-

-

12

1

+

-

-

+

13

0

-

-

-

-

14

4

+

-

-

-

15 16

1 3

-

+ -

+

+ +

Weinig kolonies Meerderheid wit

17

4

+

-

+

-

In sector 3 en 4 2x geel, rest lichtgrijs

Niets te zien Meerderheid lichtgrijs

Met AOS


Veel kleine kolonies Zo nu en dan geel/bruine kolonies Meerderheid donkere doorzichtige kolonies, en lichtgrijze (aangevreten) kolonies Voornamelijk wit en enkele lichtgrijze kolonies Niets te zien

Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 34

Hoeveelheid Zonder AOS Deelneemster

Aantal kolonies

1

10

2

2

3 4

0 18

5

0

18

±455

Opmerking

19

0

20

12

21

1

22

0

Deelneemster

Aantal kolonies

Opmerking

6

2

Kolonies aan elkaar, eentje slijmerig

Met AOS


7

1

8

0

9

9

10 11

1 5

12

1

13

0

14

1

15

1

16

6

17

0

Hele kleine kolonies

Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 35

Bijlage 4: Kweekjes Zonder AOS Deelneemster 1

Deelneemster 2

Deelneemster 3

Deelneemster 4


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 36

Deelneemster 5

Deelneemster 18

Deelneemster 19

Deelneemster 20

Deelneemster 21


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 37

Deelneemster 22

Met AOS Deelneemster 6

Deelneemster 7

Deelneemster 8

Deelneemster 9


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 38

Deelneemster 10

Deelneemster 11

Deelneemster 12

Deelneemster 13

Deelneemster 14


Profielwerkstuk

8 - Bijlagen

Pagina 39

Deelneemster 15

Deelneemster 16

Deelneemster 17


Profielwerkstuk

REUKLOZE VROUWEN T G SIMONE DE JONG & WENDEL PETERS Waarom hebben vrouwen met het Androgeen Ongevoeligheid Syndroom geen transpiratiegeur?

Recommend Documents