FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
RETINALE GENTHERAPIE Heden en toekomst
Kirsten W. M. VAN RUMST
Promotor: Prof. Dr. Elfride De Baere
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
RETINALE GENTHERAPIE Heden en toekomst
Kirsten W.M. VAN RUMST
Promotor: Prof. Dr. Elfride De Baere
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”
Datum 16/08/2011
(handtekening)
Naam (student)
(promotor)
VAN RUMST Kirsten
DE BAERE Elfride
Afkortingen µl
microliter
aa
aminozuren
AAV
adeno-geassocieerd virus
ADA
adenosine deaminase
APC
amplitude of pupillary constriction
APEX
arrayed primer extension
BSS
balanced salt solution
CBA
chicken β actine
cGMP
cyclisch guanosine monofosfaat
CMGG
Centrum voor Medische Genetica, Gent
CMV
cytomegalovirus
CNG
cyclic nucleotide gated channel
CNGA3
cyclic nucleotide gated channel alpha 3
CNGB3
cyclic nucleotide gated channel beta 3
dB
decibel
DNA
deoxyribonucleïnezuur
EORD
early-onset retinal dystrophy
ERG
elektroretinogram
et al.
et alii
ETDRS
Early Treatment Diabetic Retinopathy Study
FST
full-field sensitivity test
GCAP
guanylyl cyclase geactiveerd proteïne
GFP
groen fluorescent protein
Hz
hertz
IFN-γ
interferon gamma
kb
kilobasen
kDa
kilodalton
kg
kilogram
L
lange golflengte
LCA
Leber Congenitale Amaurosis
M
midden golflengte
mf-ERG
multifocaal ERG
mg
milligram
mm
millimeter
ms
milliseconden
nm
nanometer
OCT
optische coherentie tomografie
ONL
outer nuclear layer
OS
outer segment
OTC
ornithine transcarbamylase
PCR
polymerase chain reaction
PGD
preïmplantatie genetische diagnostiek
PR
promotor
rAAV
recombinant adeno-geassocieerd virus
RP
retinitis pigmentosa
RPE
retinaal pigmentepitheel
S
korte golflengte
SCID
severe combined immunodeficiency
SD
standaarddeviatie
SI
stimulatie index
VPLR
velocity of pupillary light reflex
Inhoudstafel Abstract .................................................................................................................................................. 1 Inleiding.................................................................................................................................................. 3 1.
2.
3.
Gentherapie ................................................................................................................................. 3 1.1.
Algemeen............................................................................................................................. 3
1.2.
Het oog en de retina............................................................................................................. 4
Structuur en werking van de retina .............................................................................................. 5 2.1.
Structuur .............................................................................................................................. 5
2.2.
Fototransductiecascade en visuele (retinoïd) cyclus ........................................................... 6
Retinale dystrofieën ..................................................................................................................... 8 3.1.
Leber Congenitale Amaurosis ............................................................................................. 8
3.1.1.
Algemeen..................................................................................................................... 8
3.1.2.
Retinaal pigmentepitheel-specifiek proteïne 65 kilodalton (RPE65) .......................... 9
3.1.2.1.
Gen en proteïne ....................................................................................................... 9
3.1.2.2.
Diermodellen ......................................................................................................... 10
3.1.2.2.1.
Muizenmodel .................................................................................................. 10
3.1.2.2.2.
Hondenmodel ................................................................................................. 11
3.1.3. 3.2.
Diagnose .................................................................................................................... 12
Kleurenblindheid en Achromatopsie ................................................................................. 13
3.2.1.
Kleurenblindheid ....................................................................................................... 13
3.2.2.
Achromatopsie........................................................................................................... 14
Methodologie........................................................................................................................................ 16 Resultaten ............................................................................................................................................. 17 1.
LCA2 – RPE65 .......................................................................................................................... 17 1.1.
Honden .............................................................................................................................. 17
1.1.1.
Proof of Concept........................................................................................................ 17
1.1.2.
Lange termijn studie .................................................................................................. 18
1.2.
Mensen .............................................................................................................................. 20
1.2.1.
Drie initiële studies .................................................................................................... 20
1.2.1.1.
Bainbridge et al. .................................................................................................... 21
1.2.1.2.
Maguire et al. ........................................................................................................ 24
1.2.1.3.
Hauswirth et al. ..................................................................................................... 25
1.2.2.
Activatie van de visuele cyclus en trage staafjes-kinetica ......................................... 28
1.2.3.
Follow-up studies ...................................................................................................... 30
1.2.3.1.
Maguire et al. ........................................................................................................ 30
1.2.3.2.
Hauswirth et al. ..................................................................................................... 32
1.2.4. 2.
Dose-escalation trial .................................................................................................. 33
Kleurenblindheid en Achromatopsie ......................................................................................... 36 2.1.
Kleurenblindheid: Doodskopaapjes................................................................................... 36
2.2.
Achromatopsie................................................................................................................... 38
2.2.1.
Hondenmodel: CNGB3-mutaties .............................................................................. 38
2.2.2.
Muizenmodel: Cnga3-mutaties ................................................................................. 40
Discussie ............................................................................................................................................... 43 1.
LCA2 – RPE65 .......................................................................................................................... 43
2.
Kleurenblindheid en Achromatopsie ......................................................................................... 46
3.
Conclusie ................................................................................................................................... 47
Referenties............................................................................................................................................ 48
Abstract
Abstract Inleiding: Gentherapie is de laatste jaren een hot topic in de medische wereld en wordt samen met stamceltherapie beschouwd als dé toekomst voor aandoeningen die tot op heden niet of onvoldoende behandelbaar zijn. Door het inbrengen van een ‘gezond’ gen wordt de deficiëntie van het eiwitproduct van het ‘zieke’ gen hersteld en kan de aandoening die hiermee gepaard gaat, genezen worden. In deze scriptie wordt ingezoomd op het onderzoek naar de behandeling van retinale dystrofieën en meer specifiek van Leber Congenitale Amaurosis type 2 (LCA2, veroorzaakt door mutaties in het RPE65-gen), kleurenblindheid en achromatopsie. LCA kan veroorzaakt worden door mutaties in één van de genen waarvan het genproduct een rol speelt in het omzetten van een lichtprikkel naar een elektrisch signaal. RPE65 is één van deze genen. Bijgevolg zorgen RPE65-mutaties voor een vroege blindheid bij kinderen. Kleurenblindheid is een zeer frequente aandoening en wordt veroorzaakt doordat één van de drie types fotopigmenten in de kegeltjes van de retina ontbreekt. Op basis van het type fotopigment dat ontbreekt, kan een bepaalde kleur niet herkend worden en neemt men deze waar als een grijstint. Achromatopsie is de ernstigste vorm van kleurenblindheid omdat patiënten geen enkele kleur kunnen waarnemen, uitgezonderd zwart, wit en grijstinten. Het heeft evenwel een andere oorzaak dan de frequentere types van kleurenblindheid, omdat hierbij bepaalde genen kunnen aangetast zijn die van belang zijn in de fototransductie in de kegeltjes. In dit geval is de oorzaak verschillend van het ontbreken van bepaalde fotopigmenten. Methodologie: Voor deze literatuurstudie werden PubMed/MEDLINE en ISI Web of Knowledge geconsulteerd. In deze databanken werd door middel van enkele trefwoorden gespeurd naar relevante literatuur omtrent de gentherapeutische behandeling van LCA2, kleurenblindheid en achromatopsie. Resultaten: Acland et al. toonden met hun Proof of Concept studie bij het Briard hondenras - met een natuurlijke deficiëntie van RPE65-eiwit - aan dat de subretinale toediening van RPE65 door een virale vector (adeno-geassocieerd virus type 2) een significant positief effect heeft op de visuele functie van deze dieren. Ook na drie jaar follow-up bleven de resultaten stabiel. Dit zorgde ervoor dat er drie onafhankelijke humane studies werden opgezet met in totaal negen patiënten met LCA2. Zij kregen elk in één oog een subretinale toediening van een virale vector met RPE65. Het doel van deze studies was vooral om de veiligheid te evalueren, maar ook de werkzaamheid van de injecties werd onderzocht. Men kwam in elke studie tot het voornaamste besluit dat deze behandeling, gedurende een follow-up van ten minste één jaar, veilig is. De resultaten in verband met de werkzaamheid waren niet in elke studie even consistent, maar ze gingen zeker de goede richting uit en verder onderzoek met grotere dosissen en op jongere leeftijd was nodig om dit uitgebreider te evalueren. De resultaten van de dose-escalation trial, die onder andere ook bij kinderen werd uitgevoerd, toonde aan dat 1.5x1011 vectoren per injectie waarschijnlijk de bovenste grens vormt qua veiligheid van retinale gentherapie. Verder viel ook op dat de beste resultaten werden geboekt bij kinderen. Hieruit concludeerde men dat uitvoeriger onderzoek nodig zal zijn bij kleuters en baby’s omdat hierbij waarschijnlijk nog betere resultaten kunnen behaald worden. 1
Abstract Mancuso et al. deden onderzoek naar de gentherapeutische behandeling van rood-groen kleurenblindheid bij doodskopaapjes. De resultaten waren spectaculairder dan verwacht. Door het inbrengen van het L-opsine-gen verkregen deze aapjes trichromatisch zicht, wat voor deze apen een nieuw fenomeen was. Hieruit werd afgeleid dat gentherapie door middel van een virale vector geladen met een fotopigment, de spectrale gevoeligheid van het oog op zich kan aanpassen. Voor de analyse over de behandeling van achromatopsie werden twee diermodellen naar voor geschoven: enerzijds een hondenmodel voor CNGB3-achromatopsie en anderzijds een muizenmodel voor Cnga3achromatopsie. Bij het hondenmodel werd aangetoond dat door subretinale injectie van CNGB3 de retinale functie van de kegeltjes werd hersteld. Het herstel van het zicht bleek promotor- en leeftijdsafhankelijk, waarbij de langste promotor (PR2.1) en de jongste honden het beste resultaat verwierven. Ook bij het muizenmodel voor Cnga3-achromatopsie kon men positieve resultaten voorleggen. Met een waterbak en verschillend gekleurde, drijvende platformen werd aangetoond dat de behandelde muizen verschillende kleuren konden onderscheiden. Discussie: Voor LCA2 staat het onderzoek naar virale gentherapie al heel ver. De resultaten van klinische studies bij de mens zijn veelbelovend, maar omdat mutaties in het RPE65-gen relatief zeldzaam zijn, kan men zich afvragen of al de tijd, energie en geld hierin moet geïnvesteerd worden. Anderzijds kunnen de resultaten van deze onderzoeken wel geëxtrapoleerd worden naar andere - meer frequente - retinale aandoeningen en kan men dit in een bredere context bekijken. Ook denkt men dat gentherapie LCA nooit volledig zal kunnen genezen en dat aanvullende therapie zoals celtransplantatie, stamceltherapie of preventieve maatregelen zoals prenatale screening nodig zullen zijn om het zicht voor 100% te herstellen of te behouden. De resultaten voor gentherapie van kleurenblindheid bij doodskopaapjes waren uitmuntend, maar ook hier kan men zich de vraag stellen wat de klinische relevantie is voor de mens. Uiteraard zijn de resultaten hiervan niet enkel van belang voor kleurenblindheid, maar voor alle patiënten die een dysfunctie van de kegeltjes hebben. Gentherapie, in de oftalmogenetica en in het algemeen, zal zeker en vast nog heel wat deuren openen voor toekomstige therapieën in alle mogelijke subdisciplines van de geneeskunde. Maar wat zeker is, is dat we het einde van het onderzoek hieromtrent nog niet bereikt hebben en dat er nog heel wat werk te doen valt.
2
Inleiding
Inleiding Dit proefschrift handelt over virale gentherapie bij retinale dystrofieën, meer bepaald bij Leber Congenitale Amaurosis type 2 (LCA2, #204100)(1), kleurenblindheid (#300821, #300822) en achromatopsie (#216900, #262300). Deze drie pathologieën komen aan bod, aangezien hierover al heel wat onderzoek is verricht en er bij LCA2 al meerdere humane trials werden verricht. Uiteraard zijn er ook nog andere retinale dystrofieën waarvoor men gentherapie zou kunnen toepassen, maar deze vallen buiten het opzet van deze scriptie. Voorbeelden hiervan zijn de ziekte van Stargardt (veroorzaakt door mutaties in het ABCA4-gen, #248200), LCA4 (#604393) en LCA10 (#611755) (veroorzaakt door mutaties in respectievelijk de AIPL1- en CEP290genen).
1. Gentherapie 1.1.
Algemeen
Gentherapie is, kort samengevat, de genetische modificatie van gastheercellen met het oog op het bereiken van een therapeutisch doel.(2) Het is al van begin jaren ’90 geleden dat de eerste gentherapeutische klinische studies werden gedaan bij de mens. Door middel van retrovirale vectoren trachtte men het adenosine deaminase (ADA) gen over te brengen naar de T-lymfocyten bij twee jonge meisjes met severe combined immunodeficiency (SCID) omwille van ADA-deficiëntie.(3) Voor velen was dit het begin van een nieuw tijdperk. De techniek van de moderne biotechnologie zou het mogelijk maken om genetische fouten te herstellen door “gezond DNA” rechtstreeks in cellen in te brengen. Ook voor aandoeningen zoals sikkelcelanemie, thalassemie, mucoviscidose en een aantal oncologische aandoeningen werden in verloop van de tijd enkele onderzoeken gestart. Maar de euforie was van korte duur. Het bleek behoorlijk lastig te zijn om op lange termijn positieve resultaten te bekomen, en wetenschappers begonnen te twijfelen.(4) Daarenboven berichtte men in 1999 dat één patiënt was overleden ten gevolge van een overgevoeligheidsreactie ten aanzien van het adeno-geassocieerde virus (AAV) type 5 dat gebruikt werd als vector om de partiële ornithine transcarbamylase (OTC) deficiëntie op te heffen.(5) En in 2002 werd het bericht de wereld ingestuurd dat twee patiënten (op een groep van tien) tijdens een klinische studie in Parijs T-cel leukemie hadden ontwikkeld bij onderzoek naar gentherapie voor X-linked SCID. Eén van hen overleed zelfs.(4;6) Op dat moment was de stemming enorm somber. Ook al verschenen er nadien nog enkele succesvolle resultaten van gentherapiestudies, deze konden de algemeen heersende sfeer van mislukking niet omkeren. Voor vele wetenschappers was het onderzoek naar gentherapie een doodlopende weg. Maar specialisten hebben begrepen dat ze hun focus moeten uitbreiden. Niet alleen het inzicht in het onderzoeksobject is van belang, maar, en zelfs misschien nog belangrijker, ook het reduceren van risico’s en het verhogen van de veiligheidsnorm behoort tot één van hun topprioriteiten. Enkel op die manier kan het vertrouwen van clinici teruggewonnen worden. Want het zijn die clinici die zorgen voor ‘echte’ patiënten en hen moeten behandelen. Men mag evenwel niet vergeten dat net door zulke risico’s te nemen in het verleden de wetenschap grote stappen vooruit heeft gezet. Kijk bijvoorbeeld naar de ontwikkeling van levensreddende therapieën zoals orgaan- en beenmergtransplantaties.(4)
3
Inleiding Hoe komt men tot een klinische gentherapie studie voor een humane genetische aandoening ? Eerst en vooral moet het desbetreffende fenotype gediagnosticeerd en beschreven worden. Van daaruit kan men vertrekken om de belangrijkste onderliggende genen te onderzoeken en eventuele mutaties op te sporen die tot de ziekte leiden. Wanneer causale ziektegenen en mutaties geïdentificeerd zijn, kan men overgaan tot het bestuderen van de pathogenese, en kan men inzicht verwerven in het etiologisch proces. Hierna start men met de eerste therapeutische studies op diermodellen voor de betrokken aandoeningen. Deze dienen als basis voor een therapeutische benadering bij mensen. Uiteindelijk komt men bij een volgende stap, waarbij men de veiligheid en werkzaamheid van een bepaalde gentherapie onderzoekt door middel van klinische studies bij de mens.(7) Gentherapie kan via twee methoden gerealiseerd worden: ex vivo en in vivo. Bij het eerste isoleert men de cellen met het gendefect en zorgt men voor groei van deze cellen in vitro. Daarna corrigeert men het genetisch defect door gentransfer met ‘gezonde’ genen. Getransduceerde cellen worden geselecteerd en verder in cultuur gebracht. Uiteindelijk brengt men de genetisch gemodificeerde cellen terug in de patiënt via infusie of transplantatie. In vivo gentherapie kan op verschillende wijzen verwezenlijkt worden, ondermeer door middel van een systemisch infuus met DNA liposomen, door middel van een biolistic gene gun met DNA plasmiden, of door middel van een weefselinjectie met recombinante virussen.(2) Het is voornamelijk deze laatste techniek die toegepast wordt voor gentherapie van het oog.(8) 1.2.
Het oog en de retina
Het oog speelt al jaren een hoofdrol als doelorgaan in de ontwikkeling van deze vernieuwende therapie. Bijgevolg nemen de onderzoekers die hieraan meewerken het voortouw in het onderzoeksgebied van gentherapie. Deze nieuw ontwikkelde technieken kunnen potentieel in andere systemen worden toegepast. De wetenschappers die hieraan hun steentje bijdragen zorgen mogelijks voor een enorme uitbreiding van het therapeutische arsenaal van de clinicus. Waarom is het oog zo geschikt als doelorgaan voor gentherapie, en dus ook zo populair voor onderzoek ? Het oog is een doorzichtige structuur omwille van de transparante kenmerken van de oculaire weefsels en daardoor kan het geven van een intra-oculaire injectie met virale vectoren gemakkelijk onder optische controle gebeuren. Daaropvolgend kan men het getransduceerde weefsel met niet-invasieve beeldvorming beoordelen. Het oog blijkt zeer voordelig omdat het om een klein, gecompartimentaliseerd en afgekapseld orgaan gaat. Hierdoor is men in staat om met kleine hoeveelheden virale vectoren een bepaald type oculaire cellen te transduceren en dit met een minimaal risico voor systemische verspreiding. Daarnaast zorgen de bloed-retina en de bloed-water barrière ervoor dat het oog een immunologisch inert systeem is, waarbij zo goed als geen immuunreacties optreden, die anders inflammatie en verminderde transgene expressie tot gevolg zouden hebben. Tot slot kan de retinale functie getest en beoordeeld worden aan de hand van een gamma aan elektrofysiologische en psychofysische testen, die veel gebruikt worden in de kliniek.(8) Tal van virale vectoren werden reeds getest op hun mogelijkheid om retinale cellen te transduceren, vooral de transductie van fotoreceptoren en retinaal pigmentepitheel (RPE), omdat deze types van cellen het vaakst betrokken zijn bij retinale degeneratie. Het adeno-geassocieerde virus blijkt de enige efficiënte virale vector te zijn die zowel fotoreceptoren als RPE kan transduceren. AAV is dan ook zowat de ‘standaard’ vector bij 4
Inleiding retinale gentherapie. Het heeft wel als nadeel dat het AAV-genoom slechts ruimte biedt voor minder dan 4,5 kilobasen (kb) humaan DNA en dat het begin van expressie na de transductie maar traag op gang komt. Oorspronkelijk werd AAV serotype 2 (AAV2) hiervoor gebruikt. Maar later ontdekte men dat het AAV2genoom kan worden verpakt in het capside van andere serotypes AAV-vectoren, wat men pseudotypering noemt. Vooral AAV5 (AAV2/5) en AAV8 (AAV2/8) kwamen hiervoor in aanmerking, omdat deze serotypes efficiënter en sneller transduceren dan AAV2. AAV2/1 en AAV2/4 worden gebruikt bij degeneratie van RPE omdat zij enkel RPE transduceren en niet de fotoreceptoren. Ook lentivirale vectoren kunnen enkel RPE transduceren en hebben enkele voordelen ten opzichte van de AAV-vectoren. Hun capaciteit is meer dan tweemaal zo groot (tot tien kb) en ze kunnen een hoger niveau van transgene expressie bolwerken.(2;8) RPE-degeneraties zijn over het algemeen gemakkelijker te behandelen dan dystrofieën van de fotoreceptoren. Dit wordt verklaard door het feit dat RPE slechts uit één enkele cellaag bestaat die efficiënt wordt getransduceerd door virale vectoren. Fotoreceptoren daarentegen bestaan uit verschillende lagen en gentransfer is hier dus moeilijker en minder efficiënt. Een bijkomend argument is dat een gedeeltelijke correctie van de RPE-functie een substantiële invloed zou kunnen hebben op de fotoreceptorfunctie en -overleving.(8)
2. Structuur en werking van de retina 2.1.
Structuur
De retina is slechts 0.5 mm dik en bestaat uit twee delen: enerzijds het buitenste deel, bestaande uit het RPE, en anderzijds het binnenste deel, opgebouwd door een aaneenschakeling van verschillende neuronen die inkomende fotonen omzetten in neurale signalen. De belangrijkste neuronen in deze schakeling zijn de fotoreceptoren (staafjes en kegeltjes), de bipolaire cellen en de ganglioncellen. Elk type fotoreceptor heeft zijn eigen bipolaire cellen. En de ganglioncellen sturen de binnengekomen informatie verder door naar de hersenen. Naast deze verbinding van neuronen zijn er nog drie andere soorten neuronen die het neuraal signaal moduleren: de amacriene, horizontale en interplexiforme cellen. Zij zorgen voor feedback of integratie van de retinale functie. Daarnaast is er nog één type cel, de Müller cel, die zorgt voor vorm en steun. Al deze cellen zijn georganiseerd in een 10-lagige structuur. Deze structuur kan men over de hele retina terugvinden behalve ter hoogte van de discus opticus (bestaande uit de nerve fiber layer en de internal limiting membrane) en de fovea (waar enkel fotoreceptoren voorkomen).(9;10) Er zijn twee soorten fotoreceptoren, namelijk staafjes en kegeltjes. De staafjes (80 à 110 miljoen) zorgen voor zicht in het donker of schemerlicht (scotopisch zicht). Ze zien alleen in grijstinten en kunnen ook geen scherp zicht geven. Ze zijn zeer gevoelig voor licht (ongeveer 100 keer gevoeliger dan kegeltjes). De staafjes bevinden zich vooral buiten de macula en nemen in aantal toe naar de periferie van het netvlies. Ze zijn minder dicht op elkaar gepakt dan de kegeltjes. Bovendien heeft niet elk staafje zijn eigen zenuwcel. Verschillende staafjes geven hun informatie door aan één en dezelfde zenuwcel. Er gaat op deze manier dus wat informatie verloren. De kegeltjes (4 à 5 miljoen) zorgen voor het kleurenzicht, scherp zicht en zicht bij daglicht (fotopisch zicht) en zijn relatief minder gevoelig aan licht. Ze zijn vooral geconcentreerd in de macula en zitten daar dicht opeen. Elk kegeltje heeft zijn ‘eigen’ zenuwcel waaraan het een signaal kan
5
Inleiding doorgeven. Dit zorgt ervoor dat je beter en scherper ziet met kegeltjes. Er zijn drie soorten kegeltjes. Afhankelijk van het soort pigment dat zij bevatten, zijn zij meer gespecialiseerd in het zien van rood, groen of blauw licht. Een rood kegeltje bijvoorbeeld kan ook blauw en groen zien, maar wordt het meest gestimuleerd door rood licht. Hetzelfde geldt voor blauwe en groene kegeltjes.(9-11)
Figuur 1. Structuur van de retina. (A) Lokalisatie van de retina. (B) Organisatie van de retinale neuronen. R: rod (staafje), C: cone (kegeltje), B: bipolaire cel, H: horizontale cel, A: amacriene cel, G: ganglioncel, M: Müller cel. (C) Organisatie van de retinale lagen. RPE: retinaal pigmentepitheel, OS: outer segment (buitenste segment), IS: inner segment (binnenste segment), ONL: outer nuclear layer (buitenste nucleaire laag), OPL: outer plexiform layer (buitenste plexiforme laag), INL: inner nuclear layer (binnenste nucleaire laag), IPL: inner plexiform layer (binnenste plexiforme laag), GCL: ganglioncellaag. Aangepast van (9).
2.2.
Fototransductiecascade en visuele (retinoïd) cyclus
Licht bestaat uit fotonen, en fotoreceptoren absorberen deze fotonen in de schijven van het buitenste segment (outer segment of OS). Dit zorgt via intracellulaire veranderingen (namelijk het sluiten van cGMP-kanalen en daardoor sluiten van Na+/Ca2+-kanalen) voor een hyperpolarisatie van de membraan van fotoreceptoren. Dit staat bekend als de fototransductiecascade en zorgt bijgevolg voor een verminderde loslating van glutamaat in de synaptische spleet met bipolaire cellen. Deze daling van glutamaat zorgt voor stimulatie van bipolaire cellen. Bij de inval van fotonen gebruiken fotoreceptoren geactiveerd vitamine A, dat bij de absorptie van een foton van zijn 11-cis isomeer naar all-trans isomeer wordt omgevormd, en dit zet de hele cascade in gang. Het metabool proces dat gepaard gaat met de recyclage van vitamine A naar zijn actieve vorm (all-trans naar 11-cis) staat bekend als de visuele (retinoïd) cyclus. Het ligt voor de hand dat mutaties in de vele genen waarvan de corresponderende eiwitten betrokken zijn bij al deze processen, aan de basis liggen van erfelijke retinale aandoeningen.(11-13)
6
Inleiding
Figuur 2. Fototransductiecascade in de OS. Belangrijkste proteïnen en mechanismen van fototransductie in de fotoreceptoren. hv: licht, Rh*: geactiveerd rhodopsine, GDP: guanosine difosfaat GTP: guanosine trifosfaat, PDE: fosfodiësterase, RGS: complex van drie proteïnen, cGMP: cyclisch guanosine monofosfaat, Pi: inorganic (anorganisch ) fosfaat. Aangepast van (11).
Figuur 3. Visuele cyclus. Enzymatische omzetting van all-trans retinal naar 11-cis retinal en de functie van RDH12, LRAT en RPE65. Aangepast van (14).
7
Inleiding
3. Retinale dystrofieën Zoals eerder aangegeven, ligt de focus in dit werkstuk vooral op LCA2, kleurenblindheid en achromatopsie. Deze pathologieën worden hier onder de loep genomen om zo nader te kunnen bepalen waar het probleem ligt. Hierdoor kunnen verderop de Resultaten van gentherapie beter geïnterpreteerd en begrepen worden. 3.1.
Leber Congenitale Amaurosis
3.1.1. Algemeen LCA werd voor het eerst beschreven in 1869 door Theodor Karl Gustav Leber en werd initieel beschouwd als een aangeboren, ernstige vorm van retinitis pigmentosa (RP).(14) Het is de vroegst ontwikkelende en ernstigste vorm van retinale dystrofie, met een aanvangsleeftijd voor het eerste levensjaar. LCA is een genetisch en klinisch heterogene retinale aandoening die resulteert in een ernstig verlies van de gezichtsscherpte, nystagmus, fotofobie, afwezige of sterk gedaalde pupilreflexen, en een aanzienlijke verminderde of zelfs afwezige activiteit op het elektroretinogram (ERG1).(14-16) Reeds in de eerste levensweken, meestal rond de leeftijd van 6 weken, merken ouders nystagmus of het gebrek aan fixatie op als eerste teken, en daarnaast merkt men ook op dat het kind enorm vaak met de vingers op de ogen drukt (het zogenaamde oculo-digitale teken.(15) LCA is een zeldzame aandoening, hoewel het vaker voorkomt in gebieden waarin inteelt frequent voorkomt zoals bijvoorbeeld Saoedi-Arabië en Zuid-India.(17) LCA is goed voor 5% van alle erfelijke retinale dystrofieën en heeft een incidentie van 1-3 per 100,000 levend geborenen per jaar, ter vergelijking met een incidentie van 1 per 3500 levend geborenen per jaar bij RP.(18;19) Bij kinderen komt het wereldwijd relatief frequent voor als oorzaak van blindheid (in 1/4 à 1/5 gevallen).(20) Veelal gebeurt de overerving op een autosomaal recessieve wijze, in zeldzame gevallen werd dominante overerving gerapporteerd.(15;21-24) Tot op heden zijn er vele honderden mutaties in 18 verschillende genen gekend die LCA of early-onset retinale dystrofie (EORD) kunnen veroorzaken: CEP290 (NPHP6), GUCY2D (RETGC), CRB1, IMPDH1, RPE65, AIPL1, RPGRIP1, RDH12, LCA5, CRX, TULP1, MERTK, LRAT, RD3, SPATA7, IQCB1 (NPHP5) ,OTX2 en KCNJ13. Dertig procent van de oorzakelijke genen zijn nog niet geïdentificeerd.(25) De meest frequent aangetaste genen in de Belgische LCA-populatie, zijn CEP290 (30%), CRB1 (16%), RPE65 (9%), GUCY2D (8%) en AIPL1 (5%).(26) Het gen dat hier verder zal besproken worden is RPE65, dat betrokken is bij het genetische subtype LCA2.
1
Met een ERG meet men de algemene elektrische reactie over de hele retina en deze metingen kunnen onderverdeeld worden in fotopische (licht,kegeltjes) en scotopische (donker,staafjes) componenten, en men kan een onderscheid maken tussen eerste-orde neuron functie (a-golf van fotoreceptoren) en tweede orde neuron functie (b-golf van bipolaire en Müller cellen).(15)
8
Inleiding 3.1.2. Retinaal pigmentepitheel-specifiek proteïne 65 kilodalton (RPE65) 3.1.2.1.
Gen en proteïne
RPE65 werd voor het eerst beschreven in 1993. Hamel et al. toonden aan, door gebruik te maken van het RPE9 monoclonaal antilichaam, dat het eiwit een massa heeft van 65 kilodalton (kDa) en wordt teruggevonden over de microsomale membraan. Het was ook deze onderzoeksgroep die in 1993 voor het eerst RPE65-cDNA kon isoleren.(27) In 1994 kon het RPE65-gen gelokaliseerd worden op de korte arm van chromosoom 1 (1p31), wat aangetoond werd door fluorescentie in situ hybridisatie.(28) Nog een jaar later, in 1995, beschreven Nicoletti et al. de RPE65-genstructuur bij de mens. Het gen bestaat uit 14 coderende exonen verspreid over 20 kb, en codeert voor een proteïne van 533 aminozuren (aa). Dit proteïne speelt een centrale rol in het retinoïd metabolisme en wordt overvloedig tot expressie gebracht in het RPE.(15;28-30) RPE65 heeft een isomerase-activiteit en is homoloog aan het β-caroteen 15,15’-monooxygenase bij zoogdieren dat de eerste stap in de biosynthese van vitamine A katalyseert.(15) Het is noodzakelijk voor de productie van 11-cis retinol. All-trans retinyl esters vormen het substraat voor de isomerohydrolase activiteit.(15;29;31;32) 11-cis retinol wordt verder omgezet tot 11-cis retinal, dat op zijn beurt wordt getransfereerd naar zowel staafjes als kegeltjes waar het opnieuw door een invallend foton tot all-trans retinal wordt omgezet.(15;29;33)
All-trans retinal substraten worden niet enkel uit fotoreceptoren
gerecycleerd (als bijproduct van ‘zien’), maar worden ook aangevoerd uit de choroidale bloedcirculatie en uit vitamine A via de voeding.(33) Mutaties in het RPE65-gen onderbreken de productie van 11-cis retinol en zorgen bijgevolg voor de accumulatie van all-trans retinal en opsine apoproteïne (ongebonden opsine). Normaal wordt rhodopsine gevormd, dat bestaat uit de verbinding van opsine met 11-cis retinal. De hoge concentratie aan ongebonden opsine zou de oorzaak zijn van de apoptose van de fotoreceptoren. Dit zou verklaard worden door het feit dat het apoproteïne de fototransductiecascade spontaan activeert en zo zorgt voor het sluiten van de cGMPkanalen (zoals bij een toestand van constante blootstelling aan licht wordt waargenomen). Hierdoor sluiten ook de Na+/Ca2+-kanalen. De hierop volgende lage concentratie calcium zou de trigger zijn voor celdood.(34-36) De ernstige afwijkingen op het ERG wijzen op de betrokkenheid van alle fotoreceptoren over de gehele retina. De abnormale gezichtsscherpte en nystagmus suggereren bovendien dat dit proces het foveale zicht congenitaal of tijdens de vroege ontwikkeling compromitteert. Oftalmoscopisch onderzoek van de fundus toont vaak tekenen van retinale degeneratie zoals dunnere retinale bloedvaten, pigmentatie in de vorm van botbalkjes, en plaatselijke regio’s van RPE-atrofie.(33) Met optische coherentie tomografie (OCT), een niet-invasieve beeldvormende techniek, verkrijgt men cross-sectionele beelden met hoge resolutie van de retinale architectuur. OCT is analoog aan een B-scan echografisch onderzoek, maar in plaats van geluidsgolven gebruikt men lichtgolven ten einde een betere longitudinale resolutie (ongeveer 10 µm) te bekomen.(15) Met deze techniek brachten Jacobson et al. de buitenste nucleaire laag (outer nuclear layer of ONL) in beeld en onderzochten de dikte van de verschillende retinale laminae bij elf patiënten met LCA2 (11-53 jaar). In de fovea hadden alle patiënten een meetbare ONL en de helft had zelfs een normale foveale dikte. Men kon ook bij meerdere patiënten een piek van de ONL-dikte waarnemen op ongeveer drie à vijf mm afstand van de fovea. Deze piek komt overeen met de gekende hoge concentratie staafjes in een ring
9
Inleiding rond de fovea bij niet-aangetaste personen. Deze data tonen duidelijk aan dat bij retinale dystrofie veroorzaakt door RPE65-mutaties, en ondanks de niet meer zo jonge leeftijd en vergevorderd gezichtsverlies, er toch nog steeds levensvatbare fotoreceptoren aanwezig zijn.(37) Dit vormt een enorm belangrijke ontdekking omdat hiermee het onderzoek naar gentherapie voor deze aandoening kon verantwoord en verdedigd worden. Mochten de fotoreceptoren niet meer levensvatbaar zijn, zou genadditie van normaal RPE65 weinig opleveren omdat de fotoreceptoren geen signalen meer ontvangen of doorgeven. Het zou bij wijze van spreken even nutteloos zijn als een bril geven aan iemand die blind is. Een kwantitatieve relatie tussen de fenotypische ernst en het specifieke genotype is tot op heden nog niet volledig opgehelderd. In vitro experimenten geven wel aan dat diverse RPE65-mutaties kunnen leiden tot een continuüm van een compleet gebrek aan 11-cis retinoïd productie tot bijzonder lage, maar toch meetbare niveaus. De resultaten van in vivo experimenten daarentegen bij een RPE65-deficiënte muis lijken deze conclusies tegen te spreken. Het laatste woord is hierover dus nog niet gezegd. Reproduceerbare en kwantificeerbare metingen van ziekte-ernst bij menselijke patiënten in combinatie met fysiologisch relevante voorspellingen over biochemische fouten door specifieke mutaties zal noodzakelijk zijn om uiteindelijk de relatie tussen fenotype en genotype volledig te begrijpen.(33) 3.1.2.2.
Diermodellen
Uiteraard worden bij gentherapeutische onderzoeken eerst heel wat diermodellen gebruikt vooraleer testen op “echte” patiënten worden overwogen. Deze diermodellen vormen een basis om de ziektepathologie te bestuderen en de functie van verschillende betrokken genen te begrijpen. Tezelfdertijd is het mogelijk verschillende experimentele behandelingsstrategieën te evalueren die later eventueel worden getest bij mensen. Hier hebben we het verder over diermodellen gebruikt bij LCA2. Die modellen zorgden niet enkel voor de nodige achtergrondinformatie, maar zijn ook een hulp bij het inschatten van de gradaties van visuele resultaten bij de verschillende modaliteiten van de therapie.(15;38;39) 3.1.2.2.1.
Muizenmodel
Er werden verschillende diermodellen met RPE65-mutaties geïdentificeerd. Het gaat enerzijds over natuurlijk voorkomende honden- en muizenmodellen naast anderzijds genetisch gemodificeerde muizenmodellen. Deze laatste betreffen enerzijds Rpe65-/- knock-out muizen en anderzijds Rpe65R91W knockin modellen.(15;29;31;33) Bij het knock-out model, tot stand gekomen door homologe recombinatie, ziet men een traag progressieve retinale degeneratie die zich uit door een verminderde dikte van de ONL. Deze muizen hebben een tekort aan rhodopsine door het gebrek aan 11-cis retinyl esters, en opstapeling van alltrans retinyl esters in het RPE. Bij de geboorte zijn zowel staafjes als kegeltjes intact, maar vanaf 15 weken wordt de ONL (die bij muizen voor 97% uit staafjes bestaat) aangetast en dunner.(29;31;33;40) De mate van degeneratie zou afhankelijk zijn van omgevings- en genetische factoren. Bij een evaluatie na 11 maanden ziet men dat muizen grootgebracht in cyclisch verlichte omstandigheden een hogere mate van degeneratie ondervonden dan muizen opgegroeid in donkere omstandigheden. Genetische variabelen zijn onder andere kleur van de vacht en oculair melanine. In tegenstelling tot bij de staafjes ziet men bij de kegeltjes een snellere degeneratie. Bij follow-up ziet men dat opsine zich niet op de juiste plaats bevindt in de kegeltjes 10
Inleiding en/of dat het buitenste segment instabiel is. Dit zou leiden tot apoptose van de kegeltjes en suggereert dat op zijn minst een deel van de kegeltjes 11-cis retinal nodig hebben voor het geschikte transport van opsine en verschillende andere membraangeassocieerde fototransductie polypeptiden. Het Rpe65R91W knock-in model werd ontwikkeld om als voorbeeld te dienen voor één van de meest voorkomende missense mutaties bij LCA2. Deze muizen hebben een partiële expressie van het mutant Rpe65, vorming van 11-cis retinal en rhodopsine-niveaus tot 10% van het normale. Dit model werd vergeleken met wildtype en knock-out muizen van vier weken tot een jaar. Wat de dikte van de ONL betreft, vond men bij knock-in en knock-out muizen dezelfde resultaten, namelijk ongeveer vijf rijen nuclei in de fovea vergeleken met negen à tien rijen bij de wildtype muizen. Deze resultaten geven aan dat een minimale productie van rhodopsine de degeneratie niet kan stoppen. Wat betreft de desorganisatie van het buitenste segment zien we bij het knock-in model een beter behoud dan bij het knock-out model. De kegeltjesdegeneratie vordert minder snel bij de knock-in muizen en bij beide modellen zijn vooral de korte golflengte gevoelige kegeltjes van de inferieure retina aangetast. Maar de omvang van degeneratie is bij het knock-out model groter.(33) Het laatste type muismodel is de natuurlijke mutant Rpe65rd12. Deze mutant wordt veroorzaakt door een nonsense mutatie in exon 3. Het fenotype is vergelijkbaar met het Rpe65-/- model. Het staafjes ERG is aanzienlijk minder actief en men ziet een trage retinale degeneratie. Na zeven maanden zijn de OS merkbaar korter en is er daling van ongeveer 30% van het aantal fotoreceptor nuclei vergeleken met wildtype. Er is geen Rpe65 expressie en men kan geen 11-cis retinal of rhodopsine detecteren. De retinyl esters daarentegen stapelen zich op in het RPE. Het enige merkbare verschil met knock-out muizen ziet men bij het oftalmoscopisch onderzoek waarbij bij Rpe65rd12 kleine witte stippen verschijnen verspreid over de hele retina op een leeftijd van vijf tot negen maanden.(29;33;41) 3.1.2.2.2.
Hondenmodel
Naast de muismodellen (zowel de natuurlijke als genetisch gemodificeerde) bestaat er ook een natuurlijk hondenmodel voor RPE65-deficiëntie. De Zweedse Briard hond heeft een spontane 4-bp deletie (AAGA, nucleotiden 487-490) in exon 5 van het RPE65-gen. Dit veroorzaakt een frameshift en hierdoor vormt zich een prematuur stopcodon.(15;29;33;42;43) Deze deletie komt overeen met de nucleotiden 340-343 van het humane exon 5.(29;43) Dit hondenras wordt ondermijnd door een recessief overgeërfde retinopathie, gekenmerkt door blindheid bij schemerlicht en met verschillende gradaties van slecht zien bij helder licht. Dit alles wordt aangetoond met ERG. De retinale degeneratie is traag progressief en er zijn geen aanwijzingen dat er verlies optreedt van fotoreceptoren voor de leeftijd van 1,5 jaar. Wel treden er moleculaire veranderingen op in fotoreceptoren, bipolaire en amacriene cellen. Bij verder verloop ziet men grote lipide-achtige inclusies in het RPE, de OS raken gedesorganiseerd en staafjes en kegeltjes gaan verloren, eerst in de perifere retina en daarna verder uitbreidend naar het centrum. In het eindstadium ziet men volledige degeneratie van fotoreceptoren in de perifere retina rond de leeftijd van vijf à zeven jaar.(15;29;33) Opmerkelijk is het feit dat deze aandoening bij het Briard ras oorspronkelijk verkeerd gediagnosticeerd werd als congenitale stationaire nachtblindheid. De diagnose werd pas herzien en LCA genoemd, wanneer mutaties bij de mens ontdekt werden.(44)
11
Inleiding 3.1.3. Diagnose De diagnose van LCA wordt klinisch vermoed aan de hand van klinische tekenen en het afwijkend ERG. Bij initieel onderzoek van de patiënt detecteert men bij het full-field flash ERG ofwel aanzienlijk verminderde of afwezige activiteit. Dit is het gevolg van het verlies van zowel staafjes als kegeltjes. Wanneer er nog een beetje activiteit zichtbaar is op het ERG, verdwijnt deze meestal volledig binnen het eerste levensjaar.(15;16;45) Daarna kunnen eventueel nog OCT en fundus autofluorescentie2 verricht worden. Differentiaaldiagnostisch weerhoudt men syndromale LCA (onder andere Senior-Loken syndroom, Joubert syndroom, Alström syndroom, …), (on-)volledige achromatopsie, (on-)volledige congenitale stationaire nachtblindheid, albinisme, nervus opticus hypoplasie, foveale hypoplasie, X-gebonden retinitis pigmentosa, vertraagde visuele ontwikkeling en cerebrale visuele aantasting.(15) Wanneer de diagnose van LCA klinisch wordt vermoed, kan men met verschillende genetische testen de diagnose bevestigen. De moleculaire diagnose kan de klinische diagnose bevestigen, LCA onderscheiden van andere retinale aandoeningen, de patiënt een exactere visuele prognose geven gebaseerd op genotypefenotype correlaties, zorgen voor een beter onderbouwde genetische counseling en kan in staat zijn om reproductieve opties zoals prenataal onderzoek of preïmplantatie genetische diagnostiek (PGD) mogelijk te maken. Genetische testen zijn ook een voorwaarde om patiënten te identificeren die in aanmerking komen voor klinische studies.(15;46) De aanwezigheid van een sequentieverandering in het genomisch DNA kan gedetecteerd worden door middel van directe mutatiedetectie (bijvoorbeeld de Asper-chip (47)), of mutatiescanning (zoals Sanger sequencing [48]) technieken. Genetisch onderzoek voor LCA in het CMGG (Centrum voor Medische Genetica, Gent) bestaat uit volgende stappen.[1] LCA chip analyse. Deze commerciële chip bevat 641 gekende ziektegeassocieerde sequentieafwijkingen in 13 LCA- of EORD-genen en heeft een sensitiviteit van 41% in de Belgische populatie. Men maakt gebruik van de Arrayed Primer Extension (APEX) techniek, bestaande uit een glasplaat met daarop een groot aantal oligonucleotiden (probes) die elk specifiek zijn voor één welbepaalde mutatie. Deze oligonucleotiden zijn zo ontworpen dat hun uiteinde dat niet verbonden is met de glasplaat, onmiddellijk gelegen is naast de nucleotide waar de mutatie kan optreden. In een voorbereidende stap worden alle gebieden in het DNA van de patiënt geamplificeerd waarin mogelijke gekende mutaties gelegen zijn. Vervolgens worden deze DNA-fragmenten gefragmenteerd en aangebracht op de glasplaat. Na hybridisatie met de probes en toevoeging van enzymen en de vier verschillende dideoxynucleotiden, gebeurt specifieke verlenging van elke probe waarbij het DNA van de patiënt als “mal” gebruikt wordt. De nieuw ingebouwde nucleotiden zijn zodanig aangepast dat zij de reactie onmiddellijk stoppen, zodat slechts één nucleotide ingebouwd wordt per probe. Bovendien dragen zij elk een fluorescente kleurstof, zodat met een camera kan gezien worden welke nucleotide op welke positie werd ingebouwd. Op deze manier kan de aanwezigheid van een groot aantal gekende mutaties in parallel nagegaan worden. Een belangrijk nadeel van deze techniek is echter dat nieuwe mutaties gelegen op plaatsen die niet getest worden, in principe niet kunnen opgepikt worden. Mutaties die gedetecteerd worden door middel van chip analyse, worden steeds geconfirmeerd door middel van Sanger sequencing. Indien slechts 2
Autofluorescentie meet de accumulatie lipofuscine in het RPE, dat afkomstig is van uiteengevallen fotoreceptor discus segmenten.(15)
12
Inleiding één mutatie aangetroffen wordt in een ziektegen, wordt de coderende regio van het betreffende gen (exonen en intron-exon boorden) onderzocht door middel van Sanger sequencing.(26;45;49) [2] Sanger sequencing van 6 gekende LCA genen. Indien chip analyse negatief is, wordt overgegaan tot sequencing van de coderende regio van de meest prevalente causale genen in de Belgische populatie: CEP290, CRB1, RPE65, GUCY2D, AIPL1 en CRX. Bij Sanger sequencing gebruikt men enzymatische single-stranded DNA synthese met base-specifieke dideoxynucleotiden, die dienen om de keten te eindigen (terminatie nucleotiden). Een enkelstrengig fragment van het DNA dient als “mal” om een mix te vormen van enkelstrengige DNA moleculen, die allen variëren in lengte met één base. Elk fragment eindigt met een dideoxynucleotide dat een base-specifiek fluorescent signaal heeft, dat geëxciteerd wordt door een laser en gedetecteerd door een camera, wat vertaald wordt naar een basesequentie voor een bepaald fragment.(26;48) [3] Next-generation sequencing panel. Aangezien Sanger sequencing een dure en tijdrovende techniek is met een lage doorvoer, werd een next-generation sequencing panel ontwikkeld voor doelgerichte her-sequencing van 16 gekende LCA en EORD genen. Met 375 primer paren kan men 236 exonen amplificeren. En na amplificatie, ligatie en shearen, worden alle amplicon pools ge-sequenced in een Genome Analyzer IIx run. De bekomen sequenties worden daarna geanalyseerd met behulp van het programma NextGENe (v2.00). op die manier kunnen dan ‘nieuwe’ mutaties ontdekt worden in de totnogtoe gekende LCA-genen.(50;51) 3.2.
Kleurenblindheid en Achromatopsie
3.2.1. Kleurenblindheid Het onvermogen om bepaalde kleuren(-combinaties) van elkaar te onderscheiden noemt men kleurenblindheid. Het is één van de meest voorkomende en best begrepen erfelijke aandoeningen. De Engelse chemicus John Dalton was de eerste om deze aandoening te diagnosticeren, in de eerste plaats bij zichzelf, in 1798. De ziekte werd naar hem genoemd: “daltonisme”.(52) Normaal kleurenzicht bij de mens is trichromatisch, en is gebaseerd op drie verschillende opsine-fotopigmenten (rood, groen en blauw) die licht absorberen in verschillende golflengtespectra (respectievelijk lang [L], midden [M] en kort [S]), in de kegeltjes van de retina. Het gen voor het blauw opsine bevindt zich op chromosoom 7, deze voor het rode en het groene bevinden zich op chromosoom X. Deze laatste twee genen zijn gekoppeld. Het gevaar bestaat dat bij ongelijke crossing-over een gen, of een deel van een gen, gedeleteerd wordt en hierdoor rood en/of groen kleurenblindheid ontstaat. Vermits deze twee genen op het X-chromosoom voorkomen zijn mannen aangetast, daar waar vrouwen in principe enkel draagster zijn. Wereldwijd zijn 5 tot 8% mannen kleurenblind, terwijl slechts minder dan 1% vrouwen kleurenblind zijn.(52-56) Om kleurenblindheid te kunnen diagnosticeren maakt men vaak gebruik van de bekende Ishihara-test. Daarnaast zijn er ook nog andere diagnostisch testen zoals de Standard Pseudoisochromatic Plates en de CU Dynamic Colour Vision test.(55;56)
13
Inleiding Figuur 4. Ongelijke crossing over. Ontstaansmechanisme van rood-groen kleurenblindheid. Door ongelijke crossing over tussen de maternele chromosomen tijdens de meiose, kan een volledig gen of een deel van het gen gedeleteerd worden. Dit noemt men respectievelijk intergenische of intragenische ongelijke crossing-over. Op die manier kunnen bij mannelijke nakomelingen bepaalde fotopigmenten niet meer aangemaakt worden en heeft het kind slechts een beperkt spectraal vermogen. Aangepast van (78).
3.2.2. Achromatopsie Totale congenitale kleurenblindheid of achromatopsie, ook wel staafjes monochromatopsie genoemd, is de ernstigste vorm van kleurenblindheid omdat hier geen enkel kegeltje werkzaam is en de patiënt enkel zwartwit en grijstinten waarneemt. Het is een autosomaal recessieve aandoening die verschilt van rood en/of groen kleurenblindheid omdat het een andere moleculaire pathogenese betreft. Dit is een zeldzame aandoening met een prevalentie rond 1 op 30.000 à 50.000.(57;58) Achromatopsie wordt gekenmerkt door ernstige aantasting van kleurenzicht, verminderde gezichtsscherpte, fotofobie, nystagmus en vermoedelijk een normale macula. Omdat enkel kegeltjes zijn aangetast, is deze aandoening een ideaal model om gentherapie te ontwikkelen die zich richt op het transduceren van fotoreceptoren. Tot nu toe zijn er vier oorzakelijke genen geïdentificeerd. Mutaties in deze genen verklaren ongeveer 90% van alle gevallen van achromatopsie. Het gaat hier over CNGA3, CNGB3, GNAT2 en PDE6C. Zij coderen allen voor essentiële proteïnen in de kegeltjes fototransductiecascade. Respectievelijk coderen ze voor de alpha- (CNGA3) en beta- (GNGB3) subunits van het cyclisch nucleotide-gated (CNG) kanaal in het buitenste segment van de kegeltjes, de alphasubunit van het kegeltjesspecifiek transducine en voor de katalytische alpha-subunit van het kegeltjesspecifiek fosfodiësterase.(25;57;58) De meerderheid van alle achromatopsiegevallen bij de mens, ongeveer 70 à 92%, wordt beschouwd als een ionenkanaalaandoening (de zogenaamde “channelopathies”), veroorzaakt door mutaties in ofwel CNGA3 (#216900) of CNGB3 (#262300). Dit laatste gen lijkt het meest prevalente ziektegen te zijn in Noord-Europa (50-87%), daar waar CNGA3 meer prevalent lijkt te zijn bij
14
Inleiding patiënten uit het Midden Oosten.(57) Deze twee genen coderen voor proteïnen die deel uitmaken van CNGkationkanalen in de membraan van het buitenste segment van de kegeltjes. Ze zijn aldus verantwoordelijk voor de hyperpolarisatie van alle kegeltjes, doordat het veranderingen van het cGMP door lichtinval omzet naar elektrische signalen, die op hun beurt de loslating van neurotransmitters in de synapsen met secundaire neuronen controleren. Het verschil met rood en/of groen kleurenblindheid ligt in het feit dat hier de fysiologie van de fotoreceptoren wordt aangetast, terwijl bij rood en/of groen kleurenblindheid enkel de spectrale gevoeligheid is aangetast. Hiernaast is bij achromatopsie ook de gezichtsscherpte aangetast omdat de fovea vooral bestaat uit kegeltjes.(25;59)
15
Methodologie
Methodologie Deze masterproef kwam tot stand door uitgebreid literatuuronderzoek waarbij verschillende bronnen werden geraadpleegd. Bij mijn eerste contact met Prof. E. De Baere stelde zij mij enkele PhD thesissen ter beschikking om mij in te werken in de wereld van de oftalmogenetica.(38;39;46) Omdat het onderwerp ‘retinale gentherapie’ nogal een breed veld omvat, werd oorspronkelijk besloten om vooral de aandacht te richten op studies omtrent LCA en meer specifiek op RPE65-gerelateerde LCA (LCA2). Deze keuze werd gemaakt omdat hier al heel wat over werd gepubliceerd en er resultaten van klinische studies bij de mens beschikbaar waren, wat interessant bleek om te verwerken. Later werd duidelijk dat ook rond kleurenblindheid en achromatopsie kon gewerkt worden omwille van de recente publicaties hieromtrent. Voor het vinden van relevante literatuur werd gebruik gemaakt van PubMed/MEDLINE en ISI Web of Knowledge. Enkele van de gebruikte (MeSH) zoektermen: gene therapy, retina, Leber Congenital Amaurosis, LCA, RPE65, LCA2, achromatopsia, colour blindness, … Op basis van de weergegeven artikels (met hun abstract) in deze databanken werden er enkele geselecteerd. Ook de suggesties van Prof. E. De Baere werden opgezocht via deze databanken. Door verder de referenties van deze artikels na te kijken, konden nieuwe artikels geselecteerd worden. Ook de suggesties die door de databanken zelf werden aangegeven, waren nuttig om verder te bekijken. Er werd getracht om zowel Proof of Concept studies als zo recent mogelijke studies te selecteren. Maar uiteraard moet men op een bepaald moment beslissen om de zoektocht te stoppen en met de informatie die men heeft de scriptie op te stellen. Daardoor werden bepaalde recente interessante studies niet verwerkt in dit proefschrift.
16
Resultaten
Resultaten 1. LCA2 – RPE65 1.1.
Honden
1.1.1.
Proof of Concept
De Proof of Concept voor gentherapie bij RPE65-deficiënte individuen werd geleverd door de studie van Acland et al. bij RPE65-deficiënte Briard honden, die een 4-bp deletie hebben in het RPE65 gen, resulterend in een prematuur stopcodon. Dit hondenras vormt een ideaal, groot dierenmodel voor gentherapie bij LCA2. In totaal werden vier honden bestudeerd tijdens deze studie. Drie ervan werden behandeld met subretinale gentherapie en de vierde diende als controle-object. Voordat men de therapie toepaste op de honden zelf werden RPE-cellen (zowel van een wild-type als een aangetaste hond) in cultuur gebracht en transduceerde men de RPE65-deficiënte cellen met rAAV-RPE65.(42;60) Dit recombinante AAV2/2 virus werd uitgerust met een kippen β-actine (CBA)-promotor/CMV-enhancer dat wild type RPE65 cDNA aandrijft.(60) Gedurende vier uur dompelde men de culturen onder in een substantie met 2.3x107 virale partikels. Door middel van immunohistochemie kon men aantonen dat er in de getransduceerde cellen een significante aanmaak was van RPE65. Polymerase chain reactie (PCR) amplificatie en Western blot analyse bevestigden nogmaals de transductie en expressie van RPE65. Met deze resultaten kon men overgaan tot het eigenlijke in vivo luik van deze studie: namelijk de subretinale injectie van virale partikels bij de honden. Bij twee van de drie honden werden beiden ogen geïnjecteerd. Het ene oog kreeg een subretinale injectie en het andere oog een intravitreale injectie. Bij de derde hond werd slechts één oog subretinaal geïnjecteerd. Er werd een oplossing van 150-200 µl ingebracht met daarin 3.7-4.6x1010 virale partikels. Na subretinale injectie zag men een transiënte loslating van de retina van ongeveer 35% (bleb-vorming), die zich spontaan herstelde binnen de 24 u. De effecten van de intra-oculaire injectie op het RPE werd geëvalueerd aan de hand van ERG en pupillometrie3. Bij de drie subretinaal geïnjecteerde ogen zag men op ERG bij het geven van lichtstimuli een toename van de maximale amplitude, die overeen kwam met ongeveer 16% van de amplitude bij niet aangetaste honden. Dit was ook het geval bij de reactie op flikkerend licht. De twee ogen die intravitreaal behandeld werden daarentegen toonden geen verschil met de situatie voordien. Ook bij pupillometrie kon men zien dat de resultaten voor de subretinaal behandelde ogen significant beter waren in vergelijking met de intravitreaal geïnjecteerde ogen.(42) Vier maanden na toediening van de virale partikels werden de drie behandelde honden op een kwalitatieve wijze geëvalueerd door middel van gedragstesten. De honden moesten bij schemerlicht een hindernissenparcours afleggen. De resultaten van deze testen waren consistent met de elektrofysiologische resultaten. Het hindernissenparcours werd vlot doorlopen wanneer het subretinaal geïnjecteerde oog gebruikt
3
Bij pupillometrie wordt elk oog beurtelings beschenen met een lampje. Hierdoor ziet men in beide ogen pupilloconstrictie optreden, geregeld door de consensuele reflex. Men blijft steeds afwisselen en als men de grootte van consrictie uitzet op een grafiek bekomt men een bepaald patroon. Hierbij ziet men dat de grootste amplitude bij de eerste stimulus verschijnt. Dit komt omdat bij de volgende stimuli de pupillen niet genoeg tijd hebben om volledig te vergroten tot aan hun baseline diameter.(61)
17
Resultaten werd, in tegenstelling tot slechte resultaten wanneer het intravitreaal of niet geïnjecteerde oog gebruikt werd.(42) Na exact 99 dagen werd een subretinaal behandeld oog chirurgisch gepreleveerd, ondermeer met het oog op correlatie van gewijzigde visuele functie en transgene expressie. Men onderzocht hierbij retinale en RPE/choroidale-weefsels. Door middel van PCR kon men aantonen dat getransduceerd DNA persisteerde in het geïnjecteerde kwadrant. Zowel de retina, RPE en choroid in dit kwadrant hadden een grotere verhouding van wild-type RPE65 ten opzichte van mutant RPE65, in vergelijking met de andere kwadranten.(42) Samengevat toonden deze resultaten aan dat de subretinale toediening van rAAV-RPE65 een significante verbetering teweeg bracht bij RPE65-deficiënte honden, wat pupillaire reflexen, retinale functie en mobiliteit betreft. Deze studie toonde voor het eerst aan dat subretinale gentherapie met virale vectoren leidt tot een verbetering van visuele functie in een groot dierenmodel voor erfelijke blindheid bij de mens.(42) 1.1.2. Lange termijn studie Na deze Proof of Concept bleef de vraag of dit principe ook werkzaam zou zijn bij de mens, en wat de garanties zijn op lange termijn werkzaamheid en veiligheid. De onderzoeksgroep van Acland et al. ging na de hoopvolle resultaten van hun Proof of Concept studie verder in op deze onderzoeksvragen. Ook de korte termijn effecten werden nog eens beoordeeld, maar nu bij een grotere onderzoekspopulatie. In totaal werden 40 honden geïncludeerd in de studie. Eenendertig van hen dienden als echte studie-objecten en negen werden enkel getest om referentiewaarden te bekomen van een ‘normaal’ ERG. Ook de vier honden van de oorspronkelijke Proof of Concept studie werden bestudeerd en twee van hen werden verder beoordeeld om de lange termijn effecten te kunnen inschatten.(60) In totaal werden 41 ogen (van de 62) geïnjecteerd, subretinaal (29) of intravitreaal (12), en over het algemeen werd de gebruikte vector goed getolereerd. Bij 7 (6 subretinaal en 1 intravitreaal) van de 41 trad intraoculaire inflammatie op, maar gelelektroforese bracht aan het licht dat deze te wijten was aan contaminatie gedurende de voorbereiding van de vector. Er werden vijf verschillende vectoren uitgetest : AAV2/2-CBAcRPE65, AAV2/2-CBA-hRPE65, AAV2/5-CBA-hRPE65, AAV2/1-CBA-hRPE65 en AAV2/1-RPE08hRPE65. Er werden geen belangrijke verschillen gezien wat type vector betreft (AAV2/2, AAV2/5, AAV2/1), promotor (CBA, RPE08), RPE65 cDNA (canien of humaan), en toegediende dosis. (60) Eén tot drie maand na de behandeling werden de honden onderworpen aan een ERG test met standaard witte flitsen onder zowel donker- als lichtgeadapteerde omstandigheden, die respectievelijk de staafjes- en kegeltjesfunctie weerspiegelen. De RPE65-deficiënte ogen zonder behandeling of met intravitreale injectie toonden geen enkele waarneembare activiteit op het ERG. De ogen die subretinaal behandeld werden daarentegen, gaven zowel in donkere als in verlichte omstandigheden een staafjes en kegeltjes ERG met normale golfvorm, maar met een verminderde amplitude. Om nog nauwkeuriger de functie van de fotoreceptoren te kunnen bestuderen, gaf men lichtflitsen met een 2000-voudige hogere energie. Hiermee bekomt men op het ERG een maximale uitwijking van de a-golf, die de elektrische activiteit van de fotoreceptoren weergeeft. Normaal piekt deze golf rond de 4 milliseconden (ms), maar bij RPE65-deficiëntie 18
Resultaten wordt het maximum pas op 10 ms gezien en is er zo goed als geen activiteit (< 3SD). Bij de intravitreaal behandelde ogen werd er bij deze hoge energie flitsen geen verandering gezien ten opzichte van de deficiënte controles. Het ERG bij 23 van de 26 subretinaal geïnjecteerde ogen gaf een maximale, maar verminderde amplitude rond 4 ms. Deze resultaten tonen aan dat er een verbeterde staafjes- en kegeltjesactiviteit ontstaat na subretinale toediening van de virale vectoren. Van de 23 met een positieve uitkomst waren er een tiental met gemiddeld een grotere amplitude dan de rest. Deze hadden hun injectie gekregen in de bovenste helft van de retina. Dit is de regio van het tapetum4. De regionale verschillen qua grootte van effect van de subretinale behandeling doet vermoeden dat er een voorspelbare reactie is gebaseerd op de verschillende fotoreceptordensiteiten in deze retinale regio’s.(60) Om de functionele gevolgen op lange termijn te kunnen bestuderen, werden twee honden van de originele Proof of Concept studie jaarlijks aan een ERG-controle onderworpen gedurende drie jaar. Beiden werden oorspronkelijk behandeld met enerzijds een subretinale en anderzijds een intravitreale injectie. Voor beide honden waren de resultaten van het ERG gelijklopend. Voor de behandeling was de fotoreceptoractiviteit op ERG bij standaard witte flitsen ondetecteerbaar. Na de subretinale behandeling zag men omvangrijke activiteit op het ERG, zowel voor staafjes als voor kegeltjes. Een zo goed als normale gevoeligheid werd bekomen voor een deel van de fotoreceptoren, wat werd aangetoond door maximale activiteit op het 4 ms tijdstip. Al deze waarnemingen bleven stabiel gedurende de drie jaar follow-up. Voor de ogen die behandeld werden met een intravitreale injectie bleven de resultaten ook stabiel en bleven deze binnen het bereik van wat verwacht kon worden bij onbehandelde RPE65-deficiënte ogen.(60) Er werd ook biochemisch onderzoek verricht op gepreleveerde monsters van de retina met RPE/choroid. Bij de onbehandelde en intravitreaal behandelde stalen kon geen productie van 11-cis-retinal aangetoond worden en zag men een enorme toename van de concentratie all-trans-retinyl esters ten opzichte van normale omstandigheden (1000 tot 10000 keer zoveel). Deze toename was duidelijk leeftijdsgebonden. Ook bij stalen van subretinaal behandelde ogen detecteerde men een stijging van all-trans-retinyl esters, maar kon men wel een gelokaliseerde stijging van de concentratie 11-cis-retinal aantonen. Deze gelokaliseerde stijging bevond zich in de regio van het tapetum. Daarrond zag men een tienvoudige lagere concentratie die niet voldeed aan de criteria van een geslaagde therapie.(60) Morfologisch onderzoek toonde een verdunning van het OS en een desorganisatie en/of verlies van één of twee rijen nucleï van de ONL buiten de regio van het tapetum. Over het algemeen viel geen verschil op te merken in dikte van de nucleaire lagen tussen vergelijkbare regio’s van normale, aangetaste en behandelde
4
Het tapetum (lucidum) (Latijn voor tapijt van licht) is een lichtreflecterende laag van cellen direct achter of soms in de retina dat het oog in staat stelt beter te zien in het donker. Het tapetum kan bestaan uit meerdere laagjes van kleine, dunne en platte cellen die door de aanwezigheid van onder andere guaninekristallen een spiegelende, reflecterende werking hebben. Door de reflectie wordt de hoeveelheid licht die op de retina valt groter waardoor een beter beeld ontstaat. Door interferentie wordt het beeld echter waziger. Het veroorzaakt de oplichtende blauwe, groene, roze of gele ogen als deze in het donker worden beschenen. De mens heeft evenwel geen tapetum lucidum.
19
Resultaten aangetaste retina’s. Hieruit mag geconcludeerd worden dat er geen ongunstig effect is van de therapie op de morfologie van de retina en dat de ziekte zeer traag verloopt.(60) Daarnaast voerde men ook nog een immunolabeling uit voor RPE65 om de techniek van het injecteren te evalueren. Daaruit bleek dat bij een goede bleb-vorming een groter gebied intenser werd gelabeld dan wanneer zich een slechte bleb vormde.(60) Als laatste werd ook de veiligheid van dit type gentherapie onderzocht, op basis van virale serologie en extra-oculaire expressie van RPE65 cDNA. Bij alle behandelde honden zag men een stijging van de immunoreactiviteit ten opzichte van het virale antigen in vergelijking met het serum van de nog niet geïmmuniseerde pup. Deze stijging was onafhankelijk van de gebruikte methode. De sterkste stijging deed zich voor bij die honden met een hoge immunoreactiviteit nog voor de behandeling. De sterkte van de stijging had evenwel geen invloed op het niveau van het succes van de therapie. Door middel van ELISA en Western blot analyse kon men geen specifieke antilichamen aantonen tegen RPE65, zowel intra- als extraoculair. PCR en RT-PCR van extra-oculaire weefsels benadrukte dat er geen expressie was van wild-type RPE65 cDNA.(60) Samengevat kan men stellen dat één enkele subretinale dosis AAV-RPE65 cDNA de visuele functie verbetert in een hondenmodel van LCA2, wat niet het geval is bij een intravitreale toediening. De graad van herstel is onafhankelijk van de gebruikte vector, cDNA (canien of humaan), promotor, of toegediende dosis. De behandeling heeft enkel effect op het geïnjecteerde gebied en expressie van RPE65 komt alleen voor in het RPE. Dit veronderstelt dat de productie van stabiel RPE65 een specifieke cellulaire omgeving vereist. Daarnaast heeft de therapie geen significante inflammatoire of andere negatieve effecten. Zelfs inflammatie door contaminatie had geen negatief effect,. Tot slot toonden ERG bevindingen aan dat de positieve effecten op de staafjes- en kegeltjesfunctie stabiel zijn gedurende 3 jaar.(60) 1.2.
Mensen
1.2.1. Drie initiële studies Nadat gebleken was uit studies bij RPE65-deficiënte Briard honden dat gentherapie veilig kon zijn en goede langetermijneffecten bood, was het de beurt aan fase I klinische studies bij de mens. Drie onafhankelijke onderzoeksgroepen (Londen, Groot-Brittannië onder leiding van Bainbridge; Philadelphia, Pennsylvania onder leiding van Maguire en Bennett, en Gainesville, Florida onder leiding van Hauswirth) durfden het aan om voor het eerst in de geschiedenis virale gentherapie toe te passen op het menselijke oog. De onderzoeksgroep in Londen startte de eerste proef in februari 2007 en op het einde van dat jaar waren ook de andere twee centra met hun onderzoek begonnen. Er was hoop om de meest ernstige vorm van erfelijke blindheid te kunnen behandelen, namelijk subtype LCA2 veroorzaakt door mutaties in RPE65. Ondanks het feit dat het drie onafhankelijke onderzoeksgroepen betrof, hadden ze allen een zeer vergelijkbare aanpak. Ze gebruikten een AAV-vector waarin het wild-type humane RPE65 cDNA opgenomen is, en die specifiek gericht is op transductie van het RPE. Verschillen in de vector betroffen de promotoren, injectiestrategie en injectievolume, leidend tot diverse resultaten. Er werd door de drie groepen geopteerd voor subretinale
20
Resultaten injectie van het slechtste oog. Elke groep behandelde oorspronkelijk drie individuen met een leeftijd variërend van 17 tot 26 jaar, en met een variabel visusverlies en visuele functie.(61-65) Bainbridge et al.(63) Leeftijd/ geslacht Mutatie Vector Promotor
23/M
17/V
Maguire et al.(61) 18/M
Y368H IVS1+5G>A E6X (hom) G40S D167Y 2/2.hRPE65p.hRPE65 1400 bp-fragment van humane RPE65 promotor 1.0 x 1011 1.0 ml M M M 12 12 6 maanden maanden maanden
26/V
26/M
Hauswirth et al.(64) 19/V
24/M
23/V
21/M
E102K E102K R234X (hom) (hom) (hom) AAV2.hRPE65v2
E417Q R44Q Y368H (hom) R91W (hom) rAAV2_CBSB-hRPE65
Kippen β-actine
Kippen β-actine
Dosis 1.5 x 1010 5.96 x 1010 Volume 0.15 ml 0.15 ml Locatie SN M M M ST T Follow4.75 2.75 1.25 3 3 3 up maanden maanden maanden maanden maanden maanden Oc Neen Neen Neen Neen MH Neen FV Neen Neen compl Syst Neen Neen Neen Neen Neen Neen Neen Neen Neen verspr BGV 20/286 20/662 20/115 <20/2000 <20/2000 20/640 20/240 20/195 20/283 voor BGV 20/145 20/662 20/115 20/1050 20/710 20/290 20/317 20/138 20/191 Na Signif Neen Neen Neen Ja Ja Ja Neen Neen Neen toename Tabel 1. Vergelijking van de drie initiële humane studies voor RPE65 gentherapie. M: man, V: vrouw, hom: homozygoot, bp: basenparen, ml: milliliter, M: macula, SN: superonasale retina, ST: superotemporale retina, T: temporale retina, Oc compl: oculaire complicaties, MH: maculaire holte, FV: foveale verdunning, Syst verspr: systemische verspreiding van de vector, BGV: beste gecorrigeerde visus, Signif toename: significante toename van de visus na behandeling. Aangepast van (64).
1.2.1.1.
Bainbridge et al.
Een eerste onderzoeksgroep is die van Bainbridge et al. in Londen. Zij namen aan dat LCA2 een pathologie is die perfect geschikt is voor gentherapie, omdat er op kinderleeftijd nog voldoende visuele functie is en omdat retinale beeldvorming doet vermoeden dat fotoreceptor celdood pas laat in het ziekteproces verschijnt. Daarom zou gentherapie in staat kunnen zijn om de visuele functie te verbeteren of om het bestaande zicht te behouden. Het doel van deze studie was om de veiligheid (bijwerkingen) en de werkzaamheid die bij het hondenmodel aanwezig was, te bestuderen bij de mens.(63) Voor deze studie werden drie jongvolwassenen (tussen 17 en 23 jaar oud) geselecteerd met een ernstige early-onset retinale dystrofie die veroorzaakt werd door een missense mutatie in het RPE65 gen. Deze patiënten werden geselecteerd omdat ze ondanks hun uitgebreide retinale degeneratie toch nog een beperkte retinale functie overhielden. Hierdoor kon men verwachten dat zij eventueel baat zouden hebben bij deze therapie. Het oog met de slechtste gezichtsscherpte werd gebruikt als studie-oog en het oog met het beste zicht diende als controle. Als vector gebruikte men de tgAAG76-vector. Dit is een recombinante AAV2vector. Deze is opgebouwd uit de coderende sequentie van het humane RPE65 cDNA, voorafgegaan door een 1400 bp-fragment van de humane RPE65-promotor en met op het einde een polyadenylatiefunctie van een runder groeihormoon.(63) Voor de subretinale injectie verrichtte men eerst een drie-poorts vitrectomie en nadien een retinotomie boven het proximale deel van de superotemporale vasculaire arcade. Op die 21
Resultaten manier kon men door middel van een subretinale canule tot één ml van de virale vector (1011 virale partikels) toedienen in de subretinale ruimte van het oog. Hierbij kwam ongeveer een derde van de retina in aanraking met de virale vector, inclusief de macula.(62;63;66) Om postoperatief de kans op intra-oculaire inflammatie te vermijden, gaf men de patiënten een kuur van orale prednisolone gedurende vijf weken (1 week preoperatief dagelijks 0.5 mg/kg lichaamsgewicht, 1 mg/kg in de eerste week postoperatief, 0.5 mg/kg in week twee, 0.25 mg/kg in week drie en 0.125 mg/kg in week vier).(63;66)
Figuur 5. Subretinale injectie. Aangepast van (69).
In de vroege postoperatieve periode werden de patiënten regelmatig klinisch onderzocht, verrichtte men funduscopie en OCT om het herstel van de retinale loslating te controleren en om de intra-oculaire inflammatie zo snel mogelijk te herkennen. Na 24 uur was de retinale loslating spontaan hersteld. En ten laatste na zes maanden herstelde het zicht zich terug tot op het niveau van voor de operatie. Postoperatief kon men een milde, zelflimiterende intra-oculaire inflammatie vaststellen, maar dit is een typisch verschijnsel na een vitrectomie. Voor de rest traden er geen andere bijwerkingen op. Door middel van PCR werden verschillende stalen van tranen, serum, speeksel (op dag 1 en dag 30) en sperma (op dag 30) onderzocht. Uit de resultaten van deze test kon men besluiten dat er geen systemische verspreiding van de virale vector was opgetreden. Ook kon men geen specifieke cellulaire of humorale immuunreactie tegen het AAV-kapsel of specifieke humorale immuunreactie tegen het transgenproduct detecteren. Bij twee van de drie patiënten zag men wel een kleine toename van de aspecifieke activatie van T-cellen, maar dit kan toe te schrijven zijn aan het stopzetten van corticosteroïden. Uit al deze resultaten kon men concluderen dat de veiligheid van subretinale gentherapie op korte termijn gewaarborgd is.(63;66)
22
Resultaten Zoals hierboven aangegeven, verminderde de gezichtsscherpte als gevolg van de tijdelijke retinale loslating en keerde terug naar het niveau van voor de operatie na ongeveer zes maanden. Bij geen enkele van de drie patiënten kon men na deze periode een klinisch significante verbetering van de gezichtsscherpte of verandering in de perifere gezichtsvelden vaststellen. Ook bij flash of pattern ERG zag men in vergelijking met voordien geen verschil in retinale activiteit. De sterke nystagmus bij Patiënt 2 vertoonde na de behandeling geen significante verbetering.(63;66) Zowel bij microperimetrie, dark-adapted perimetrie als bij het testen van de visuele mobiliteit vielen er bij Patiënt 1 en 2 geen significante positieve of negatieve veranderingen op te merken. Bij Patiënt 3 daarentegen zag men wel een verbeterde retinale functie. Bij microperimetrie zag men in het studie-oog in een gebied van aan de buitenste rand van de macula tot voorbij de grote vasculaire arcade een significante toename van de retinale gevoeligheid met maar liefst 14 dB, wat een toename met factor 25 inhoudt. In het controle-oog was deze verbetering niet op te merken. Bij dark-adapted perimetrie zag men in het studie-oog van Patiënt 3 op 37 verschillende plaatsen een significante toename van de sensitiviteit. Op 18 van de 37 locaties, allen gelegen in het inferieure deel van de retina, nam de gevoeligheid zelfs toe met factor 100. In het controle-oog echter zag men op sommige plaatsen zowel significante als niet-significante dalingen van de sensitiviteit. Het testen van de visuele mobiliteit gebeurde onder twee verschillende omstandigheden: enerzijds bij zwak licht (4 lux) en anderzijds onder sterke belichting (240 lux). In deze laatste situatie trad er bij Patiënt 3 geen verandering op in vergelijking met de testen voor de behandeling. Deze patiënt liep reeds een goed parcours onder sterke belichting bij het baseline onderzoek. Bij zwak verlichte omstandigheden echter kon men vaststellen dat Patiënt 3 met het studie-oog, vijf maanden na de toediening, het parcours nu significant sneller en foutloos kon afleggen (in tegenstelling tot acht fouten bij baseline). Bij een follow-up onderzoek vier weken na deze eerste test (zes maanden postoperatief) kon men deze resultaten bevestigen. Verder zag men ook dat Patiënt 1 en 3 het parcours iets sneller aflegden met het controle-oog als tevoren. Maar deze verbetering kan toegeschreven worden aan een algemeen leereffect. De verbetering met het studie-oog kon evenwel niet enkel toegeschreven worden aan dit leereffect omdat de toename van het effect veel groter was dan van een leereffect verwacht kon worden.(63;65;66) Uit de studie van Bainbridge et al. kan men concluderen dat het veilig is om tot één ml van de virale vector subretinaal in te brengen zonder dat hierbij op korte termijn ernstige klinische bijwerkingen optreden. Uiteraard dient de lange termijn veiligheid van deze virale gentherapie nog verder onderzocht te worden. In deze studie heeft slechts één patiënt (van de drie) baat gehad bij de behandeling. Of dit positief effect staafjes- of kegeltjes-gemedieerd is, is op dit moment niet duidelijk, en vormt onderwerp van verder onderzoek. Ook is men niet helemaal zeker dat de verbetering enkel te wijten is aan de toename van de concentratie RPE65. Het is niet uitgesloten dat de verbetering van de visuele functie een gevolg is van het aspecifieke trofische effect van de operatie, maar dit wordt als eerder onwaarschijnlijk beschouwd. Wat opviel, is dat de functie van de centrale macula en de gezichtsscherpte bij geen enkel individu verbeterden. Dit zou eventueel verklaard kunnen worden door de aanwezige amblyopie of de nood aan hogere concentraties RPE65. Wat vaststaat, is dat Patiënt 3 bij baseline een betere visus had dan de andere twee en
23
Resultaten dus waarschijnlijk een minder ernstige degeneratie had. Dit zou een verklaring kunnen bieden voor het positieve effect van de therapie bij deze patiënt. Dit leidde tot de veronderstelling dat verder onderzoek nodig is bij kinderen, omdat zij meer baat zouden kunnen hebben bij deze therapie.(63;65) 1.2.1.2.
Maguire et al.
Een tweede onderzoeksgroep is die van Maguire en Bennett et al. in Philadelphia (University of Pennsylvania). De doelstelling van hun studie was om de veiligheid na te gaan van subretinaal toedienen van rAAV-RPE65 cDNA bij patiënten met LCA, en het bestuderen van de werkzaamheid van deze vorm van gentherapie. Drie patiënten tussen de 19 en 26 jaar oud met LCA2, veroorzaakt door missense mutaties, werden geselecteerd om deel te nemen aan dit onderzoek. Het onderzoek liep van september 2007 tot en met januari 2008. Het ergst getroffen oog (dus met het slechtste zicht) werd gekozen als studie-oog, terwijl het andere oog als controle diende. Als vector gebruikte men het recombinante AAV2.hRPE65v2. Dit is een replicatie-deficiënte AAV-vector die het humane RPE65 cDNA bevat. De vector werd ook voorzien van een CBA-promotor die de expressie van het RPE65 aandrijft. Het was bewezen in vitro dat deze virale vector kon instaan voor de productie van RPE65 in de doelwitcellen. In tegenstelling tot de Londense studie werd aan de oplossing met de vector surfactant toegevoegd. De bedoeling hiervan is om verlies van vector te minimaliseren bij contact met de gebruikte hulpmiddelen en instrumenten. Onder algemene verdoving werd een standaard drie-poort pars plana vitrectomie verricht, waarbij het corticale glasvocht verwijderd wordt. Daarna injecteerde men 150 µl met een totaal van 1.5x1010 virale vectoren in de subretinale ruimte. Bij Patiënt 2 en 3 werd de macula blootgesteld aan de oplossing met de virale vector.(61;66-68) Na de ingreep werden de patiënten onderworpen aan een reeks testen, bestaande uit een volledig oftalmologisch
onderzoek
(gezichtsscherpte,
Goldmann
perimetrie,
pupilreflexen,
OCT,
hindernissenparcours, …), een algemeen klinisch onderzoek en laboratoriumtesten om de vector biodistributie en immuunrespons te kunnen beoordelen. Postoperatief zag men dat de retinale loslatingen zich spontaan herstelden binnen de 14 uren. Alle retinale onderzoeken waren weinig opmerkelijk met uitzondering van het optreden van een buitenste lamellaire cyste in de fovea bij Patiënt 2 op dag 5. Dit was te zien op OCT. Deze patiënt was vooraf al gekend met een epiretinale membraan in het studie-oog. Op dag 14 zag men op OCT en via oftalmoscopie dat er zich een maculaire holte (macular hole) had ontwikkeld bij deze patiënt. Hij was hier zich niet van bewust en bij follow-up bleef deze holte even groot. Overigens traden er geen andere ernstige bijwerkingen op en was er geen bewijs van systemische verspreiding van de vector. Enkel op dag 1 vond men bij Patiënt 1 een lage concentratie aan vector DNA in een traanstaal. Daarnaast trad er geen humorale immuunrespons op tegen het RPE65-proteïne en was er geen bewijs voor enige cellulaire immuunreactie tegen het AAV2-kapsel of het RPE65-proteïne.(61) Om de werkzaamheid van subretinale gentherapie bij LCA2 te evalueren, maakte men onder andere gebruik van pupillometrie. De testen bij baseline, zowel bij 0.04 lux als bij 10.0 lux, toonden aan dat de pupilreflexen van de drie patiënten veel ongevoeliger waren dan bij de controlepersonen. De verschillen in diameter voor of na de stimulus waren zelfs verwaarloosbaar. Na de injectie zag men dat de responsiviteit van het studieoog bij 10.0 lux enorm toegenomen was. Bij Patiënt 3 zag men na één maand zelfs een verbetering van de 24
Resultaten gevoeligheid bij de zwakste stimulus (0.04 lux). Bij het controle-oog daarentegen zag men geen verschil met baseline. Om via statistische analyse de significantie van deze resultaten te kunnen aantonen, werden deze testen regelmatig herhaald. Bij Patiënt 1, 2 en 3 waren respectievelijk 15 van de 17 (p=0.003), 14 van de 14 (p<0.001) en 16 van de 18 (p<0.001) testen positief en zag men een veel grotere amplitude bij het belichten van het studie-oog. Bijgevolg kon men de nulhypothese verwerpen en was ook de Student’s t-test significant voor elke patiënt. De geïnjecteerde ogen waren dus veel doeltreffender geworden in het sturen van hun pupilreflex. Deze ogen werden drie keer gevoeliger dan voordien, en de gevoeligheid overtrof die van het voorheen beter functionerende controle-oog.(61;68) Al na twee weken gaven de drie patiënten aan dat ze een verbeterd zicht hadden in schemerige omstandigheden. De toegenomen pupilreflexen werden dus vergezeld van verbeterde gezichtsscherptes. Voor Patiënt 1 nam de visus in het studie-oog toe met 0.28 op de logMAR-schaal. Zijn visus verbeterde van het herkennen van handbewegingen naar een Snellen equivalent van 20/1050. Bij Patiënt 2 verbeterde het zicht van het studie-oog met 0.45 op de logMAR-schaal, en was de visus na de ingreep equivalent aan 20/710 op de Snellenkaart, in vergelijking met het waarnemen van handbewegingen voordien. Er werd ook een verbetering van het controle-oog vastgesteld, maar dit zou eventueel verklaard kunnen worden door een placebo-effect of door een afname van de nystagmus (zie hieronder). Bij Patiënt 3 nam de visus toe met 0.34 op de logMARschaal, en het Snellen equivalent ging van 20/640 naar 20/290. Ook zag men voor de drie patiënten een positieve trend bij het gezichtsveldonderzoek van het studie-oog. Er was een gemiddelde toename van 80° naar 200°. Nochtans is dit onderzoek bij patiënten met ernstige visuele aantasting slecht betrouwbaar omwille van de grote variabiliteit. In dit geval zag men echter dat de toename in het gezichtsveld de variabiliteit van het niet-geïnjecteerde oog duidelijk overtrof. De therapie had ook een invloed op de nystagmus. Men zag namelijk een verbetering van zowel de monoculaire als de binoculaire amplitude en frequentie van de nystagmus.(61;66) Uit de resultaten van de studie van Maguire en Bennett et al. kan men besluiten dat de subretinale toediening van AAV2.hRPE65v2 voor een duidelijke verbetering zorgt van de retinale functie voor tenminste zes maanden. Dit werd aangetoond zowel door objectieve als subjectieve testen. Aangezien er geen controle was met een lege vector, kan men er dus niet zeker van zijn dat de positieve effecten volledig toe te schrijven zijn aan de expressie van RPE65. Het belangrijkste doel van deze studie, namelijk het onderzoeken van de veiligheid van virale gentherapie, bleek zeer gunstig te zijn. Bij één patiënt werd wel een maculaire holte vastgesteld, die eerder een gevolg was van een contractie van een vooraf bestaande epiretinale membraan gestimuleerd door de vitreoretinale ingreep dan door de vector zelf. Uiteindelijk zullen een langere follow-up en meer patiënten nodig zijn om de veiligheid en werkzaamheid van de ingreep nog beter te kunnen bepalen. Dit zal ook toelaten om de beïnvloedende factoren voor de mate van en de duur van herstel te kunnen definiëren.(61;68) 1.2.1.3.
Hauswirth et al.
Van de drie onderzoeksgroepen was de groep van Hauswirth et al. de laatste om hun resultaten te publiceren, wat hen de mogelijkheid bood om vergelijkend onderzoek te doen van de drie fase I klinische studies. Het 25
Resultaten doel van deze studie was om op korte termijn de veiligheid en werkzaamheid van virale gentherapie bij personen met LCA2 te evalueren. Hiervoor werden drie jongvolwassenen (tussen 21 en 24 jaar oud) met RPE65-afhankelijke LCA geselecteerd. Twee van hen waren homozygoot voor een mutatie in RPE65 en de derde was compound heterozygoot. Ook in deze studie werd slechts één oog behandeld. Zoals in de vorige studies werd het slechtst functionerende oog geselecteerd voor een subretinale injectie met de rAAV2-CBSBhRPE65 vector. De patiënten werden vervolgens gedurende 90 dagen van nabij gevolgd. Men verrichte een standaard drie-poort vitrectomie in het studie-oog en via een canule kreeg elke patiënt een injectie van 150 µl met daarin 5.96x1010 virale vectoren. Enkel bij Patiënt 1 werd de fovea blootgesteld aan de vector. Bij Patiënt 2 lukte de ingreep onmiddellijk, terwijl bij de twee andere patiënten de retinotomie niet voor een retinale loslating zorgde, waardoor de toediening mislukte in een eerste tijd. Bij Patiënt 1 had men daardoor twee pogingen nodig en bij Patiënt 3 zelfs drie. Uiteindelijk slaagde men er bij de drie patiënten in om de vector toe te dienen. Na ongeveer 5 à 6 uren was het meeste subretinale vocht geabsorbeerd.(64) Zoals in de andere studies werd aangetoond, was er ook hier geen klinische evidentie voor intra-oculaire inflammatie. Daarentegen werd er wel inflammatie van de conjunctivae opgemerkt. Deze nam zeer geleidelijk af gedurende de eerste maand en op dag 60 waren de conjunctivae volledig genezen. Voor de rest bleken er bij klinisch onderzoek geen noemenswaardige veranderingen te zijn en waren de parameters in het bloed en de urine normaal. Om de immuunrespons van het lichaam in beeld te brengen, werden verschillende analyses gedaan. Een eerste was het bepalen van circulerende antilichamen in het bloed tegen het AAV2capside bij baseline en op dag 14 en 90 na de behandeling. Voor Patiënt 1 en Patiënt 3 werden geen significante verschillen opgemerkt, maar bij Patiënt 2 zag men wel een 4.5 tot 7.5-voudige toename op dag 90 in vergelijking met baseline of dag 14. Dit fenomeen moet wel in het juiste perspectief geplaatst worden. De concentratie antilichamen op dag 90 was gelijkwaardig aan die van Patiënt 3 bij aanvang van het onderzoek en bleef ook ver onder het gemiddelde niveau van een normale referentiepopulatie. Een tweede test bepaalde de specifieke reactiviteit van perifere lymfocyten tegen het AAV2-kapsel (antigenspecifieke lymfocytenproliferatie respons: ASR-test). Deze werd verricht bij aanvang en op dag 14 en 90 postoperatief. Bij Patiënt 1 en Patiënt 3 zag men bij geen enkele meting een significante stijging van de stimulatie index5 (SI). Patiënt 2 daarentegen vertoonde bij de meting op dag 90 een geringe toename van de index van 1.89 bij baseline naar 2.10 op dag 90. Het minimale niveau van significantie voor de SI varieert tussen 2 en 3. Het is bediscussieerbaar of dit een significante stijging is. Met een derde test werd de T-cel immuunreactie op het AAV2-capside gemeten bij baseline en op dag 14 en dag 90. Hiervoor werden perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) gebruikt. Deze cellen werden blootgesteld aan drie verschillende peptide-pools van het AAV2-kapsel. Daarna werd de interferon-γ (IFN-γ) secretie geanalyseerd en vergeleken met positieve en negatieve controle. Bij geen van de drie patiënten kon een positieve reactie ten opzichte van één van de pools opgewekt worden. Een vierde en laatste test onderzocht de biodistributie van de vector in het perifere bloed door middel van PCR bij aanvang en op dag 1, 3 en 14 na de toediening. Op geen enkel moment waren
5
De stimulatie index (SI) is de verhouding van de opname van [3H]thymidine in de aanwezigheid van het antigen ten opzichte van de situatie zonder het antigen.(64)
26
Resultaten vectorgenoomkopieën detecteerbaar in het bloed, waardoor systemische verspreiding kon uitgesloten worden.(64) De resultaten van het onderzoek naar de veiligheid van subretinale gentherapie met virale vectoren bij de mens waren dus ook in deze studie veelbelovend en bijkomend werd ook hier de werkzaamheid van de ingreep geëvalueerd. De drie patiënten gaven aan dat ze vooral bij weinig omgevingslicht een toegenomen lichtgevoeligheid opmerkten, en dit was vooral goed te merken wanneer ze dit vergeleken met hun controleoog. Voor iedere patiënt was de graad van toename van de gevoeligheid individueel verschillend, zo ook voor de verschillende locaties in het gezichtsveld met toegenomen sensitiviteit. Naast deze subjectieve resultaten werden ook enkele objectieve testen verricht. Wat de gezichtsscherpte betreft kon men geen significant verschil optekenen. Deze werd geëvalueerd aan de hand van de Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS) gezichtsscherptemeting. Patiënt 1 vertoonde de langste herstelperiode postoperatief wat betreft gezichtsscherpte: op dag 90 was zijn scherpte nog steeds 3 lettergroottes onder de laagste meting bij baseline. Patiënt 2 vertoonde een snellere herstelperiode en keerde terug naar het niveau van voor de ingreep. Bij Patiënt 3 was er zo goed als geen verlies direct postoperatief en ook hij bleef op het niveau van voor de injectie. De gezichtsscherpte van de controle-ogen bleef gedurende de follow-up van 90 dagen onveranderd. Door middel van OCT bestudeerde men de retinale anatomische basis voor de resultaten van de gezichtsscherpte. De foveale dikte bij Patiënt 2 en Patiënt 3 was op dag 90 niet verschillend van de dikte bij aanvang van het onderzoek. Bij Patiënt 1 daarentegen was er een vermindering in dikte van 80.3 µm en de grens voor significantie is 16.7 µm. De foveale architectuur voor de ingreep vertoonde geen typische inzinking. Dit zou kunnen verklaard worden door een epiretinale membraan of een mogelijke zwelling van centrale gliale Müller cellen (wat geobserveerd kan worden bij retinale degeneraties). Op dag 90 zag men een meer typische inzinking, maar de dikte was overal afgenomen. De controle-ogen vertoonden bij geen enkele patiënt enige verandering gedurende de gegeven tijdsperiode. Om de subjectieve resultaten van toegenomen lichtgevoeligheid te objectiveren, onderzocht men de gevoeligheid bij donkeradaptatie met fullfield sensitiviteitstesten (FST). Direct na de injectie zag men afname in gevoeligheid bij alle drie, maar deze herstelde binnen de eerste week. Verder onderzocht men de gevoeligheid op dag 30, 60 en 90. Bij evaluatie van de resultaten van alle studie-ogen als groep bekwam men een significant resultaat (p<0.001). Tussen dag 30 en dag 90 echter werden geen duidelijke trends waargenomen voor verandering in gevoeligheid. Voor de controle-ogen als groep werden geen significante verschillen aangetoond (p=0.99). Bij individuele evaluatie van de studie-ogen van elke patiënt ziet men zowel voor Patiënt 1 als voor Patiënt 2 een positieve significante toename van gevoeligheid ten opzichte van de baseline (respectievelijk p=0.04 en p=0.002). Bij Patiënt 3 zag men evenwel geen significante verandering in het studie-oog (p=0.07). Voor elk controle-oog afzonderlijk kon er geen significante verandering in lichtgevoeligheid aangetoond worden.(64) Uit de studie van Hauswirth et al. kan men concluderen dat het op korte termijn (studieduur van slechts 90 dagen) veilig is om een virale vector uitgerust met humaan RPE65 subretinaal toe te dienen. Enkel bij Patiënt 2 zag men bij enkele testen een toename van de immuunafweer van het lichaam, maar in de juiste context mag men dit zeker relativeren. De subjectieve toename van lichtgevoeligheid, vooral in donkere
27
Resultaten omstandigheden, die de drie individuen aangaven, konden slechts bij twee van de drie objectief bevestigd worden met FST. De toename in gevoeligheid werd vooral in de eerste 30 dagen gerealiseerd en stagneerde daarna. Daarnaast werd geen verbetering gemeten van de gezichtsscherpte, wat zou kunnen verklaard worden door het vergevorderd stadium van de ziekte. Daarom is onderzoek nodig bij jongere kinderen en zijn studies nodig met hogere dosissen, om de degeneratie van het RPE tot stilstand te brengen of op zijn minst te vertragen.(64) 1.2.2. Activatie van de visuele cyclus en trage staafjes-kinetica De onderzoeksgroep van Hauswirth et al. stopte niet bij de ‘klassieke’ safety en efficacy studies, maar ging op zoek naar antwoorden op enkele sleutelvragen. Op dat moment was het nog onduidelijk of enerzijds het staafjeszicht of anderzijds het kegeltjeszicht, of beiden, hersteld werden door de subretinale toediening van virale vectoren met RPE65. Men wist ook niet of de verbetering van het zicht, die men kon waarnemen, volledig kon verklaard worden door het aantal intacte fotoreceptoren in het behandelde gebied.(69) Normaal zicht bij de mens wordt gevoeliger voor licht na het wegvallen van omgevingslicht. Dit proces staat beter bekend als donkeradaptatie. In normale omstandigheden kan er tot één uur nodig zijn vooraleer er volledige donkeradaptatie is bereikt en het staafjes-nachtzicht volledig actief is. Veranderingen in lichtgevoeligheid na één uur donkeradaptatie zijn bij normale ogen niet significant. Bijgevolg werden bij de proefpersonen de initiële retinale sensitiviteitstesten uitgevoerd na een periode van 1 à 2 uur donkeradaptatie. Deze korte periode van adaptatie bleek echter niet voldoende te zijn om maximale sensitiviteit te meten. Patiënten gaven aan dat ze bij ontwaken in een donkere kamer een bijzonder toegenomen helderheid in hun behandeld oog waarnamen. Omwille van dit opmerkelijk feit besliste men om de gevoeligheidstesten opnieuw uit te voeren, maar nu met een langere periode van donkeradaptatie (3 à 8 uur). Bij de drie patiënten werd een opmerkelijke toename van de visuele sensitiviteit waargenomen in het behandelde gebied. Onbehandelde retinale regio’s toonden geen significante veranderingen in gevoeligheid bij een langere periode van donkeradaptatie. Deze resultaten doen vermoeden dat de kinetica van de herstelde retinoïd cyclus abnormaal traag zijn.(69) Om de kinetica van donkeradaptatie verder te definiëren en om staafjes- en kegeltjeskinetica van elkaar te onderscheiden, werd bij het meten van de gevoeligheid gebruik gemaakt van een desensitiserende lichtflits. Patiënt 1 had niet voldoende visuele functie om een betrouwbare test uit te voeren en werd daarom niet aan dit onderzoek onderworpen. Bij Patiënt 2 en 3 werden respectievelijk twee en één retinale studiegebieden geselecteerd. Minder dan een minuut nadat het oog met een flash werd gedesensitiseerd, werd al visuele functie waargenomen, die kegeltjes-gemedieerd was. De kegeltjes-gemedieerde functie bleef op een plateaufase gedurende meer dan 2 uur, waar dit in normale ogen slechts 7 tot 9 minuten duurt. Het einde van die plateau-fase werd aangegeven door het verschijnen van de staafjes-functie. Bij Patiënt 2 zag men in het ene gebied een plateaufase van 4 uur en in het andere gebied van 2 uur, zoals ook het geval was bij Patiënt 3. Het staafjes-gemedieerd herstel verliep zeer traag en duurde bij beide patiënten op zijn minst 8 uur.(69)
28
Resultaten De kegeltjesfunctie werd bij Patiënt 2 en 3 beoordeeld gedurende de verlengde plateaufase na donkeradaptatie en het gebruik van een flits. Bij beide patiënten nam de gevoeligheid na de ingreep significant toe, maar bleef wel nog steeds ongeveer 1.5 log eenheden onder de normale gevoeligheid. Voor Patiënt 1 kon met geen enkele lichtstimulus enige kegeltjessensitiviteit gedetecteerd worden. De staafjesfunctie werd zowel na standaard als na verlengde donkeradaptatie gemeten. De langere periode van donkeradaptatie zorgde voor een extra toename van de staafjesgevoeligheid bij Patiënt 2 en 3, en werd ook detecteerbaar bij Patiënt 1. Voor Patiënt 2 verbeterde de sensitiviteit tot 1.5 log eenheden onder de normale gevoeligheid, voor Patiënt 3 tot 2.2 log eenheden en voor Patiënt 1 bleef de sensitiviteit onder de grens van 4 log eenheden onder de normale gevoeligheid.(69) De onderzoeksgroep van Hauswirth et al. stelde de hypothese voorop dat gentherapie de functionele blokkade van de visuele cyclus kan opheffen, maar dat het gedegenereerde RPE-cellen niet kan herstellen. Om dit kracht bij te zetten, onderzocht men de relatie tussen de retinale structuur en de retinale functie in het gebied (± 2mm) met de meest waarneembare biologische activiteit. Enkel Patiënt 1 en 2 werden hiervoor onderzocht, omdat bij Patiënt 3 het gebied met de hoogste biologische activiteit moeilijk bereikbaar was voor het verkrijgen van data over de retinale structuur (temporale locus). De ONL-dikte bedroeg voor Patiënt 1 29% van het normale gemiddelde en voor Patiënt 2 was dit 43%. RP patiënten die geen RPE65-mutaties hebben, en waarvan de ONL-dikte vergelijkbaar is als bij Patiënt 1 en 2, vertonen een sensitiviteitsverlies tussen 0.5 en 2.5 log eenheden.(69) Deze waarden vallen ook binnen de grenzen van een theoretisch model dat de relatie beschrijft tussen ONL-dikte en staafjessensitiviteitsverlies.(69;70) Voor de injectie werd bij Patiënt 1 en 2 respectievelijk een verlies van 7.2 en 6.4 log eenheden gemeten. Na de ingreep merkte men een toename bij Patiënt 1 van 2.3 log eenheden (200-voudig), maar hiermee bereikte men niet de grens van het theoretisch model voor eenvoudige fotoreceptordegeneratie. Bij Patiënt 2 daarentegen nam men een stijging van 4.8 log eenheden waar (63.000-voudig) en hierdoor viel dit resultaat binnen de grenzen van het model voor eenvoudigere aandoeningen waarbij enkel een degeneratieve component zorgt voor gezichtsverlies. Op deze manier heeft men kunnen aantonen dat subretinale gentherapie het potentieel in zich heeft om de retinoïd cyclus component binnen RPE65-LCA te herstellen.(69) Uit dit doorgedreven onderzoek van Hauswirth et al. kan men concluderen dat hoe beter de ONL bewaard blijft, hoe groter de toename in gevoeligheid is na een behandeling met subretinale gentherapie. Dit kan verklaard worden doordat er nog meer capaciteit bewaard gebleven is om 11-cis-retinal te synthetiseren.(69) Een alternatieve hypothese die er van uitgaat dat dit verklaard kan worden door de vrijstelling van neurotrofe factoren als gevolg van de subretinale ingreep, wordt ontkracht door simulatie-injecties bij dieren waarbij geen toename in gevoeligheid te merken valt.(71-73) Het extreem lang herstel van het staafjeszicht suggereert een trage loslating van 11-cis-retinal en dus een langdurige regeneratie van rhodopsine. Hiervoor zijn twee verklaringen mogelijk: [1] een verminderde graad van synthese en [2] een toegenomen obstructie van inter- en intracellulair transport. Men concludeerde dat mocht de werkzaamheid van gentherapie gemeten worden door de donkeradaptatie testen, er een efficiënte methode bedacht moet worden gezien het lange tijdsverloop bij deze twee patiënten.(69)
29
Resultaten 1.2.3. Follow-up studies Zoals hierboven aangegeven, liep de follow-up periode in de studie van Bainbridge et al. over 12 maanden. Bij de groepen van Maguire et al. en Hauswirth et al. liepen deze respectievelijk over maximaal vijf en drie maanden. Voor deze laatste twee studies gebeurde nog een extra follow-up studie over respectievelijk 1.5 en 1 jaar na de initiële toediening van de virale vector. 1.2.3.1.
Maguire et al.
De onderzoeksgroep van Philadelphia stelde de follow-up studie op om de significante verbeteringen die al na één maand gezien werden gedurende een langere periode te kunnen evalueren. Dit stelde hen in staat om enerzijds de visuele functie kwantitatief te beoordelen, meer specifiek of deze verbeterde, verslechterde of stabiel bleef over de periode. Anderzijds kon men de invloed van de behandeling vergelijken met het onbehandelde oog en evalueren of het natuurlijk verloop van de ziekte werd gewijzigd.(67) Wat de veiligheid betreft, zag men net zoals in de korte-termijnstudie geen immunologische reacties of ernstige bijwerkingen optreden. Ook werden er geen serumantilichamen tegen het RPE65 cDNA gedetecteerd. De neutraliserende antilichamen die men bij Patiënt 2 aantrof daalden tegen het einde van de follow-up periode terug naar het niveau van voor de ingreep. Bij Patiënt 1 en Patiënt 3 werden geen veranderingen vastgesteld van het maculaire profiel of dikte op fundoscopie of OCT. Bij Patiënt 2 daarentegen werd op dag 14 een maculaire holte vastgesteld en deze bleef de hele tijd aanwezig. Er was evenwel geen uitbreiding van de holte te noteren. Dit fenomeen had echter geen invloed op de verbetering van het zicht, die al na 30 dagen werd geobserveerd. De gezichtsscherpte bleef namelijk stabiel tot 1.5 jaar na de behandeling, het laatste punt van waarneming.(67) De evaluatie van de visuele functie werd op twee punten gedaan: enerzijds de subjectieve onderzoeken en anderzijds de objectieve testen. De gezichtsscherpte is één van die subjectieve onderzoeken en zoals reeds aangegeven, zag men al na één maand een significante verbetering van de gezichtsscherpte van het geïnjecteerde oog. Deze verbetering bleef toenemen tot op het einde van de follow-up. De grootste toename werd gedurende de eerste maanden genoteerd, maar zeer opmerkelijk zag men ook daarna nog een toename. Bij Patiënten 1 en 3 verbeterde de gezichtsscherpte zodanig dat de studie-ogen, die voorheen de slechtste functie hadden, na de behandeling een betere gezichtsscherpte hadden dan de controle-ogen. Dit was niet zo bij Patiënt 2, maar daar zag men wel een verbetering, zij het niet significant, in het niet-geïnjecteerde oog in de eerste dagen na de subretinale toediening in het studie-oog. Deze toename in gezichtsscherpte werd tot 1.5 jaar na de behandeling opgemeten. Bij Patiënten 1 en 3 kon men dit niet vaststellen op korte termijn, maar voor Patiënt 1 zag men voor het controle-oog wel een lichte verbetering tussen dag 150 en 1.5 jaar. Een ander subjectief onderzoek is het testen van de Goldmann perimetrie. Op korte termijn zag men een toename van de gezichtsvelden van de studie-ogen, maar bij het testen na 1.5 jaar werd geen verdere verbetering waargenomen. Ook in de controle-ogen werd geen verandering opgemerkt. Een laatste subjectief onderzoek is het testen van de mobiliteit door het afleggen van een hindernissenparcours. In vergelijking met de resultaten op dag 30 zag men na 1.5 jaar een lichte continue verbetering van zowel de tijd die nodig was om
30
Resultaten het parcours af te leggen als het aantal obstakels die ontweken werden. Een leereffect in deze subjectieve test kan nooit volledig uitgesloten worden, hoewel de vorm van het traject werd veranderd bij elke test.(67) Voor de objectieve evaluatie van de visuele functie werden ook een drietal testen voorzien. Een eerste analyseert de pupilreflexen. Deze test zorgt voor een objectieve evaluatie van de transmissie van impulsen gegeven aan fotoreceptoren naar de retinale ganglioncellen en zo verder naar pupillomotore centra in het centraal zenuwstelsel. Voorheen werd al aangetoond dat het toedienen van AAV2.hRPE65v2 op korte termijn voor een significante verbetering zorgde van de reflexen bij stimuli in het geïnjecteerde oog. Dit toonde aan dat er een betere retinale functie en pupilreflex was in het studie-oog ten opzichte van de controle. Het verschil tussen beide kan worden gekwantificeerd door het meten van de snelheid en de amplitude van de reflexen (respectievelijk velocity of pupillary light reflex [VPLR] en amplitude of pupillary constriction [APC]). Bij baseline was er bij de drie patiënten geen verschil merkbaar tussen de beide ogen. Na één maand echter waren bij stimulatie met kortdurende lichtflitsen (0.2 seconden) zowel de VPLR als de APC van het behandelde oog significant toegenomen. Deze verschillen tussen beiden ogen konden tot 1.5 jaar na de injectie gemeten worden. De voornaamste toename werd wel genoteerd tussen de eerste en de vierde maand postoperatief. Wanneer testen werden verricht met langer durende lichtflitsen (1.0 seconden) zag men ook hier een significante toename van de VPLR en APC van het geïnjecteerde oog die meetbaar was tot 1 à 1.5 jaar na de ingreep. Een tweede objectief onderzoek is het testen van de oculaire motiliteit. Na de behandeling zag men bij de drie patiënten dat de oogbewegingen constant en symmetrisch waren. Men zag ook een toename van de intensiteit van de oscillatie bij abductie en bij het afdekken van één oog. Bij Patiënt 1 en 3 zag men dat de frequentie van zowel de monoculaire als de binoculaire nystagmus in primaire positie met minstens 50% verminderde vanaf dag 60 en dat deze verbetering zich voortzette tot 1.5 jaar na behandeling. Bij de drie patiënten zag men zelfs een significante daling van de amplitude van de nystagmus in primaire stand. Nog bij Patiënt 1 en 3 werd een vermindering van de exotropie vastgesteld aangezien een verminderde interpupillaire afstand gemeten werd. Bij Patiënt 3 daarenboven veranderde de exotropie in het rechtse oog naar een alternerende exotropie met een lichte dominantie van het rechtse oog. Al deze resultaten van de mobiliteit van de ogen tonen aan dat het toedienen van RPE65 in één oog bij patiënten met LCA2 zorgt voor een stabiele reductie van de oogbewegingen in beide ogen samen met een verbeterde oculaire motiliteit. Als laatste objectieve test werd nog een full-field ERG verricht, maar tot 1.5 jaar na de ingreep werden geen veranderingen opgemerkt in het retinale antwoord.(67) Uit deze lange termijn follow-up studie van de onderzoeksgroep van Philadelphia kon men concluderen dat er ook na 1.5 jaar zo goed als geen immuunresponsen of geen bijwerkingen optraden en dat deze vorm van gentherapie dus veilig is. Zowel het optreden van neutraliserende antilichamen bij twee van de drie patiënten als het optreden van een maculaire holte bij Patiënt 2 vielen binnnen de grenzen van het veilige. De concentratie antilichamen daalde na verloop van tijd terug naar het niveau van voor de toediening en de holte werd gedurende de follow-up niet groter en had geen invloed op de werkzaamheid van de therapie. Wat de werkzaamheid betreft, kon men concluderen dat de verbeteringen die na één maand zowel bij de subjectieve als objectieve testen van de visuele functie werden vastgesteld ook na 1.5 jaar nog aantoonbaar waren. De
31
Resultaten significante reductie van de nystagmus zou evenwel kunnen verklaard worden doordat een verbeterde gezichtsscherpte zorgt voor een stabielere fixatie en aldus voor een betere oculomotore reactie van de ogen. Dat er op ERG geen verbetering werd gezien, kan verklaard worden door de lage dosis die werd toegediend, het lage aantal fotoreceptoren voor therapie, het vermogen van het RPE om 11-cis-retinal te synthetiseren na het herstel van RPE65-expressie en het vermogen van de fotoreceptoren om 11-cis-retinal te gebruiken. Men mag dus concluderen dat de transgene expressie van een AAV-injectie stabiel is gedurende een zekere tijd. Dit sluit de mogelijkheid uit dat de toename in visuele functie het resultaat zou zijn van een transiënt neurotroof effect van de ingreep. De AAV2-gemedieerde gentransfer naar de humane retina lokt geen cytotoxische T-lymfocyten activiteit uit tegen het AAV-kapsel zoals gezien wordt in humane studies met de lever. De resultaten over de veiligheid en werkzaamheid suggereren dat de retina een ontvankelijk doelorgaan is voor stabiele AAV2-gemedieerde gentransfer bij mensen.(67) 1.2.3.2.
Hauswirth et al.
Ook de onderzoeksgroep van Florida zette een follow-up studie op om op iets langere termijn de resultaten van veiligheid en werkzaamheid van de initiële studie verder te bestuderen. Eén jaar na de behandeling vroeg men zich af of de ingreep nog steeds zo veilig was als oorspronkelijk werd gerapporteerd en wat de duur was van het herstelde zicht van het geïnjecteerde oog.(74) Eén jaar na de toediening waren de drie jongvolwassenen (nu tussen de 22 en 25 jaar oud) gezond en wel en traden er geen ernstige vectorgerelateerde bijwerkingen op. Door het meten van de titers antilichamen tegen het AAV2-capside kon men de humorale immuunrespons monitoren. Na 12 maanden waren de titers ruim onder het populatie gemiddelde en binnen het interval van baseline en 3 maanden. De ASR-test toonde na één jaar geen significante stijging van de SI. Het klinisch onderzoek verliep normaal en ook de bloed- en urinetesten vertoonden geen significante afwijkingen.(74) Wat de werkzaamheid van de behandeling betreft, zag men dat de klinische oculaire onderzoeken van zowel de studie- als de controle-ogen geen verandering toonden ten opzichte van de resultaten op 3 maanden. Gezichtsscherpte, centrale retinale structuur (op OCT) en de gezichtsvelden bleven gelijk op het 6, 9 of 12 maanden tijdspunt en veranderden niet in vergelijking met de korte termijn studie. Voor de lichtgevoeligheid werden evenmin veranderingen genoteerd qua sterkte of retinale uitgebreidheid na de positieve resultaten van de initiële studie.(74) Opmerkelijk was dat Patiënt 2 aangaf dat ze voor het eerst de verlichte digitale klok op het dashboard van de auto kon lezen wanneer ze vooraan in de auto zat. Nochtans waren de gezichtsscherpte of de visuele gevoeligheid niet verder toegenomen in vergelijking met de meting drie maanden postoperatief. Deze verandering in fixatie was het gevolg van de ontwikkeling van een extrafoveaal kegeltjeszicht met een betere gevoeligheid dan de onbehandelde fovea. Deze onverwachte visuele winst zou dus verklaard kunnen worden door het ontstaan van een pseudofovea en een op training beruste ontwikkeling van het volwassen visueel systeem.(75) Om te kunnen definiëren of deze positieve veranderingen in gevoeligheid staafjes of kegeltjes gemedieerd waren, gebruikte men stimuli met chromatisch licht onder omstandigheden met lichtadaptatie. Bij Patiënt 1 was de toename staafjes gemedieerd en bij Patiënt 2 en 3 waren zowel de staafjes als de kegeltjes betrokken bij deze resultaten.(74) 32
Resultaten Uit deze follow-up studie van de groep van Hauswirth et al. kon men besluiten dat de duur van verbeteringen consistent was met de elektrofysiologische data van de hondenstudies. Een groot verschil tussen de menselijke en de honden RPE65-ziekte ligt in de significante retinale celdood bij de mens op elke leeftijd. Het behandelde retinale gebied bij de mens heeft niet de volle capaciteit qua aantal cellen omwille van vroegere celdood. Het is dan ook onzeker hoeveel cellen er nog verder zullen afsterven in dit beter functionerende gebied. De negatieve invloed van de omgevende onbehandelde zones zou via acellulaire autonome mechanismen de levensduur van de herstelde visuele eilandjes kunnen verkorten.(74) 1.2.4. Dose-escalation trial Na de drie initiële studies en de follow-up studies werd het duidelijk dat er ook studies nodig waren zowel met grotere dosissen als studies bij kinderen. De studiegroep van Philadelphia, samen met nog enkele buitenlandse experts, ging deze uitdaging aan met een dose-escalation trial onder andere bij kinderen en includeerde naast Amerikaanse ook enkele Belgische en Italiaanse patiënten. Het doel van de studie was om de veiligheid en de werkzaamheid van toenemende subretinale dosissen AAV2-hRPE65v2 te evalueren tot maximaal twee jaar na de injectie. Daarnaast was het ook de bedoeling om de rol van de leeftijd, en bijgevolg het stadium van de ziekteprogressie, in te schatten in de graad van omkeerbaarheid van de blindheid. Dezelfde virale vector van de studie van Maguire et al. werd gebruikt om het RPE te transduceren die na een standaard pars plana vitrectomie en het verwijderen van het achterste corticale gedeelte van het corpus vitreum subretinaal werd toegediend. Opnieuw werd het slechtste oog geselecteerd als studie-object. In totaal werden 12 patiënten geselecteerd om aan deze studie deel te nemen en drie daarvan zijn de patiënten van de onderzoeksgroep van Maguire et al. die als eersten ter wereld subretinale gentherapie hebben ondergaan. In deze studie gebruikte men drie verschillende dosissen van de virale vector. De dosis die in de initiële studie werd gebruikt, werd nu als low dose (1.5x1010 virale partikels) weerhouden. Zes patiënten kregen de medium dose (4.8x1010 virale partikels en dus iets meer dan drie keer zoveel als in de eerste studie) en nog eens drie andere patiënten kregen de high dose (1.5x1011 virale partikels en dus tien keer zoveel als de low dose) toegediend. Het injectievolume bedroeg 150 µl bij de low en medium dose, en het dubbele (300 µl) voor de high dose. Bij 9 van de 12 patiënten werd de macula blootgesteld aan de vector. Bij 3 van de 12 werd de macula niet blootgesteld omwille van verregaande atrofie in dit gebied. De duur van de respons op de injectie werd gedurende 3 maanden tot 2 jaar lang opgevolgd.(76) Binnen de 14 uur na de ingreep zag men dat alle retinale loslatingen spontaan hersteld waren. Ook bij patiënt CH10 (medium dose), die bij baseline een epiretinale membraan vertoonde die eerst verwijderd werd vooraleer de injectie werd toegediend, zag men bij controle-OCT op dag 8 geen evidentie voor een maculaire holte. Alle postoperatieve retinale onderzoeken vertoonden geen afwijkingen behalve bij patiënt NP15 (high dose). Bij deze patiënt werd pigment atrofie opgemerkt aan de onderrand van de oorspronkelijke plaats van loslating. Voor de rest traden er bij geen enkele patiënt ernstige bijwerkingen op. Slechts tijdelijk werden sporen van de vector aangetroffen in tranen en bloed (met PCR) na de operatie, maar er werden geen schadelijke immuunresponsen opgemerkt.(76)
33
Resultaten Wat betreft de werkzaamheid van deze dose-escalation trial gaven alle 12 patiënten subjectief aan dat ze een verbeterd zicht hadden in vaag verlichte omstandigheden, en dit vanaf twee weken postoperatief. Naast deze subjectieve verbetering werden heel wat objectieve onderzoeken verricht om de positieve bevindingen van de patiënten te kunnen staven.(76) De toename in gezichtsscherpte was wezenlijk en stabiel bij respectievelijk 3 patiënten met low dose (3/3), 3 patiënten met medium dose (3/6) en 1 patiënt met high dose (1/3). Slechts bij 1 patiënt (uit de medium dose groep) werd een daling van de gezichtsscherpte vastgesteld. Bij de overige patiënten bleef de gezichtsscherpte stabiel. De toename in scherpte is niet geassocieerd met leeftijd, hoewel de aanvangswaarden bij kinderen beter was. Er werd dus geen manifest dosiseffect gevonden met betrekking tot de vooruitgang in gezichtsscherpte. Wel kon men een verbetering of stabilisatie waarnemen na subretinale injectie, met uitzondering van 1 patiënt.(76) Bij alle 12 patiënten kon men een uitbreiding van het gezichtsveld vaststellen, ook bij de patiënten met een ernstig aangetast gezichtsveld voorheen. Er werd een grote variabiliteit vastgesteld in de toename van het gezichtsveld, maar de uitbreiding in elk geïnjecteerd oog overtrof telkens de variatie van het contralaterale niet geïnjecteerde oog. Er werd een correlatie waargenomen tussen de toename van het gezichtsveld en de oppervlakte van de nog reversibele delen van de retina die blootgesteld werden aan de vector. Ook zag men een correlatie tussen de toename en het effect van onmiddellijke positionering van het hoofd postoperatief op de randen van de retinale loslating. Men stelde ook een correlatie vast tussen de toename en het baseline gezichtsveld. Men zag dat het gezichtsveld na de injectie vaak de regio die was blootgesteld overtrof. Ondanks het groter ingebracht volume (en dus groter blootgesteld gebied) bij oudere patiënten (> 19 jaar) nam het gezichtsveld niet zo sterk toe als bij jongere patiënten (≤ 19 jaar). Dit zou kunnen verklaard worden doordat er waarschijnlijk een groter verlies is van nog reversibele fotoreceptoren in een verder gevorderd stadium bij oudere patiënten.(76) De meeste patiënten uit de groep van medium en high dose werden onderworpen aan een test om de full-field gevoeligheid voor wit licht te onderzoeken. Twee van de negen patiënten kon men hierop niet onderzoeken omdat de uitrusting voor deze test niet beschikbaar was. Uiteindelijk kon men bij vijf van de zeven patiënten een groot inter-oculair verschil vaststellen tussen het geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde oog. Men gebruikte hiervoor zeer strenge criteria en dit resultaat is bijgevolg significant. Een resultaat werd pas positief bevonden wanneer het verschil meer dan drie keer de standaarddeviatie (SD) van het gemiddelde interoculair verschil bij mensen met normaal zicht overtrof. De toename in gevoeligheid was vooral opmerkelijk bij de jongste personen.(76) Bij elf van de twaalf proefpersonen werden de pupilreflexen getest en bij alle elf patiënten zag men een verbetering van deze reflexen. Er werd een significant verschil waargenomen tussen het geïnjecteerde en controle-oog qua amplitude en snelheid van constrictie van de pupil. Bij baseline was de respons op een flauwe stimulus (<0.04 lux, na 40 minuten donker adaptatie) te verwaarlozen. Na de ingreep zag men een
34
Resultaten toename van op zijn minst 2 log eenheden. Het effect van de injectie met virale vectoren op de pupilreflexen bleef gedurende de follow-up stabiel.(76) De uiteindelijke gevoeligheid van het geïnjecteerde oog correleerde met leeftijd (Spearman correlatie coëfficiënt (r) =-0.80, p=0.002) en baseline gevoeligheid (r=0.50, p=0.09). Gedurende de follow-up stelde men vast dat er steeds zwakkere lichtstimuli nodig waren om activiteit te kunnen waarnemen. En in de analyse van de correlatie tussen leeftijd en die dalingen in intensiteit, vond men r=-0.61 (p=0.03). Dit wijst erop dat jongere individuen meer kans hebben om finaal een grotere toename in gevoeligheid te bekomen met een injectie met AAV2-hRPE65v2. Deze resultaten kon men niet aantonen in het controle-oog.(76) Een full-field scotopisch en fotopisch ERG vertoonde zowel voor als na de ingreep een vlak patroon en toonde geen verschil aan. Bij het multifocale ERG daarentegen kon men wel tekenen van activiteit van de retina registreren. Omwille van nystagmus bij de meeste patiënten kon men enkel bij patiënt NP15 (high dose) pre- en postoperatief, en bij patiënten NP04 en CH09 (beide medium dose) postoperatief dit onderzoek doen. Men kon ook vaststellen dat de amplitude van de nystagmus bij de meeste daalde na de ingreep, en dit is een argument voor verbetering van fixatie van het studie-oog. In tegenstelling tot het full-field ERG zag men bij patiënt NP15 op dag 30 fotopische signalen in één deel van de retina en op dag 60 en 90 in meerdere delen van de retina. Ook bij de twee andere patiënten (NP04 en CH09) kon men activiteit waarnemen in één deel van de retina. Een verklaring waarom bij multifocale ERG wel en bij full-field ERG geen activiteit werd waargenomen, ligt waarschijnlijk in het feit dat de totale behandelde oppervlakte te klein is om een grote elektrische respons op te wekken die zichtbaar zou zijn op full-field ERG.(76) Een laatste test om de werkzaamheid van de subretinale injectie met drie verschillende dosissen te onderzoeken, is het afleggen van een gestandaardiseerd hindernissenparcours zowel pre- als postoperatief. Dit werd beoordeeld aan de hand van het aantal fouten en de tijd die nodig was om het parcours af te leggen. Voor de toediening van de virale vector hadden 11 van de 12 patiënten grote moeite om het parcours af te leggen, zeker bij zwak verlichte omstandigheden. Patiënt NP04 werd niet onderworpen aan deze test bij weinig omgevingslicht. Na de behandeling zag men bij vier kinderen (3 met medium dose, 1 met high dose) een substantiële verbetering in hun loopvaardigheid over het parcours wanneer ze hun onbehandelde oog afdekten. Ze maakten minder fouten en legden het parcours sneller af dan bij baseline. Wanneer hun behandelde oog werd afgedekt, konden ze veel minder nauwkeurig het parcours afleggen.(76) Uit de resultaten van deze dose-escalation trial kan men concluderen dat eerst en vooral de veiligheid van deze vorm van therapie met hogere dosissen niet in het gedrang komt. Enkel met PCR kon enige hoeveelheid virale vector in het bloed aangetoond worden bij twee patiënten met uitgebreide retinale degeneratie. Dit veronderstelt dat er een transiënte systemische blootstelling kan optreden na de toediening van een hoge dosis of bij patiënten met een uitgebreide retinale atrofie. Daarom is het aangewezen om in toekomstige studies geen dosissen te gebruiken met meer dan 1.5x1011 vectoren per injectie, omdat men in deze studie eventueel het plafond van de veilige dosissen heeft bereikt. Daarnaast ondersteunen de resultaten over de werkzaamheid de hypothese dat het antwoord op subretinale gentherapie afhangt van de uitgebreidheid van
35
Resultaten de retinale degeneratie en dus ook van de leeftijd van de patiënt. Het meest opmerkelijke in deze studie is de capaciteit van een aantal kinderen om na behandeling onafhankelijk en accuraat een hindernissenparcours af te leggen, zelfs in duistere omstandigheden. Als besluit kan men stellen dat de objectieve tests het subjectieve gevoel van de patiënten bevestigt. De objectieve en subjectieve resultaten van deze studie ondersteunen de hypothese dat de beste resultaten verkregen worden bij de jongste patiënten. Naast hun betere baselinewaarden ziet men ook een grotere vooruitgang in de resultaten. Waarschijnlijk zal het niet mogelijk zijn om ooit met deze vorm van therapie een volledig normaal zicht (20/20) te reconstrueren. Dit valt te verklaren door het amblyope effect van de congenitale nystagmus. Gezichtsscherpte is echter slechts een onderdeel van de totale retinale/visuele functie en de vooruitgang die geboekt wordt in de andere gebieden maken deze vorm van therapie zeker en vast nuttig. Bij sommige onderzoeken zag men na de behandeling een bilaterale toename van de visuele functie. Hiervoor zouden er drie mogelijke verklaringen zijn. [1] Ten eerste zijn full-field tests zoals microperimetrie subjectief en is het mogelijk dat door een leereffect de resultaten stelselmatig verbeteren. [2] Een tweede verklaring is dat de verbetering van nystagmus in het studie-oog zou kunnen resulteren in een toegenomen functie van het controle-oog. [3] Een laatste verklaring voor de bilaterale vooruitgang is de verandering van hoe het visuele signaal verwerkt wordt (plasticiteit van het centraal zenuwstelsel). Deze verandering in signaalverwerking zou effect kunnen hebben op het visuele resultaat van het controle-oog. Uiteindelijk kan men besluiten dat de werkzaamheid van de subretinale toediening van virale vectoren met RPE65 nog meer zal toenemen wanneer men de injectie plant nog voordat de retinale degeneratie de kans heeft gehad om verder te vorderen.(76;77)
2. Kleurenblindheid en Achromatopsie 2.1.
Kleurenblindheid: Doodskopaapjes
Mancuso et al. publiceerde in 2009 een studie in Nature over gentherapie voor rood-groen kleurenblindheid bij volwassen doodskopaapjes en haalden hiermee wereldwijd het nieuws. Overal werd zeer veel aandacht besteed aan de hoopvolle resultaten van deze studie. Mancuso et al. was de eerste groep die gentherapie toepaste bij primaten bij wie alle fotoreceptoren intact en gezond waren waardoor het volle potentieel van gentherapie kon beoordeeld worden.(53) Kleurenblindheid komt regelmatig voor bij apensoorten die leven in de Nieuwe Wereld, zoals de doodskopaapjes (Saimiri sciureus). Zij hebben niet de drie kegeltjespigment genen die mensen doorgaans wel hebben. Zij missen het L-opsine gen en bijgevolg zijn alle mannelijke en sommige vrouwelijke doodskopaapjes dichromaten. Het is belangrijk voor de interpretatie van de resultaten van dit onderzoek om te vermelden dat de studie gebeurde bij volwassen dieren en niet bij jonge onvolgroeide soortgenoten. Het doel van de studie was om via subretinale injecties met een virale vector die het L-opsine gen bevat, van de dichromate aapjes trichromaten te creëren om zo eventueel later een vergelijkbare techniek toe te passen bij mensen met kleurenblindheid of achromatopsie.(53;54) Als vector gebruikte men rAAV2/5 die het humane L-opsine gen bevat. De transcriptie van dit gen stond onder controle van de L/M-opsine enhancer en promotor. Deze regulerende componenten werden zo gekozen dat voornamelijk in de M-kegeltjes en niet in de S-kegeltjes of staafjes, transcriptie en expressie konden gebeuren. Om de virale vector ter plaatse te
36
Resultaten brengen, maakte men gebruik van drie subretinale injecties van 100 µl, met een totaal van 2.7 x 1013 virale partikels, in elk oog.(53) In totaal brachten 15 à 36% van de M-kegeltjes het transgen tot expressie.(52;53) Nog voor de behandeling werden de apen getraind om een aan dieren aangepaste en computergestuurde kleurenzien-test, de Cambridge Colour Test, uit te voeren. Dichromaten die het L- of M-fotopigment ontbreken, kunnen namelijk onmogelijk kleuren in de buurt van het zogenaamde ‘spectraal neutraal punt’ in de blauw-groene regio (golflengte 490 nm) van grijs onderscheiden. Dat geldt ook voor complementaire kleuren in de buurt van het ‘extraspectraal neutraal punt’ in het rood-paarse gebied (golflengte 499 nm). Dichromaten kunnen maar 2 kleuren onderscheiden: blauw en geel. Voor de toediening van de virale vector werden 2 dichromate apen onderworpen aan de kleurenzien-test met 16 verschillende kleurtinten. Zoals voorspeld, werden blauwe en gele kleren goed onderscheiden, maar werden kleuren in het blauw-groene en rood-paarse gebied zeer moeilijk of niet herkend.(53) Nadat de subretinale injecties werden toegediend, bracht een gedeelte van de M-kegeltjes het L-opsine tot co-expressie. Hierdoor zou de spectrale gevoeligheid zich verplaatsen en zou er reactie ontstaan op licht uit het lange golflengte gebied. Op die manier zouden er twee verschillende soorten kegeltjes ontstaan die licht absorberen van midden tot lange golflengte, wat noodzakelijk is voor trichromatie. Om dit aan te tonen, werd gebruikt gemaakt van een op maat gemaakte wide-field kleuren multifocaal elektroretinogram (mf-ERG). Met deze techniek kon men bewijzen dat sommige kegeltjes het L-opsine tot expressie brachten en dat subretinale gentherapie de spectrale gevoeligheid kon veranderen bij een gedeelte van de kegeltjes.(53;54) Die verandering in spectrale gevoeligheid verandert mogelijks het kleurenzicht gedrag en daar zijn twee mogelijke verklaringen voor: [1] er zou een toename zijn van de gevoeligheid voor licht uit het lange golflengte gebied. Maar als het neurale circuit voor de extractie van kleureninformatie achter de aangeboren M+ L-kegeltjes ontbreekt, dan zouden deze apen dichromatisch blijven. [2] Een tweede, meer logische, verklaring zou zijn dat de behandeling in staat is om de sensorische capaciteit uit te breiden, waardoor trichromatisch kleurenzicht verworven wordt.(53) De apen werden dagelijks getest met de kleurenzien-test en na ongeveer 20 weken postoperatief zag men een verbetering in de tresholds voor blauw-groen en roodpaars. Dit was een teken dat ze stilaan trichromatisch zicht verwierven. Dit tijdstip komt overeen met meetwaarden van hoge expressieniveaus van het transgen.(53;54) De verandering in spectrale gevoeligheid, die men kon waarnemen met mf-ERG, is noodzakelijk, maar daarom niet voldoende om een nieuwe vorm van kleurenzicht te creëren. Om er zeker van te zijn dat de geobserveerde gedragsverandering bij de behandelde doodskopapen (met het L-pigment transgen) niet enkel het gevolg is van een shift in de spectrale gevoeligheid werden twee aapjes getest op respectievelijk dominante golflengtes 496 en 500 nm en anderzijds 496 en 507 nm. Deze dominante golflengtes overspannen samen de mogelijke verwarringspunten voor deuteranopen (enkel L-kegeltjes) en protanopen (enkel M-kegeltjes) en voor elke intermediaire dichromatische vorm die zou kunnen ontstaan door de expressie van combinaties van L- en M-pigmenten. Bij beide apen kon men zien dat de gemeten tresholds voor deze extra kleurtinten gelijk waren aan de tresholds voor de dominante golflengte 490 nm. Dit toonde aan dat een spectraal neutraal punt nu ontbrak en ze volledig trichromatisch geworden waren. De behandelde
37
Resultaten aapjes waren zelfs in staat om blauw-groen (490 nm) te onderscheiden op een achtergrond van rood-paars (499 nm). De positieve resultaten in verband met het kleurenzicht die men met deze studie behaalde, bleven meer dan twee jaar lang stabiel en de apen werden verder opgevolgd om de lange termijn effecten te evalueren.(53) Uit de resultaten van de studie van Mancuso et al. kon men concluderen dat volwassen doodskopaapjes door middel van retinale gentherapie met een virale vector met L-opsine, een nieuw vermogen hadden om kleuren waar te nemen die voordien onwaarneembaar waren. Gentherapie verandert de spectrale gevoeligheid van een deel van de kegeltjes. Vroeger dacht men dat er aanpassingen zouden nodig geweest zijn in de evolutie of ontwikkeling van het oog om dichromatie om te vormen tot trichromatie, bovenop het aanbrengen van een derde kegeltjessoort. De resultaten uit deze studie daarentegen tonen aan dat trichromatisch kleurenzicht niets meer vereist dan een derde kegeltjessoort. Omdat deze proeven werden uitgevoerd bij een volwassen populatie en trichromatisch zicht verworven werd gelijktijdig met de expressie van L-opsine, kan men besluiten dat dit proces van trichromatie gebruik maakt van de bestaande neurale schakelingen zonder enige verandering aan het visueel systeem.(52-54) 2.2.
Achromatopsie
Omdat channelopathies bij de mens de meest frequente oorzaak (70-92%) zijn van achromatopsie, leek het zeer interessant om onderzoek over dit onderwerp in deze masterproef te verwerken. Er worden twee studies gebruikt om het effect van gentherapie bij de twee verschillende subtypes (veroorzaakt door mutaties in CNGB3 en CNGA3) te illustreren. Bij de eerste studie wordt gebruik gemaakt van een hondenmodel (met CNGB3-mutaties) en bij de tweede studie werden muizen (met Cnga3-mutaties) gekozen als model voor de aandoening.(57;59) 2.2.1. Hondenmodel: CNGB3-mutaties Komáromy et al. gebruikten twee onafhankelijke hondenmodellen (Alaskan Malamute en Duitse Kortharige Pointer) om het potentieel effect van gentherapie bij achromatopsie op het frequentst gemuteerde gen bij de mens (namelijk CNGB3, 50-87%) te onderzoeken. In totaal werden 33 honden geselecteerd voor deze studie. Negen van hen hadden een missense mutatie in exon 6 (CNGB3m/m) en de overige 24 hadden een genomische deletie (CNGB3-/-, ‘nul allel’). De karakteristieken van deze laatste vorm komen overeen met het fenotype bij humane patiënten. Als virale vector werd geopteerd voor rAAV5 met verschillende vormen van de humane promotor voor het L-opsine. Vijfentwintig honden (19 met CNGB3-/- en 6 met CNGB3m/m) kregen een subretinale injectie met een therapeutisch of reporter gen. Meestal werd slechts één oog geïnjecteerd en diende het andere oog als controle. Bij alle honden lag het therapeutisch gebied in het tapetum, waar zich een grote concentratie aan kegeltjes bevindt. Het ingebracht volume varieerde tussen 60 en 190 µl en de concentratie vector genomen bedroeg 1012/ml. Tien ogen (bij 8 honden) werden geïnjecteerd met vergelijkbare volumes van een gebalanceerde zoutoplossing (BSS) om het placebo-effect van subretinale behandeling te evalueren.(57)
38
Resultaten In tegenstelling tot mensen en primaten, die afzonderlijke soorten kegeltjes hebben, zijn honden functionele dichromaten. Ze hebben S-kegeltjes en gecombineerde L/M-kegeltjes. In het geselecteerde therapeutisch gebied komen deze laatste acht keer zoveel voor als de S-kegeltjes. Vanaf een leeftijd van acht weken zijn alle honden met een mutatie in of een deletie van CNGB3 blind. Er is geen kegeltjes-gemedieerde functie, maar de staafjesactiviteit is wel normaal. Ondanks het verlies van functie, zijn de kegeltjes wel aanwezig en maken ze specifieke merkers aan. Wel merkt men dat er in het verloop van de tijd meer kegeltjes verloren gaan en dus is het tijdsbestek waarbinnen gentherapie kan gebeuren ook van belang voor het onderzoek.(57) Om het onderzoek te laten slagen, was het van belang om eerst na te kijken of de mutante kegeltjes konden getransduceerd worden door virale vectoren met reporter onderdelen en promotoren afgeleid van L/Mkegeltjes. Hiervoor gebruikte men rAAV5 en verschillende versies van de humane L-opsine promotor om het groen fluorescent proteïne (GFP) gen tot expressie te brengen in de L/M-kegeltjes. De expressie van het gen was doelgericht naar de onfunctionele L/M-kegeltjes in de CNGB3-mutante retina en de graad van expressie was promotor afhankelijk. In deze studie waren drie verschillende promotoren voorhanden (van kort naar lang): PR0.5, 3LCR-PR0.5 en PR2.1. Enkel de laatste twee werden geëvalueerd met het GFP reporter gen. Bij het gebruik van PR2.1 zag men een sterke expressie van GFP, in tegenstelling tot de kortere 3LCR-PR0.5 waarbij een zwakkere expressie te zien was. Belangrijk om te vermelden is dat de transductie van de kegeltjes enkel gebeurde in de regio van de subretinale bleb en dat de expressie van GFP snel afnam voorbij de rand van de bleb. De humane S-opsine promotor werd niet gebruikt in dit onderzoek omdat in een vorige studie was ondervonden dat de expressie niet specifiek was (zowel in L/M-kegeltjes, staafjes en RPE, maar niet in S-kegeltjes).(57) Nadat gebleken was dat de virale vectoren specifiek de L/M-kegeltjes transduceerden, kon men overgaan tot het eigenlijke doel van de studie. Door middel van één enkele subretinale injectie bracht men de rAAV5 vector in met het humane CNBG3 transgen. Het resultaat van deze ingreep werd door een flicker-ERG gemeten en geobjectiveerd. Dit ERG gaf aan dat de behandeling de kegeltjesfunctie herstelde en follow-up toonde dit positief resultaat over meer dan één jaar. De langste periode van opvolging duurde ongeveer 2.5 jaar (130 weken) en de positieve resultaten bij follow-up deden vermoeden dat de verbetering stabiel en waarschijnlijk permanent is. Er werd geen verschil waargenomen tussen de resultaten voor CNGB3m/m en CNGB3-/-.(57) Wat de promotoren betreft, zag men dat efficiënt en constant herstel van de kegeltjes niet kon behaald worden met de twee kortere promotoren (PR0.5 en 3LCR-PR0.5). Met PR0.5 bekwam men in 1 van de 2 behandelde ogen een transiënt herstel van de functie en bij 3LCR-PR0.5 zag men bij 2 van de 7 ogen een voorbijgaand herstel. Bij beide promotoren was er na drie weken activiteit zichtbaar op ERG, maar die verdween opnieuw na 13 weken. Met de langste promotor (PR2.1) werd een robuust en stabiel herstel waargenomen bij 12 van de 17 ogen en eens de kegeltjesfunctie was hersteld, bleef deze stabiel. Naast de invloed van de gebruikte promotor, zag men ook de invloed van de leeftijd van het onderzochte dier. Slechts bij 1 op 3 ogen bij honden ouder dan 54 weken was er een duidelijk herstel van de functie met de PR2.1
39
Resultaten promotor. Daarentegen reageerden 11 van de 14 ogen positief op de behandeling bij honden jonger dan 28 weken.(57) Zowel bij de subretinale toediening van de GFP-vectoren als bij de vectoren met BSS werd geen recuperatie van de kegeltjesfunctie gedetecteerd. Hierdoor kon het placebo-effect van de injectie op zich uitgesloten worden en was dit een indicatie dat het herstel van de kegeltjesfunctie volledig toe te wijten was aan de aanwezigheid van hCNGB3 in de vector.(57) Naast de elektrofysiologische bevindingen over de kegeltjesfunctie werden zeven honden geselecteerd om kwalitatief en kwantitatief de mobiliteit te testen in een hindernissenparcours. Zes van hen werden behandeld met PR2.1 en één met PR0.5. Als objectieve parameter werd de duur voor het afleggen van het parcours genomen. Men zag een significante daling (p<0.01) van de gemiddelde benodigde tijd bij de behandelde honden bij een lichtintensiteit van 25 lux of meer. De waarden kwamen zelfs in de buurt van die van normale controlehonden, alhoewel iets trager. Dit blijvend verschil werd ook verwacht vermits normale honden binoculair goed zien en bij de geïnjecteerde honden slechts in één oog ongeveer 30% van de retina werd behandeld. Ondanks dit feit zijn de overeenkomsten in mobiliteit zeer opmerkelijk(57) Door middel van kwantitatieve real-time PCR onderzocht men in alle geanalyseerde retina’s de expressie van het hCNGB3. De sterkte van expressie bij PR2.1 bevestigde de bevindingen met GFP. In behandelde ogen die geen (blijvend) herstel van de kegeltjesfunctie vertoonden, lag de expressie van hCNGB3 3.6 tot 150 keer lager in vergelijking met succesvol behandelde ogen. Dit betekent dat de expressie een bepaald niveau moet overschrijden om de functie van de kegeltjes te kunnen herstellen. Wanneer de expressie van het transgen vergeleken werd met de amplitude op het ERG vond men een hoogst significante Spearmancorrelatie van 0.85 (p<0.0001) wat betekent dat hoe meer expressie er is, hoe hoger de amplitude zal zijn.(57) Als conclusie kan men stellen dat gentherapie met rAAV5-hCNGB3 de retinale functie van kegeltjes herstelt bij twee hondenmodellen voor CNGB3-achromatopsie en waarschijnlijk is dit permanent. De recuperatie werd aangetoond door een ERG specifiek voor kegeltjes en door het herstel van het zicht overdag. De verbetering van de functie is onafhankelijk van de soort mutatie, maar wel promotor- (de langste, PR2.1) en leeftijdsafhankelijk. Omdat mutaties in CNGB3 de frequentst voorkomende oorzaak zijn van achromatopsie bij mensen, geven deze resultaten veel hoop voor toekomstige klinische studies.(57) 2.2.2. Muizenmodel: Cnga3-mutaties Als tweede diermodel voor een channelopathy als oorzaak voor achromatopsie wordt een Cnga3-/muismodel beschreven. Michalakis et al. onderzochten of ze via een subretinale injectie met virale vectoren deze muizen terug konden laten zien. Als vector gebruikte men rAAV5 met de muizen S-opsine promotor met mCNGA3 cDNA om de kegeltjesfunctie te herstellen. Met een subretinale injectie van 1 à 1.5µl werden 6-9x109 virale partikels ingebracht bij 12 tot 14 dagen jonge Cnga3-/- muizen. De procedure werd onmiddellijk opgevolgd door scanning laser oftalmoscopie en OCT.(59)
40
Resultaten Dit onderzoek was voor deze groep een hele uitdaging omdat men op dat moment nog geen inzicht had in het gedrag van een ‘ziek’ kegeltjessysteem. Het was onduidelijk of een OS-ionkanaal functioneel tot expressie kon komen in de onfunctionele, morfologisch aangetaste en degenererende Cnga3-/--kegeltjes. Daarnaast wist men ook niet of dat de enorme deregulatie van de signaalcascade van de kegeltjes volledig kon worden hersteld en zou reageren op lichtstimuli. En als derde onderzoeksvraag vroeg men zich af of de aangetaste muizen deze nieuwe ‘zichtbare’ informatie kon gebruikt worden bij het gedrag dat geleid wordt door het zicht.(59) Tien weken na de behandeling zag men een duidelijk functioneel herstel van de kegeltjes op ERG. Bij zwak licht was er geen verschil tussen behandelde, onbehandelde en wild-type ogen wat wijst op een normale staafjesfunctie. Onder fotopische omstandigheden werd echter een duidelijk hersteleffect van de kegeltjes waargenomen. Naast de standaard scotopische en fotopische omstandigheden werd ook nog een 6Hz scotopisch flicker ERG verricht. Met toenemende stimulus intensiteit zorgt dit voor een transitie van staafjesnaar kegeltjesactiviteit. Bij toenemende intensiteit zag men een progressief verschil tussen behandelde en onbehandelde ogen en dit betekent dus dat er een functioneel voordeel ontstond na behandeling. Bij hoge intensiteiten, wanneer de staafjesfunctie zo goed als afwezig is, was het behandelingseffect bijzonder voor de hand liggend. Als laatste werd ook nog een ERG verricht met een vaste lichtintensiteit maar nu met een variërende frequentie van flitsen. Hiermee kan men op een betrouwbare manier een onderscheid maken tussen staafjes- en kegeltjesactiviteit. Met toenemende frequentie wordt het deel van de kegeltjes in het antwoord op een lichtstimulus steeds belangrijker en vanaf 5 Hz wordt het antwoord alleen maar opgebouwd door de kegeltjes. Op dit ERG zag men dat de behandeling met gentherapie voor een substantiële verbetering zorgde bij Cnga3-/- muizen.(59) Om deze conclusies te substantiëren, werden de ogen verwijderd, gefixeerd, in coupes gesneden en verwerkt voor immunohistologie. In het geïnjecteerde deel van de retina vond men expressie van Cnga3, maar niet in het onbehandelde deel. Men kon hieruit opmaken dat één enkele injectie (1 à 1.5 µl) ongeveer 30% van de retina bedekt. Het proteïne werd voornamelijk aangetroffen in de OS van de kegeltjes, in vergelijkbare concentraties als wild-type. Het Cnga3-proteïne was ook in staat om de expressie en de lokalisatie van Cngb3 te herstellen in de OS van de kegeltjes. Dit veronderstelt de aanwezigheid van CNG-kanalen in de OS.(59) In het onbehandelde deel van de retina vond men door middel van cGMP-specifieke antilichamen een grote opstapeling van cGMP in de kegeltjes . Dit zou het resultaat zijn van de continue activatie van het guanylyl cyclase door Ca2+-vrij guanylyl cyclase geactiveerd proteïne (GCAP) in de Cnga3-/--kegeltjes. De expressie van Cnga3 zorgde voor een daling van het cGMP tot wild-type niveaus en dit geeft aan dat de Ca2+getriggerde feedback inhibitie van het guanylyl cyclase werd hersteld in de behandelde kegeltjes. Normaal ziet men bij retinale degeneratie de opregulatie van stress fibers (gliale fibrillaire zure proteïnen) door Müller gliale cellen. Maar de expressie van Cnga3 zorgde voor een daling van het aantal stress fibers, wat veronderstelt dat dit de degeneratie kan vertragen. Dit blijkt ook door het hoge aantal kegeltjes dat men nog vindt bij de behandelde dieren in vergelijking met onbehandelde controledieren.(59)
41
Resultaten Op ERG kon men aantonen dat de behandelde kegeltjes terug in staat waren om door licht uitgelokte signalen op te wekken en de bipolaire cellen op een normale manier te exciteren. Verder werd onderzocht of deze signalen in staat waren om de ganglioncellen op een normale wijze te exciteren. Hiervoor werden multielectrode array metingen uitgevoerd op geïsoleerde retina’s van behandelde en onbehandelde ogen. Zoals verwacht zag, men bij de onbehandelde retina’s (en dus enkel met een staafjesfunctie) een goede reactie bij scotopische omstandigheden, en geen enkele activiteit onder fotopische omstandigheden. Bij de behandelde zag men zowel bij zwakke als sterke belichting fikse activiteit. Drieëndertig van de 46 gemeten ganglioncellen (van drie retina’s) vertoonden duidelijke piekactiviteit onder fotopische lichtomstandigheden. Dit toonde aan dat de transmissie van signalen van de kegeltjes naar de binnenste lagen van retina werd hersteld.(59) Als laatste werd het gedrag beoordeeld dat beïnvloed wordt door het verwerken van informatie die men haalt uit het zicht. Hiervoor werd een simpele test ontwikkeld die vooral uitgaat van het kegeltjeszicht onder fotopische omstandigheden. Op dag 1 werden de muizen getraind om in een waterbak een rood voorwerp te associëren met een stabiel platform. Op dag 2 leerden de muizen onderscheid maken tussen twee willekeurig geplaatste platformen. Datgene met een rood voorwerp was stabiel, terwijl datgene met een groen voorwerp zonk van zodra de muis er trachtte op te kruipen. Wild-type muizen (n=12) waren in staat om op basis van het verschil in kleur een onderscheid te maken en volbrachten de opdracht met een significantie boven het kansniveau (76.4 ± 4.3% correcte keuzes, p=0.003). Het feit dat voor deze taak kegeltjes-gemedieerd zicht nodig is, werd bevestigd door de onbehandelde Cnga3-/- muizen (n=12) die deze taak niet tot een goed eind konden brengen. Zij presteerden niet significant beter dan het 50% kansniveau (55.6 ± 3.7%, p=0.328). Behandelde muizen (n=7) presteerden significant beter (73.8 ± 5.0%, p=0.009) dan hun onbehandelde soortgenoten en er was zelfs geen significant verschil met de wild-type controles (p=0.711). Dit bevestigt dat gentherapie volstaat om het gedrag op basis van het kegeltjeszicht te herstellen.(59) Samengevat toonden Michalakis et al. met deze studie aan dat het mogelijk is om met virale gentherapie het voornaamste onderdeel (Cnga3) van het CNG-kanaal te laten produceren in congenitaal dysfunctionele kegeltjes bij Cnga3-deficiënte muizen. Dit resulteerde in het herstel van normale expressie van het modulerende onderdeel (Cngb3) van het CNG-kanaal en assemblage van dit kanaal op de juiste plaats in de OS van de kegeltjes. De metingen in retinale ganglioncellen in combinatie met de data over het gedrag zorgen voor het duidelijk bewijs dat retina’s met compleet dysfunctionele kegeltjes vanaf de geboorte, kunnen getransformeerd worden zodanig dat ze signalen kunnen opwekken die hogere visuele centra kunnen verwerken op een zodanige manier dat het dier in staat is om succesvol objecten te onderscheiden op basis van informatie die de kegeltjes ontvangen en bijgevolg actie ondernemen. Dit resultaat is veelbelovend en relevant voor toekomstige therapeutische toepassingen bij de mens.(59)
42
Discussie
Discussie 1. LCA2 – RPE65 De resultaten van de originele Proof of Concept en follow-up studie bij de Briard honden van Acland et al. zorgden voor heel wat hoop en geloof in de genezing van mensen met LCA2. Deze studie toonde aan dat één enkele injectie in deze jonge honden met LCA2 leidde tot een subjectieve en objectieve visusverbetering. De behandeling zorgde voor een stabiele omkering van de blindheid. Een bijkomend belangrijk gegeven is dat immunologisch en histologisch kon aangetoond worden dat de gentransfer met AAV2 volledig veilig verliep. Omdat de resultaten van Acland et al. zo hoopvol waren en deze vorm van therapie ook veilig bleek te zijn, durfde men het aan om bij mensen voor het eerst gentherapie in het oog toe te passen. Drie onafhankelijke studiecentra (onder leiding van Bainbridge, Maguire en Bennett, en Hauswirth) publiceerden de bevindingen van dit pionierswerk. Wat heeft men geleerd uit en wat kan men besluiten uit deze drie onafhankelijke studies over monoculaire subretinale gentherapie bij negen jongvolwassenen met LCA2 ? Er was bij geen enkele patiënt evidentie voor systemische toxiciteit door de subretinale injectie van de virale vector. Er was grote bezorgdheid over de mogelijke immuunrespons van het lichaam omwille van negatieve ervaringen in vroegere trials. Daarom onderzocht men bij de drie studies humorale immuunreacties tegen AAV2 en werd er getest voor een T-cel gemedieerde reactie. Bij geen enkel individu vond men een positief resultaat, wat de onderzoekers en de hele medische wereld geruststelde. Enkel de ASR-test die enkel in het onderzoek van Hauswirth et al. werd gebruikt, gaf bij één patiënt na 90 dagen een stimulatie-index die net de grenswaarde van significantie overschreed. Deze waarde was wel maar licht gestegen ten opzichte van baseline en de relevantie hiervan blijft tot op heden onduidelijk. Het is evenwel niet verwonderlijk dat er zo goed als geen immuunactiviteit optreedt, gezien de kleine dosissen die men heeft toegediend. Bij non-oculaire gentherapiestudies met rAAV2-vectoren gebruikt men doorgaans 2 tot 4-maal hogere dosissen. Men kan dus stellen dat bij deze lage dosissen het gebruik van subretinale gentherapie met AAV2 relatief veilig is wat betreft de immuunreactie. Verder onderzoek is dus nodig naar de veiligheid bij hogere dosissen (zie Dose-Escalation Trial). Er traden bij twee van de negen patiënten retinale complicaties op. In de studiegroep van Maguire et al. zag men bij één patiënt een maculaire holte optreden. Waarschijnlijk was deze het gevolg van de contractie van een vooraf bestaande epiretinale membraan, maar er zouden ook nog andere factoren een rol gespeeld hebben in het ontstaan ervan. Bij één patiënt in de studie van Hauswirth et al. werd via OCT een verdunning van de fovea vastgesteld. Bij deze twee patiënten met retinale complicaties was de plaats van de retinotomie op zo’n 1 à 1.5 mm verwijderd van de fovea, en kwam de fovea in contact met de vector. Bij vier andere patiënten waarbij de fovea blootgesteld werd aan de vector door injectie, werd de retinotomie op grotere afstand verricht van de fovea. Een retinotomie dicht bij de fovea zou een risicovolle strategie zijn en de foveale integriteit kunnen verstoren. Dit is een belangrijke bevinding die zeker moet meegenomen worden bij verder onderzoek.
43
Discussie Een cruciale vraag voor verdere klinische studies in LCA2 handelt over hoe de resultaten van deze drie studies gerelateerd kunnen worden aan hun respectievelijke toegediende vectortiters. Jammer genoeg zijn er op zijn minst een viertal onzekerheden die direct in verband staan met de vector op zich, die het maken van duidelijke conclusies ernstig in de weg staan. [1] Ten eerste produceerde, zuiverde en titreerde elke onderzoeksgroep zijn eigen vector in een andere instelling, waarbij men gebruik maakte van verschillende protocollen zonder dat hiervoor een standaardprocedure werd afgesproken. Aldus kan elke opgegeven titer niet blindelings vergeleken worden met de andere twee. [2] Ten tweede was het gebied van het RPE dat blootgesteld werd aan de vector, niet identiek in de drie studies of zelfs niet met zekerheid geweten. Dit is noodzakelijk om de effectieve “multipliciteit van infectie” van de virale partikels per RPE-cel in te schatten. De studies van Maguire et al. en die van Hauswirth et al. zouden op basis van het geïnjecteerde volume (0.15 ml) kunnen vergeleken worden, maar hun respectievelijke dosis verschilde met ongeveer een factor 4 (respectievelijk 1.5x1010 en 5.96x1010). In de studie van Bainbridge et al. gebruikte men een groter injectievolume (1 ml) en ook een grotere dosis virale vectoren (1.0x1011). Daarenboven werd bij deze studie de gecreëerde bleb verplaatst door gebruik te maken van gas om zo de fovea te bedekken met virale vectoren. Op die manier werd een ongekend deel van de retina blootgesteld aan de vector en verminderde de vectortiter in de verplaatste bleb door binding aan het RPE en fotoreceptoren in het oorspronkelijk losgemaakte gebied en in het gebied waarover de bleb werd verplaatst. Dus is het zeer moeilijk om de uiteindelijke dosis vectoren op de finale locatie in te schatten. [3] Ten derde was elke vector van de drie studies opgebouwd uit verschillende regulerende elementen die de expressie van het humaan RPE65 cDNA controleren. Aangezien de relatieve transcriptionele niveaus niet gekend zijn, kan men niet zomaar de relatieve expressie beoordelen. [4] Het vierde en laatste element van onzekerheid is de grote variatie in visuele functie bij aanvang voor iedere cohorte patiënten in elke onderzoeksgroep. Het stadium van degeneratie zou aan de basis kunnen liggen van een grote variatie in de verhouding van het aantal RPEcellen ten opzichte van het aantal fotoreceptoren, en zou een significant verschil kunnen veroorzaken in de interactiemogelijkheden van de vectoren met het RPE. Het onderzoek naar de werkzaamheid van subretinale gentherapie in deze eerste studies, die primair de veiligheid onderzochten, was slechts een secundair doel. Maar dit werd wereldwijd wel met grote aandacht gevolgd, zeker door diegenen die op zoek waren naar een behandeling voor ongeneeslijke erfelijke retinale degeneraties. De standaard outcome bij oculaire studies is de gezichtsscherpte en dat is bij deze studies niet anders. Bij geen enkele van de negen patiënten kon men een toename van de gezichtsscherpte aantonen, ondanks het feit dat bij zes van de negen individuen de fovea werd blootgesteld aan de vector. De onderzoeksgroep van Maguire et al. was de enige die een verbeterde gezichtsscherpte kon rapporteren. Maar de drie patiënten in deze studie hadden wel de slechtste gezichtsscherpte van allemaal bij baseline en na follow-up bleef deze zelfs nog onder het baseline niveau van de andere patiënten. Het feit dat het ontstaan van een maculaire holte geen significant effect had op de toename van de gezichtsscherpte bevestigt de conclusie dat deze patiënten voordien een extreem verlies van gezichtsvermogen hadden en dat ze na de therapie nog steeds een slecht, maar minder extreem gezichtsverlies hadden. De vraag die men zich hierbij stelt, is uiteraard wat de klinische betekenis daarvan is. Men suggereert zelfs dat de toename in
44
Discussie gezichtsscherpte door een placebo-effect zou kunnen verklaard worden. Bij lagere resoluties (typisch <20/200) wordt de gezichtsscherpte mede bepaald door de extrafoveale retina, wat hier een verklaring zou kunnen bieden voor de toename in scherpte. Een stijging van de visuele sensitiviteit para-of perifoveaal zou bijdragen aan de toename in gezichtsscherpte. Een andere referentie voor het meten van de werkzaamheid is de lichtgevoeligheid bij donkeradaptatie. In de groep van Bainbridge et al. werd slechts bij één patiënt een toegenomen gevoeligheid waargenomen. De drie patiënten uit de studie van Maguire et al. gaven aan dat ze subjectief een beter zicht hadden in donkere omstandigheden, maar sensitiviteitstesten werden niet gerapporteerd. In de cohorte van Hauswirth et al. gaven de drie patiënten aan dat er een verbeterd zicht was in het duister en de testen toonden bij hen een significante toename van de sensitiviteit aan. Maar geen enkele van de drie onderzoeksgroepen heeft aangetoond of de verbetering van de sensitiviteit staafjes- of kegeltjes-gemedieerd was. Dit vormt dan ook het onderwerp van verder onderzoek (zie artikel Cideciyan en Hauswirth et al.). Wat is de volgende stap in het klinisch onderzoek naar subretinale gentherapie bij personen met LCA2 ? Men concludeerde uit de drie initiële studies dat het ontbreken van sluitend bewijs omtrent werkzaamheid waarschijnlijk het gevolg was van het vergevorderde stadium van de ziekte. Daarom was er onderzoek nodig naar zowel het toedienen van hogere dosissen als subretinale gentherapie bij kinderen met LCA2. Ook is het belangrijk om verder de positieve en negatieve effecten van subretinale injecties op de structuur en functie van de retina te onderzoeken. Bij verdere follow-up van de negen patiënten die al behandeld zijn, moet de aandacht vooral gericht zijn op het identificeren van de precieze retinale lokalisatie van de positieve effecten, het meten van de grootte van het effect over de behandelde regio, het bepalen van het belang van de staafjes en kegeltjes in de resultaten, het vaststellen van de mogelijke relatie tussen de grootte van het effect en de integriteit van fotoreceptoren en het RPE, en het vinden van een volledige verklaring voor elke vorm van therapiefalen. Maguire en Bennett et al. en Hauswirth et al. verrichten na hun fase I studie nog follow-up onderzoek en de resultaten hiervan konden de eerder gevonden bevindingen bevestigen. Subretinale gentherapie voor LCA2 is veilig (op korte termijn) en kan positieve gevolgen hebben voor de patiënt. In de dose-escalation trial werden voor het eerst hogere dosissen gebruikt en werden ook kinderen onderworpen aan de therapie. De resultaten van deze studie waren over het algemeen positief en deze therapie bleek ook veilig te zijn. Men concludeerde dat het best is om bij volgende onderzoeken de dosis niet boven 1.5x1011 virale vectorkopijen op te drijven omdat er bij deze dosis toch transiënte systemische blootstelling voorkomt. Opmerkelijk was ook dat de resultaten bij kinderen zichtbaar beter waren dan bij volwassenen. Dit is een indicatie om verder onderzoek te doen bij nog jongere kinderen (baby’s en kleuters), wat voor een een moeilijk ethisch vraagstuk zorgt. Na het analyseren van deze studies mogen we stellen dat retinale gentherapie heel wat toekomst biedt aan patiënten met LCA2. Het is niet ondenkbaar dat binnen enkele jaren deze vorm van therapie de ‘standaard’ zal worden voor deze totnogtoe ongeneeslijke aandoening. Uiteraard is er nog verder onderzoek nodig om de
45
Discussie ingreep te optimaliseren en de werkzaamheid te garanderen. Men moet er wel rekening mee houden dat gentherapie op zich het zicht waarschijnlijk nooit volledig zal kunnen herstellen. LCA is een degeneratieve aandoening die al op vroege leeftijd begint. Door middel van gentherapie kan men enkel deze degeneratie stoppen of op z’n minst vertragen, eerder dan de volledige capaciteit terug opbouwen. Andere strategieën zoals celtransplantatie en stamceltherapie kunnen een complementaire rol spelen. Beide technieken kunnen ‘dode’ fotoreceptorcellen vervangen en hierdoor zou de volledige capaciteit kunnen hersteld worden. Het onderzoek naar deze therapieën staat echter nog in de kinderschoenen. Een preventieve optie waarvan op dit moment gebruik gemaakt kan worden wanneer het genetisch defect gekend is in een familie, is het prenataal genetisch onderzoek. Prenatale diagnostiek wordt aangewend voor het opsporen van genetische afwijkingen tijdens een zwangerschap. Indien het ongeboren kind eveneens homozygoot of compound heterozygoot blijkt te zijn voor de familiale mutaties, kan beslist worden om de zwangerschap af te breken. Het is echter een invasieve techniek. Een elegantere reproductie optie voor dit type aandoeningen is PGD. In vitro fertilisatie wordt uitgevoerd, embryo's worden in het 8-cellig stadium onderzocht, en enkel gezonde embryo's worden teruggeplaatst. Voordeel van deze techniek is dat er geen zwangerschapsinterruptie nodig is, nadeel is dat er per mutatie een ‘private’ test moet opgezet worden, en dat de wachttijden hierdoor erg lang kunnen zijn.
2. Kleurenblindheid en Achromatopsie De spectaculaire resultaten van de studie van Mancuso et al. had waarschijnlijk niemand durven dromen, maar wat is de relevantie hiervan voor de mens ? Het dagdagelijkse leven voor mensen met dichromatisch zicht verloopt immers zonder noemenswaardige problemen in vergelijking met mensen met trichromatisch zicht, ondermeer door een normale visus. Kleurenblindheid die voorkomt bij 5-8% van de mannen, en 1% van de vrouwen wordt niet als een echte ‘aandoening’ gezien. De kosten-baten van gentherapie met een subretinale injectie in deze aandoening moet dan ook in vraag gesteld worden. In de studie van Mancuso et al. kregen beide apen na de ingreep corticosteroïden, wat er eventueel op kan wijzen dat er inflammatie is geweest. Naast de veiligheid en de risico’s van deze therapie kan ook de kostprijs ter discussie gesteld worden.. In een bredere context geplaatst, biedt deze studie ook heel wat perspectieven voor alle aandoeningen die de kegeltjes aantasten, zoals achromatopsie. Mancuso et al. konden met hun studie aantonen dat ‘nieuwe’ signalen die de gewijzigde kegeltjes ontvangen probleemloos naar de visuele cortex worden overgebracht en dat de hersenen deze signalen perfect kunnen interpreteren. Deze conclusie druiste in tegen de algemeen aanvaarde gedachte dat neurale verbindingen die zich gevormd hebben tijdens de ontwikkeling, op een inadequate wijze nieuwe input zouden verwerken. De studie bij de doodskopaapjes, en later ook studies bij dierenmodellen van achromatopsie, konden dit weerleggen en aantonen dat het mogelijk is om het bestaande neuronale netwerk te herprogrammeren. Dit biedt heel wat positieve vooruitzichten voor aandoeningen zoals achromatopsie, kegeltjes- en staafjesdystrofie, retinitis pigmentosa en enkele maculopathieën (onder andere de ziekte van Stargardt).
46
Discussie
3. Conclusie Als conclusie kan men stellen dat retinale gentherapie veel potentieel heeft, maar dat dit niet direct op grote schaal in de klinische praktijk zal kunnen toegepast worden. LCA2 is immers een zeldzame aandoening, die evenwel een uitstekend testplatform vormde. Daarnaast zijn meerdere, vaker voorkomende, retinale aandoeningen gebaseerd op het dysfunctioneren van staafjes en/of kegeltjes in plaats van het RPE (zoals bij LCA2). Ondanks de mooie resultaten die bekomen werden in de studie met de doodskopaapjes werden naast het testen van diermodellen nog geen studies bij de mens ondernomen. De resultaten voor retinale gentherapie zijn veelbelovend en de verwachtingen hooggespannen. Wat de toekomst in petto heeft is niet bekend, maar men mag er zeker van zijn dat er nog veel staat te gebeuren!
47
Referenties
Referenties (1) Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM®. McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD). [ 2011 Available from: http://omim.org/. (2) Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics. 4 ed. London: Garland Science; 2010. (3) Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M, et al. T-Lymphocyte-Directed Gene-Therapy for Ada(-) Scid - Initial Trial Results After 4 Years. Science 1995 Oct 20;270(5235):47580. (4) [Anon]. Gene therapy deserves a fresh chance. Nature 2009 Oct 29;461(7268):1173. (5) Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivel NA, Bagg A, Gao GP, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Molecular Genetics and Metabolism 2003 Sep;80(1-2):148-58. (6) Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, Le Deist F, Wulffraat N, McIntyre E, et al. A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine 2003 Jan 16;348(3):255-6. (7) Molday R. Gene Therapy Success: LCA-RPE65 Trials. 2008; Vancouver: The Foundation Fighting Blindness; 2008. (8) Smith AJ, Bainbridge JW, Ali RR. Prospects for retinal gene replacement therapy. Trends in Genetics 2009 Apr;25(4):156-65. (9) Remington LA. Clinical Anatomy of the Visual System. St. Louis: Elsevier; 2005. (10) Sung CH, Chuang JZ. The cell biology of vision. Journal of Cell Biology 2010 Sep 20;190(6):953-63. (11) Purves D, Williams SM. Neuroscience. 2001;2nd ed. (12) Fain GL, Hardie R, Laughlin SB. Phototransduction and the Evolution of Photoreceptors. Current Biology 2010 Feb 9;20(3):R114-R124. (13) Yau KW, Hardie RC. Phototransduction Motifs and Variations. Cell 2009 Oct 16;139(2):246-64. (14) Leber T. Uber retinitis pigmentosa und angeborene amaurose. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 1869;15:1-25. (15) den Hollander AI, Roepman R, Koenekoop RK, Cremers FPM. Leber congenital amaurosis: Genes, proteins and disease mechanisms. Progress in Retinal and Eye Research 2008 Jul;27(4):391-419. (16) Franceschetti A, Dieterle P. L'importance diagnostique de l'electrorétinogramme dans les dégénérescences tapétorétiniennes avec rétrecissement du champ visuel et héméralopie. Confinia Neurologica 1954;14:184-6. (17) Kumaramanickavel G, Joseph B, Vidhya A, Arokiasamy T, Shridhara Shetty N. Consanguinity and ocular genetic diseases in South India: analysis of a five-year study. Community genetics 2002;5(3):182-5. (18) Kaplan J, Bonneau D, Frezal J, Munnich A, Dufier JL. Clinical and Genetic-Heterogeneity in RetinitisPigmentosa. Human Genetics 1990 Oct;85(6):635-42. (19) Bunker CH, Berson EL, Bromley WC, Hayes RP, Roderick TH. Prevalence of Retinitis Pigmentosa in Maine. American Journal of Ophthalmology 1984;97(3):357-65. (20) Fazzi E, Signorini SG, Scelsa B, Bova SM, Lanzi G. Leber's congenital amaurosis: an update. European Journal of Paediatric Neurology 2003;7(1):13-22. (21) Sorsby A, Williams CE. Retinal Aplasia As A Clinical Entity. British Medical Journal 1960;1(JAN30):293-&. (22) Sohocki MM, Perrault I, Leroy BP, Payne AM, Dharmaraj S, Bhattacharya SS, et al. Prevalence of AIPL1 mutations in inherited retinal degenerative disease. Molecular Genetics and Metabolism 2000 Jun;70(2):142-50.
48
Referenties (23) Perrault I, Hanein S, Gerber S, Barbet F, Dufier JL, Munnich A, et al. Evidence of autosomal dominant Leber congenital amaurosis (LCA) underlain by a CRX heterozygous null allele. Journal of Medical Genetics 2003 Jul;40(7). (24) Daiger SP, Sullivan LS, Mortimer SE, Hedstrom L, Gire AI, Zhu J, et al. Mutations in IMPDH1 are associated with Leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2005;46. (25) Daiger, S. P., Sullivan, L. S., and Bowne, S. J. Retinal Information Network. [ 2011 Available from: http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/. (26) Coppieters F, Casteels I, Meire F, De Jaegere S, Hooghe S, van Regemorter N, et al. Genetic Screening of LCA in Belgium: Predominance of CEP290 and Identification of Potential Modifier Alleles in AHI1 of CEP290-related Phenotypes. Human Mutation 2010 Oct;31(10):E1709-E1766. (27) Hamel CP, Tsilou E, Pfeffer BA, Hooks JJ, Detrick B, Redmond TM. Molecular-Cloning and Expression of Rpe65, A Novel Retinal-Pigment Epithelium-Specific Microsomal Protein That Is Posttranscriptionally Regulated In-Vitro. Journal of Biological Chemistry 1993 Jul 25;268(21):15751-7. (28) Hamel CP, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG, Redmond TM. The Gene for the Retinal-Pigment Epithelium-Specific Protein Rpe65 Is Localized to Human 1P31 and Mouse-3. Genomics 1994 Apr;20(3):509-12. (29) Cai X, Conley SM, Naash MI. RPE65: Role in the Visual Cycle, Human Retinal Disease, and Gene Therapy. Ophthalmic Genetics 2009;30(2):57-62. (30) Nicoletti A, Wong DJ, Kawase K, Gibson LH, Yangfeng TL, Richards JE, et al. Molecular Characterization of the Human Gene Encoding An Abundant 61-Kda Protein-Specific to the RetinalPigment Epithelium. Human Molecular Genetics 1995 Apr;4(4):641-9. (31) Redmond TM, Yu S, Lee E, Bok D, Hamasaki D, Chen N, et al. Rpe65 is necessary for production of 11-cis-vitamin A in the retinal visual cycle. Nature Genetics 1998 Dec;20(4):344-51. (32) Mata NL, Moghrabi WN, Lee JS, Bui TV, Radu RA, Horwitz J, et al. Rpe65 is a retinyl ester binding protein that presents insoluble substrate to the isomerase in retinal pigment epithelial cells. Journal of Biological Chemistry 2004 Jan 2;279(1):635-43. (33) Cideciyan AV. Leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations and its treatment with gene therapy. Progress in Retinal and Eye Research 2010 Sep;29(5):398-427. (34) Moiseyev G, Chen Y, Takahashi Y, Wu BX, Ma JX. RPE65 is the isomerohydrolase in the retinoid visual cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005 Aug 30;102(35):12413-8. (35) Xue LL, Gollapalli DR, Maiti P, Jahng WJ, Rando RR. A palmitoylation switch mechanism in the regulation of the visual cycle. Cell 2004 Jun 11;117(6):761-71. (36) Woodruff ML, Wang ZY, Chung HY, Redmond TM, Fain GL, Lem J. Spontaneous activity of opsin apoprotein is a cause of Leber congenital amaurosis. Nature Genetics 2003 Oct;35(2):158-64. (37) Jacobson SG, Aleman TS, Cideciyan AV, Heon E, Golczak M, Beltran WA, et al. Human cone photoreceptor dependence on RPE65 isomerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007 Sep 18;104(38):15123-8. (38) Leroy B. Contribution to the Understanding of Genotypes and Phenotypes in Inherited Retinal Dystrophies Universiteit Gent; 2006. (39) Dharmaraj S. Clinical and molecular analysis of Leber congenital amaurosis 2007. (40) Rohrer B, Ablonczy Z, Znoiko S, Redmond M, Ma JX, Crouch R. Does constitutive phosphorylation protect against photoreceptor degeneration in RPE65(-/-) mice? Retinal Degenerations: Mechanisms and Experimental Therapy 2003;533:221-7. (41) Pang JJ, Chang B, Hawes NL, Hurd RE, Davisson MT, Li J, et al. Retinal Degeneration 12 (rd12): A new, spontaneously arising mouse model for human Leber congenital amaurosis (LCA). Molecular Vision 2005 Feb 28;11(17):152-62. (42) Acland GM, Aguirre GD, Ray J, Zhang Q, Aleman TS, Cideciyan AV, et al. Gene therapy restores vision in a canine model of childhood blindness. Nature Genetics 2001 May;28(1):92-5.
49
Referenties (43) Aguirre GD, Baldwin V, Pearce-Kelling S, Narfstrom K, Ray K, Acland GM. Congenital stationary night blindness in the dog: common mutation in the RPE65 gene indicates founder effect. Mol Vis 1998 Oct 30;4:23. (44) den Hollander AI, Black A, Bennett J, Cremers FPM. Lighting a candle in the dark: advances in genetics and gene therapy of recessive retinal dystrophies. Journal of Clinical Investigation 2010 Sep;120(9):3042-53. (45) Zernant J, Kulm M, Dharmaraj S, den Hollander AI, Perrault I, Preising MN, et al. Genotyping microarray (disease chip) for Leber congenital amaurosis: Detection of modifier alleles. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2005 Sep;46(9):3052-9. (46) Yzer S. Autosomal recessive retinal dystrophies: genotypes and phenotypes 2007. (47) Asper Biotech: Leber Congenital Amaurosis. [ 2011 Available from: http://www.asperbio.com/asperophthalmics/panel-of-ophthalmogenetic-tests/leber-congenital-amaurosis-lca. (48) Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. Dna Sequencing with Chain-Terminating Inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1977;74(12):5463-7. (49) Yzer S, Leroy BP, De Baere EF, de Ravel TJ, Zonneveld MN, Voesenek K, et al. Microarray-based mutation detection and phenotypic characterization of patients with Leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2006 Mar;47(3):1167-76. (50) Metzker ML. Next Generation Technologies: Basics and Applications. Environmental and Molecular Mutagenesis 2010 Aug;51(7):691. (51) Coppieters, F., De Wilde B, De Meester E, Lefever S, De Rocker N, Leroy BP, Vandesompele J, and De Baere, E. Leber Congenital Amaurosis: Development Of A Comprehensive Molecular Genetic Test Panel Using Next-generation Sequencing . [ 2011 Available from: http://www.abstractsonline.com/plan/ViewAbstract.aspx?mID=2684&sKey=9456c86d-1d58-492cab4f-bc1dfbebebee&cKey=706fafe4-645c-4869-9af2-25200f841a61&mKey=%7B6F224A2D-AF6A4533-8BBB-6A8D7B26EDB3%7D. (52) Bennett J. Gene Therapy for Color Blindness. New England Journal of Medicine 2009 Dec 17;361(25):2483-4. (53) Mancuso K, Hauswirth WW, Li QH, Connor TB, Kuchenbecker JA, Mauck MC, et al. Gene therapy for red-green colour blindness in adult primates. Nature 2009 Oct 8;461(7265):784-U34. (54) Shapley R. VISION Gene therapy in colour. Nature 2009 Oct 8;461(7265):737-9. (55) Barret KE, Barmen S.M., Boitano S., Brooks H. Ganong's Review of Medical Physiology. 23 ed. New York: McGraw-Hill Medical; 2009. (56) Mollon J.D., Reffin J.P., Regan B.C. Handbook of the Cambridge Colour Test. London: Cambridge Research Systems; 2000. (57) Komaromy AM, Alexander JJ, Rowlan JS, Garcia MM, Chiodo VA, Kaya A, et al. Gene therapy rescues cone function in congenital achromatopsia. Human Molecular Genetics 2010 Jul 1;19(13):258193. (58) Thiadens AAHJ, Somervuo V, van den Born LI, Roosing S, van Schooneveld MJ, Kuijpers RWAM, et al. Progressive Loss of Cones in Achromatopsia: An Imaging Study Using Spectral-Domain Optical Coherence Tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2010 Nov;51(11):5952-7. (59) Michalakis S, Muhlfriedel R, Tanimoto N, Krishnamoorthy V, Koch S, Fischer MD, et al. Restoration of Cone Vision in the CNGA3(-/-) Mouse Model of Congenital Complete Lack of Cone Photoreceptor Function. Molecular Therapy 2010 Dec;18(12):2057-63. (60) Acland GM, Aguirre GD, Bennett J, Aleman TS, Cideciyan AV, Bennicelli J, et al. Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Molecular Therapy 2005 Dec;12(6):1072-82. (61) Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN, Mingozzi F, Bennicelli J, et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine 2008 May 22;358(21):2240-8.
50
Referenties (62) Chung DC, Lee V, Maguire AM. Recent advances in ocular gene therapy. Current Opinion in Ophthalmology 2009 Sep;20(5):377-81. (63) Bainbridge JWB, Smith AJ, Barker SS, Robbie S, Henderson R, Balaggan K, et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine 2008 May 22;358(21):2231-9. (64) Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S, Cideciyan AV, Schwartz SB, Wang LL, et al. Treatment of Leber Congenital Amaurosis Due to RPE65 Mutations by Ocular Subretinal Injection of AdenoAssociated Virus Gene Vector: Short-Term Results of a Phase I Trial. Human Gene Therapy 2008 Oct;19(10):979-90. (65) Bainbridge JW, Ali RR. Sucess in sight: The eyes have it! Ocular gene therapy trials for LCA look promising. Gene Therapy 2008 Sep;15(17):1191-2. (66) Koenekoop RK. Successful RPE65 gene replacement and improved visual function in humans. Ophthalmic Genetics 2008;29(3):89-91. (67) Simonelli F, Maguire AM, Testa F, Pierce EA, Mingozzi F, Bennicelli JL, et al. Gene Therapy for Leber's Congenital Amaurosis is Safe and Effective Through 1.5 Years After Vector Administration. Molecular Therapy 2010 Mar;18(3):643-50. (68) Miller JW. Preliminary results of gene therapy for retinal degeneration. New England Journal of Medicine 2008 May 22;358(21):2282-4. (69) Cideciyan AV, Aleman TS, Boye SL, Schwartz SB, Kaushal S, Roman AJ, et al. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2008 Sep 30;105(39):15112-7. (70) Jacobson SG, Aleman TS, Cideciyan AV, Sumaroka A, Schwartz SB, Windsor EAM, et al. Identifying photoreceptors in blind eyes caused by RPE65 mutations: Prerequisite for human gene therapy success. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2005 Apr 26;102(17):6177-82. (71) Jacobson SG, Acland GM, Aguirre GD, Aleman TS, Schwartz SB, Cideciyan AV, et al. Safety of recombinant adeno-associated virus type 2-RPE65 vector delivered by ocular subretinal injection. Molecular Therapy 2006 Jun;13(6):1074-84. (72) Wen R, Song Y, Cheng T, Matthes MT, Yasumura D, Lavail MM, et al. Injury-Induced Up-Regulation of Bfgf and Cntf Messenger-Rnas in the Rat Retina. Journal of Neuroscience 1995 Nov;15(11):737785. (73) Del Priore LV. Effect of sham surgery on retinal function after subretinal transplantation of the artificial silicone retina. Archives of Ophthalmology 2005 Aug;123(8):1156. (74) Cideciyan AV, Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S, Schwartz SB, Boye SL, et al. Human RPE65 Gene Therapy for Leber Congenital Amaurosis: Persistence of Early Visual Improvements and Safety at 1 Year. Human Gene Therapy 2009 Sep;20(9):999-1004. (75) Cideciyan AV, Hauswirth WW, Aleman TS, Kaushal S, Schwartz SB, Boye SL, et al. Vision 1 Year after Gene Therapy for Leber's Congenital Amaurosis. New England Journal of Medicine 2009 Aug 13;361(7):725-7. (76) Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright JF, Pierce EA, Testa F, et al. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 2009 Nov 7;374(9701):1597-605. (77) Cremers FPM, Collin RWJ. Promises and challenges of genetic therapy for blindness. Lancet 2009 Nov 7;374(9701):1569-70. (78) Deeb SS, Motulsky AG. Red-Green Color Vision Defects. GeneReviews 2005 Sep 19.
51
