Reakční kinetika enzymových reakcí
• studuje časový průběh enzymových reakcí za různých reakčních podmínek
• zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy
-
uvažujme monomolekulární přeměnu
SP např.: hexosafosfátisomerasa
D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát
Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S P.
k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s-1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k1 = 0,006 s-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)
Definujme „počáteční reakční rychlost“ -rychlost reakce na počátku experimentu, kdy koncentrace produktů je nulová:
dc i v vlim = T] lim ot ν i . dt 0 t 0 αi - stechiometrický faktor - hodnoty pro reaktanty (substráty) reakce dosazujeme jako záporné a pro produkty reakce jako kladné
-definována pouze pro pokusy in vitro, kde jedině lze zajistit koncentraci produktů reakce
nulovou v
- měření k definovanému objemu roztoku o dané koncentraci [S], přidáme určité množství enzymu a vhodnou analytickou metodou sledujeme množství vznikajícího produktu. Rychlost reakce můžeme určit jako směrnici časové závislosti koncentrace produktu při kontinuálním měření v čase nula. Obvykle necháme reakci probíhat po určitou dobu, poté ji přerušíme (např. zdenaturováním enzymu) a změříme koncentraci produktu; počáteční reakční rychlost se pak vypočte jako podíl koncentrace produktu a příslušného času. NUTNO DÁT POZOR ABYCHOM BYLI DOSTATEČNĚ DALEKO OD TERMODYNAMICKÉ ROVNOVÁHY (Obvykle přípustný pokles max. o 5 % )
v =
d [P] dt
=
-
d [S ] dt
Cesta k rovnici Michaelise a Mentenové
- zanedbáme zpětnou reakci řízenou konstantou k-2
- enzym: volný (E) a s obsazeným vazebným centrem (ES) [E0] = [E] + [ES] kde [E0] značí celkovou koncentraci aktivního enzymu - substrát volný a vázaný, a pro jeho celkovou koncentraci analogicky platí [S0] = [S] + [ES] (zanedbá se; koncentrace [S] v ES obvykle nepatrná vzledem ke koncentraci volného [S]
-produkt se u „nevratného“ modelu vyskytuje v jediném ději, kdy vzniká rozpadem komplexu ES; počáteční reakční rychlost enzymové reakce je proto vyjádřena vztahem:
vo = 2k.[ES]
Rychlost vzniku (nebo zániku) komplexu ES je dána součtem rychlostí dílčích dějů:
Za [E] dosadíme [Eo] - [ES] a získáme vztah
Pokud [S] >> [E] je rychlost změny koncentrace komplexu ES výrazně nižší než změna koncentrace substrátů i produktů. Lze tedy položit časovou derivaci rovnou nule, čímž po úpravě získáme:
k 1 .[ E o ] .[ S ] [ ES ]= k 1 + 2 k + 1 k .[ S ]
Počáteční reakční rychlost je dána prostým vynásobením konstantou k2 (viz výše), takže po vykrácení zlomku na pravé straně konstantou k1 získáme vztah:
k2 .[E o ].[S] v o= k-1 +2 k [S] k1
Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu KM – má rozměr koncentrace; je rovna konc. substrátu při Vlim /2; charakterizuje daný enzym za definovaných podmínek; Nízká hodnota KM - vysoká afinita enzymu k substrátu
Příklad Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce:
S [mol/dm3] vo [nmol/dm3 . min]
6,25 .10-6 15
7,5 . 10-5 56,25
1,0 .10-4 60
1,0 .10-3 74,9
1,0 .10-2 75
a) Odhadněte hodnoty Km a Vlim. b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu
2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?
0
Dvojnásobně reciproký výnos – snadné určení Vlim a KM ze získaných dat Jiné metody – software, odhad
Další důležité pojmy: definice limitní rychlosti:
Vlim = k2 . [Eo]
když [E0] = [ES]
V lim k 2 kcat = číslo přeměny („turnover number“) = molekulová (molární) [ Eo ] aktivita enzymu - počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturaci substrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času
Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu) K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku) - kolik potřebuji enzymu pro reakci - koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min).
Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu
Závislost v0 na [E] při [S]=konst.
Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě
"Nemichaelisovské enzymy“
v0
Allosterický efekt
(ze Slovníku Biochemických pojmů; M. Kodíček)
(Z řeckého allós = jiný, stereós = prostor) - konformační změna v určité části molekuly biopolymeru vyvolaná jistou změnou v jiné části molekuly; Touto změnou může být kovalentní modifikace (např. fosforylace enzymu) či nekovalentní vazba nízkomolekulárního či makromolekulárního Efektoru (např. vazba [S] nekompetitivního inhibitoru na enzym, positivní homotropní allosterický efekt u hemoglobinu, vyvolání konformační změny membránového receptoru vazbou bílkovinného hormonu apod.). Allosterický efekt se uplatňuje zásadním způsobem při regulaci biologické aktivity mnoha bílkovin.
- positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy) -hemoglobin – „čestný enzym“
Positivní homotropní alosterický efekt
V lim.[S ] vo = K + [S ]n
n
v0 na [S] pro enzym kde působí positivní homotropní allosterický efekt hodnoty
Hillova rovnice; n - koeficient sigmoidity - čím vyšší má hodnotu, tím více se závislost v0 na [S] liší od hyperboly a má výraznější tvar sigmoidy. Hodnota n bývá často rovna počtu enzymově aktivních podjednotek v oligomerním enzymu. Sigmoidita – fyziologický význam; citlivá reakce změny [S]. Konstanta K souvisí s hodnotou [S]½, což je koncentrace substrátu potřebná k dosažení v0 =Vlim/2, vztahem:
Dva molekulové modely pro positivní homotropní allosterický efekt a) Symetrický (Monodův). Dva konformační stavy; vysoká/nízká afinita k substrátu. Navázáním první molekuly substrátu je aktivní konformace stabilizována, schopnost ostatních podjednotek vázat a přeměňovat substrát se prudce zvýší a na závislosti v0 na [S] - inflexní bod. Přechod z jedné konformace do druhé je náhlý bez stabilních meziproduktů a všechny podjednotky mají stejnou konformaci (s vysokou nebo nízkou afinitou); proto symetrický b) Sekvenční. Přepokládá se zde, že vazba prvního substrátu indukuje v enzymu konformační změny, které se postupně šíří od jedné podjednotky k druhé a převádějí jejich aktivní místa do konformace o vyšší schopnosti vázat a přeměňovat substrát.
Inhibice enzymů Jakákoliv látka snižující rychlost enzymové reakce, může být považována za inhibitor.
Možná je i tzv. - inhibice substrátem: - při velmi vysokých [S] hodnota v0 může klesat (místo aby limitovala k hodnotě Vlim). Substrát je do vazebného centra vázán řadou nekovalentních interakcí. Při velmi vysoké koncentraci substrátu se může do aktiv. centra „tisknout“ více molekul substrátu, přičemž žádná z nich nemá takovou orientaci, aby katalytické skupiny mohly realizovat její chemickou přeměnu.
v0
[S]
Kompetitivní inhibice
Zdroj: http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/images/1cf9e9bb.jpg
[ E ].[ I ] KI = [ EI ]
[ I ] KM´ = KM . 1 + , KI
V lim.[S ] vo = [ I ] KM . 1 + [S ] KI
V´lim = Vlim
Kompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice
Zdroj: http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/images/me44be66.jpg
V lim .[S ] [ I ] 1 + KI vo = KM [S ] [ I ] 1 + KI
KI =
[ ES ].[ I ] [ ESI ]
Akompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
[ E ].[ I ] [ ES ].[ I ] KI = [ EI ] [ ESI ]
KS =
V lim.[S ] vo = [ I ] 1 + . KS + [S ] KI
[ E ].[S ] [ EI ].[S ] [ ES ] [ ESI ]
V lim V´lim = [I ] (1 ) KI
Nekompetitivní inhibice
Regulace enzymové aktivity
INHIBICE: - nevratná - vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive)
Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu a) neinhibované reakce, b) při kompetitivní inhibici, c) při akompetitivní inhibici a d) při nekompetitivní inhibici
Další typy inhibice: -smíšená -ireverzibilní
Regulace enzymové aktivity (připomenutí - viz minulá přednáška) • na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní) • pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými
enzymy) - nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy)
- vratné (fosforylace, adenylace...) • efektory (aktivátory a inhibitory)
- allosterický efekt
Imobilizované enzymy Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně
Imobilizace enzymů Vazba na nosič
sorpcí
Kovalentní vazbou
Zachycení (entrapment)
V matrici gelu
Opouzdření (encapsulation)
Využití enzymů → aplikovaná enzymologie využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk:
průmysl potravinářský a nepotravinářský klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů) farmaceutika
Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12% !) Oxidoreduktasy – (GOD - analytika) Ostatní (5 - 7%) Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO Rostlinné Živočišné Rekombinantní technologie
Příklady Biodetergenty (proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy) Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy) Mlékárenství (chymosin) Hydrolýza proteinů …….
Biotechnologie Definice? Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě.
Přednosti:
surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí Nevýhody: Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?
Biotechnologické směry 1. Průmyslová mikrobiologie a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová) b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery), c) Biotransformace d) Biomasa
2. Průmyslové biotechnologie 3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace) 4. Živočišné biotechnologie 5. Biotechnologie užitkových rostlin 6. Veterinární a medicínské biotechnologie
Regulace enzymové aktivity
