Teoretický úvod:
FLUORESCENCE RYCHLÁ KINETIKA FLUORESCENČNÍ INDUKCE
Praktikum fyziologie rostlin
FLUORESCENCE 1. Co je to fluorescence? Emisi záření, ke kterému dochází při přechodu excitované molekuly do základního stavu souhrnně označujeme jako luminiscenci. Pokud je excitace vyvolána absorpcí kvanta záření nazýváme emitované záření fluorescence. Emitované záření je charakterizováno větší vlnovou délkou a nižší energií než záření excitační. U fotosyntetizujících organizmů je molekulou emitující fluorescenci zejména chlorofyl a po exitaci viditelným nebo UV zářením. Fluorescence chlorofylu má svůj původ v chloroplastech zelených rostlin (přesněji řečeno, ve světlosběrných komplexech PS II a I) a odráží širokou škálu procesů, které probíhají v jejich fotosyntetických aparátech během konverze sluneční (excitační)
energie
na
chemickou energii přenašečů vodíku
(NADPH)
makroergických
a
molekul
(ATP). Ve fotosyntetickém aparátu
je
energie
záření
světelného absorbována
kvant
v
anténních
pigmentech PS II a I a přenášena
do
reakčních
Obr. 1. Absorpční spektra zeleného listu (vlevo – šedá=kyselina ferulová a další fenolické látky vázané v b.s., žlutá=karotenoidy, zelená=chlorofyly) a odpovídající fluorescenční emisní spektra (vpravo). Podle Buschman a kol. 2000.
center obou fotosystémů.
2. Zdroj fluorescence chlorofylu – fotosystém II (PSII) Naprostou většinu (cca 90%) fluorescence emituje při pokojových teplotách chlorofyl a z reakčního PS II, zatímco PS I fluoreskuje pouze velmi slabě. Je tedy důležité si uvědomit, že informace o změnách ve fotochemickém využití záření získané z měření fluorescence se týkají pouze PSII. Po absorpci kvanta světelného záření přejde elektron molekuly chlorofylu a v reakčním centru ze základního (S0) do excitovaného (S1 nebo S2) stavu. Ten je však velmi nestabilní a elektron je předán na další molekulu nebo přejde do základního stavu a energie vznikající při přechodu z excitovaného do základního stavu je vyzářena.
2
Po absorpci kvanta světelného záření molekulou chlorofylu dojde k jednomu z těchto konkurenčních pochodů : 1. energie fotonů je využita pro separaci náboje a přenos elektronu ve světelné fázi fotosyntézy (fotochemické využití energie) 2. energie fotonů je vyzářena v podobě červeného záření s vlnovou délkou větší než 650 nm – fluorescence 3. energie fotonů se rozptýlí na teplo – disipace (obr. 2) Tyto tři procesy si navzájem konkurují,
pokles
zastoupení
jakéhokoli z těchto deexcitačních procesů se projeví
vzrůstem
zastoupení jiného (Govindjee, 1995). Pouhých
zhruba
3-5%
absorbované energie je vyzářeno jako fluorescence, což se jeví jako
zanedbatelné
množství,
přesto díky změnám fluorescence můžeme usuzovat na změny účinnosti fotochemických reakcí primární V případě, fluorescence
fáze že
fotosyntézy. je
intenzita
nízká,
účinnost
fotochemických reakcí primární fáze fotosyntézy je vysoká a naopak.
Obr. 2. Schéma absorpce záření a deexcitace Po absorpci záření elektron přeskočí na orbital o vyšší energetické úrovni, molekula je ze základního stavu uvedena do stavu excitovaného (singletové stavy SI a SII). Při deexcitaci (návratu elektronu na původní orbital a molekuly do základního stavu) může být energie uvolněna jako teplo nebo jako zářivá energie v oblasti viditelného světla (jev zvaný fluorescence, emitované záření má nižší energii a delší vlnovou délku). B = modré světlo, např. 430 nm, R = červené světlo, např. 680 nm. (Pavlová, 2006)
3. Přenos elektronu strukturami fotosyntetického aparátu Chlorofyly absorbují ve dvou oblastech PAR – v oblasti modré a fialové a v oblasti červené. Tomu také odpovídají dva typy excitovaných stavů – fotony z oblasti modré mají vyšší energii a způsobí přeskok elektronu na orbital od jádra vzdálenější (singletový stav II, SII), než foton
z oblasti červené (singletový stav I, SI, obr. 2). Energie mezi prvním a druhým singletovým stavem se mění na energii tepelnou a není do reakčního centra přenášena. Systém je uspořádaný tak, že směrem k reakčnímu centru množství energie potřebné k excitaci molekuly pigmentu postupně nepatrně klesá (vlnová délka absorpčního maxima 3
pigmentů stoupá). Proto je na periferii LHC více molekul chlorofylu b, který má nižší absorpční maximum než chlorofyl a, k jeho excitaci je tedy třeba foton o vyšším obsahu energie. V reakčním centru je molekula chlorofylu a, která je excitována kvantem s nejnižším obsahem energie, tady s nejvyšším absorpčním maximem. Tak je zajišťován jednosměrný přenos energie do reakčního centra. (Pavlová, 2006)
V reakčním centru fotosystémů se energie záření mění na chemickou energii oxidačně redukčních reakcí. V reakčním centru dojde k excitaci jedné molekuly chlorofylu a ze specifického páru, následuje vlastní fotochemická reakce – uvolnění elektronu (tzv. separace náboje) se současnou oxidací molekuly chlorofylu a a s redukcí prvního akceptoru elektronu. Je zahájen sled oxidačně redukčních reakcí, v nichž se uvolněný elektron přenáší na další akceptory. Oxidovaná molekula chlorofylu a přijme elektron od příslušného donoru a je schopna další excitace. Energie absorbovaná fotosyntetickými pigmenty fotosystému II je přenesena do reakčního centra II a zde způsobuje exitaci
molekuly
chlorofylu
a.
V
excitovaném stavu je jeden elektron v molekule
chlorofylu
na
vnějším
orbitalu vázán slabě a přejde na molekulu
feofytinu,
která
má
k
elektronu vyšší afinitu než excitovaná molekula chlorofylu a. Dojde k oddělení (separaci) náboje, tj. k předání elektronu z molekuly chlorofylu a (donoru) na molekulu feofytinu (akceptor).
Z feofytinu je elektron přes atom Fe předán na molekulu plastochinonu QA, vázanou na protein D2, jejíž redoxní potenciál je kladnější (méně záporný) než u feofytinu. QA se redukuje na QA-. Charakter interakce QA s proteinem D2 umožňuje
přenos
pouze
Obr. 3. Schéma PSII CP43, CP47 – hydrofobní proteiny; D1, D2 – proteiny reakčního centra PSII; QA, QB – molekuly chinonu; Tyr 161 – tyrozinový zbytek v pozici 161 v proteinu D1; OEC – komplex rozkládající vodu, obsahuje 4 atomy Mn; P680 – pigment 680, molekula chlorofylu a s maximem absorpce 680 nm; v reakčním centru jsou vázány 2 molekuly chlorofylu a, tzv. specifický pár. hν - foton. (Pavlová, 2006)
jednoho
elektronu (QA je ve formě semichinonu). Elektron je transportován dále na QB (vázaný na D1), vzniká redukovaný semichinon QB-. QA přijímá od feofytinu další elektron, uvolněný z chlorofylu a, transportuje ho na QB- a vzniká QB2-. K plné redukci plastochinonu jsou však třeba ještě dva protony (2H+), které QB2- přijme ze strany stromatu, čímž se mění na PQH2
4
(plastochinol). V této formě je plastochinon vázán na D1 jen slabě, z vazebného místa se uvolní do membrány. Vazebné místo na D1 se obsadí jednou z molekul PQ, které v nadbytku volně difundují mem-bránou thylakoidu. PQ má k vazebnému místu silnou afinitu a molekulu PQH2 vytěsní.
4. Kinetika indukované fluorescence chlorofylu a Fluorescence chlorofylu není statická veličina, ale mění se v čase. Když temnotně adaptovanou rostlinu vystavíme kontinuálnímu světlu, intenzita fluorescence vykazuje charakteristické změny v čase. Tyto změny jsou způsobeny rozdíly v rychlostech fotochemie na tylakoidální membráně a fixace CO 2 ve stromatu chloroplastů. Zatímco fotochemické B
B
procesy na membráně začnou probíhat okamžitě po vystavení rostliny světlu, metabolické procesy ve stromatu startují daleko později. V temnotně adaptovaném stavu, který je vzhledem k elektronově transportním procesům fotochemicky neaktivním stavem thylakoidní membrány, jsou obecně všechna reakční centra PSII a přenašeče elektronů na akceptorové straně PSII reoxidovány. V tomto stavu je možné zaznamenat tzv. minimální výtěžek fluorescence (F0 nebo O), jestliže je vzorek v předzatemněném stavu osvětlen slabým měřícím zářením fluorimetru. Je-li vzorek následně ozářen krátkým saturačním pulzem bílého světla, způsobí tento saturační pulz rychlé uzavření všech aktivních reakčních center PSII, neboť dojde k úplné redukci jejich primárního elektronového akceptoru Q A , doprovázené úplným vysycením fotochemických procesů v PSII. B
B
Tehdy je zaznamenán tzv. maximální výtěžek fluorescence (FM). Rozdíl mezi FM a F0 je označován jako maximální výtěžek variabilní fluorescence v temnotně adaptovaném stavu (FV). FV lze vypočítat ze vztahu:
FV = FM – F0 Po zapnutí aktinického světla (středně silné světlo, nejčastěji červené, optimální pro fotosyntézu) se intenzita fluorescence zvyšuje až na FP (peak), maxima při dané intenzitě ozářenosti, pak opět klesá, až se po několika minutách ustálí na určité hodnotě FS (steady-state). Změna fluorescence B
v čase mezi F0 a FP je tzv. „rychlá fáze“ fluorescenční indukce a souvisí s primárními procesy fotochemie na PSII. „Pomalá fáze“ fluorescenční indukce (FP až FS) souvisí s postupným přechodem fotosyntetického aparátu z temnotně do světelně adaptovaného stavu. Ten je charakterizován nepřetržitou syntézou ATP, NADPH+H+ a souběžnou fixací CO2. Jakmile se procesy elektronového transportu a spřažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je dosaženo i tzv. ustálené úrovně (steady-state) výtěžku fluorescence (F S). B
Po zapnutí aktinického světla (středně silné světlo, nejčastěji červené, optimální pro fotosyntézu) se intenzita fluorescence zvyšuje až na FP (peak), maxima při dané intenzitě ozářenosti, pak opět klesá, až se po několika minutách ustálí na určité hodnotě FS (steady-state). Změna fluorescence B
5
v čase mezi F0 a FP je tzv. „rychlá fáze“ fluorescenční indukce a souvisí s primárními procesy fotochemie na PSII a trvá přibližně do 1s. „Pomalá fáze“ fluorescenční indukce (F P až FS) souvisí s postupným přechodem fotosyntetického aparátu z temnotně do světelně adaptovaného stavu a může trvat až několik minut. Světelně adaptovaný stav je charakterizován nepřetržitou syntézou ATP, NADPH+H+ a souběžnou fixací CO2. Jakmile se procesy elektronového transportu a spřažených biochemických reakcí dostanou do rovnováhy, je dosaženo i tzv. ustálené úrovně (steady-state) výtěžku fluorescence (F S). (Soukupová 2006) B
5. Rychlá fáze fluorescenční indukce – OJIP křivka Rychlá fáze fluorescenční indukce je definovaná jako záznam přechodu fluorescence chlorofylu během několika málo sekund z temnostně adaptovaného stavu fotosyntetického aparátu po ozáření krátkým pulzem aktinického světla. Zaznamenaná křivka má několik charakteristických fází označovaných anglickými zkratkami O, J, I, P:
O = origin, počátek, odpovídá základní hladině fluorescence chlorofylu a v temnostně adaptovaném stavu, také je označován jako F0.
J a I = odrážejí krátkodobé rovnovážné stavy mezi vkladem exitační energie do PSII a tokem energie z PSII pomocí redoxní kaskády chinonů (QA, QB, PQ) a dalších akceptorů v elektrontransportním řetězci PSII. Rovnovážné stavy J a I nastávají zpravidla po 2 a 30 ms od ozáření aktinickým světlem
P = peak, vrchol, odpovídá maximální hladině fluorescence dosažitelné při daném ozáření.
Nárůst fluorescenčního signálu z fáze O (F0) do P (v případě saturačního pulzu FP = FM) vypovídá o postupném poklesu
koncentrace
oxidovaného
chinonu QA a současné akumulaci jeho redukované formy QA-. Časový průběh
OJIP
přechodu
odráží
postupnou redukci zásobníku (poolu) elektronových
akceptorů
PSII
(jednoelektrolového přenašeče QA, dvouelektronového QB a mobilního plastochinonu). QA je určující faktor,
Obr. 4. Rychlá fáze fluorescenční indukce (nárůst
na kterém závisí vzrůst fluorescence
fluorescence chlorofylu, OJIP křivka) měřená na listu 9-ti denní pšenice fluorimetrem Plant Efficiency Analyser (PEA, Hansatech, Norfolk, UK). Převzato z Roháček et al. 2008
při OJIP přechodu.
6
6. Vybrané Fluorescenční parametry odvozené z OJIP křivky Ze tvaru a jednotlivých hodnot OJIP křivky můžeme odvodit různé fluorescenční parametry, které se dají ve fyziologických studiích využít k interpretaci dějů ve fotosyntetickém aparátu například pod vlivem různých stresových faktorů, což budete mít možnost vyzkoušet i během jedné z úloh.
FO , F0 F P , FM FV FJ FI P0
minimální FChl v temnotně adaptovaném stavu, měřený ve fázi O – 50s po zapnutí aktinického světla FChl ve fázi P pro danou intenzitu aktinického světla, v případě saturační ozářenosti FM = maximální FChl variabilní FChl FV = FP – FO, v případě saturační ozářenosti FV = FM-F0 FChl ve fázi J pro danou intenzitu aktinického světla FChl ve fázi I pro danou intenzitu aktinického světla maximální výtěžek FChl v temnotně adaptovaném stavu je mírou maximální fotochemické kapacity PS II. Pro mnoho různých rostlinných druhů měřených v nestresových podmínkách je jeho průměrná hodnota rovna 0,8. U stresovaných nebo poškozených rostlin je poměr FV/FM výrazně snížen (např. na 0,5), a tak velikost P0 slouží jako citlivý indikátor fotoinhibice nebo jiného typu poškození komplexů PS II. P0 = (FM - F0) / FM = FV / FM = FP – FO / FP
7. Vliv stresu vysokých teplot na fotosyntetický apartá a tvar OJIP křivky Fotosyntetická aktivita chloroplastů je záma jako velmi citlivá k teplotě. Při vyšších teplotách dochází v listech ke snížené produkci kyslíku, snížené fixaci CO2 a k významné inhibici fotofosforylace. Vysoké teploty způsobují rozvolnění gran v chloroplastech, případně disociaci anténního komplexu PSII. V některých studiích je popisován i pozměněný transport
Obr. 5. Teplotní závislost na tvaru OJIP křivky Při ošetření teplotou nad 40°C je na křivce patrná další fáze v nárůstu fluorescence – K, která může v některých případech (48°C) vykazovat nejvyšší hladinu fluorescence v celém přechodu z FO do FP. Výsledky získány na listových terčících hrachu Pisum sativum L. ošetřených příslušnou teplotou po dobu 5 minut. Převzato z Srivastava a kol. 1997.
elektronů mezi chinony QA a QB. Právě tyto změny lze snadno detekovat pomocí měření fluorescence chlorofylu. 7
Při vysokých teplotách dochází díky výše zmíněným fyziologickým změnám i ke změně tvaru nebo absolutních hodnot některých fází fluorescenční OJIP křivky. Například bylo zaznamenáno snížení variabilní FChl FV a to hlavně díky poklesu FP (FM).
8. Význam fluorescence ve fotosyntetickém výzkumu Záznam fluorescence vyzařované molekulami Chl a se ve fotosyntetickém výzkumu stal základem široce využívané metody, která dovolila pochopit fotochemické a nefotochemické procesy probíhající v tylakoidní membráně chloroplastů. Emise fluorescence z molekul chlorofylu fixovaných v chloroplastech zelených rostlin je citlivým indikátorem fotosyntetických procesů, probíhajících v časové škále od mikrosekund (tj. pro rychlé primární fotochemické děje) až po mnoho minut (tj. pro pomalé regulační a enzymatické procesy ve stromatu chloroplastů). Vyhodnocením fluorescenčních indukčních křivek (FIK) lze získat tzv. fluorescenční parametry, které umožňují kvalitativně
i kvantitativně
charakterizovat funkčnost fotosyntetického aparátu rostlin, jejich fyziologický stav, úroveň stresu, jemuž jsou rostliny vystaveny a též detailně studovat děje probíhající v thylakoidních membránách v obou fotosystémech (PS I a PS II), světlosběrných komplexech, mechanizmy regulující elektronový transport, fotoinhibiční a ochranné procesy apod.
Literatura: Pavlová L. Fyziologie rostlin (skriptum). Karolinum. 2006.
Srivastava A. et al. Regulation of antenna structure and electron transport in Photosystem II of Pisum sativum under elevated temperature probed by the fast polyphasic chlorophyll a fluorescence transient: OKJIP. Biochimica et Biophysica Acta. – Bioenergetics: 1320, str. 95-106. 1997.
Roháček 2006 Sokupová 2006 Buschman 2000 Govindjee 2005
8
Zadání praktických úloh k tématu:
FLUORESCENCE Přehled úloh k vypracování: Úkol 1: Rychlá kinetika fluorescenční indukce 1a) Ověřte působení herbicidu diuronu na listy kukuřice seté pomocí změření a analýzy rychlé fluorescenční indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen.
1b) Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou.
9
Úkol 1: Rychlá kinetika fluorescenční indukce Cíl: Představit měření fluorescence jako možný neinvazivní a nedestruktivní způsob detekce raných fází stresu fotosyntetického aparátu.
Hypotéza, kterou během práce ověříme: Narušení funkce fotosyntetického aparátu vlivem stresu ovlivní intenzitu fluorescence, změnu intenzity je možné měřit.
Dílčí úlohy: 1a) Ověřte působení herbicidu diuronu na listy kukuřice seté pomocí změření a analýzy rychlé fluorescenční indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen.
1b) Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou.
Úloha 1a: Ověřte působení herbicidu diuronu na listy kukuřice seté pomocí změření a analýzy rychlé fluorescenční indukce (OJIP) kapesním fluorimetrem FluorPen. Princip: Herbicid diuron - DCMU (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) je specifický inhibitor fotosyntézy. DCMU blokuje vazebné místo plastochinonu – přenašeče elektronů ve fotosystému II - a přerušuje tak přenos elektronů z PSII
na
molekulu
plastochinonu.
Přerušení
elektrontransportního řetězce v PSII zamezuje přeměně zářivé energie na chemickou. DCMU působí výhradně na přenos elektronu mezi PSII reakčním centrem a plastochinonem, nemá přímý
Obr. 6: Herbicid diuron 3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylmočovina. V ČR se tento herbicid nepoužívá.
účinek na PSI nebo další fáze fotosyntetických reakcí. Energie fotosynteticky aktivního záření způsobuje v reakčním centru PSII excitaci elektronu v molekule chlorofylu a. Energie excitovaného elektronu může být využita těmito konkurenčními cestami (Obr. 2): buď elektron přejde do základního energetického stavu a odpovídající energie se přemění na teplo, nebo je vyzářena v podobě červeného záření 10
(s maximem kolem 700 nm) - fluorescence, či je využita v kaskádě navazujících fotochemických reakcí – fotosyntéza. Tato tzv. fotochemická cesta zahrnuje rozdělení náboje a přenos elektronu přes řadu přenašečů – jedním z prvních je právě plastochinon. Po vazbě plastochinonu s DCMU není tento schopný přenášet elektrony a většina energie excitovaného elektronu je vyzářena jako fluorescence. Křivka rychlé kinetiky indukované fluorescence nemá po aplikaci diuronu klasický několikafázový tvar (Obr. 7.).
Potřeby: kukuřice setá (Zea mays), rostliny staré přibližně týden kádinka s vodou kádinka s roztokem herbicidu DCMU papírová krabice na zakrytí rostlin při adaptaci na tmu kapesní fluorimetr FluorPen (PSI Brno) stolní počítač s možností bluetooth komunikace a softwarem FluorPen Provedení: 1. Připravte si do kádinky 500 M
Obr. 7. Tvar OJIP křivek
roztok DCMU – 1ml zásobního roztoku napipetujte do 100 ml vodovodní vody. 2. Aplikujte roztok DCMU na list kukuřice.
Aby herbicid účinkoval téměř okamžitě, je potřeba list jemně poškodit. Stačí, když list ve dvou místech vzdálených od sebe cca 2cm přeložíte. Ponořte list přibližně na 30s do roztoku diuronu (Je výhodné list zlomit blízko u špičky, lépe se pak ponoří do kádinky s roztokem herbicidu).
3. Stejně naložte s listem jiné rostliny, ale ponořte jej do čisté vodovodní vody – bude sloužit jako kontrola.
Je s výhodou si listy na špičce označit fixem, ať jste si jisti, co měříte ;-)
4. Rostlinu nechte po dobu 10-15 minut adaptovat na tmu (pod papírovou krabicí) – dojde k utlumení fotochemických dějů, všechna reakční centra PSII se otevřou – oxidují, stejně tak jako další články elektrontransportního řetězce PSII. 5. Po uplynutí doby potřebné k adaptaci na tmu opatrně nadzvihněte krabici a změřte rychlý nástup indukované fluorescence pomocí kapesního fluorimetru FluorPen.
Pracujte rychle, nechte rostlinu stále stíněnou krabicí, ať nemusíte opakovat fázi adaptace na tmu.
11
Do svorky fluorimetru uzavřete oblast listu mezi dvěma zlomy – tam bude působení herbicidu nejvíce patrné!
Změřte rychlý nástup indukované fluorescence i u nepoškozeného listu – bude vám sloužit jako druhá kontrola.
6. Stáhněte naměřená data z fluorimetru do počítače. V softwaru FluorPen si prohlédněte OJIP křivky kontrolního a herbicidem ošetřeného listu. Graf si pomocí PrintScreen přeneste jako obrázek do dokumentu a vytiskněte. 7. Zaznamenejte z tabulky také následující parametry a porovnejte mezi kontrolním a herbicidem ošetřeným listem.
kontrola
herbicid diuron
FO FP FV FI FJ Fv/FP
Úloha 1b: Použijte rychlou kinetiku indukované fluorescence pro porovnání stavu fotosyntetického aparátu a identifikaci kontrolních rostlin a rostlin stresovaných vysokou teplotou. Potřeby: kukuřice setá (Zea mays), rostliny staré přibližně týden sušárna předehřátá na 45°C papírová krabice na zakrytí rostlin při adaptaci na tmu kapesní fluorimetr FluorPen (PSI Brno) stolní počítač s možností bluetooth komunikace a softwarem FluorPen Provedení: 1. Rostliny kukuřice nechte 10 minut inkubovat v sušárně při teplotě 45°C. 2. Po 10ti minutách rostliny vyjměte, nechte 5 minut při pokojové teplotě na světle. 3. Rostliny nechte po dobu 10-15 minut adaptovat na tmu (pod papírovou krabicí) – dojde k utlumení fotochemických dějů, všechna reakční centra PSII se otevřou – oxidují, stejně tak jako další články elektrontransportního řetězce PSII. 4. Rychle a opatrně vyjměte rostliny z krabice a změřte rychlý nástup indukované fluorescence pomocí kapesního fluorimetru FluorPen. 5. Stáhněte naměřená data z fluorimetru do počítače. V softwaru FluorPen si prohlédněte OJIP křivky kontrolního a vysokou teplotou stresovaného listu. Graf si pomocí PrintScreen přeneste jako obrázek do dokumentu a vytiskněte. Do protokolu vysvětlete příčinu tvaru OJIP křivek.
12
6. Do protokolu zaznamenejte z tabulky také následující parametry a porovnejte mezi kontrolním a vysokou teplotou stresovaným listem. vysoká teplota
kontrola FO FP FV FI FJ Fv/FP
Vyhodnocení experimentů: Vypracujte protokoly, ve kterých zdokumentujete a vyhodnotíte získaná experimentální data. Vysvětlete příčinu tvaru OJIP křivek, vysvětlete rozdíly mezi kontrolní variantou a variantou ošetřenou herbicidem, vysvětlete efekt vysoké teploty.
13
Manuál k ovládání kapesního fluorimetru FluorPen Obecné instrukce: Tlačítko MENU používáte pro listování v nabídce Tlačítko SET používáte jako „enter“ pro spouštění či vstup do jednotlivých funkcí nabídky Pokud se v nabídce ztratíte, mačkejte tak dlouho tlačítko MENU, dokud se nedostanete na položku RETURN, pak stiskněte SET a dostanete se o úroveň výš. Měření rychlé kinetiky fluorescenční indukce (O-J-I-P křivky) 1. Zapněte přístroj dlouhým stiskem tlačítka SET 2. Tlačítkem MENU listujte v nabídce dokud nenajdete položku MEASURE 3. Pokud v projdete celou nabídku a položku MEASURE nenajdete, najeďte na RETURN a stiskněte SET. Tímto se dostanete v nabídce o úroveň výš. Postup opakujte, dokud nenarazíte na položku MEASURE, pak stiskněte SET. 4. Listujte v nabídce parametrů a najdete OJIP, nic nemačkejte v tuto chvíli je přístroj připraven k měření. 5. Podle instrukcí v postupu úlohy uzavřete list kukuřice do svorky fluorimetru. Svorka musí těsnit, ale nepřitlačujte ji silou, abyste list nepoškodili. 6. Když máte připravený list, stiskněte SET. Probíhá měření, na displeji můžete sledovat pokrok procesu v %. Když se na displeji ukáže znova OJIP, měření bylo dokončeno. 7. Přístroj je připraven k dalšímu měření. 8. Když doměříte, stáhněte data do počítače a přístroj vypněte. Stažení dat z FluorPenu do počítače Nastavení FluorPenu, zapnutí bluetooth komunikace 1. Pokud jste zrovna doměřili, listujte v nabídce na položku RETURN a stiskněte SET. Dostanete se do hlavní nabídky. 2. Listujte hlavní nabídkou a najděte položku SETTING BLUETOOTH, MEASURE AND SOUND, stiskněte SET. 3. Měli byste mít kurzor na položce BT_OFF. Pokud ne, listujte dále pomocí MENU tlačítka až tuto položku najdete. 4. Stiskněte SET – položka se změní na BT_ON. Přístroj je připraven komunikovat s počítačem pomocí bluetooth. Stažení dat pomocí software FluorPen 1. Otevřete program Fluorpen (ikona se zeleným listem) 2. Na horní liště v nabídce klikněte na SETUP a vyberte DEVICE ID. 3. Počítač by se měl spojit s fluorimetrem. Vždy zkontrolujte, zda máte zapnutou bluetooth komunikaci na fluorimetru! 4. Po připojení se vám zpřístupní levá horní ikona pro stažení dat do počítače, klikněte na ni a číselné hodnoty parametrů z OJIP křivky se zobrazí v okně DATA. Soubor uložte pomocí ikony s disketou nebo pomocí menu FILE. 5. Po stažení dat vypněte bluetooth na fluorimetru. 6. Dostaňte se do hlavní nabídky a vyhledejte položku DATA BROWSE AND ERASE. Smažte naměřená data a vypněte fluorimetr dlouhým stiskem tlačítka MENU. 7. Zaznamenejte si do protokolu požadované parametry. 8. Přepněte dole na záložku GRAPH. Prohlédněte si získané OJIP křivky a pomocí funkce printscreen si je přeneste do dokumentu, který následně vytiskněte. 9. pomoc v boji se softwarem či tiskem požádejte vyučujícího. Nevíte-li si rady, požádejte o asistenci vyučujícího. Selže – li všechno, použijte anglický manuál 14
