Reakce mikroorganismů na změny v prostředí • • • • • • • •
Co je adaptace? →odpověď na stres Co je stres? Změna teploty (teplo nebo chlad) Výživa (nedostatek nebo toxicita) Světlo (množství/ kvalita Tlak (obvykle vodní) O2 (přítomnost/nepřítomnost)
Typy extremofilů • • • • • •
Acidofilní pod pH 3 Alkalifiní nad pH 9 Endolitní v pórech hornin Halofilní min. 0,2M NaCl Hypertermofilní 80-122 oC Piezofilní – odolávají zvýšenému hydrostatickému tlaku
Typy extremofilů • • • • • •
Polyextremofilní – více kategorií najednou Psychrofilní –kryofilní rostou až do -15 oC Radiorezistentní Termofilní 60-80 oC Xerofilní – odolávají suchu Termoacidofilní 70-80 oC a pH 2-3
Klasifikace je založena na 16/18S rRNA sekvencích • Hypertermofily náleží buď do řádu Bacteria nebo Archea. • Jsou adaptované k aciditě, kyslíku, nizké salinitě, vysoké salinitě, nízkému redox potenciálu, podle naleziště. • Extrémní acidofilové- aerobní, fakultativně anaerobní a anaerobní kokovité. Rostou mezi pH 1 až 5, s optimem 3. Sulfolobus, Metallosphaera, Acidianus, Stygiolobus • Mírní acidofilové a neutrofilové – většinou podmořské, nízká salinita. Většina jsou striktní anaerobové:Thermoproteus, Pyrobaculum,
Energetika extremofilních bakterií Hypertermofilní bakterie nejsou schopné růstu při teplotě pod 60 C, nejvíce adaptované Pyrolobus fumarii, neroste pod 90 C. Typickým prostředí jsou podvodní vulkány, mořské nebo pozemní. Sirné prameny – dvě vrstvy: horní silně kyselá, kyslík je přítomen, rovněž Fe. Je oranžově zabarvená. Rody: Sulfolobus, Acidianus. Spodní vrstva – černomodrá – Fe. Rody: Thermoproteales, Methanothermus. Podmořské systémy: mělčiny a hlubokomořské. Vysoká koncentrace soli, pH závisí na typu vulkanické činnosti.
Izolace – aerobní i anaerobní vzorky horkých sedimentů, bahna, hornin, půdy a vod. • Většina horkých biotopů je anaerobních vzhledem k přítomnosti sulfanu. • Během vzorkování je nutné chránit vzorky před kyslíkem. • Šokové chlazení nebo okamžitá redukce kyslíku je nutná pro zabránění inaktivace buněk. • Kultura Pyrobaculum islandicum 108 CFU/ml odumřela po 40 min vzdušnění. • Nárůst 1 den až 1 týden po inokulaci • Vzhledem k teplotě, agarové půdy nejsou vhodné, polysilikáty, nebo vyředění pro zisk čisté kultury.
Optická mikroskopie
Složení prostředí pro hypertermofily
• • • • • • • • • • • • • •
Typ Lokality:
pozemní solfatarová pole, parou prohřívaná půda, bahna hlubinné horké prameny geothermální elektrárny
mořský podmořské horké prameny a fumaroly „black smokers“ hlubinné zdroje ropy, oplachované mořskou vodou až do 400 C „bs“
Teploty: povrchové do 100, hlubinné nad 100 Salinita: obvykle nízká 0,1 -0,5% okolo 3% pH: 0,5 – 9 5 - 8,5 , vzácně 3 Plyny a CO2, CO, CH4,H2 CO2, CO, CH4,H2, H2S,S0. Sirné látky H2S S0 S2O3 2-, SO4
Proteiny hypertermofilů • enzymy hypertermofilů a mesofilů jsou si podobné na 40 až 85% • jejich 3rozměrné struktury jsou srovnatelné
• mají tytéž katalytické mechanismy
Methanothermus fervidus
klonování a exprese genů z hypertermofilů v mesofilech • více než 100 genů z hypertermofilů bylo exprimováno v mesofilech • transkripční systém Archaei je více podobný eukaryotnímu, pro expresi v E.coli jsou nutné silné promotory • většina hypertermofilních enzymů se správně skládá při 60oC a zachovává si termostabilitu • ornitinkarbamoyl transferasa z P.furiosus exprese v S.cerevisiae stabilnější než v E.coli
Pyrodictium abyssi
volná energie stabilizace ΔGstab
• ΔGstab= ΔHstab - TΔSstab • volná energie stabilizace proteinu je rozdíl mezi volnými energiemi složeného a rozvinutého proteinu • ΔHstab stabilizační enthalpie • ΔSstab stabilizační entropie
termodynamické studie hypertermofilních enzymů • odehrávají se mimo teplotní rozsah většiny kalorimetrů • provádějí se v přítomnosti guanidin hydrochloridu nebo v pH mimo fysiologický rozsah • teplota denaturací se tak stává fyzikálně měřitelná • rozdíl v ΔGstab je obvykle 5 - 20 kcal/mol • někdy jen 3 -6,5 kcal/mol
mechanismy inaktivace proteinů • „unfolding“ proteinů lze měřit diferenciální skenovací kalorimetrií, cirkulárním dichroismem,viskositou • mezofilní enzymy - irreversibilní rozpad • hypertermofilní proteiny rovněž nevratná denaturace,ale jsou k tomu nutné vyšší množství energie -100kcal/mol • chemické modifikace probíhají jen na denaturovaném proteinu
složení aminokyselin a vnitřní vlastnosti • první statické porovnání mezi meso- a thermoukázalo trend k výměně Gly za Ala, a Lys za Arg. Dnes je jasné, že to není jen primární sekvence, • poněkud více hydrofobních a aromatických AK • nejvíce vlivu má distribuce zbytků a jejich interakce v proteinu • Arg je lépe adaptován k vysokým teplotám než Lys • cystein - nižší obsah (citlivost k oxidaci)
disulfidové můstky • disulfidové můstky, stabilizují protein? • vzhledem k citlivosti cysteinu a disulfidových můstků k vysoké T, 100oC - horní limit pro stabilitu proteinu • serinová proteasa Aquifex pyrophilus obsahuje 8 cysteinů, jsou však chráněné před destrukcí • t1/2 při 105oC - 6 h, pH 9,0 • t1/2 při pH 8 -1 h „unfolded“ struktura
Typy acidofilních mikroorganismů
Alkalofilní mikroorganismy
Aquifex pyrophilus – dělící se buňka s bičíky. Pokoveno Pt, transmisní elektronmikrografie. Úsečka - 1μm
Typy halofilních organismů
hydrofobní interakce
• hydrofobní interakce - stabilizační mechanismus hypertermofilních enzymů • zvýšení stability o 1.3(+/- 0,5)kcal/mol vyvolá každá přidaná methylová skupina
aromatické interakce • aromatické páry jsou definovány vzdáleností menší než 7.0 Ǻ mezi středy fenylových kruhů • α-amylasa z P.furiosus o 5% více aromatických residuí než homolog z B.licheniformis • Thermitasa - Thernoactinomyces vulgaris 16 aro. mesofilní homolog B.amyloliquefaciens pouze 6
Posttranslační modifikace • glykosylace - zvyšuje termostabilitu • posttranslační methylace lysinu • (A-ε-monomethyllysin) nalezen u Sulfolobus
• stabilizace solemi - nejlépe působí K+ a NH4+ • stabilizace substrátem - T.maritima dihydrofolát reduktasa je kineticky stabilizovaná substráty, NADPH 6tinásobné zvýšení t1/2 při 80oC
Thermoproteus tenax - 1 • hyperthermofilní Crenarcheum Thermoproteus tenax roste chemolithoautotrofně na H2, CO2, a So • nebo chemoorganoheterotrofně v přítomnosti So a různých organických substrátů • pro metabolismus glukosy užívá variantu EmbdenMeyerhof-Parnasovy dráhy, právě tak jako dráhu EntnerDoudoroff • varianty EMP - hexokinasa bez regulačních vlastností - fosfofruktokinasa závislá na Ppi - dvě glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenasy (GAPDH)
Thermoproteus tenax- 2 2 glyceraldehyd 3 – fosfát dehydrogenasa (GADPH) -Klasická fosforylační GADPH -Allosterická nefosforylační GADPH -Pyruvát kinasa PH bez allosterického potenciálu -Kontrolní bod EMP pro T.tenax je na úrovni rovnováhy mezi glyceraldehyd 3 – fosfát / 3- fosfoglycerát
Thermoproteus tenax-3 Enzymy T.tenax podobně jako ostatní archeální pyruvát kinasy se liší od bakteriálního typu omezenou regulovatelností. Přeměna pyruvátu na PEP - PEP karboxykinasa Fosfoenolpyruvát syntasa PEPS Pyruvát + ATP + H2O ↔ PEP + AMP + Pi Nalezena u P.furiosus cca 2.25MDa
Thermoproteus tenax - 3 • přeměna fosfoenolpyruvátu a pyruvátu - významný klíčový bod EMP dráhy u všech bakterií a eukaryot • situace u Archae méně jasná • koexistence fosfoenolpyruvát syntetasy (PEPS) a pyruvát fosfát dikinasy (PPDK), které se kromě pyruvát kinasy (PK) účastní této reakce u hyperthermofilní crenarcheoty T.tenax • geny pocházející z T.tenax naklonovány v E.coli • enzymové a regulační vlastnosti rekombinantního produktu se testovaly
Thermoproteus tenax - 4 • PEPS katalyzuje jednosměrnou přeměnu pyruvátu na fosfoenolpyruvát • PPDK (pyruvát fosfát dikinasa) má dvousměrnou aktivitu s preferencí pro katabolickou reakci • na rozdíl od pyruvát kinasy T.tenax, která je regulovaná na úrovni transkripce, ale vykazuje jen omezený regulační potenciál na úrovni proteinu, aktivity PEPS a PPDK jsou modulovány ATP a intermediáty metabolismu cukrů • exprese PEPS je regulovaná na úrovni transkripce jako odpověď na nabízený zdroj uhlíku (Northern blot analysa)
Pyrrococcus horikoshii • Hyperthermofilní β-1,4 endoglukanasa (EGPh) z hyperthermofilního archaeonu Pyrococcus horikoshii vykazuje silnou hydrolytickou aktivitu ke krystalické celulose. • Charakteristické rysy EGPh jsou: (1) zdá se, že má disulfidické vazby, které jsou vzácné u proteinů anaerobních hypertermofilních archeonů, a • (2) postrádají vazebnou doménu pro cukr, která je nezbytná pro účinnou hydrolyzu celulosy.
Pyrrococcus horikoshii 2 • Nejprve studovali vztah mezi disulfidickými vazbami a katalytickou aktivitou pomocí různých mutant pro cystein. Aktivita mutovaných enzymů ke karboxymethyl celulose (CMC) se zvyšovala bez ztráty thermostability. • Dále byly připraveny fuse tak, že thermostabilní doména k chitinu pro chitinasu z P. furiosus byla připojena C-konci EGPh a jeho variant. Tyto fuse enzymů vykázaly vyšší aktivity než divoký typ EGPh jak ke CMC a krystalické celulose (Avicel).
Získávání energie u hyperthermofilních chemolithoautotrofů • 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
• • • • • • •
Methanothermus
H2 + S0 → H2S Pyrodictium 2 H2 + H2SO4 → H2S + 4H2O Archaeoglobus H2 + HNO3 → HNO2 + H2O Pyrobaculum H2 + ½ O2 → H2O Pyrobaculum 2 S0 + 3 O2 + 2H2O → 2 H2SO4 Aquifex 2 FeS2 + 7 O2 + 2H2O → 2 FeSO4+ 2 H2SO4 Acidianus
Typy fermentací - reakce poskytující energii u heterotrofních hyperthermofilů • Pyruvát → L(+)-laktát + acetát + H2 + CO2 • Thermotoga, Thermosipho • peptidy → isovalerát, isobutyrát, butanol, CO2 , H2 • Pyrodictium, Hyperthermus, Thermococcus • Pyruvát → acetát + H2 + CO2 • Pyrococcus
Reakce poskytující energii u heterotrofních hyperthermofilů
• respirace S0
2 [H] + S0 H2S
Thermofilum • Desulfurococcus SO42- (S2O32-,SO32-) +2H+ H2S + 4 H2O
• Sulfolobus, Metallosphaera
•
O2 2 [H] + 1/2O2 H2O
Populace žijící v permafrostu
Psychrofilní mikroorganismy a proteinové inženýrství • Adaptace na extrémní teploty? • Specifické strukturní vlastnosti • Chladově aktivní β-galaktosidasa (BgaS) izolovaná z Arthrobacter sp. • Vykazuje 50% aktivity při 0oC • Podobně jako u E.coli- tetramer, monomery neaktivní • BgaS je termolabilní nad 25oC a po 10 min při 37oC zcela ztrácí aktivitu • Využitím znalostí β-galaktosidasy z E.coli – specifické mutace • BgaS7 2,5x vyšší aktivita při 15oC, hydrolyzoval 80% laktosy v mléce za polovinu času než BgaS při 2,5oC
