q
, 1
Bul. Agron. (31) (2) 63 - 67 (2003)
Transformasi Genetik Tanaman Kentang cv. Atlantik Dengan Mengintroduksikan Gen Hordothionin untuk Mendapatkan Ketahanan terhadap Penyakit Bakteri
Genetic Transformation of Potato cv. Atlantic by Introducing Hordothionin Genefor Engineering Bacterial Disease Resistance ~urhasanah'),G . A. wattimena1),Agus ~urwito'), Ni Made Armini ~ i e n d i ' ) suharsono2) , ABSTRACT Hordothionins are small anti-bacteria proteins present in barley endosperm. To reveal the potential of this proteins for engineering bacterial disease resistance into potato, a semi-synthetic hordothionin gene construct was introduced in potato cv. Atlantic via Anrobacterium tumefaciens strain LBA 4404, under the control of a caul~jlower mosaic virus (CaMV) 35s promotor. The in vitro grown stem (internodus) was used in this research. Afer 6 weeks in regeneration medium and 2 weeks in rooting medium there were 22 regenerated plants that were screened in kanamycine containing medium. PCR analysis using spesrfic primer from CaMV 35Spromotor showed the presence of ampl19ed T-DNA in 4 transgenic lines from 22 putative transgenic plants were tested. The in vitro toxicity against Ralstonia solanacearum tested from transgenic lines showed variation in resistance level. There were only 2 of the transgenic lines were tolerant, while one of them was moderate tolerant even one of them was susceptible. Key worh : Potato, Hordothionin gene, Disease resistance PENDAHULUAN Latar Belakang Kentang adalah salah satu tanaman pangan yang paling produktif dan ditanam secara luas di dunia. Kentang memproduksi kalori kurang lebih dua kali lebih banyak dibandingkan padi dan jagung. Kentang juga bergizi tinggi, sebab mengandung konsentrasi vitamin C yang cukup tinggi dan asam amino essensial yang baik untuk nutrisi manusia (Poehlman dan Sleper, 1996). Kendala utama dalam budidaya tanaman kentang adalah tingginya tingkat serangan hama dan penyakit yang dapat menurunkan produksi tanaman kentang (Mahmud, 1990). Salah satu penyakit yang penting dan banyak menyebabkan kemsakan pada tanarnan kentang adalah penyakit-penyakit bakteri. Penyakit bakteri mempakan penyakit yang secara ekonomi sangat penting untuk daerah tropik, termasuk Indonesia. Hal ini dikarenakan kelembaban dan temperatur yang cukup tinggi, sehingga sangat disukai untuk pertumbuhan bakteri dan kondisi ini mempakan
faktor pembatas untuk budidaya tanaman kentang (During et al., 1993; During, 1996; Hayward, 1991; Montanelli et al., 1995; Mahmud, 1990). Menurut Mahmud (1990), secara umum penyakit bakteri lebih sukar dikendalikan dibanding penyakit lain, dan tidak ada bahan kimia yang dapat digunakan untuk mengontrol penyakit-penyakit tersebut. Cara yang dapat diterapkan untuk mengatasi masalah tersebut yaitu dengan penggunaan kultivar yang resisten atau toleran terhadap penyakit tersebut, sertifikasi benih dan rotasi tanaman. Untuk mendapatkan kultivar bam yang memiliki resistensi tinggi terhadap serangan penyakit dan sesuai untuk kebutuhan konsurnen perlu dilakukan program pemuliaan tanaman yang dapat diterapkan melalui persilangan konvensional dan teknik rekayasa genetika tanaman. Pemuliaan tanaman secara konvensional untuk mendapatkan kultivar kentang yang resisten terhadap bakteri menghadapi berbagai kendala. Kendala itu disebabkan gen resisten terdapat pada spesies kentang yang diploid atau gen-gen anti mikroba yang terdapat pada organisme lain (Rich, 1983; During, 1996). Oleh
1) Laboratorium Bioteknologi Jurusan Budidaya Pertanian IPB JI. Meranti Kampus IPB Darmaga. TelpFax (0251) 629353 2) Laboratorium Genetika Pusat Peneiitian Biaeknologi Institut Pertanian Bogor.
"";
Bul. Agron. (31)(2) 63- 67 (2003)
k~ena itu penerapante~
-
, : -'c..'c:
I ;;;~;; ~~~
:;~~~~~"";;
rekayasagenetika dapat
.il~"
BAHAN DAN METODE
dlgunakanuntuk mengataslpermasalahan tersebut. Teknik rekarasa genetika p.ada tanamankentangdapat d lakukan
Konstruk..\"i GenHordothionin dan PenyiapanBakteri . . Gen hordothiomn yang terdapat pada plasmid p~INPLUSth (pDFI030) (koleksi Dr. Willem J. Sttek~mada~ CPRO-DLO ~elanda) terdiri daTi tiga domain,. !attu, sekuen .SI~nal peptida, sekuen hor~othlomn daD sekuenacIdIc peptida yang berasal
'
t~z~ :t:~~; I ,;.;;
I dengan berbagat cara antara lain dengan bantuanAgrobacteriumtumefaciens(Stiekema,1988). Beberapagen-genpenyandi peptida anti mikroba yang digunakan dalarn rekayasa genetika untuk ~en~pa~an ketahananterhadappenyakitbakteri telah dlapl1kasikan pada tanarnan solanaceae, khususnya
:..
tanarnan tembakau yang umunya dipakai sebagai model
~
I
dalarn sistem.transformasi. Beberapabasil penelitian yan~ t~~ahdll~ memberikan basil yang cukup menjanjikan dl masa mendatanguntuk mendapatkan tanam.anyan~ mempunyai resistensiterhadapbakteri, sepertlcecropm,attacin, tachyplesinI dan thionin. Hordothionin, yaitu thionin yang terdapat pada endospermatanarnanbarley adalah snatu protein anti bakteri yang dapat meningkatkan resistensi tanaman terhadap serangan bakteri berdasarkan penelitian Florack. e~ al. (1994), yang menggunakan gen hordothiomn yang ditransformasikan pada tanaman te~bakau dan menunjukkan adanya toksisitas invitro d~ tanarnan tembakau terhadap beberapapenyakit
sItus .Ec~R!/~~mHl p~da pBINPLUS (Garnbar I). Plasffild 1m di.mtroduksikankedalarn Eschericia coli DH5~ .(kolek.sl Dr. Suharsono,Lab. Genetika Pusat Penel1ttan Bloteknologi lPB) sebagai inang untuk memperbanyak dan selanjutnya dintroduksikan ke dal~ Agro~~cterium tumefaciensLBA 4404 (koleksi Balat Penel1ttanPerkebunanKaret Taman Kencana Bogor) denganmetodakonjugasitiga tetna (triparental mating) denganbantuanbakteri penolongE. coli HE 10I (p~ ~013~ (koleksi Dr. Antonius Suwanto, Lab MikroblOlogI Pusat Penelitian Bioteknologi lPB). B.akteri basil triparental mating ini selanjutnya dlgunakanuntuk mentransformasitanamankentang.
,
akibat serangan bakteri pada tanaman solanaceae.
!
Penelitianini bertujuanuntuk mendapatkan tanarnan
;~~
:
! C.j:
kenta~g transgenik yang resisteD terhadap penyakit
pCPO5 (Florack et al., 1994) dan diklonkan pada
..
bakten.
i
',
, :,
.
, ,
;
s
"Of
r
Hordothionin expr~~;~~3~ector 10kb
\
Signalpeptida
Hordothionin
Acidic polipeptida
p nos NPTII
:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::1111::11~~~::::::::::::::: ::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::~~:~1::::1:::~::::::
~ ~
~ ~~ ~
;
GEN
on pBR g4 ~
LB
I
GarnbarI. Petapla.s~dpBINPL~~th (pDFIO~O).G~nhor~othionin dengantiga domainyaitu: signal peptida,gen hordothlonm dan aCIdic polypepttda dnnsersikan pada plasmid pBINPLUS menghasilkan plasmid pBINPLUSth (pDFI030).
: i
Persiapan. Eksplan, Transformasi, Kokultivasi dan Regenerasl
!
Eksplan mas batang (internodus) dari tanarnan kentangin vitro kultivar atlantik (koleksiProf. Dr. G. A. Wattimena, Lab Bioteknologi Tanaman Jurusan B.u~idaya Pertanian lPB) yang berornur 4 minggu dlslapkan dalarn cawan petri,
"
dan ditransformasi
penambahan antibiotika kanarnisin 100 mg/l daD ti . . ce otaxime 500 mgil. Subkultur dllakukan dengan pemi~dahanke mediumyang sarna2minggu sekaliatau ses~ kebutuhan dan eksplan yang bertunas dlpmdahkan ke medium pengakarandengan penambahankanamysin100mg/l daDcefotaxime250 mg/l. ..
dengan kultur bakteri LBA 4404 (pDF 1030) selarna 15
AnahslS Tanaman Transgenik
menit. ~elanjutnyaeksplan di~okultivasi sel~ma2 hari daD dltanarn dalarn medIa regenerasl dengan
Tanaman yang mampu bertahan tumbuh dalam medium seleksikanamisin selanjutnyadiuji keberadaan
,
64
Nurhasanah,G. A. Wattimena,Agus Purwito, Ni Made Annini Wiendi, Suharsono
,
'ci!'o~~~;,,:,,-
-
--
Bul. Agron. (31) (2) 63 67 (2003)
1:;:',,[ c
.:
I
!
gennya dengan analisa PCR dengan menggunakan
I
primer dari promotor CaMv 35S, yaitu 5'-
telah ditransformasidenganLBA 4404 (pDF1030)
t
CTGCATGCTTCACGGTGCAAGC-3 (forward primer) daD 3'-CAAGCGAGGAGGTGCGACTTC-5 (reverse primer). Kondisi PCR dilakukan pada
setelah enam minggu dalam media regenerasiyang mengandungkanamisin,mulai beregenerasimembentuk tunas yang didahului denganpembentukankalus pada
denaturasi awal 94°C 2 menit, denaturasi 94 °C 1 menit,
eksplan
annealing56 °C 1 menit,extension72°C2 menit(35
ditransformasidengan AgrobacteriumLBA 4404
siklus).
kosong (tanpa plasmid pDF1030) yang digunakan
juga dilakukan untuk menguji ketahanannyaterhadap Ralstonia solanacearum. Tanaman transgenik yang berumur 4 minggu diinokulasi secarain vitro dengan inokulum yang berasal dari kentang pada konsentrasi 1.2 X 109Colony Forming Unit (CFU) per ml bakteri. lnokulasi dilakukan dengan menggunting daun kedua/ketigadari pucuk denganmenggunakanglinting yang dicelup dengan inokulum bakteri setiap kali infeksi. Tanamanyang telah diinokulasi diinkubasipada suhu 20-25°C daD dilakukan pengamatan terhadap periodeinkubasidaDkejadianpenyakit.
dipindahkan ke medium regenerasimulai menguning daD mati. Hal ini menunjukkan ketidak mampuan tanaman atlantik normal untuk tumbuh di dalam mediumyangmengandungkanamisin. Sebagian besar ku1tur dari eksplan yang ditransformasi yang tidak mampu membentuk tunas selanjutnyamulai menguningdan mati. Kematiankultur yang ditransformasi ini dapat diakibatkan oleh kegagalantransformasieksplan sehinggatidak mampu bertahandalam medium yang mengandungkanamicin. Barret et al. (1997), menyatakan bahwa kerugian transformasi genetik tanaman dengan menggunakan Agrobacteriumdikarenakanbanyaknyaterjadi kematian kultur yang dapat diakibatkanoleh kontaminasibakteri Agrobacterium yang tidak terbunuh oleh antibiotik cefotaxime karena sulitnya untuk mengeliminasi pertumbuhan Agrobacterium sehingga mengganggu pertumbuhan kultur daD mengakibatkan kematian karena tingginya konsentrasi antibiotik pembunuh Agrobacterium yang ditambahkan kedalam media regenerasi.
.
I
t
Analisatoksisitasinvitro padatanamantransgenik
,
HASIL DAN PEMBAHASAN Gen hordothionin dalam plasmid pDF 1030 telah berhasil diintroduksikan ke dalam E. coli DH5a yang digunakansebagaiinang untuk memperbanyakplasmid. Metoda triparental mating yang dilakukan juga telah berhasil memindahkanplasmid pDF 1030 ke dalam Agrobacterium strain LBA 4404. Koloni LBA 4404 (pDF 1030)ini selanjutnyadigunakanuntuk mentransformasitanamankentang.
Eksplan tanaman kentang kultivar atlantik yang
(Gambar
2).
Tanaman
atlantik
yang
sebagaikontrol mulai daTiminggupertamasetelah
~c
-+
... Gambar2. Perkembangan eksplanpadamediaregenerasi: a. Eksplanbertunasb. eksplanmenguningdaDmati . Kultur yangbertunassetelahdipindahkanke dalam medlu~ pengakaranyang mengandungkanamisin dan cefotaxlmemampumembentukakar setelah1-2 minggu di dalam medium pengakaran. Dari 500 eksplanyang ditransformasidiperoleh 22 kultur dugaan transgenik
yang mampu tumbuh denganbaik menjadiplantlet di dalammediumseleksikanamisin.Selanjutnyakultur ini diperbanyakdenganstek satu nodus di dalam medium kultur yang ditambah kanamisin untuk dilakukan pengujianlanjutan.
Transfromasi GenetikTanaman KentangCV. Atlantik...
.':~
65
~~~~~;;;;t;;;,ccc~£~
,:-",,~i~~~C
; :j.r
Bur. Agron.
(31) (2) 63
-
67 (2003)
, .
i{
~ ,, i
!,
: 11
Dari basil analisis PCR dengan menggunakan
tanamankentang. Sedangkantanaman-tanaman lainnya
primer dari promotor 35S CaMV yang dilakukan pada
yang tahan terhadap media kanamisin (lolos dari media
22 tanaman dugaan transgenik didapatkan 4 tanaman yang positif dapat teramplifikasi (Gambar 3) yang ditunjukkan dengan munculnya pita pada ukuran :t400bp. Hal ini menunjukkan bahwa gen yang diintroduksikan berhasil masuk ke dalam genom
seleksi kanamisin) tetapi tidak memberikan basil positif daTi uji PCR mungkin merupakan tanaman yang tumbuh dari bagian sel eksplan yang tidak bersentuhan dengan medium kanarnisin.
"-"")-\"11.o1""41:11-01'8'138!i ~~ "C'-' ., ~
~
,
g
".-,j"~
~~ ~
'"
2
-.
" ".,
";,,2"...,2__2'_4,02"-._"-"";0,, t-" ;]; ~
" ., , .
',Co
"
, ,: ~ !'!, ~
~ ~
Garnbar3. Hasil analisisPCR pada22 tanarnankandidattransgenik(tahanmediumseleksikanamisin),Terlihat adanya bandpadaukuran:t 400 bp. Marker DNA A.500 bp.
,
~ }
Hasil pengujian toksisitas in vitro terhadap Ralstoniasolanacearummenunjukkantingkat resistensi yang bervariasidaTikultur transgenik(Tabel 1). Dimana dari keempatkultur transgeniktersebuthanya 2 kultur yang toleran terhadap Ralstonia solanacearum sedangkan1 diantaranyamoderat tolerant clan 1 lagi
rentan. Tingkat resistensi yang bervariasi ini dipengaruhi oleh ekspresi dan gen hordothionin yang diintroduksikan,yaitu olehjumlah protein hordothionin yang dihasilkan(Florack et al., 1994)tetapi hal ini suiit dibuktikan karenadalam penelitian ini tidak dilakukan isolasiprotein hordothionindari tanamantransgenik.
Tabell. Pengujiantoksisitasinvitro terhadapRalstoniasolanacearum Nomor tanaman tr .k rransgemK
P . d . rob . eno e m asl
K . d' k. eJa ~ Ian penya . ~ It
12A (Transgenik+) 12B (Transgenik+) 13A (Transgenik+) 28 (Transgenik+) Atlantik
15 6 9 14 7
15 100 35 15 100
Berdasarkanbasil penelitian ini dapatdisimpulkan bahwa: 1. Transformasi genetik tanaman kentang dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens yang dilakukan mampu meregenerasikan :t5% dari eksplan menjadi kultur yang dapat tumbuh dalam !1lediumseleksi. 2. Didapatkan4 kultur transgenikdaTibasil introduksi gen hordothionin kedalam genom tanamankentang berdasarkanbasil analisisPCR. 3. Hasil pengujiantoksisitasinvitro terhadapRalstonia solanacearum,menghasilkan2 tanamantransgenik yang toleran, 1 kultur moderattoleran clan 1 kultur rentanterhadappenyakit ihi.
66
T. k . . mg - at reslstensl Toleran Rentan Moderattoleran Toleran Rentan
UCAPAN TERIMA KASIH ProyekRUT VIII atasnamaAgus Purwito dengan judul "Metoda Transgenik clan Fusi Protoplas untuk Merakit Klon Kentang Tahan Penyakit Busuk Lunak clanLayu Bakteri" yang mendanaipenelitianini.
DAFfAR PUSTAKA Barret, C., E. Cobb, R. McNicol, G. Lyon. 1997.A risk assessm~ntstudy of plant genetic transformation using agrobacteriumand implications for analysis of transgenicplants. Plant Cell Tissue and Organ Culture47: 135-144.
NU'ha~.noh' G.A. Wattimena, AgusPurwito,Ni MadeArminiWiendi,Suharsono
j
-
Bul. Agron. (31) (2) 63 - 67 (2003)
During, K., M. Fladung,H. L6rz. 1993. Antibacterial resistanceof transgenicpotatoplantsproducingT4
,
lysozyme do/am Fritig,
-"
Bomard dan
Mahmud, M. 1990. Penyakit bakteri tanamanpangan dan hortikultura di IndonesiaDa/am Perlindungan
Michel
Tanaman
Legrand. Mechanismsof plant defenseresponses. Kluwer AcademicPublishers.p. 437-440.
t
(eds).
Prawiroesoemardjo,
S.,
D.
Sudarmadji,Harsono, I. S. Basuki. PT. Agricon. Hal 233-251.
During, K. 1996. Genetic engineeringfor resistanceto bacteria in transgenic plants by introduction of foreign genes.Molecular Breeding.2: 297-305.
Montanelli, .C., A. Chiari, T. ~hiari, F. St~fanini, G. Nascarl. 1995. EvaluatIon of resIstance to Pseudomonas so/anacearum in potato under controlledconditions.Euphytica.81: 35-43.
Florack, D. E. A., W. G. Dirkse, B. Visser, F. Heidekamp,W. J. Stiekema.1994. Expressionof biologically active hordothionins in tobacco. Effects of pre- and pro-sequences at the amino and carboxyl termini of the hordothionin precursoron mature protein expression and sorting. Plant Molecular Biology. 24: 83-96.
Poehlman,J. M., D. A. Sleper. 1996. Breeding Field Crops4rd.Iowa StateUniversity Press.494 halo Rich, A. E. 1983.PotatoDisease.AcademicPress.238 halo Stiekema,W. J., F. Heidekamp,J. D. Louwerse,H. A. Verhoeven, P. Djikhuis. 1988. Introducing of foreign genes into potato cultivars Bintje and Desiree using an Agrobacterium tumefaciens binary vector.PlantCells Report.7: 47-50.
Hayward, A. C. 1991. Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas so/anacearum.Ann. Rev. Phytopathol.29: 65-87.
,.
,
1
,
::::~~:~:t~ ;,.
~
!
-,
',"~~'~":;;
30:;
~
"'" ,
~, .. ~.'.
i¥
ti c
-~
~'"
-
~: ,
i
~
~7.
TransfromasiGenetikTanamanKentangCV. Atlantik,..
67
