~- Bul. Agron. (29) (2) (2001) tl ').- : '; I' "~ " :j; ABSTRACT

1;-

~

::

Bul. Agron.(29)(2) 40- 49 (2001)

~-

tL

.-

') I' "

:

'; "~ :j;

, ,, j,

...:;,:;

'I 'I

l' I' ;

,i

PemetaanMarker AFLP untuk MembuatPetaGenetikBit Gula

i

Mapping of ALP Marker to Constructa GeneticMap Sugar Beet

,'"

; i , #

Asep Setiawan!)

!

~

i'

1 i!

ABSTRACT

r

j!

One hundred eighty two AFLP marker using primer combination of EcoR//MseI and PstI/MseI were used in this

,J

i,

study to create a DNA marker genetic map of Sugar beet. In average each primer combination yielded 15.5

1:

polymorphicband.AFLPmarkerusingprimercombination of EcoR//MseI signifcantly yieldedmorepolymorphicband than PstI/MseI. From this study a high densityDNA marker map coverageall nine chromosomesof sugar beet with

!

I

,

totallylengthof 744cM Haldanewasestablished.

.!

Ii

i

Key words: AFLP, Genetic map, Restriction enzyme, Polymorphic

,;;il

~

ci

,l :

';! ;"

PENDAHULUAN

Botstein, 1989, Yano et al., 1997, Setiawan et al.,

Peta genetik terbukti bennanfaat sebagai alat untuk studi genetik. Pembuatan peta genetik pada dasanya

2000). Peta keterpautan dengan jarak antar marker lebih daTi 5 cM dikategorikan sebagai peta yang berdensitas

berprinsip pada fenomena keterpautan antara antara dua gen yang telah lama dikenal oleh Punett daD Bateson

rendah atau moderat (Tanksley, et al., 1992). DNA marker berbasis PCR Amplified

':

(Suzuki et al., 1986). Dua gen dikatakan terpaut apabila allel-allel dari keduagen yang berasaldari tetuayang sarnaseringatau

Length Polymorphism (AFLP) yan menjanjikan hasil bebas dari artefak daD dapat diandalkan telah diperkenalkan oleh Vos et al. (1995). Keunggulan

-oil ~, :'

:.

senantiasa dijumpai pada individu yang sarna. Jarak antara dua gen yang terpaut dinyatakan dalam cM. Satu

AFLP selain untuk tanaman telah pula ditunjukkan oleh Majer et al. (1996) untuk studi biologi molekular daD

~-

,

: ;

;

, l

!

I: , ij

1

cM didefinisikan sebagaipeluang, bahwa 1% rekombinan akandijumpai dari suatupersilangan.Gen dengan jarak I cM akan lebih sulit terpisah dibanding gen dengan jarak 2 cM. Dengan berkembangnyamarka molekular, keterpautangenetik kini menjadi semakin penting untuk dikaji daD penggunaannyasemakin meluastidak hanyaoleh ahli genetiktapi juga oleh para pemuliadan ahli biologi molekular. Petaketerpautanberdensitastinggi untuk beberapa tanamansepertipadi dengan 1300marker (Kurata et al 1994), tomat dengan 1030 marker (Tanksley, et al.,

Fragment

keragamangenetikpadacendawan. Teknik AFLP berbasiskanamplifikasi selektif dari

,; (jo i

:::1 ;~

1

1

I

~

i

fragmen-fragmenDNA hasil restriksi dari total genomic DNA denganensim restriksi endonuklease(V os et al., 1995). Teknik ini melibatkantiga tahapanutama yaitu: Restriksi DNA daD ligasi adapter-adapter,amplifikasi selektif dari fragment-fragmen restriksi (restriction fragments),daDanalisisgel dari produk amplifikasi. Tujuan

1992), daD Kedelai dengan 840 marker (Keirn et al., ] 997). Peta keterpautandengan densitastinggi dapat berfungsi untuk berbagai keperluan seperti untuk kromosom walking (Wickman dan Williamson, 1991),

Studi ini bertujuan untuk menilai efisiensi AFLP marker dalam menghasilkanmarker polimorf, membandingkandua ensim pemotongjarang yaitu Eco RI

marker-based selectionuntuk memepercepat program pemuliaan (Tanksleyet al., 1989;Paterson et al., 1988)

dan Pstl dalam menghasilkan marker polimorf dan membuatpeta keterpautan marker padatanamanbit

dan untuk mendeteksi dan karakterisasi lokus yang mengendalikan sifat kuantitatif atau untuk memfasilitasi

gula yang akan digunakan pada tahap selanjutnya yaitu sebagai basis pemetaan QTL bagi sifat resistensi

diseksi sifat kuantitatif kedalam faktor-faktor genetik

terhadappenyakitbercakdaunCercospora.

yang diskret (Paterson,et al., 1988; Lander daD

I

.

i I

~

l

-"

c

I) StafPengajarJurusanBudidayaPertanianIPB, Bogor

~

.. 40

. ,

;;;j

j

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

BAHAN DAN METODE EkstraksiDNA . ~

t tu ea.

P

.

Untuk DNA sebanyak 5 gram daun d. b ' l ekstraksi F D d. segar b.t d " lam I arl setlap tanaman 2. aun yang lam I diusahakanyang belum terlalu tua dan tidak kotor. Selanjutnyadaun di masukkandalam kantong plastik dan dikeringkan dengan pengering vakum (vacuumdryer) selama 3 hari. Daun yang telah kering selanjutnyadisimpan pactasuhu 20 ° C menunggusaat ekstraksitiba. Tepung daun yang acta didalam tabung 50 ml selanjutnya dicampur dengan buffer untuk ekstraksi DNA dan diinkubasi pactasuhu 65° C selama30 - 60 menit. Selanjutnya campuran kloroform-isoamil alkohol (24:I) denganvolume sebandingdengan buffer untuk ekstraksiDNA ditambahkandalam setiaptabung. PemisahanDNA dengankomponen set lain dilakukan dengan sentrifugasi (20 °C 7500 RPM, 20 menit, sentifugal tipe J2-HC Beckmann).Larutanjernih yang, mengandungDNA selanjutnyadipindahkanke tabung 50 ml lain yang baru. Isopropanol ditambahkan lalu tabungditaruh dalam es selama30 menit. SetelahDNA terpresipitasi, selanjutnya DNA dipindahkan kedalam tabung reaksi 2ml. Pelarutan DNA selanjutnya dilakukan dengan menggunakanI - 2 ml O.I x TE. KonsentrasiDNA selanjutnyaditurunkan hingga 10 12ngiuL. Untuk menguji mutu DNA dilakukan uji restriksi. Secaraacak 20 sample DNA diambil untuk direstriksi denganEcoRI. 100ng DNA di cerna(digesting)dengan -

basil silanganduatetuayaitu no 93164Pdan no. 95098P digunakanprogram Mapmaker/EXP3.0 (Lander et al., 1987; Lincoln et al., 1993). Marker-marker dalam kromosom dikatakan terpaut apabila mereka tidak bersegregasisecarabebas.Perintahgroup denganLaD skore = 4 dan jarak 25 cM Haldaneditetapkansebagai kriteria untuk menetapkanketerpautan antar marker. Prosedur detail penggunaanMapmaker dapat dilihat pactamanualMapmaker/exp3.0.

menggunak~ 5 unit ~nsimEco RI. Hasil analisade~gan elektroforeslsmenunJukkanseluruh sampleDNA tldak mengalamipartial digestion.

AFLP dilaksanakan sesuai uraian Vos et al. (1?95). Pre.amplifikasidil~ukan dengan dua primer

ElM nyata lebih tinggi dari pactayang dihasilkan oleh PIM. (TabeI1.). Pacta studi ini 217 lokus AFLP marker telah dianalisa. Contoh pola pita AFLP dapat dilihat pacta gambar 1. Secara keseluruhan 14 primer kombinasi yang digunakanmenghasilkansecararata-rata 15.5pita I' rf po Im~e~nggulanAFLP telah dilaporkan oleh banyak

ollgonukleotldEco RI-A (pnmer y~g homolog dengan adapterEco RI dan Msel~C (pr~meryang. ~o~olog dengan adapter Msel), setlap prImer memlllkl satu n~kleotida selektif. Preamplifikasi ~an amplifikasi dllakukan d~ngan.menggunakanPerkIn Elmer 9~00. PelabelanprImer dlla~uk~ dengancaramelabelprImer

penulis setelah teknologi AFLP diintroduksikan oleh Vos et al. (1995). Banyak peta marker telah disusun dengan menggunakanAFLP marker. Pactabit gula misalnya oleh Schondelmaieret al. (1996) dan Barnes et al. (1996).Penyusunanpetamarkerberdensitastinggi padakentangjuga telah dilakukanoleh Qi dan Lindhout

Eco ~ +3.de.n~an radloaktlfgamma P33~ATP. P~oduk ampllfikasl dlpls~kan pada polyacryl~lde gel 6 Yo, 60

(1997) serta van Eck et al. (1995). Keunggulan salah satunya adalah karena marker ini efisien

w.att. selama leblh. k~rang 1?0 memt. Setelah gel dlkenngkan d~teksl smyal dll~uan dengan menggunakanfilm smar X (Kodak Blomax MR-I, Eastman Kodak)selama2 - 3 hari dalamkasetfilm sinarX.

menghasilkanpolimorfisme dibanding marker lainnya (Schondelmaier, et al., 1996). Studi ini juga menunjukan hal serupa AFLP dinilai efisien menghasilkanpita polimorf:

t ;

I

I f i ,

,

:

.

Metode yang dlgunakan pacta pnnslspnya sepertl yang telah diuraikan oleh Saghai-Maroof et al. (1984).

i r

!f

. .

Skoring datadilakukan secaramanualdengancara memberiskor A/C atauBID untuk satuAFLP marker.A = tidak actapita, C = actapita yang diperolehdari tetua I. B = tidak actapita, D = actapita yang diperoleh dari

AnalisisAFLP

. r

. " i

2

t

t

'

enyusunan pe a gene Ik

Untuk menyusun peta genetik dari populasi F2

HASIL DAN PEMBAHASAN Dalam penelitian ini 189 DNA total dari tanaman F2 dan tetuanyadianalisa menggunakanteknik AFLP. Delapan primer kombinasi Eco RI/Msel (ElM) dan enam primer kombinasi PstI/Msel (PIM) digunakan dalam penelitian ini. Ke 15 primer kombinasi ini diperoleh d'iifi basil screeningprimer yang dilakukan terhadap7 tanamanF2. Ke 8 ElM primer kombinasi menghasilkan151 pita polimorf atau rata-rata 18.8 pita polimorf per primer kombinasi. Kombinasi PIM primer menghasilkan66 pita polimorf denganrata-rata 11 pita polimorf per primer kombinasi. Secara-rata-rata jumlah pita polimorf yang dihasilkan oleh kombinasi primer

AFLP dalam

I

I I

r~

AsepSetiawan

.

41

,

" ; !;

r ': i

!

---

j-

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

j,. Cc

Table 1.

Pita polimorf AFLPpada189tanaman F2.Menggunakan kombinasiprimerE/M = EcoRI/MseIclanP/M = PstI/MseI).

PrimerkombinasiE/M

Jumlahpita polimorf

PrimerkombinasiP/M

Jumlahpita polimorf

E35/M62 E35/M51 E35/M47 E35/M50 E34/M59

12 14 17 19 21

P34/M50 P31/M50 P32/M47 P33/M59 P31/M59

9 10 10 10 11

~~~~~~

~~

P33~47

1_6

E31/M62

28

-

-

Total Mean .t std')

151 18.9.t 5.0

Total Mean.tstd

66 11.0+ 2.53

-

. ~ 1.! 1 1

i

'

') Std = standardeviasi;Berdasart-studenttest (a = 0.01),jumlah rata-ratapita polimorftkyang dihasilkanoleh kombinasiprimer E/M nyata lebih tinggi dari padaP/M (thinmg = 3.864> t.abel = 2.90).

.

Dalam percobaandengantanamansugarbit, dari 5 gram daunsegarrata-ratadapatdiperolehsebanyak200 ug DNA.. Digunakannya5 gram daunmengingatselain AFLP analisaRFLP juga akan dilakukan padapopulasi ini. Sebelum PCR, jumlah clan kualitas dari DNA hendaknyadiperiksa.HanyadiperlukannanogramDNA untuk pelaksanaanAFLP. Akan tetapi DNA hendaknya diupayakan memiliki kualitas yang memadai untuk menghindariadanyaartefak. KontaminasidenganDNA asing harus dihindari selama penanganan DNA, kontaminasi DNA sedikit saja dapat berakibat timbulnya artefak karena sistem marker ini berbasis PCR. Satu fragmen DNA asing saja berpotensiuntuk diamplifikasi. Fasekritis dalam AFLP adalah saat pemotongan denganensim restriksi. Digesti parsial harus dihindari sebabhal ini dapat berakibattimbulnya artefak (V os et al., 1995). Untuk menghindarihal ini makauji restriksi

harus dilakukan. DNA yang tidak mumi, biasanya akibat adanyakontaminasifenol atau bahan penyusun sellain. Hal ini seringkalimenjadi penyebabterjadinya partial digestion. Langkah pertama dalam AFLP adalah restriksi gandadari DNA menggunakandua ensim berbedayaitu ensim pemotong jarang clan pemotong sering yang diikuti denganpemasangan adapteryang akan mengapit fragmenDNA. Ensim pemotongjarang yang digunakan adaliih ensim yang mengenal 6 basa pada situs pemotongandalamhal ini Eco RI clanensim pemotong sering yang di pakai adalah MseI yang mengenal 4 sekuenbasapadasituspemotongan. Pemotong sering Mse 1 menghasilkan frgamen DNA berukurankecil dalamjumlah banyak.Kombinasi ensim pemotong jarang clan pemotong sering diharapkan dapat menghasilkan jumlah optimum fragmenDNA yang,dihasilkansehinggapola pita AFLP

perlu dilakukansebelumtahapanpemotongan ganda

nantinyadapatdlskor denganbaik. Eco RI banyak

denganmenggunakanduajenis ensim dilakukan. DNA

digunakan sebab ensim ini dinilai relatif murah clan masalah restriksipartialrelatifsedikit(Voset al., 1995). Penggunaan PstI yang juga hexamericdimaksudkan untuk mendapatkanpenyebaran.

yang terpotongsempumaakanterlihat sebagaismear padaelektroforesis.Apabilaada indikasiDNA tidak terpotong dengan sempuma maka pemumian DNA

~~I'~!~~ .";,f,,M;;! ,!;.2i.i, 'i?\"¥ T,;i'

42

PemetaanMarker AFLP untuk MembuatPetaGenetikBit Gula c~

"'" . .

~~

~

'

~

y-

,

-.~"'r~ Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

i I I , f

I

llic ~.

II

III

.I'

If

!~

I '1c

;

0.0

.

E335910c

!. I~

I

~~547130

~~:~

~~55019c

1~:~

~~~

20.9 21.5

M2 P335905C

25.7 25.7

M28 P315005C

23.9 24.7 24.7 25.2 25.7 25.7 27.2 34.7 36.5 38.9 40.9 43.0

E355010D M1 E345919C E3162110 E3459030 E384707C E384709D P334713D E356207c P334704c P334705d P315907d

28.3 28.8 30.2 41.4 42.8 43.1 43.2 43.4 43.4 43.7 45.9 46.4 46.4 54.8

E335917C E335918c M27 E345906C E335903D E3359040 E316206C E345907D E3162140 E355110D P324710C E384705C E384704d E384701C

596 I

M26

29.6 29.6 40.4 48.0 48.4 48.7 49.2 50.6 51.0 53.1 56.6 61.7

E316210D E316204D M40 E335909D E335911C E355105C E384713d E316213C E356204c E345901C M41 P334703D

69.4 81.7

E335919d M42

' ,:' -

E345908d

!, -

90.4 92.5 97.9 97.9 100.2 104.0 105.3 105.3 111.5 118.0

c

+

~:~

'*"

'

i~

P315011C E335920c M43 E316225d P315903d E345905c P315911c M44 E354707C

Gambar2. Petaketerpautangenetik dati populasiF2 populationyang terdiri atas226 lokus tersebarpada 9 linkage groups. Kode lokus marker terletak disebelahkanan dan jarak antar marker dalam cM Haldaneterletak

disebelahkin. M areRFLPmarker,E or P are AFLP markerdenganprimerkombinasiEcoRI/MseIor

I

PstI/M.'ieI.Penomorankromosommengikuti Schondelmaierdan lung (1977)

"

! " ! ~

l

44

PemetaanMarker AFLP untuk MembuatPetaGenetikBit Gula

.

,

--c

.

l I.

~

!

l t

! I.

t

.. .~

"

. !

Setiawan

E316229D

35.8

20.5 26.0 34.8

2.7 8.7 15.4

2.6 1.3

0.0

M23

M24 E345914C E384702C

E355014C P334715c E356212C

E355013D M25

P315003C

if!, :,; ,to: ,

P315001D

~j

00

M5

-"

15.8

It hili,

E316230C M19 P315904C

19.2

V

0.0 6.3 11.7 E345904d. P334702d P315905C

M18

E384708D E384715C P334717C E355101C 58.7 58.7 60.5 62.5 62.5 69.3 70.7

55.5

20.6 31.5 45.4 53.4 55.5 E345918d M7 E354710D E355015d P334718D E316212c! E356201c'

E316209D

M6 E355012D E384712D E316202d E316207D

62.9 63.8

59.1 61.1 61.6 62.0 62.4 62.4 62.4

56.7

41.7 42.4 47.4 47.4 54.5 M22

E335916C E345911d E345912c E316205d

IV

17.7 18.0 20.0

29.2 31.5 31.9 E335905d E316203d E356202D P345007d P315008c P315908D

E384706D

P324711C

31.9

M17

74.8

P345001 D P324702D

32.4 34.1 38.5 47.7 51.4 53.5 57.5 M16

25.0 27.2 28.6

65.0 E345910c M15

'

E355009c E335914C

E384716c

~ E355001C E335908c

71.1 71.6

P315906c E345915d E355006c

E316208D P324704d

63.8 69.4

E384703d P335902C P335901d P324706c E335922C' E356209c E355107D M8

.

M21 M20 P315909c P315901c E316226d E316220D

,"c:rc;~'l

72.1 75.0 75.6 78.9 86.9 108.1

:;c"',.,; c;':;'[

Gambar2. Lanjutan

~:'~

3i~{1;

E345920D E354703d E316201c E355008c E335907D

65.7 77.7

,

82.0 87.0 92.7 94.5 98.5

78.5 80.4

77.6 78.2 78.5

,

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

Asep

.

45

.

~

~

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001) 1

!

0.0

E316223d

6.8

E316221 c E3562060

6.8

8.9 00 . 8.0

VII

M33

14.9 15.7 15.7

VIII

M34 0.0

P324708C

15.8 158

E356210c IX

."

4.9 5.5 6.3 7.3 19.6 20.7 22.6 24.9 33.4

P315010C P334707C M14 P3150090 M13 E345902c E355018d P324701d M12:

16'8 16'8 17'6 19'1 19'1 19:1 22.3 22.3 22.7

E354716 E335915c E354717~ E384710 ~ E355113~ E335906d M36 E355106c E335921c

I ' ~~!

21.5 22.1

E356205C E316218c

49.6 51.5

P324703c M11

23 1 .

E335902C

32.9 36.1

P3347120 P335908C

61.5 63.2 63 2 64.3 65.2 66.5 68.3 69.1 71.2

E355016c M10 E335901 c E3847170 E38471-80 E356211C E3562030 E316222C E355115C

29,.1 30;7 31.1

P315902c E355003d M37

32.6 ~ 42.1 44.8 46.8 4,6.8

E355111 C E345917d P335909c E3547040 E384719C

1

73.0

E354709d

73.9

E354705d

~~:~ 55.9

~~15OO60

I:

78.5 85.4 85.4

E355108d E355114c M9

59.1 672 .

E356208C M39

86.0

P334711c

88.3 92.7

P3347090 P334710c

!

.

ii,

,ft

~

I

59.8

M31

72.6

E316224c

31' 1

.

~

+ i

E3459090 E345913C

P334706c E355004C E355011c E354708c E3547140 P315910d M32 E354702d E316231d

!;:

.,

i!\

P3359060 M35 E3550050

14.1 14.5 14.5 15.9 16.3 16.3 16.3 16.6 21,.5

I

;'" ~

E355002c

E355109c

r

Gambar2. Lanjutan

I; .:: zc

l-'.

Klustering marker secara umum terjadi pada bagian tengah peta. Kromosom VII, VIII dan IX cenderung memiliki klustering mengarah kepinggir. ~lustering pada bagian tengah kro~osom mem~g dlharapkanpada kromosom yang bersifat metasentrik, dimana sentromernya berada di tengah kromosom. Sangatberalasanbahwa didaerah marker yang lebih

baik. Menumt Barneset. al. (1996)AFLP menggunakan EcoRI menghasilkan marker yang relatif kurnng menyebar dibanding AFLP menggunakan PstI. EnsimPst~ yang. ~ikenal sebag.ai sen~itive me~lasi (methylationsensItiveenzyme)diketahUlmenghasilkan fragmen lebih sedikit dibanding ensim non sensitif metilasi EcoRI. lung (1992) melaporkan bahwa

46

PemetaanMarker AFLP untuk MembuatPetaGenetikBit Gula

...

; ;;~

't, ~

" ~ ,j ~

. '1 -~:~

--J

,

.c~~=-

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

...

~

i i

genomebit gula sangatkaya dengansekuenberulang clan metilasi paling banyak terjadi pada daerah ini. Kidwell (1998) dalam studi diversitas melaporkan bahwa kombinasi Pst II Msel menghasilkan tingkat diversitas yang lebih rendah dibanding menggunakan kombinasi EcoR11 Msel. Tingkat diversitas rendah ini kemungkinan berkaitan dengan lebih sedikitnya polimorf yang dihasilakan oleh AFLP berbasis Pstl dibandingAFLP berbasisEco RI. Kesalahan dalam scoring data merupakan hal yang kritis dalam studi yang melibatkan banyak individu clan marker. Untuk mengurangi kesalahan makapenelitianharusdipersiapkandenganperencanaan yang baik. Kemungkinan tertukarnya contoh DNA individu tanamanclankontaminasiDNA harusdicegah. Kesalahandalam skaTingmasih dapat dikoreksi akan

tetapikesalahan akibattertukarnyaDNA contohtidak

al., 1997)petaketerpautan berdasarkan populasiaktual yang ada setiapwaktu harusdibuat lagi karenapopulasi aktual tersebut mungkin mengekspresikansuatu sifat tertentu yang diinginkan. Dalam studi ini sifat ketahananterhadap Cercospora menjadi target. Jadi penyusunanpeta marker ini sebenarnyamerupakan bagianawal daTiusahapemetaansifat kuantitatif untuk ketahananterhadappenyakit bercak daun (Cercospora beticola Sacc.)padabit gula. Dari studi ini berhasil dibuat peta sepanjang744 cM Haldaneyang meliputi seluruh seluruh kromosom haploidbit gula yang berjumlahsembiIan kromosm(n = 9). Petamolekuler bit gula lain yang telah ada saat ini antaralain memiliki panjang 1057 cM Haldane(Pillen et al., 1993),688 HaldanecM (Schumacher,1997)clan 557 cM Haldane(Schondelmaieret al., 1996). Hal ini

mengindikasikan bahwapanjangpeta daTi studi ini

lagi mungkin diperbaiki. Karena ini robotisasimenjadi secaraumum sebanding denganpeta yang telah ada. trend dalam teknologi marker yang bekerja dengan Tidak ada informasi berapa panjang sebenarnyapeta populasidalamjumlah besar. sugar beet dapat dianggap lengkap. Oleh karena itu AFLP termasuk kodominan marker (V os, et al., adalahlebih baik berfikir konservatif.Bila asumsi 1057 1995) akan tetapi dalam studi ini 80 % AFLP marker cM adalah peta lengkap maka studi ini telah berhasil diskor sebagai dominan marker. Hal ini dilakukan ; mengcover70% genombit gula. karena seringkali ada keraguan dalam menetapkan Dari 261 polimorfik markeryang digunakandalam intensitassinyal suatulokus marker sebagaihoterosigot studi ini, sebanyak226 marker berhasildikelompokkan atauhomosigot.Dengandiskor sebagaidominanmarker kedalamsembilankelompok (Gambar2). PadaGambar maka lokus heterosigottidak dapat dibedakandengan 2 selain 182 AFLP marker terdapat juga 44 RFLP lokus homosigot dominan. McKill et al. (1996) juga marker. Dalam tulisan ini marker RFLP tidak dibahas melakukanskor dominan terhadapAFLP marker pada lebih lanjut, hal ini semata-matadilakukan agar tulisan tanaman padi akibat sulitnya menskor data AFLP dapatterfokushanyapadaAFLP marker.Sepertiterlihat sebagaimarker kodominan,demikianjuga Kiem et al., pada Tabel 4. Terdapatdua kromosom yang memiliki (1997) yang bekerja dengankedelai. Kesalahanskoring panjanglebih dari 100 cM, clansatu kromosomdengan juga mempengaruhi presisi peta genetik (Sael dan panjangkurang daTi 50 cM. Kromosom I adalahyang Nilsson, 1996) oleh karena itu apabila ada keraguan terpanjang(118.2 cM dan Kromosom II adalah yang maka lebih baik menskor AFLP sebagai dominan terpendekyaitu 43.2 cM (Tabel 2). Meskipun dalam markerdari padasebagaikodominanmarker. peta marker sepertitersaji pada gambar2 terdapattiga DNA dari populasi F2 basil silangan93164P dan jarak antarmarkeryang lebih dari 20 cM, jarak rata-rata 95098P digunakan menyusunpeta genetik. Walaupun antaramarker pada peta tersebutyang adalah 3.1 cM. petageneticbit gula telah banyakdibuat (Barzen,et al., Dengan demikian peta ini dapat dikategorikan dalam 1992;Hallden et al., 1996;Barneset al., 1996;Pillen et petadengandensitastinggi. al., 1993; Schondelmaieret al., 1996; Schumacheret

'1£ r

.

!;I"~c'~::l""!

i,:t;;'~""'!':.",:'"

~

;:" ~:';.- ,c-

:i:~,.~'"c;:'"~~

,~~ ,~; ",-i.,.. .~ -";,'%li"'~ !~c,j ('"if,' ,!q;;!\

.\V;",T

;'"

':!~ Asep Setiawan

47

. ,

I'!

"~" ~

,

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

-,

- ,~'

... c..;

Table 2: PenyebaranmarkerdaDpanjangpetagenetik Chromosome

RFLp4)

AFLP PstI/MseII)

AFLP EcoRI/Msef)

Total

I II III IV V VI VII VIII IX Total

5 4 5 5 4 6 4 6 5 44

4 5 2 9 6 6 4 9 4 49

16 9 12 9 17 23 9 14 24 133

25 18 19 23 27 35 17 29 33 226

cMJ) 118.2 43.2 59.7 81.4 98.6 107.9 74.6

~ ~

92.9

67.5 744

I)AFLP markersmenggunakanPstI andMseI. AFLP markersusing EcoRI andMseI . 3) cM adalahmenggunakan fungsi Haldane(Haldane 1919);Penomorankromosommengikuti sistempenomoranyang digunakanoleh Schondelmaierand Jung(1997) 4) RFLP marker tidak dibahasda1amtulisan ini sebagaiupaya memfokuskanpembahasanpada AFLP marker sekitar sentromermemiliki frekuensi frekuensi rekombinasi yang rendah. Bosemark daD Bormotov (1971) melaporkan bahwa kromosom bit gula adalah bersifat metasentriatau sub metasentrik,ini berarti terjadinya klustering yang condongmengarahkepinggir padakromosomVII, VIII daDIX bilkanlahdisebabkanoleh posisi sentromer.

;;0

2)

UCAPAN TERIMA KASIH

Bo$emark, N.O., Bormotov, V.E. 1971. Chromosome morphology in a homozygousline of sugar beet. Hereditas69:205-212.

Penulismengucapkanterima kasih kepada: I. Prof. C. Jung daDDr. Koch dari Dept. of crop Sci. and Plant Breeding, Kiel University Germany atas segala bimbingan daDbantuannyaselamapenelitian ini berlangsung. 2. Ms. M. Bruisch atasbantuanteknisnya I

3.

DAAD

yang

penelitian

!

li

membiayai

penulis

selama

ini berlangsung.

Hallden, C., Hjerdin, A., Rading, 1. M., SaIl, T., Fridlundh, Akesson,

B.1

Johannisdottir,

C., Nilsson,

N-O.

G., 1996.

Tuvesson, A high

S.,

density

RFLP linkagemap of sugarbeet.Genome39:634645. DAFTARPUSTAKA

;

I

telah

HaldaneJBS. 1919. The combinationof linkage value and the calculationof distancebetweenthe loci of linked factors.J. Genet.8:299-309.

Barnes S., Massaro, G., Lefebvre, M., Kuiper, M., Verstege,E. 1996.A CombinedRFLP and AFLP geneticmap for sugarbeet.Proceedingsof the 59th IIRB Congress. Barret, B.A., Comparison Diversity

Kidwell, ofAFLP Assessment

K.K., and

Fox, P.N.

Pedigree-Based Methods

1998. Genetic

Using

Wheat

Cultivars from the Pacific Northwest. Crop Sci. 38:1271-1278. . Barzen, E., Mechelke, W., Ritter, E., Kappert, E.S. 1995. An extendedmap of the sugarbeet genome containing RFLP and RAPD loci. Theor. Appl. Genet.90:189-193.

48

Keirn, P., Schupp,J.M., Travis, S.E., Clayton, K., Zhu, T., Shi, L., Ferreira, A., Webb, D.M. 1997. A High-Density Soybean.Genetic Map Based on AFLP Markers.Crop SCI.37: 537-543. h. Kurata, N., Nagamura,Y., Yamamoto,K., Harus Ima, Y., Sue,N., Wu, J., Antonio, B.A., Shomura,A., Sh!mizu,

T.,

Lin~

Shlm~n.o,

T.,

Kublkl,

.S.Y., Y.,

Inoe, Toyam~,

T.,

Fuk~da, T.,

A.,

1

Miyamoto,

Y., Kmhara, T., Hayasaka,K., Mlyao, A., Monna, L., Zhong,H.S., Tamura,Y., Wang, ZX., Momma, T., Umehara,Y., Yano, M., Sasaki,T., Minobe, Y. 1994. A 300-kilobase-intervalgeneticmap of rice including 883 expressedsequences.Nature Genet. 8:365-372.

'to

PemetaanMarker AFLP untuk MembuatPetaGenetikBit Gula

"'" . ,

Bul. Agron. (29) (2) 40 - 49 (2001)

4f: ~

Lander, E.S., Green, P., Abrahamson,J., Barlow, A., Daly, M.J., Lincoln S.E. Newburg, L. 1987. Mapmaker: An interactive computer packagefor constructing primary genetic linkage maps of experimentaland natural populations.GenomicsI: 174-181.

Schondelmaier, J., Jung, C. 1997. Chromosomal assigmentof the nine groups of sugar beet (Beta vulgaris L.) using primary trisomics. Theor. Appl. Genet.95:590-596. Schumacher, K., Schondelmaier, J., Barzen, E., SteinrUcken,G., Borchardt, D., Weber, W.E., Jung,C., Salamini,F. 1997. Combining different linkage maps in sugar beet (Beta vulgaris L.) to makeone map.Plant Breeding 116:23-38.

Lincoln, S.E., Daly, M.J., Lander, E.S. 1993. Costructing genetic linkage maps with MAPMAKER/EXP version 3.0: A tutorial and referencemanual.

Setiawan,A., G. Koch, S.A. Barnes, C. Jung. 2000. Mapping Quantitative trait loci (QTLs) for resistance to cercospora leaf spot disease (Cercospora beticola Sacc.) in Sugar beet (Beta vulgaris L.). Theor. Appl. Genet. 100 (8): 1176-

Majer, D., Mithen, R., Lewis, B.G.,Vos, P., Oliver, R. P. 1996. The use of AFLP finger printing for the detectionof geneticvariation in fungi. Mycol. Res. 100(9): 1107-1111.

1182 Mckill,

DJ.,

Zhang,Z.,

Redona,

E.D.,

Co low it, P.M.

1996. Level of polymorphism and genetic mapping of AFLP markers in rice. Genome 39:969-977.

1

1

Shagai-Maroof,M.A., Soliman,K.M., Jorgensen,R.A., Allard, R.W. 1984. RibosomalDNA spacer-length polymorphismsin barley: Mendelian inheritance, chromosomallocation, and population dynamics. Proc.Nat!. Acad. Sci. 81: 8014-8018.

Paterson,A. H., Lander, E. S., Hewitt, J.D., Peterson, S., Lincoln, S. E., Tanksley, S. D. 1988. Resolution of quantitative traits into Mendelian' factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms.Nature 335:721-726

Tanksley, S.D., Young, N. D., Paterson, A. H., Bonierbale. 1989. RFLP mapping in plant breding: new tools for an old science. Bio Technology7: 257- 264.

Pillen, K., SteinrUcken,G., Herrmann,R.G., Jung, C.

Van Eck H:J., van der Voort, J. R., Draaistra, J., van

t

Qi,

1993. An extendedlinkagemap of sugarbeet

Zandvoort,P., van Encvort, E., Segers,B.,

(Beta vulgaris L.) including nine putative lethal genes and their restorer gene X. Plant Breeding III: 265-272.

Peleman,J., Jacobsen,E., Helder, J., Bakker, J. 1995. The inheritance and chromosomal localization of AFLP markers in a non-inbreed

X.,

Lindhout,

P.

1997.

Development

of

potato offspring. 1995.

AFLP

Molecular

Breeding

I: 397-410.

markersin barley. Mol GenGenet254: 330-336. Wicking, C., Williamson B. 1991. From linked marker to gene.TrendsGenet.7: 288-293.

Sail, T., Nilsson, N-O. 1994. The robustnessof recombinationfrequencyestimatesin intercrosses with dominantmarkers.Genetics(137):589-596

Zuzuki D.T., Griffiths, A. J. F., Lewontin, R.C. 1981. An Introductionto GeneticAnalysis. 2nd~. W.H. FreemanandCo. SanFrancisco.911p.

Scholdelmaier,J., SteinrUcken,G. and Jung, C. 1996. Integrationof AFLP markersinto a linkagemap of sugar beet (Beta vulgaris L). Plant Breeding 115: 231-237.

. ,

.

'(c.§{~' ':;'" "'r;~"";1,,,,'1"

"

j ;1

AsepSetiawan

49

,