)
Protilátky proti Borrelia garinii (IgG) . Návod k testu pro WESTERN BLOT OBJEDNACÍ
PROTILÁTKY
ČÍSLO
PROTI
DY2134-1601 G
Borelia garinii (kompletní antigeny)
IG-TŘÍDA
SUBSTRÁT
FORMÁT
IgG
WESTERN BLOTové 16x01(16) stripy potažené antigenem
Indikace: Infekce Borrelia garinii. Související onemocnění: Erythema chronicum migrans, Lymphadenosis cutis benigna, acrodermatitis chronica atrophicans, artritis, carditis, neuroborreliosis. Principy testu: Testovací souprava pro WESTERN BLOT umožňuje kvalitativní, in vitro zkoušku lidských protilátek proti Borrelia garinii. Testovací souprava obsahuje testovací stripy s extraktem elektroforeticky oddělených antigenů Borrelia garinii. V prvním kroku reakce se tyto stripy blokují a inkubují s ředěným sérem pacienta. Jde-li o positivní vzorek, váží se specifické protilátky třídy IgG (i IgM a IgA) na antigeny. Detekce navázaných protilátek se provádí další inkubací s protilátkou proti lidským IgG označenou enzymem (konjugát), která dávají barevnou reakci. Součásti testovací soupravy: ♦ Testovací stripy s elektroforeticky separovanými antigeny Borrelia garinii: 16 testovacích stripů ♦ Kontrolní strip na vyhodnocovací šabloně: 1 testovací strip inkubovaný s pozitivním kontrolním sérem ♦ Alkalickou fosfatázou značené protilátky (kozí) proti lidským IgG: 1x3 ml 10x koncentrované, t.j. množství dostačující pro přípravu 30 ml konjugátu hotového k použití ♦ Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrovaného pufru, t.j. množství dostačující pro přípravu 500 ml universálního pufru hotového k použití ♦ Roztok substrátu: 1 x 30 ml, připravený k použití, Nitrobluetetrazoliumchloride/5-Bromo-4-cloro3- indolylphosphate (NBT/BCIP) ♦ Vyhodnocovací šablona a vyhodnocovací protokol: 1 papír ♦ Vaničky k inkubaci: 2 x 8 kanálků ♦ Plastová folie ♦ Pracovní návod Uskladnění: Skladujte testovací soupravu při +2°C až +8°C. Upozornění k použití: Používejte pouze součásti se stejným číslem šarže. Varování: Kontrolní sérum, které se používá k inkubaci kontrolního proužku, bylo testováno na negativitu HBSAg, anti-HIV-1 a anti-HIV-2 s použitím EIA a nepřímé imunofluorescence. Přesto musí být s veškerým materiálem nakládáno jako s možným zdrojem infekce, a proto s ním zacházejte opatrně. Některé reagencie jsou potenciálně toxické (pufr, roztok substrátu). Vyvarujte se jejich kontaktu s kůží. Dojde-li ke kontaktu s kůží, umyjte ji mýdlem a proudem vody.
Strana 1 z 6
)
Příprava reagencií Pozor: Všechny složky nechte před použitím vytemperovat na laboratorní teplotu. ♦ Potažené testovací stripy: Připraveny k použití. Skleněnou zkumavku s testovacími stripy otvírejte teprve, když stripy mají laboratorní teplotu, aby se předešlo kondenzaci vodní páry na stripech. Po vyjmutí stripů zkumavku těsně uzavřete a skladujte při teplotě +2°C až +8°C. ♦ Universální pufr: Koncentrát pufru je dodán 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovního universálního pufru odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte v poměru 1 : 10 destilovanou nebo deionizovanou vodou. K inkubaci jednoho testovacího stripu naředˇte 1,5 ml koncentrovaného pufru 13,5 ml destilované nabo deionisované vody. Zředěný pufr je stálý maximálně jeden týden při teplotě +2°C až +8°C. UPOZORNĚNÍ: Jestliže dojde v koncentrovaném pufru ke krystalizaci, zahřejte ho před ředěním na 37°C a dobře promíchejte. ♦ Konjugát: Koncentrát protilátek proti lidským IgG je 10 x koncentrovaný. K přípravě pracovní koncentrace konjugátu odpipetujte čistou pipetou potřebné množství a zřeďte v poměru 1 :10 universálním pufrem. Pro jeden testovací strip se ředí 0,15 ml koncentrátu s 1,35 ml universálního pufru. ♦ Roztok substrátu: Připravený k použití. Uzavřete lahvičku ihned po použití, komponenty jsou citlivé na světlo. Příprava vzorků Vzorky séra pro analýzu jsou naředěny 1:51 universálním pufrem (30 µl séra se přidá k 1,5 ml universálního pufru a dobře promíchá.) Inkubace Blokování:
Počet kanálků inkubační vaničky shodný s počtem testovaných sér se naplní 1,5 ml universálního pufru. Ze skleněné zkumavky vyjměte požadovaný počet testovacích stripů a dejte do každého kanálku jeden tak, aby se citlivá vrstva nedotýkala dna vaničky (značka a číslo stripů musí být viditelné). Inkubujte na kývavé třepačce 15 minut při laboratorní teplotě. Potom všechen pufr odsajte.
Inkubace se sérem: (1. krok)
Naplňte každý kanálek 1,5 ml předem zředěného vyšetřovaného séra a inkubujte na kývavé třepačce 30 minut při laboratorní teplotě.
Promývání:
Odsajte sérum z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného universálního pufru.
Inkubace s konjugátem: (2.krok)
Napipetujte 1,5 ml předem zředěného konjugátu do každého kanálku a inkubujte 30 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě.
Promývání:
Odsajte konjugát z každého kanálku a promývejte je 3 x po pěti minutách na kývavé třepačce vždy 1,5 ml ředěného universálního pufru.
Inkubace se substrátem: (3.krok)
Napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do každého kanálku a inkubujte 10 min na kývavé třepačce při laboratorní teplotě.
Zastavení:
Odsajte substrát z každého kanálku a promyjte každý strip třikrát v deionizované nebo destilované vodě.
Strana 2 z 6
)
Borrelia garinii - WESTERN BLOT Postup provedení testu 1. PŘÍPRAVA: umístěte blotovací stripy do inkubačních kanálků obsahujících 1,5 ml universálního pufru 15 min třepat 2. INKUBACE VZORKU: odsajte, napipetujte 1,5 ml zředěného séra (1:51) do inkubačních kanálků 30 min třepat 3. PROMÝVÁNÍ 4. INKUBACE S KONJUGÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml konjugátu (1:10) do inkubačních kanálků 30 min třepat 5. PROMÝVÁNÍ 6. INKUBACE SE SUBSTRÁTEM: odsajte, napipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do inkubačních kanálků 10 min třepat 7. ZASTAVENÍ: odsajte, propláchněte vodou 8. VIZUÁLNÍ HODNOCENÍ Vyhodnocení a interpretace výsledků Anti-Borrelia-garinii- WESTERN BLOT (IgG) Manipulace: Položte inkubované blotovací stripy na filtrační papír, opatrně je přetřete savým papírem a pomocí čistého adhesivního pásku připevněte na plastový film. Nyní přilepte plastový film s blotovacími stripy k vyhodnocovacímu protokolu. (Upozornění: Jestliže bylo inkubováno méně než 16 stripů, je možné plastový film odstřihnout a část se stripy připevnit k protokolu.) Přiložte vyhodnocovací šablonu k blotovacím stripům a umístěte ji tak, že černá čára nad číslem blotovacího stripu tvoří linii s orientační čárou na vyhodnocovací šabloně. Číslo šarže na vyhodnocovací šabloně musí být shodné s číslem na zkumavce s používanými blotovacími stripy. Zřetelně rozpoznatelné proužky na blotovacích stripech, které se shodují se značkami na vyhodnocovací šabloně, zaneste do protokolu. Antigeny: Antigen pro EUROIMMUN Anti-Borrelia-garinii-WESTERN BLOT je získán ze zvláště vhodného kmene Borrelia garinii (1, 2). Vykultivovaná borrelie byla solubilisována pomocí sodium dodecyl sulfátu. Solubilisované proteiny byly diskontinuální polyacrylamidovou gelovou elektroforézou rozděleny podle molekulové hmotnosti a přeneseny na nitrocelulózu. Z každé testovací soupravy byly 2 testovací stripy inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto barvených stripů obsahuje souprava, druhý zůstává ve výrobním závodě Euroimmun k dokumentaci.
Strana 3 z 6
)
Specifita antigenů na testovacích stripech:(3,4,5)
Band
Antigen
Specifita
83 kDa
membránový vesikální protein, p83
degradační produkt p100, vysoce specifický
75 kDa
heat shock protein, p75
nespecifický
62 kDa
heat shock protein, p62
nespecifický
57/59 kDa
p57 a p59
nespecifický
50 kDa
p50
nespecifický
47 kDa
p47
pravděpodobně genově specifický
43 kDa
p43
nespecifický
41 kDa
flagellin, p41
rodově specifický, zkřížená reakce s ostatními spirochaetaceae a bakteriemi s bičíkem
39 kDa
Bmp A, p39
vysoce specifický
37 kDa
p 37
specifita nejistá
30 kDa
p 30
specifický
29 kDa
Osp A, p 29
zevní povrchový protein A, vysoce specifický
28 kDa
p 28
nespecifický
25 kDa
Osp C, p25
zevní povrchový protein C, vysoce specifický
21/22 kDa
p21/22
vysoce specifický
19 kDa
p19
specifický
IgG třída protilátek proti Borrelia garinii K vyhodnocení signálů musí být brána v úvahu pozice a intenzita zabarvení proužků, protože negativní séra mohou vyvolat na stripech slabý signál. Antigeny Borrelia garinii mohou být obecně rozděleny do tří kategorií (6).
Kategorie
Antigeny
1
Zkříženě reagující a nedefinované antigeny s molekulovou hmotností, 28 kDa, 37 kDa, 43 kDa, 47 kDa, 50 kDa, 57 kDa, 59 kDa, 62 kDa a 75 kDa
2
Rodově specifické antigeny s molekulovou hmotností 41 kDa (flagellin).
3
Druhově specifické a vysoce specifické antigeny s molekulovou hmotností 19 kDa, 21/22 kDa, 25 kDa, 29 kDa, 30 kDA, 39 kDa a 83 kDa.
Strana 4 z 6
)
Interpretace výsledků: Na základě předchozích zkušeností mohou být výsledky testu rozděleny do negativní, hraniční nebo suspektní a positivní skupiny.
Výsledky
Charakteristika
Negativní
Žádné proužky nebo slabá intenzita antigenů z kategorie 1 a 2.
Hraniční nebo suspektní
Jeden zřetelný proužek z kategorie 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín) a několik zřetelných signálů z kategorie 1 a 2. Doporučujeme odebrat nový vzorek a test po několika týdnech zopakovat.
Pozitivní
Více než jeden zřetelný proužek z kategorie 3 (antigeny z kategorie 3 mají ve vyhodnocovacím protokolu šedý odstín). Zejména v případě pacientů v pozdějším stadiu nemoci, můžeme nacházet více proužků z kategorie 1 a 2.
Klinické projevy infekce Borrelia garinii Borrelia garinii je druh bakterie patřící do čeledi spirochaetaceae. Tato čeleď zahrnuje pět rodů: borrelia, spirochetes, cristispira, treponema a leptospira. Borrelia garinii je patogenem onemocnění borelioza (Lymská borelioza nebo Lymská nemoc; 7,8), které se přenáší přisátím klíštěte. Protilátky proti Borrelia garinii se objevují převážně u specificky infikovaných osob. Prevalence těchto protilátek v normální populaci v Německu je v průměru méně než 15% - nepočítaje endemické oblasti. U osob pracujících v zalesněných oblastech nalézáme protilátky ve 40% případů. Infekce Borrelia garinii se může manifestovat v oblastech dermatologie, neurologie, oftalmologie a interní medicíny. Klinické projevy boreliozy se dělí do tří stádií: I.stádium: Typickou primární manifestací infekce Borrelia garinii je erythema chronicum migrans, cirkulární zčervenání kůže v okolí klíštěcího kousnutí. Erytém je doprovázen celkovými chřipkovými symptomy s horečkou, zimnicí a třesavkou, s bolestí hlavy a zvracením. V některých případech se může objevit lymfadenopatie (lymphadenosis cutis benigna). Ve stadiu I. může dojít ke spontánnímu uzdravení nebo se může rozvinout generalisovaná borreliosa. Přechodná fáze je asymptomatická: IgM protilátky proti antigenům Borrelia garinii jsou sérologicky detekovatelné u 50% až 90% pacientů. Prevalence IgG protilátek je významně nižší. Přesto v tomto stádiu jsou serologické výsledky často negativní. Jsou-li přítomny odpovídající symptomy, doporučujeme sledovat pacienta několik týdnů. II.stadium: Několik týdnů až měsíců po kousnutí klíštětem se může rozvinout množství symptomů. V popředí jsou neurologické symptomy: meningitida, encefalitida, asymetrická polyneuritida, parézy hlavových nervů, Bannwarthova lymfocytární meningoradiculoneuritida. Rovněž nacházíme často artritidu, především kolenního kloubu, nelokalizované bolesti kostí, kloubů a svalů. Méně časté jsou kardiologické projevy - myokarditida a perikarditida. Protilátky proti Borrelia garinii jsou detekovatelné u 50% až 90% pacientů. V časné fázi tohoto stadia nalézáme hlavně IgM protilátky, v pozdní fázi pak často pouze IgG. Přesto IgM protilátky mohou dlouho přetrvávat. III.stadium: Typickými projevy infekce Borrelia garinii ve stadiu III. jsou chronická relapsující erosivní artritida, acrodermatitis chronica atrophicans a progresivní encefalomyelitida, která může přejít ve sclerosis multiplex. Bez léčby se může terciární stadium rozvíjet během let až dekád po původní infekci. V tomto stadiu IgG protilátky významně narůstají u 90% až 100% pacientů, zatímco IgM jsou detekovatelné jen zřídka.
Strana 5 z 6
)
Infekce Borrelia garinii může být serologicky diagnostikována u mnoha pacientů s různou symptomatologií (např. rozsáhlé artritické potíže nebo závažné neurologické symptomy), jejichž příčina byla dříve nejasná. Pro diagnozu neuroboreliosy je rozhodující nález protilátek v mozkomíšním moku, protože zde zřídka (narozdíl od séra) dochází ke zkřížené reakci, která by mohla ovlivnit výsledky testu, proto je pozitivní reakce očekávána pouze v případě neuroboreliozy. K detekci protilátek proti Borrelia garinii přicházejí v úvahu různé techniky: ELISA, imunofluorescence, pasivní hemaglutinace a WESTERN BLOT. ELISA test je často používán paralelně s nepřímou imunofluorescencí k předběžnému zhodnocení vzorku séra. EUROIMMUN Anti-Borrelia-garinii-WESTERN BLOT, objednací číslo: DY 2134, je zvláště vhodný k diferenciaci pozitivních vzorků séra. Literatura 1. Johnson, R., Schmid, G.P., Hyde, F.W., Steigerwald,A.G., Brenner, D.J.: Borrelia burgdorferi sp. nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int. J. Syst. Bacteriol.34:496-497 (1984). 2. Burgdorfer, W., Barbour, A.G., Hayes, S.F., Benach, J.L., Grunwaldt, E., Davis, J.P.:Lyme disease - A Tick - Borne Spirochetosis? Science 216: 1317-1319 (1982). 3. Ma, B., Cristen, B., Leung, D., Vigo-Pelfrey, C.: Serodiagnosis of Lyme Borreliosis by Western Immunoblot: Reactivity of varius significant antibodies agains Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. Feb./92: 370-376. 4. Zöller, L., Burkard, S., Schäfer, H.: Validity of Western 5. Immunoblot band patterns in the serodiagnosis of Lyme Borreliosis. J. Clin. Microbiol. Jan./91: 174-182. 6. Moskophidis, M., Luther, B.: Wertigkeit des Immunoblots in der Serodiagnostik der LymeBorreliose. LAB-med 19: 231-237 (1995). 7. Tilton, R.C., Ryan, R.W.: The laboratory diagnosis of Lyme disease. J. Clin. Immunoassay. 16: 208-214 (1993). 8. Horst, H.: Einheimische Zeckenborreliose (Lyme-Krankeit) bei Mensch und Tier. perimedFachbuch-Verlagsgesellschaft mbH, Erlangen (1991). 9. Kienholz, S., Ohly, C., Kienholz, M,: Zecken: Infektionen mit Borrelia burgdorferi. Diagnose und Labor 42: 74-82 (1992).
Strana 6 z 6
