Protilátky proti Borrelia (IgG) Návod k testu ELISA OBJEDNACÍ ČÍSLO
PROTILÁTKY PROTI
IG-TŘÍDA
SUBSTRÁT
FORMÁT
EI 2132-9601 G
Borrelia burgdorferi
IgG
Mikrodestičky
96x01(96)
Borrelia afzelii kompletní antigen
potažené antigenem
Indikace: Infekce Borrelia. Související onemocnění: Erythema chronicum migrans, Lymphadenosis cutis benigna, acrodermatitis chronica atrophicans, artritis, carditis, neuroborreliosis. Principy testu: Souprava testu ELISA umožňuje in vitro, kvantitativní vyšetření na protilátky proti Borrelia . Souprava testu obsahuje mikrotitrační stripy, každý s osmi oddělenými reakčními jamkami potaženými směsí antigenů Borrelia burgdorferi a Borrelia afzelii. V prvním kroku reakce jsou zředěné vzorky pacienta inkubovány v jamkách. V případě pozitivního vzorku se specifické IgG protilátky (i IgA a IgM) váží k antigenům. K detekci navázaných protilátek se provádí další inkubace s enzymovým konjugátem (enzymem značené protilátky proti lidským IgG), který je schopen vyvolat barevnou reakci. Intenzita vzniklého zabarvení je přímo úměrná koncentraci protilátek proti antigenům Borrelia. Součásti testovací soupravy:
•
Jamky mikrotitrační destičky, potažené antigeny Borrelia: 12 stripů po 8 oddělitelných jamkách, připravené k použití.
•
Kalibrační sérum 1, 200 RU/ml (lidské IgG): 1x1,3 ml, připraveno k použití. Tmavě červená barva.
•
Kalibrační sérum 2, 20 RU/ml (lidské IgG): 1x1,3 ml, připraveno k použití. Červená barva.
•
Kalibrační sérum 3, 2 RU/ml (lidské IgG): 1x1,3 ml, připraveno k použití. Světle červená barva.
•
Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1x1,3 ml, připraveno k použití. Modrá barva.
•
Negativní kontrolní sérum (lidské): 1x1,3 ml, připraveno k použití.
•
Enzymový konjugát: peroxidázou značené (kozí) protilátky proti lidským IgG: 1x1,5 ml, připraveno k použití
•
Vzorkový pufr: 1x100 ml, připravený k použití. Světle modrá barva.
•
Promývací pufr: 1x100 ml 10x koncentrátu.
• Roztok chromogen/substrát: 1x12 ml, připravený k použití. • Stop roztok: 1x12 ml, připravený k použití. •
Rámeček na stripy mikrotitrační destičky.
•
Návod k testu, protokol se směrnými hodnotami.
Skladování: Skladujte testovací soupravu při teplotě +2°C až +8°C.
Varování: Kontrolní séra byla testována na negativitu HBSAg, anti-HIV-1 a anti-HIV-2 s použitím EIA a nepřímé imunofluorescence. Přesto musí být s veškerým materiálem nakládáno jako s možným zdrojem infekce, a proto s ním zacházejte opatrně. Některé reagencie jsou potenciálně jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. Dojde-li ke kontaktu s kůží, umyjte ji mýdlem a proudem vody. Charakteristika testu Kalibrace: Protože neexistuje žádné mezinárodní referenční sérum pro kvantitativní měření protilátek proti Borrelia, kalibrace je provedena v relativních jednotkách (RU). Pro každou skupinu prováděných testů, hodnoty optické denzity (OD) kalibračních sér a relativní jednotky vymezené pro pozitivní a negativní kontroly musí být v limitech stanovených pro platnou šarži testovací soupravy. Protokol s těmito směrnými hodnotani je přiložen. Jestliže není dosaženo hodnot specifikovaných pro kontrolní séra, výsledky testu mohou být nepřesné a test by se měl zopakovat. Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě, proto se při nepoužití termostatu mohou hodnoty OD lišit. Čím vyšší je laboratorní teplota při inkubaci substrátu, tím vyšší budou hodnoty OD. Obdobně závisí hodnoty OD na délce inkubace. Ačkoli kalibrační séra podléhají stejným vlivům, výsledek testu, který se takto liší, bude do značné míry kompenzován přepočtem. Dobu inkubace substrátu lze přizpůsobit laboratorní teplotě: •
teplota 14°C - 18°C : inkubace substrátu 18 minut
•
teplota 19°C - 23°C : inkubace substrátu 15 minut
•
teplota 24°C - 30°C : inkubace substrátu 12 minut
Detekční limit: Detekční limit anti-Borrelia ELISA (IgG) je přibližně 1 RU/ml. Antigen: Antigeny jsou izolovány z obzvláště vhodných kmenů Borrelia (Borrelia burgdorferi sensu stricto a Borrelia afzeli). Vykultivované kmeny byly solubilisována pomocí sodium dodecyl sulfátu. Použitá směs antigenů obsahuje všechny významné proteiny. Linearita: Linearita testu byla zjištěna užitím řady ředění sér pacientů s vysokou koncentrací protilátek. Anti-Borrelia-burgdorferi ELISA (IgG) je lineární v měřícím rozsahu 2 - 200 RU/ml. Příprava reagencií:
•
•
Potažené jamky: Připraveny k použití. Ochranný obal odstraňte až tehdy, když proužky byly vytemperovány na laboratorní teplotu, aby se zabránilo kondenzaci vodní páry na potaženém povrchu. Otevřené, nepoužité části proužků, které se nespotřebují, by měly být umístěny do čistých plastových sáčků, přiložených k soupravě, těsně uzavřeny a skladovány při teplotě +2°C až +8°C. Měly by být spotřebovány do jednoho týdne. Kalibrační a kontrolní séra: Připravená k použití. Séra by měla být před použitím důkladně promíchána.
•
Enzymový konjugát: Připravený k použití
•
Vzorkový pufr: Připravený k použití.
•
Promývací pufr: Promývací pufr je 10x koncentrovaný. Potřebné množství odpipetujte z lahvičky čistou pipetou a nařeďte 1 : 10 destilovanou vodou. Např. nařeďte 5 ml s 45 ml destilované vody pro jeden strip. Pracovní koncentrace pufru je stálá maximálně jeden týden při teplotě +2°C až +8°C. UPOZORNĚNÍ: Jestliže koncentrovaný pufr krystalizuje, zahřejte ho před ředěním na 37°C a dobře promíchejte.
• •
Roztok chromogen/substrát: Připravený k použití. Po použití okamžitě uzavřete láhev, protože součásti jsou citlivé na světlo. Zastavovací roztok: Připravený k použití.
Příprava vzorků séra nebo plasmy Vzorky séra nebo plasmy se ředí vzorkovým pufrem 1: 101. Např. přidejte 10µl k 1,0ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. UPOZORNĚNÍ: Kalibrační a kontrolní séra jsou předem naředěna a připravena k použití, neřeďte je. Inkubace Inkubace vzorků:
Pipetujte 100 µl kalibračního séra, pozitivní kontroly nebo zředěného séra pacienta do jednotlivých jamek podle pipetovacího protokolu a inkubujte 30 min při laboratorní teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a třikrát je promyjte vždy nejméně 200 µl naředěného pufru. Provádíte-li test manuálně, po každém promývání vyklepte destičku důkladně na savý papír.
Inkubace konjugátu:
Pipetujte 100 µl zředěného konjugátu do každé jamky. Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě.
Promývání:
Vyprázdněte jamky a třikrát je promyjte vždy nejméně 200 µl naředěného pufru. Provádíte-li test manuálně, po každém promývání vyklepte destičku důkladně na savý papír.
Inkubace substrátu:
Pipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé jamky. Inkubujte 15 min ve tmě při laboratorní teplotě.
Zastavení reakce:
Pipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky ve stejném pořadí a stejnou rychlostí jako roztok chromogen/substrát.
Měření:
Fotometrické měření intenzity zabarvení se provádí při vlnové délce 450 nm (a referenční vlnové délce 630 nm) do 30 minut po přidání zastavovacího roztoku. Pipetovací protokol 1
2
3
4
A
Kalibrační s.
Pacient 5
Pacient 13
Pacient 21
B
Kalibrační s.2
Pacient 6
Pacient 14
Pacient 22
C
Kalibrační s.3
Pacient 7
Pacient 15
Pacient 23
D
Pozitivní kontrola
Pacient 8
Pacient 16
Pacient 24
E
Pacient 1
Pacient 9
Pacient 17
Pacient 25
F
Pacient 2
Pacient 10
Pacient 18
Pacient 26
G
Pacient 3
Pacient 11
Pacient 19
Pacient 27
H
Pacient 4
Pacient 12
Pacient 20
Pacient 28
Pipetovací protokol je proveden např. pro čtyři stripy. Tyto stripy jsou baleny jednotlivě a každá jamka může být oddělena, což umožňuje přizpůsobit počet testovacích jamek počtu vyšetřovaných vzorků a minimalizovat znehodnocení materiálu.
Výpočet výsledků Horní hranice normálních hodnot (cut off hodnota), který doporučuje EUROIMMUN, je 20 RU/ml. Hodnoty vyšší než horní hranice jsou hodnoceny jako pozitivní, hodnoty nižší jako negativní. Negativní kontrolní sérum slouží jako vnitřní kontrola spolehlivosti postupu testu. Pozitivní kontrola musí probíhat s každým testem, negativní kontrola je nezávazná. Kvalitativně: Hodnoty OD vzorku pacienta vyšší než hodnoty OD kalibračního séra 2 (20 RU/ml- cut off hodnota) jsou pozitivní, hodnoty nižší jsou negativní. Kvantitativně: Standardní křivka, z které lze odečíst koncentraci protilátek ve vzorku séra, se sestrojí vynesením koncentrací 3 kalibračních sér a odpovídajících hodnot OD do grafu. Následující graf je příkladem typické kalibrační křivky. Příklad kalibrace
2 1,8 1,6
Extinkce
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
50
100
150
200
RU/m l
Jestliže hodnoty OD vzorku séra leží nad rozsah kalibrační křivky, doporučujeme provést test znou s ředěním 1:400. Výsledek v RU/ml odečtený z kalibrační křivky musí být vynásoben faktorem 4. Klinické projevy infekce Borrelia burgdorferi je druh bakterie patřící do čeledi spirochaetaceae. Tato čeleď zahrnuje pět rodů: borrelia, spirochetes, cristispira, treponema a leptospira. Borrelia burgdorferi je patogenem onemocnění borelioza (Lymská borelioza nebo Lymská nemoc), které se přenáší přisátím klíštěte. Protilátky proti Borrelia burgdorferi se objevují pčevážně u specificky infikovaných osob. Prevalence těchto protilátek v normální populaci v Německu je v průměru méně než 15% - nepočítaje endemické oblasti. U osob pracujících v zalesněných oblastech nalézáme protilátky ve 40% případů. Infekce Borrelia burgdorferi se může manifestovat v oblastech dermatologie, neurologie, oftalmologie a interní medicíny. Klinické projevy boreliozy se dělí do tří stádií: I.stadium: Typickou primární manifestací infekce Borrelia burgdorferi je erythema chronicum migrans, cirkulární zčervenání kůže v okolí klíštěcího kousnutí. Erytém je doprovázen celkovými chřipkovými symptomy s horečkou, zimnicí a třesavkou, s bolestí hlavy a zvracením. V některých případech se může objevit lymfadenopatie (lymphadenosis cutis benigna). Ve stadiu I. může dojít ke spontánnímu uzdravení nebo se může rozvinout generalisovaná borreliosa. Přechodná fáze je asymptomatická: IgM protilátky proti antigenům Borrelia burgdorferi jsou serologicky detekovatelné u 50% až 90% pacientů. Prevalence IgG protilátek je významně nižší. Přesto v tomto stadiu jsou serologické výsledky často negativní. Jsou-li přítomny odpovídající symptomy, doporučujeme sledovat pacienta několik týdnů.
II.stadium: Několik týdnů až měsíců po kousnutí klíštětem se může rozvinout množství symptomů. V popředí jsou neurologické symptomy: meningitida, encefalitida, asymetrická polyneuritida, parézy hlavových nervů, Bannwarthova lymfocytární meningoradiculoneuritida. Rovněž nacházíme často artritidu, především kolenního kloubu, nelokalizované bolesti kostí, kloubů a svalů. Méně časté jsou kardiologické projevy - myokarditida a perikarditida. Protilátky proti Borrelia burgdorferi jsou detekovatelné u 50% až 90% pacientů. V časné fázi tohoto stadia nalézáme hlavně IgM protilátky, v pozdní fázi pak často pouze IgG. Přesto IgM protilátky mohou dlouho přetrvávat. III.stadium: Typickými projevy infekce Borrelia burgdorferi ve stadiu III. jsou chronická relapsující erosivní artritida, acrodermatitis chronica atrophicans a progresivní encefalomyelitida, která může přejít v sclerosis multiplex. Bez léčby se může terciární stadium rozvíjet během let až dekád po originální infekci. V tomto stadiu IgG protilátky významně narůstají u 90% až 100% pacientů, zatímco IgM jsou detekovatelné jen zřídka. Infekce Borrelia Burgdorferi může být sérologicky diagnostikována u mnoha pacintů s různou symptomatologií (např. rozsáhlé artritické potíže nebo závažné neurologické symptomy), jejichž příčina byla dříve nejasná. Pro diagnozu neuroboreliosy je rozhodující nález protilátek v mozkomíšním moku, protože zde zřídka (narozdíl od séra) dochází ke zkřížené reakci, která by mohla ovlivnit výsledky testu, proto je pozitivní reakce očekávána pouze v případě neuroboreliozy. K detekci protilátek proti Borrelia burgdorferi přicházejí v úvahu různé techniky: ELISA, imunofluorescence, pasivní hemaglutinace a WESTERN BLOT. Mnozí používají ELISA test paralelně s nepřímou imunofluorescencí k předběžnému zhodnocení vzorku séra. Substráty používané v EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi-imunoflorescence-test, objednací číslo: FI 2132 a v EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi-ELISA, objednací číslo: EI 2132 poskytují úplné antigenní spektrum této bakterie. Soudí se, že používání přípravků tohoto typu poskytuje vyšší úroveň diagnostické přesnosti než použití jednotlivých antigenů. EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferiWESTERN BLOT, objednací číslo: DY 2132, je zvláště vhodný k diferenciaci pozitivních vzorků séra.
Literatura 1. Johnson, R., Schmid, G.P., Hyde, F.W., Steigerwald,A.G., Brenner, D.J.: Borrelia burgdorferi sp. nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int. J. Syst. Bacteriol.34:496-497 (1984). 2. Burgdorfer, W., Barbour, A.G., Hayes, S.F., Benach, J.L., Grunwaldt, E., Davis, J.P.:Lyme disease - A Tick - Borne Spirochetosis? Science 216: 1317-1319 (1982). 3. Ma, B., Cristen, B., Leung, D., Vigo-Pelfrey, C.: Serodiagnosis of Lyme Borreliosis by Western Immunoblot: Reactivity of varius significant antibodies agains Borrelia burgdorferi. J. Clin. Microbiol. Feb./92: 370-376. 4. Tilton, R.C., Ryan, R.W.: The laboratory diagnosis of Lyme disease. J. Clin. Immunoassay. 16: 208-214 (1993). 5. Horst, H.: Einheimische Zeckenborreliose (Lyme-Krankeit) bei Mensch und Tier. perimedFachbuch-Verlagsgesellschaft mbH, Erlangen (1991). 6. Kienholz, S., Ohly, C., Kienholz, M,: Zecken: Infektionen mit Borrelia burgdorferi. Diagnose und Labor 42: 74-82 (1992).
