Proliferáció és transzport folyamatok vizsgálata epitéliális mirigyekben

Proliferáció és transzport folyamatok vizsgálata epitéliális mirigyekben Egyetemi doktori (Ph. D.) értekezés

dr. Szűcs Ákos Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Varga Gábor egyetemi tanár, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Kecskeméti Valéria, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Hegyi Péter, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Flautner Lajos, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Simon György, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Pap Ákos, egyetemi magántanár, az orvostudományok doktora

Budapest 2008

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK.................................................................................................. 2 RÖVIDÍTÉSEK ................................................................................................................ 5 BEVEZETÉS..................................................................................................................... 7 Külső elválasztású mirigyek anatómiája ..................................................................... 9 Nyálmirigy ................................................................................................................... 9 Hasnyálmirigy ............................................................................................................ 11 Exokrin szekréció ........................................................................................................ 12 Nyálmirigy ................................................................................................................. 12 Enzimszekréció........................................................................................................ 13 Elektrolit szekréció.................................................................................................. 13 Hasnyálmirigy ............................................................................................................ 19 Enzimszekréció: ...................................................................................................... 19 Elektrolit szekréció: ................................................................................................ 20 A sejtproliferáció és szabályozása – a PKC jelentősége........................................... 23 A külső elválasztású mirigyek szekréciós és proliferációs folyamatainak neurohumorális szabályozása..................................................................................... 25 Gasztrointesztinális peptidek: .................................................................................... 27 Szekretin.................................................................................................................. 28 Kolecisztokinin........................................................................................................ 29 Vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP).................................................................. 30 Neurotenzin (NT) .................................................................................................... 31 Purinerg jelátvitel: ...................................................................................................... 32 CÉLKITŰZÉS................................................................................................................. 36 ALKALMAZOTT MÓDSZEREK................................................................................ 37 Szekréciós vizsgálatok:................................................................................................ 37 Oldatok és anyagok .................................................................................................... 37 2

Tartalomjegyzék

RT-PCR...................................................................................................................... 37 Sejttenyésztés ............................................................................................................. 38 Intracelluláris pH (pHi) mérése .................................................................................. 38 Immunhisztokémia ..................................................................................................... 39 Statisztikai analízis..................................................................................................... 39 Proliferációs vizsgálatok: ............................................................................................ 40 Sejttenyésztés ............................................................................................................. 40 [3H]-timidin-inkorporáció .......................................................................................... 40 Immunoblotting.......................................................................................................... 40 EREDMÉNYEK ............................................................................................................. 41 Szekréciós vizsgálatok:................................................................................................ 41 Transzporterek és receptorok kimutatása RT-PCR segítségével ............................... 41 Áteresztő membránon növesztett monolayerek polarizációja.................................... 42 Bazolaterális Na+/H+ kicserélő (NHE) kimutatása..................................................... 43 Bazolaterális Na+-HCO3− kotranszporter (NBC) kimutatása..................................... 45 Bazolaterális Na+-K+-2Cl− kotranszporter (NKCC) kimutatása ................................ 47 A transzepitéliális HCO3− szekéció mérése................................................................ 47 Forskolin hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra............................................... 48 Szekretin és VIP hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra ................................... 50 ATP és UTP hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra ......................................... 50 Proliferációs vizsgálatok: ............................................................................................ 53 Protein kináz Cε sejtosztódásra kifejtett hatása ......................................................... 53 PKC aktivációjának szerepe az ERK kaszkád stimulációjában ................................. 54 PKC izoformák szerepe a PMA, CCK és NT indukálta ERK stimulációban ............ 57 MEGBESZÉLÉS............................................................................................................. 59 Szekréciós vizsgálatok:................................................................................................ 59 Par-C10 és Capan-1 sejtek permeábilis membránon növesztve polarizált monolayert formálnak ................................................................................................................... 59 A polarizált epitélium funkcionális bizonyítékai – a bazolaterális oldal anion transzporterei.............................................................................................................. 60

3

Tartalomjegyzék

A transzepitéliális bikarbonát szekréció és szabályozása – gasztrointesztinális peptidek szerepe ......................................................................................................... 62 A transzepitéliális bikarbonát szekréció és szabályozása – purinerg jelátvitel szerepe .................................................................................................................................... 63 Proliferációs vizsgálatok: ............................................................................................ 65 PKC izoformák hatása a sejtnövekedésre .................................................................. 65 Az ERK kaszkád aktivációjának kinetikája a proliferáció szabályozásában ............. 66 Az ERK kaszkád szerepe a sejtproliferációban.......................................................... 67 PKC izoformák szerepe az ERK kaszkád aktivációjában.......................................... 69 KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................................. 70 ÖSSZEFOGLALÁS........................................................................................................ 71 SUMMARY ..................................................................................................................... 72 IRODALOMJEGYZÉK................................................................................................. 73 BIBLIOGRÁFIA............................................................................................................. 89 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ....................................................................................... 92

4

Rövidítések

RÖVIDÍTÉSEK ACh AE ATCC ATP BCECF-AM

-

BSA cAMP CCK cDNS CF CFTR CGRP DAG DMEM EDTA EGF ENaC EIPA ERK EVOM FITC GDP GHRH GIP GLP GPCR GRP GTP H2DIDS HEPES IGF IMDM IP3 mRNS NBC NGF NHE NKCC NMB NMC NMDG NPPB NPY

-

acetilkolin anion exchanger American Type Culture Collection adenozin trifoszfát 2’7’-bisz (2-karboxietil)-5(6)-karboxifluoreszcein acetoximetil észter bovine serum albumin ciklikus adenozin monofoszfát kolecisztokinin komplementer (mRNS-ről visszaírt) dezoxi-ribonukleinsav cisztikus fibrózis cystic fibrosis transmembrane conductance regulator calcitonin gene-related peptide diacylglycerol Dulbecco’s modified Eagle’s medium etiléndiamin-tetraecetsav epidermal growth factor epitéliális Na+ csatorna 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride extracellular-signal-regulated kinase epitéliális voltohmmeter fluorescein isothiocianát guanozin difoszfát growth hormone releasing hormone gastric inhibitory peptide gastrin-like peptide G-protein kapcsolt receptor gastrin-releasing peptide guanozin trifoszfát dihidro-4,4’-diizotiocianato-stilbén-2,2’-diszulfonsav 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetánszulfát insulin-like growth factor Iscove's Modified Dulbecco's Medium inozitol-trifoszfát hírvivő ribonukleinsav Na+-HCO3- kotranszporter nerve growth factor Na+-H+ kicserélő Na+-K+-2Cl- kotranszporter neuromedin B neuromedin C N-metil-D-glukamin 5-nitro-2-(3-fenylpropilamino)-benzoesav neuropeptid Y

5

Rövidítések

NT PACAP PBS PCR pHi PIP2 PKC PLC PMA PMSF PP PSTI PTFE PYY RT SDS-PAGE S. E. M. TBS TEER TGF£ UTP VIP

-

neurotenzin pituitary adenylate cyclase activating polypeptide phosphate-buffered saline polimeráz láncreakció intracelluláris pH foszfatidil-inozitol-biszfoszfát protein-kináz C foszfolipáz-C phorbol myristate acetate fenilmetilszulfonil-fluorid pankreatikus polypeptid pancreatic secretory trypsin inhibitor poli(tetrafluor-etilén) peptid YY reverz transzkriptáz SDS-poliakrilamid gélelektroforézis standard error mean Tris-buffered saline transzepitéliális elektromos rezisztencia transforming growth factor-α uridin trifoszfát vazoaktív intesztinális polipeptid

6

Bevezetés

BEVEZETÉS A tápcsatorna lebontó, továbbító és felszívó folyamataihoz elengedhetetlenül szükséges a béltraktus teljes hosszában megtalálható epitéliális mirigyek szekréciós tevékenysége. Az emésztőenzimekben és elektrolitokban gazdag nedvet részben a tápcsatornához csatlakozó járulékos nagy mirigyek – nevezetesen nyálmirigyek, hasnyálmirigy stb.- választják el, részben a nyálkahártyában megtalálható hámsejtek szekretálják. Ezen mirigyekben a különböző funkciójú hámsejtek más és más elrendezésben vesznek részt a mirigyek felépítésében, ezáltal a mirigyek szekréciós mechanizmusai is jelentős különbségeket mutatnak. A hámsejtek egy része enzimeket és más fehérjetermészetű anyagokat választ ki, míg mások kizárólag elektrolitoldat szekréciójára vagy kizárólag visszaszívására szakosodtak. Ezek a produktumok központi szerepet játszanak a béltraktus normál működésnek fenntartásában és védelmében, valamint az emésztésben. Ezen mirigyek rendellenességei az emésztési folyamat súlyos zavarához vezetnek. A mirigyek veleszületett rendellenességeinél (pl. ciszikus fibrózis, CF) a csökkent bikarbonát szekréció sűrű, viszkózus nedvelválasztást eredményez. A kialakult nyákdugó

a

kivezetőcsöveket

elzárva

károsítja

az

emésztési

funkciókat

és

következményes krónikus gyulladáshoz vezet. Az exokrin szekréció szabályozásában szerepet játszó reguláló peptidek részt vesznek a mirigysejtek proliferációjának, differenciációjának szabályozásában is. A sejtek szaporodásának zavara daganatok kialakulásához vezet, melynek regulációjában ezen regulátoroknak szintén kulcsszerepe lehet. Ahhoz, hogy a kórfolyamatok eredetét megismerjük, meg kell ismernünk azokat a membrán transzport folyamatokat és az ezek szabályozásáért felelős neurohumorális szabályozó mechanizmusokat, amelyek a humán külső elválasztású mirigyek folyadékés elektrolit-szekréciójáért felelősek, valamint tisztáznunk kell a fenti neurohumorális mechanizmusok

szerepét

a

proliferációs

és

differenciációs

mechanizmusok

szabályozásában. Mivel normál emberi szövetek gyakorlatilag nem gyűjthetők kellő mennyiségben, vizsgálati modellként kézenfekvő lehet olyan emberi nyálmirigy és hasnyálmirigy adenokarcinomákból származó sejtvonalak alkalmazása, melyek polarizált monolayer-

7

Bevezetés

ben növekednek, illetve fenotípus tekintetében a natív szövetre rendkívül hasonlítanak. A patkány parotisból származó immortalizált Par-C10 daganatos sejtvonalat Quissell és munkatársai állították elő simian vírus (SV40) transzfekciójával [1]. A morfológiai vizsgálatok alapján ez a sejtvonal volt az első parotisz eredetű sejtvonal, amely az immortalizáció után is acináris struktúrákra jellemző jól differenciált fenotípust mutatott. Emellett a többi sejtvonaltól eltérően membránon tenyészett Par-C10 sejtek polarizált epitéliumot formáltak, így alkalmassá váltak iontranszport folyamatok vizsgálatára, ezen belül mikrofluorometriás transzportvizsgálatokra, illetve rövidzárlati áram mérésére is. A sejtek expresszálnak a CFTR mellett számos egyéb iontranszport fehérjét is, a normál humán nyálmirigyek acináris struktúráinak megfelelően. Az emberi hasnyálmirigy szekréciós folyamatainak modellezésére számos emberi hasnyálmirigy adenokarcinomából származó sejtvonalat – például Capan-1, CFPAC-1, Panc-1 és HPAF – használtak már [2]. Ezek közül azonban csak a Capan-1 és a Panc-1 expresszálja a CFTR-t [3, 4]. A jól differenciált Capan-1 hasnyálmirigy daganatos sejtvonal azonban egyedüliként formál összefüggő, polarizált monolayert, ha áteresztő felületen tenyésztjük [4, 5], [6], valamint számos fiziológiásan is előforduló ligand (szekretin [5, 6], vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP) [7, 8], ATP [9], angiotensin II [10], Ca2+[11]) receptorát expresszálja. A Capan-1 sejtvonal monolayerként tenyésztve alkalmas mind a rövidzárlati áram mérésére, mind pedig a HCO3- transzport vizsgálatára mikrofluorometriás módszerrel. A sejtproliferációs és differenciációs vizsgálatokhoz alkalmazott Panc-1 szintén emberi hasnyálmirigy eredetű, de kevéssé differenciált daganatos sejtvonal, mely CFTR-t, mind pedig a Na+ HCO3- kotranszportert (NBC) expresszálja [12]. Azonban membránon növesztve nem formál polarizált monolayert, ezért

a

transzportfolyamatok

vizsgálatához

alkalmatlannak

bizonyult,

azonban

proliferációs és differenciációs vizsgálatok elvégzéséhez kiválóan használható volt az emberi hasnyámirigy szövethez rendkívül hasonló fenotípus okán.

8

Bevezetés

Külső elválasztású mirigyek anatómiája Nyálmirigyek Szemben hasnyálmiriggyel,

az

exokrin

mely

bizonyos

morfológiai homogenitást mutat a

Glandula parotis accessoria

gerincesek között, a nyálmirigyek rendkívül

változatosak

elhelyezkedés,

a

az

fejlődés,

a

Ductus parotideus

Glandula parotis

mikroszkópos szerkezet és a funkció

Glandula sublingualis

tekintetében. A szájban a nyál termeléséért 90%-ban nyálmirigy

a –

három

pár

a

parotisz,

Glandula submandbularis

nagy

1. ábra A nyálmirigyek

a

szubmandibuláris és a szublingvális mirigyek –, kisebb részben a szájüregi szubmukózában elhelyezkedő számtalan kis nyálmirigyek (labialis, palatinalis, buccalis, lingualis és sublingualis) felelősek. A primer nyál termelését végző acinussejtek – a többi külső elválasztású mirigyhez hasonlóan - festődés, valamint a granulumok mérete alapján két alapvető csoportba sorolhatók. A hematoxilin-eozin festéssel a bazofil plazma miatt halványkékre festődő szerózus sejtek kisebb granulumokat tartalmaznak és híg, fehérjedús szekrétumokat termelnek. A rózsaszínre festődő (eozinofil) mucinózus sejtek sűrű, nyálkás váladékot termelnek és nagy méretű szekréciós vezikulákat tartalmaznak. A kevert acinusokban a kivezetőcsőhöz közelebb elhelyezkedő mucinózus sejteket félhold alakban (Gianuzzi-féle félhold) a szerózus sejtek veszik körül. A legnagyobb nyálmirigy, a parotisz tisztán szerózus mirigy, mely az alapszekrécióban csak kis mértékben vesz részt, stimuláció hatására azonban szerózus, enzimekben gazdag nyálat választ el, mely a stimulált nyálnak több mint 50%-át adja. A szubmandibuláris mirigyek kevert mirigyek, melyek szerózus és mucinózus sejteket egyaránt tartalmaznak, így viszkózusabb, mucintartalmú nyálat választanak el és elsősorban az alapszekréció folyamatában vesznek részt. A szublingvális mirigyek a nagy

9

Bevezetés

nyálmirigyek közül a legkisebbek, szintén kevert nyálmirigyek, melyek főként mukózus sejteket tartalmaznak. Az acinussejteket kosár alakban körbeölelő mioepitél sejtek összehúzódásukkal elősegítik a szekrétum kiürülését, valamint a szekréció során védik az acinusokat a nagy intraluminális nyomás következében fellépő túlzott kitágulás ellen. A legtöbb összetett külső elválasztású mirigyhez hasonlóan a nyálmirigyek is szekréciós végkamrákból (acinusokból) és szerteágazó duktuszrendszerből épülnek fel. Ezen képletek mentén ereket és idegeket tartalmazó, a parenchymát lebenyekre tagoló kötőszövetes szeptumok vannak, melyeknek a mirigyállomány megtámasztásában is fontos szerepe van. A mirigyek tömegének 80%-át alkotó szekréciós végződések polarizált acinussejtekből állnak, melyek egy, a duktuszrendszerbe vezető fő kivezetőcsövet vesznek körül. A mirigy belseje felé haladva kisebb extralobuláris (vagy interlobuláris) duktuszokra tagolódik, melyek a lebenyek közötti kötőszövetben haladnak. Hámbélésük a duktuszok tagolódásával többrétegű laphámból többrétegű hengerhámmá alakul, mely fokozatosan egyrétegűvé válik. A lebenyeken belül találhatók a striatált duktuszok, melyeket bélelő hengerhámsejtek a bazális membrán betüremkedései miatt a bázisra merőleges csíkolatot mutatnak és sok fajban citoplazmájukban szekréciós granulumok is kimutathatók. A duktuszrendszer legdisztálisabb elemei az interkaláris duktuszok, melyek falát lap- vagy köbhámsejtek bélelik. Az acinusok és a duktuszok közötti

elhelyezkedésükből,

alacsony

differenciáltsági

fokukból,

valamint

ultrastrukturális megjelenésükből arra lehet következtetni, hogy ezek a duktuszok, valamint az acinusok prekurzor sejtjeinek tekinthetők, bár a szekrécióban betöltött csekély szerepüket is igazolták. A duktuszok szövettani szerkezete jelentős faji különbségeket mutat: emberben a nyálmirigy duktuszok nagy részét a striatált duktuszok teszik ki, míg más fajokban, mint a patkányban a domináns típus a striatált helyett a granuláris duktusz. A nyálmirigy dukuszsejtek mind szerkezetileg, mind funkcionálisan polarizáltak, és így a membrán is két részre osztható. Az apikális membrán a lument határolja, míg a bazolaterális membrán a sejtek közötti tér, illetve a kapillárisok felé néz. A duktuszsejteket az acinusokhoz hasonlóan tight junctionok kötik össze egymással, azonban az acinusokhoz képest ezek sokkal kevésbé permeábilisek az ionok és a víz számára. A nyálmirigyek acinusainak és duktuszainak bazolaterális és luminális membránján is találhatók

10

Bevezetés

specifikus receptor rendszerek, melyeket az odakötődő neurotranszmitterek és peptidek aktiválnak. Hasnyálmirigy A hasnyálmirigy a gyomor mögött, a patkóbéltől körülölelve található, ahova nedvét is

üríti.

Vékony

mirigyállományba

kötőszövetes szeptumokként

tokja,

a

benyúlva

lebenykékre osztja azt. A mirigy működését tekintve két részre osztható. Az endokrin működésért

a

mirigyállományban

található

Langerhans-szigetek

elszórtan felelősek,

amelyek a véráramba inzulint, glukagont és

2. ábra A hasnyálmirigy

számos egyéb hormont választanak el. A hasnyálmirigy nagyobbik, exokrin része összetett tubuloacináris mirigy. Az emésztőenzimeket szintetizáló és elválasztó sejtek acinusnak nevezett szőlőfürtszerű csoportokba rendeződnek, mely a külső elválasztású mirigy 80%-át alkotja, a nyálmirigyben látotthoz igen hasonló módon. Az acinussejtek az emésztőenzimeket membránkötött szekretoros granulumokban tárolják. A granulumok tartalma exocitózissal jut az acinus lumenjébe. Az acinussejtekből származó enzimek egy faágszerűen elágazó vezetékrendszerbe jutnak [13]. A duktuszfa a centroaciner sejtekkel kezdődik, melyek kapcsolatban állnak mind az acinusokkal, mind a valódi duktuszhálózat legkisebb egységével, az interkaláris duktuszokkal. A számtalan interkaláris duktusz egymásba nyílva egyre nagyobb és nagyobb vezetékké szélesedik, végül fő hasnyálmirigy vezetékként (ductus pancreaticus major) az epevezetékkel együtt a patkóbél lumenébe nyílik. A duktuszsejtek vizes, bikarbonátban gazdag nedvet választanak el, amely egyrészt az emésztőenzimeket szállítja a duktuszokon keresztül, másrészt a patkóbélbe érkező gyomortartalom savas kémhatását semlegesíti. A centroaciner sejtek és az interkaláris duktuszsejtek eredetüket tekintve egy sejttípusba tartoznak, néha principális sejteknek nevezik őket. Ezek squamosus sejtek, a Golgi-komplex és a szekréciós vezikulák ritkák, míg a mitochondriumok meghatározóak.

11

Bevezetés

Tovább haladva a duktuszfán a principális sejtek kocka, majd végül oszlop formájúvá alakulnak. Ezek növekvő mennyiségben tartalmaznak citoplazmatikus vezikulumokat, valamint jól fejlett durva felszínű endoplazmás retikulumot és Golgi-komplexet. A principális sejtek apikális membránján rövid mikrovillusok és általában egy egyszerű cilium található, melynek szerepe ismeretlen. A szomszédos sejtek interdigitálisan, az apikális részek junkcionális komplexumokkal kapcsolódnak egymáshoz. A principális sejtek az elektrolitokon kívül nagy molekulasúlyú glikoproteineket is szekretálnak, így például a mucint. A principális sejteken kívül nagy számú speciális sejttípus található az interlobuláris és fő duktuszok epitéliumában. Ilyenek a kehelysejtek, az eddig ismeretlen funkciójú kefesejtek (jellemző apikális mikrovillusokkal rendelkeznek) és a kis számú endokrin sejtek. A duktuszok lamina propriájában csupasz idegrostok futnak. Az idegvégződések a duktális epitélium bazális felszínének közelében végződnek, melytől szinte mindig a lamina basalis választja el azokat. Ezek többnyire cholinerg és adrenerg rostok, bár a VIP-et tartalmazó peptiderg idegek is általánosak.

Exokrin szekréció Nyálmirigyek A három pár nagy nyálmirigy és a járulékos mirigyek által termelt hypozmotikus nyál fő feladata a szájüreg nedvesen tartása. Ugyanis a szervezet folyadékháztartásának egyik fontos szabályozója a szájnyálkahártya nedvessége. Dehidrációban ugyanis a jelentős mértékben csökkenő nyálszekréció következményeképpen fellépő szájszárazság a folyadékfelvétel legfőbb induktora. A száj nedvesen tartása mellett a szecernált lizozimeknek, IgA-nak és néhány más fehérjének köszönhetően a nyál fontos szerepet játszik a szervezet elsődleges védekező mechanizmusaiban, a termelődő kálcium-kötő fehérjék pedig a fogak felszínén bevonatot képezve védenek a caries ellen. A nyál legfontosabb feladata talán mégis a tápcsatorna lebontó-, továbbító-, és felszívó folyamataihoz nélkülözhetetlen emésztőenzim- és elektrolit szekréció.

12

Bevezetés

Enzimszekréció A nyálban megtalálható legfontosabb emésztőenzim az amiláz (más néven ptyalin) a táplálékban megtalálható keményítőt az α-1-4 glikozil kötések hasítása révén maltózzá bontja [14]. A folyamat második része a vékonybélben történik, melyet a hasnyálmirigy termelte amiláz katalizál. A nyálmirigy eredetű α-amiláz szerepe egészséges egyénekben a poliszaharidok emésztésében másodrendű, mivel a gyomorsav hatására gyorsan inaktiválódik. Az enzim pH optimuma 6,8 körül van, de a rövid-láncú glükóz polimerek stabilizálhatják az enzimet, rövid ideig biztosítva ezáltal annak működését a gyomor savas pH-ján is [15]. Ezek alapján érhető, miért is fontos a nyálmirigy amiláz szerepe azon betegeknél, akik krónikus hasnyálmirigy gyulladás vagy fejlődési rendellenesség miatt inkomplett emésztési funkciókkal rendelkeznek [15]. Az amiláz szekréciója az autonóm idegrendszer szabályozása alatt áll. Legnagyobb mennyiségben a parotisz szerózus sejtjei termelik, akár a szekretált fehérjék mennyiségének egy harmadát is kiteheti, de kisebb mennyiségben a szubmandibuláris mirigy sejtjei is elválasztják. Az amiláz nem csak az emésztésben vesz részt, de fontos szerepet játszik a szájüreg egészségének fenntartásában: megköti a Streptococcusokat és szabályozza a baktériumok megtapadását a szájüreg felszínén [16]. Egy másik, a nyálban található emésztőenzim a nyelv hátsó részén elhelyezkedő Ebner-féle mirigyek acinussejtjei által termelt lipáz [17]. A nyálmirigy lipáz a hasnyálmirigyben termelődő lipázzal szinergista módon [18] a táplálékban található triglicerideket bontja [19], elválasztásának legfőbb stimulátora a táplálék magas zsírtartalma. Az amilázhoz hasonlóan egészségesekben jelentősége másodlagos, azonban cisztikus fibrózisban, valamint más egyéb hasnyálmirigy szekréciós megbetegedésben nélkülözhetetlenné válik az elégtelen hasnyálmirigy működés következtében fellépő steatorrhea tüneteinek enyhítésében [20]. Elektrolit szekréció A nyálmirigyek acinusai jelentős mennyiségű, enyhén lúgos kémhatású, szekretoros fehérjéket is tartalmazó folyadékot választanak el. A nyáltermelődés kétlépcsős folyamat. Az acinus sejtek (3.ábra) izotóniás (140 mEq/l NaCl) elsődleges nyálat termelnek, mely elektrolit koncentrációja (Na+, K+, Cl−, HCO3−) a legtöbb faj esetén

13

Bevezetés

megegyezik a plazmában mért koncentrációkkal. Az elsődleges nyál összetétele a duktuszokon áthaladva módosul, a Na+ és a Cl− legnagyobb része abszorbeálódik, kis mennyiségű K+, HCO3− és fehérjék szekretálódnak. A duktuszokban az aquaporin vízcsatornák hiányában [21] az alacsony vízpermeabilitás miatt csak a víz kis része abszorbeálódik, ezért a szájüregbe ürülő végső nyál hipotóniás (25 mEq/l NaCl) és HCO3− koncentrációja lényegesen magasabb a plazmáénál [22]. Ahogy növekszik a szekréciós ráta, a duktális epitéliumnak egyre kevesebb ideje van az elektrolit összetételt átalakítani, így a sóvisszaszívás lecsökken és a nyál kevésbé lesz hipotóniás. Következésképpen a szájüregbe szekretált nyál végső összetétele nem állandó, hanem erősen függ az áramlási rátától. Jelen ismereteink szerint az acináris elektrolit-és folyadékszekréció folyamatához a transzepitéliális Cl- mozgás játszik vezető szerepet, melyhez a hajtóerőt a Na+ K+ ATPáz által generált Na+ grádienst felhasználó transzport mechanizmusok szolgáltatják.. Ezen folyamat egyik eleme a bazolaterális membránban elhelyezkedő Na+-K+-2Clkotranszporter, azonban a legtöbb faj acináris sejtjeiben működik még egy a bazolaterális Cl-/HCO3- antiporteren és Na+-H+ kicserélőn keresztül megvalósuló második Cl- felvevő út is. Ezen Na+ függő folyamatok a kémiai grádienshez képest ötszörös Cl- koncentrációt képesek létrehozni a sejt belsejében [23, 24], amely a hajtóerőt szolgáltatja a Clszekrécióhoz. Agonisták hatására nyílnak a bazolaterális oldal K+ és Cl- csatornái, melyek elengedhetetlenek a Cl- effluxhoz szükséges elektrokémiai grádiens fenntartásához. Ugyanis ezen csatornák megnyitásának hatására az intracelluláris K+ és Cl- koncentráció esik és transzepitéliális potenciál különbség keletkezik [25]. A lumen-negatív grádiens hatására Na+ ionok passzív mozgása figyelhető meg a sejtkapcsoló struktúrákon keresztül, melyet az ozmotikus grádiensnek megfelelelően víz passzív áramlása követ. Gresz és mtsai kutatásai alapján ismert, hogy a nyálmirigy acináris víztranszportban feltehetően fontos szerepet játszanak az aquaporin csatornák, ezek közül is a AQP3 a bazolaterális, a AQP5 pedig a luminális membránban működik [21]. A fenti folyamatok hatására plazma-szerű elsődleges szekrétum keletkezik. Ugyanakkor kimutatható, hogy a Na+-K+-2Cl- kotranszporter bumetaniddal történő gátlása mellett is szignifikáns nyálszekréció

történik,

amely

bumetanid-rezisztens

HCO3--függő

transzport

mechanizmusok jelenlétére utal [26, 27]. Korábbi tanulmányokból ismert a Cl-/HCO3-

14

Bevezetés

kicserélő és Na+-H+ kicserélő jelenléte egyes fajok nyálmirigy acináris sejtjeinek bazolaterális mebránjában [28]. A Cl-/HCO3- kicserélő működéséhez szükséges HCO3jelenlétéről a citoplazmában elhelyezkedő szénsavanhidráz gondoskodik [29], a víz és CO2 HCO3- -tá és H+-ná történő átalakulásának katalizálásával. A keletkezett H+ a Na+/H+ kicserélőn (NHE) keresztül távozik. A Cl- effluxhoz hasonlóan a HCO3- szekréció is folyadék szekréciót generál. Ugyanakkor a Cl- csatornák általában nem teljesen szelektívek, más anionokat is transzportálnak, így bikaronátot is. Mindezek az elektrogenikus HCO3- áram jelentőségére utalnak a folyadék elválasztásban. Bazolaterális oldal +

CO2

+

Na+ Na+ HCO3¯

H2O Na K 2Cl¯

K+

ACh NKCC1

NHE1 H

NBC1

+

CO2+H2O

β rec M3R ↑[cAMP] ↑[Ca2+]

CAII H2CO3

H2 O

NKA Na+ K ATP ADP+ +

H++HCO3⎯

HCO3¯ AEx Cl¯ Luminális oldal 3. ábra. A nyálmirigy acinussejt. Felül a bazolaterális, alul a luminális oldal látható. NHE1: 1. típusú Na+H+-kicserélő, NBC1: Na+-HCO3- kotranszporter, NKA: Na+- K+- antiporter, AE: anion-exchanger, NKCC1: 1.típusú Na+-K+-2Cl- kotranszporter, ACh: acetilkolin, CAII: 2-típusú karboanhidráz, β-adrenerg receptor, M3R: muszkarinerg receptor .

A folyamatban feltételezhetően szerepet játszik a mirigy- és fajspecifikus expressziós mintázatot mutató Na+-HCO3- kotranszporter működése is [30]. Mivel a parotisz sejtekben kimutatott Ca2+-aktiválta Cl- csatornát az intracelluláris pH kisfokú csökkenése is gátolja, érthető a nyálelválasztás érzékenysége az pHi változásaira. Ez a

15

Bevezetés

mechanizmus lehet felelős a szekréció során az intracelluláris homeosztázis fenntartásáért. Az agonisták indukálta intracelluláris [Ca2+] növekedés a Na+-H+ kicserélő serkentése révén [31] növeli az pHi-t, amely a Ca2+-aktiválta K+ és

Cl- csatornák

működését fokozva serkenti a szekréciót az [Ca2+]i visszatéréséig, bizonyítva ezáltal a csatornák fontos szerepét a folyadék szekrécióban elhúzódó stimuláció esetén. Míg az acináris folyadék- és elektrolittranszport jól feltérképezett, addig igen keveset tudunk a duktális transzportmechanizmusokról (4.ábra). A HCO3− a lumen felé valószínűleg, az apikális membránban elhelyezkedő Cl−/HCO3−-kicserélőn keresztül távozik, azonban az anion kicserélő izoformája nem ismeretes (AE vagy SLC26). Jelenlegi tudásunk szerint ez a transzporter a fő hajtóereje a nyálba történő HCO3szekréciónak, mely egyenes arányban áll a duktális Cl- felvétellel. Ugyanakkor az is ismeretes, hogy a Cl-/HCO3--kicserélő expressziója jelentős faji különbségeket mutat, sőt a különböző izoformák azonos fajon belüli megjelenése a duktuszfa különböző magasságaiban is eltérő lehet. Néhány fajban, mint például az egérben a Cl--HCO3-kicserélő nem található meg. Ezt a transzportmechanizmust Zhao és munkatársai [32] kimutatták patkány szubmandibuláris nyálmirigyben mind a luminális, mind pedig a bazolaterális membránban, bár kissé nagyobb expresszióval a luminális oldalon, míg mások csak a luminális membránban azonosították. Egy másik tanulmány szerint patkány parotisz duktuszokban a Cl-/HCO3--kicserélő nem bír különösebb jelentőséggel. Nyugalmi állapotban, amikor a duktális folyadék Cl- koncentrációja a nagyarányú reabszorpció miatt alacsony, a HCO3- és Na+ koncentráció szintén alacsony (jóval a plazmaszint alatt van), ami a NaCl reabszorpciójával valósul meg. A K+ koncentrációja viszont magas (jóval magasabb, mint a plazmában). Amikor a nyál szekréciós rátája növekszik, a duktuszsejtekből felszabaduló HCO3- koncentrációja is növekszik. Magas szekréciós rátánál a HCO3- koncentrációja jóval magasabb a nyálban, mint a plazmában, feltehetően a Cl-/HCO3--kicserélő fokozott működése miatt. Ezzel párhuzamosan a duktuszrendszerben az acinusokból származó Cl- miatt növekszik a Cl- koncentráció. Mivelhogy a duktális folyadék Cl- koncentrációja a transzport mechanizmusok korlátozott transzportkapacitása miatt magas, a nyál HCO3- koncentrációja is növekszik. A bazolaterális oldalon történő felvétel feltehetően a Na+/H+ kicserélő, a Na+HCO3− kotraszporter (NBC) és a H+-ATPáz együttes működése révén valósul meg. A

16

Bevezetés

szabályozási útvonalak (neurotranszmitterek, receptorok

és

szignáltranszdukciós

útvonalak) azonban még kevéssé ismertek. A nyálmirigy duktuszokban a Na+ reabszorpció elsődleges forrása a duktuszsejtek bazolaterális membránjában található energiaigényes Na+-K+-ATPáz, mely befelé irányuló Na+ áramlást és kifelé irányuló K+ áramlást tart fenn a sejten belüli Na+ kipumpálásával, illetve a K+ felvételével. A befelé irányuló Na+ gradiens fenntartja az apikális Na+ csatorna (ENaC) és valószínűleg Na+-H+kicserélő mechanizmusok általi Na+ reabszorpciót a nyálfolyadékból. A Na+ sejtből való kijuttatását a bazolaterális Na+-K+ pumpa végzi. Miután a klór az apikális Cl¯-HCO3¯ kicserélőn át szintén a sejtbe jut, Cl¯ abszorpció indul meg, tehát több klór távozik a bazolaterális membránon, mint az apikálison. A HCO3¯ az apikális Cl¯HCO3¯ kicserélőn keresztül távozik a lumenbe és ezáltal jön létre HCO3¯ szekréció. Az apikális Cl¯-HCO3¯ kicserélőn át a sejtbe került Cl- a bazolaterális oldalon található Cl--csatornákon keresztül jut az interstitiumba [33]. A Cl- transzportjában feltehetően fontos szerepet játszik a Na+-K+-Cl--kotranszporter. Mint később látni fogjuk, a Na+-K+-Cl--kotranszporter elhelyezkedése lényeges különbséget mutat a nyálmirigy és a pancreas duktuszsejt között. Ez a kotranszporter a nyálmirigy duktuszsejtben a luminális membránban, míg pancreas duktuszsejtben a bazolaterális membránban helyezkedik el. Iránya mindkét sejttípus esetében a sejt belseje felé irányul. Ennek a kotranszporternek a fő hajtóereje a pancreashoz hasonlóan a nyálmirigy esetében is a Na+/K+-ATPáz, mely K+-t pumpál ki a sejtből, így a sejt belseje felé irányuló K+ gradienst tart fenn. A K+-szekréció első lépéseként a K+ a bazolaterális Na+-K+ ATPáz segítségével a sejtbe jut, majd az apikális K+-H+-kicserélő segítségével távozik. A Na+H+- kicserélő és a K+-H+-kicserélő együttműködve biztosítják a Na+ és a K+ elektroneutrális kicserélődését. A K+-H+-kicserélő megtalálható a patkány parotiszban [34], de nem mutatható ki a submandibularis nyálmirigyben [32]. A bazolaterális membránban K+-csatornák működnek, melyeken keresztül a K+ elhagyva a sejtet, az intersticiumba jut. Rágcsálók esetében már bizonyították, hogy nyugalmi nyálszekréciókor a HCO3−-jelentős része is visszavételre kerül a lumen felől. Ebben a folyamatban, a megőrző funkcióban több transzporter - szubmandibuláris mirigy esetén bazolaterálisan az NHE1, luminálisan az NHE2 és NHE3, valamint az NBC3 - különböző izoformái vesznek részt [35].

17

Bevezetés

A duktális ionszekréció paraszimpatikus és szimpatikus szabályozás alatt áll. Rágcsálók

szubmandibuláris

nyálmirigyéből

izolált

intralobuláris

granuláris

duktuszsejtek muszkarinerg és α1-adrenerg stimulációra az acinus sejtekéhez hasonló tranziens intracelluláris Ca2+- szint emelkedéssel válaszolnak. Ugyanakkor substance P [36] (4.) vagy VIP [37, 38] aktiválja az adenil-ciklázt, emelve ezzel az intracelluláris cAMP-szintet. A β-adrenerg receptor stimulációja szintén a cAMP-szint emelkedéséhez vezet [39]. Mindezen adatok alapvetően állatkísérletes vizsgálatok eredményein alapulnak, miután mindezidáig nem volt lehetőség a duktális elektrolit transzport molekuláris szintű és funkcionális tanulmányozására, bár immunhisztokémiai módszerekkel a humán nyálmirigy duktuszok transzportereinek feltérképezése már kétségtelenül megkezdődött [21]. Bazolaterális oldal CO2

Na+ Na+ HCO3¯ VIP NHE1

H++HCO3⎯

K+ Cl¯, HCO3 CFTR NKCC1 Na+ K+2Cl¯ H+

ACh

NKA R R ↑[cAMP] ↑[Ca2+] + Na+ K ATP ADP+

NBC1

H+ CAII CO2+H H2CO3 2O

K+

-

H+

HCO3¯

NHE2 Na+

ENaC

AE

Cl¯

Na+

H 2O

Luminális oldal

4. ábra. A nyálmirigy duktális epitélsejt. Felül a bazolaterális, alul a luminális oldal látható. NHE1: 1. típusú Na+-H+-kicserélő, NHE2: 2. típusú Na+-H+-kicserélő NBC1: 1.típusú Na+-HCO3--kotranszporter, NKA: Na+- K+- antiporter, AE: anion-exchanger, CFTR: cystic fibrosis transmembran conductance

18

Bevezetés regulator, NKCC1: 1.típusú Na+-K+-2Cl- kotranszporter, VIP: vazoaktív intesztinális peptid, ACh: acetilkolin, CAII: 2-típusú karboanhidráz, ENaC: epitéliális Na+ csatorna.

Hasnyálmirigy A külső elválasztású hasnyálmirigy szerepe egyrészt a táplálék lebontásához szükséges emésztőenzimek, másrészről pedig a gyomorban termelődő sósav közömbösítéséhez, az optimális pH beállításához és fenntartásához szükséges alkalikus, magas bikarbonát tartalmú elektrolitoldat szekréciójában áll. Ennek megfelelően a szekréció két eltérő szerkezetű sejtféleségben, kettős szekréciós mechanizmussal történik. A mirigyvégkamrákat alkotó acinusok kis mennyiségű, emésztőenzimeket (proteázok, nukleázok, lipáz, foszfolipáz, amiláz) tartalmazó primer szekrétumot juttatnak a kivezetőcsövek lumenébe, az oldat a plazmáéval megegyező összetételű – izozmotikus - elektrolitoldat. A koncentrált összetételű nedvet a kivezetőcsövecskék hámsejtjei által termelt nagy volumenű, erősen alkalikus kémhatású szekrétum higítja. Enzimszekréció: Az exokrin pancreasszövetben az acinussejtek által elválasztott emésztő enzimek részben aktív enzimként (α-amiláz, lipáz, egyéb ribonukleázok), részben pedig inaktív proenzimek – zimogének - formájában találhatóak. Fiziológiás körülmények között a zimogének inaktívak maradnak a hasnyálmirigyben, aktivációjuk csak a duodenum lumenében megy végbe. Ez a biztonsági mechanizmus biztosítja a védelmet a hasnyálmirigy állomány és a környező szövetek önemésztődése ellen, aktiválódásuk után igen agresszív proteolitikus és lipolitikus aktivitással rendelkező enzimek idő előtti aktivációja ugyanis a szervezet saját szövetei ellen fordulva kiterjedt nekrózist, a környező szövetek elhalását okozhatja. Az elsődleges aktiváció folyamatának első lépcsője a patkóbél hámsejtjeinek kefeszegélyében elhelyezkedő enteropeptidáz, mely a tripszinogén amino-terminális végéről hasít le egy oktapeptidet, ezáltal azt tripszinné alakítva beindít egy öngerjesztő aktivációs kaszkádot. Az aktív tripszin molekula ezután képes a még inaktív tripszinogén peptidkötésének hasítására, így indítva el az autokatalitikus folyamatot. A tripszin azonban képes egyéb proteolitikus zimogének

19

Bevezetés

aktivációjára is; hasítja a kimotripszinogén, a prokarboxipeptidázok, a profoszfolipáz, valamint proelasztáz proenzimek inaktivitásáért felelős peptidkötéseket. A tripszin katalizálja önmaga képződését is tripszinogénből, ezt autoaktivációnak hívjuk. A korán (még a hasnyálmirigyen belül) aktiválódott tripszin molekulákat a védő funkciójú pankreatikus szekretoros tripszin inhibitor (PSTI) köti meg. Elektrolit szekréció: A hasnyálmirigy duktuszrendszer az acinusok által elválasztott enzimekben gazdag nedvet a béltraktus felé szállítja, közben azonban közel izotóniás, sok más szekréciós epitéliumtól eltérően bikarbonátban gazdag, folyadékot szekretál a nedvhez. Az enyhén lúgos kémhatású nedv emberben 140mM koncentrációban tartalmaz bikarbonátot, a Cl- koncentráció 20mM [40]. Mint minden szekréciós epitélium esetében, a hasnyálmirigy duktusz transzcelluláris bikarbonátszekréciója során (5.ábra) is a luminalis oldalon elválasztott ionokat a bazolaterális oldalról történő felvétel kompenzálja, tehát a szekréciós folyamat során a duktális epitélsejtek a bazolaterális oldalról bikarbonátot vesznek föl, azt a lumen felé leadják [41]. Az aktív transzportfolyamathoz a hajtóerőt a bazolaterális Na+/K+-ATPáz aktív működése által létrehozott Na+ grádiens biztosítja. A bikarbonát transzportja a bazolaterális membránon keresztül alapvetően kétféle módon mehet vége: egyrészt a sejtmembránon át szabadon diffundáló CO2 víz jelenlétében szénsavvá alakul, a szénsav pedig H+ és HCO3- -ra disszociál. Mindehhez azonban a karboanhidráz enzimrendszer működése szükséges. A sejtből a proton a bazolaterális Na+/H+ cserélőn (NHE1) keresztül vagy a vakuoláris típusú H+-ATPáz (V-ATPáz) segítségével távozik. Másrészt pedig szintén a Na+ fluxust kihasználva a bazolaterális Na+-HCO3– kotranszporteren (NBC1) át közvetlenül lép bikarbonát a sejtbe [12, 42]. Szelektív gátlószerek alkalmazásával kimutatták, hogy a stimulált duktuszok bikarbonátszekréciójáért nagyobbrészt az NBC-, és csak kisebb mértékben az NHE-függő mechanizmus felelős [43]. Tengerimalac és patkány duktuszokon végzett kísérletek alapján a duktális folyadékszekréció egyértelműen bikarbonát jelenlététől függ [44], ugyanakkor néhány fajban megfigyelhető Cl--ban gazdag nedv elválasztása bikarbonát jelenléte nélkül [45]. A folyamat pedig bumetanide adásával gátolható, ami a Na+-K+-2Cl- kotranszporter aktív

20

Bevezetés

jelenlétére utal a mebránban. Ugyanakkor Capan-1 sejteken végzett rövidzárlati áram mérések evidenciát szolgáltattak az NKCC működésére [5], mRNS-ének expresszióját pedig kimutatták CFPAC-1 sejteken is [46]. A mechanizmus azonban, ahogyan a sejt a bazolaterális oldalról bekerült bikarbonátot a lumen felé leadja, máig nem tisztázott teljesen. Különféle modellek láttak napvilágot annak a kérdésnek a magyarázatára, hogy miképp is képes a sejt 140mM koncentrációjú bikarbonát oldat előállítására. Egy lehetséges mód szerint tengerimalacból izolált interlobuláris duktuszok esetében az alapszekrécióhoz elegendő hajtóerőt jelent a bazolaterális NBC1 és NHE1 transzportereken a sejtbe lépő bikarbonát, mely aztán döntően a luminális membrán anion kicserélői segítségével szekretálódik a lumenbe. Az ezzel párhuzamosan a bazolaterális anion kicserélőkön keresztül felvételre kerülő Clionok főképp a luminális membrán CFTR csatornáin át lépnek a lumenbe. E folyamatok kismértékű, spontán, kloridot és bikarbonátot is tartalmazó szekréciót eredményeznek. Stimuláció esetén azonban a CFTR csatorna áteresztőképessége megnövekedik, serkenti az apikális oldal anion kicserélőit, valamint a bazolaterális NBC1-et és minden valószínűség szerint gátolja a bazolaterális AE-t. Abban az esetben, ha az apikális AE 2:1 sztöchiometriával működik, a folyamat a lumenben mérhető HCO3- koncentráció gyors növekedéséhez

és

a

Cl-

relatív

hiányához

vezet.

Az

intracelluláris

térben

következményesen kialakuló Cl- hiány miatt a CFTR is áteresztőbbé válik HCO3számára. A megnövekedett luminális bikarbonát koncentráció feltehetően a luminális AE működésére is gátló hatással van, megakadályozva annak fordított működését és a bikarbonát reabszorpcióját. Mindezek következményeként a jelentősen megnövekedett HCO3- szekréciót nagyon kis mennyiségű Cl- elválasztása kíséri és a bikarbonát legnagyobb része a CFTR-en keresztül lép a lumenbe. Ezen modellnek kissé ellentmond, hogy van irodalmi adat arra vonatkozóan, hogy a magas luminális bikarbonát koncentráció gátolja a CFTR működését tengerimalacban [47]. Emellett CFTR mutációk következtében kialakuló hasnyálmirigy elégtelenség esetében a szekréció csökkenése nem a csatorna kiesett működéséből ered, mint inkább az apikális AE-k csökkent aktivációjából. Az ellentmondásra más modellek sem adnak teljes magyarázatot. Mások szerint ugyanis a bikarbonát szekréció kétfázisú folyamat, mely a duktuszfa különböző magasságainak eltérő anatómiai és funkcionális sajátosságaiból adódik [2]. A proximális

21

Bevezetés

duktuszok az acinusok által termelt nedvhez nagy mennyiségű, kb. 120 mM bikarbonátot tartalmazó folyadékot választanak el. Ez a relatív magas bikarbonát koncentráció gátolja a disztális duktuszok apikális Cl- permeabilitását, ugyanakkor az itt szekretálódott bikarbonát a nedv végső koncentrációját tovább növeli. Ezen felül feltételezhető egy részleteiben nem ismert Cl- visszaszívó mechanizmus is, mely a nedv Cl- tartalmát tovább csökkenti. A különböző szakaszok eltérő szekréciós mechanizmusának hátterében különböző anion kicserélők expressziója (SLC26A6 és SLC26A3) állhat, melyek eltérő sztöchiometriával működnek. Bazolaterális oldal Na+

+

+

+

Na K 2Cl¯

CO2

+

Na Na 2HCO3¯

NKCC1 AE

NHE

NBC

ATP VIP R

R

K

Sec R

H CAII

cAMP Ca2+

H2CO3

Na+

NKA Na+ K ATP ADP+ +

+

CO2+H2O

+

H++HCO3⎯

PKA II

Cl¯, HCO3-

CaCl

HCO3¯

HCO3¯

CFTR

AEx 2Cl¯

R

PAT-1

ATP Cl¯

Luminális oldal

5. ábra. A hasnyálmirigy duktális epitélsejt. Felül a bazolaterális, alul a luminális oldal látható. NHE1: 1. típusú Na+-H+-kicserélő, NBC1: Na+-HCO3--kotranszporter, NKCC1: 1.típusú Na+-K+-2Cl- kotranszporter, NKA: Na+- K+- antiporter, CAII: 2-típusú karboanhidráz, PKA: protein-kináz-A, AE: anion-exchanger, CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, Sec: szekretin, VIP: vazoaktív intesztinális peptid, ATP: adenozin-trifoszfát.

22

Bevezetés

A sejtproliferáció mechanizmusa – a PKC jelentősége Az emberi szervezet bizonyos sejtjei teljes életciklusuk során megtartják szaporodási, proliferációs képességüket. Ezen tulajdonság fontos szerepet játszik a különböző károsító noxák elleni küzdelemben. Ugyanakkor az ellenőrzés alól kibújó folyamat kontrollálatlan sejtburjánzáshoz, daganatképződéshez vezethet. A proliferációt szabályozó folyamatok szabályozásának ismerete ezért elengedhetetlen a daganatos megbetegedések elleni küzdelemben is. A protein kináz C (PKC) enzimről jól ismert, hogy alapvető szerepet tölt be ezen folyamatok regulációjában. A PKC család legalább 10 tagot számlál, melyek a szöveti megjelenésben, szubcelluláris lokalizációban, szubsztrát specificitás tekintetében, vagy akár az aktivátorok és kofaktorok típusában különbözhetnek egymástól [48]. A hagyományos (konstitutív (c)) izoformák (cPKCα, -βI, -βII és -γ) aktivációjában szerepet játszik a kálcium, a diacilglicerol (DAG) és különböző foszfolipidek, a novel (n) izoformák (nPKCδ, -ε, -η és -θ) szabályozásában a kálcium nem bír jelentőséggel, míg az atípusos (a) izoformák (aPKCζ és -λ) aktivációjában sem a DAG, sem a kálcium nem vesz részt [48]. A PKC izoenzimek minden sejttípusban expresszálódnak, azonban az egyes sejtek között jelentős különbség mutatkozik ezen izoformák expressziós mintázatában, a sejten belüli lokalizációjában [49]. A PKC izoenzimek a szervezetben az adott fajra, szövetre, valamint sejtre specifikus megoszlási mintázatot hoznak létre. A különböző PKC izoenzimek G-protein kapcsolt receptoron (GPCR) keresztüli indirekt aktivációjára képes számos, egyébként a külső elválasztású mirigyek szekréciós működését szabályozó peptid is. GPCR-ok aktiválják a foszfolipáz C β-t és foszfatidil-inozitol-4,5-biszfoszfát (PIP2) hasításából DAG és inozitol-1,4,5-trifoszfát (IP3) keletkezik. Előbbi aktiválja a cPKC-t és nPKC-t, míg utóbbi serkenti a kálcium felszabadulását az intracelluláris raktárakból [50]. cPKC és nPKC aktiválható DAG-analóg forbol-észterekkel is [51]. A PKC család tagjai számtalan sejtfunkcióban, mint például a sejtnövekedésben és differenciációban vállalnak fontos szerepet. Egyes közlemények szerint a forbol-észterek kiváltotta PKC aktiváció gátolja [52], míg mások szerint serkenti [53] a hasnyálmirigy daganatsejtek növekedését. Ugyanakkor Panc-1 sejteken natív formában is expresszálódó 23

Bevezetés

neurotenzin receptor aktivációja a PKC indirekt stimulációján keresztül serkenti a proliferációt [54]. A szerin/treonin protein-kinázok közé tartozó mitogén-aktivált protein-kinázok (MAPK) aktivációjáért egy sor foszforilációs kaszkádon keresztül ható extracelluláris szignál lehet a felelős [55]. Ezek közül a legismertebb az extracelluláris szignál regulálta kináz (ERK1 és ERK2). Az ERK kaszkád aktivációja akár receptor tirozin-kinázok, úgy mint EGF vagy PDGF receptorok serkentésén keresztül jöhet létre [55]. A G-protein kapcsolt receptorok különböző – PKC-függő és PKC független [56] - mechanizmusokon keresztül aktiválhatják az ERK kaszkádot [50]. A PKC akár direkt módon a Raf-1 foszforilációján keresztül [57], akár Ras-függő módon [58] serkentheti az ERK kaszkádot. Az ERK kaszkád direkt foszforilációs mechanizmussal számos enzim és transzkripciós faktor, úgy mint p90RSK, Elk-1 és c-Myc [59] aktivációjáért felelős. Ezen folyamatok következményeképpen az ERK alapvető szerepet játszik olyan kulcsfontosságú sejtfolyamatok szabályozásában, mint a differenciáció, apoptózis és proliferáció [60]. Panc-1 emberi hasnyálmirigy daganatsejtekben a neurotenzin aktiválta PKC ERK-függő módon

szabályozza a proliferációt [54]. Továbbá, MiaPaCa-2 hasnyálmirigy

daganatsejteken forbol-észterek hatására létrejövő PKC aktiváció ERK-függő módon serkenti a kötőhely-független növekedést [53]. Ugyanakkor MiaPaCa-2 [53] és DanG [61] emberi hasnyálmirigy daganatsejteken a forbol-észterek gátolják a kötőhely-függő növekedést, az ERK kaszkád szerepe a folyamatban még nem ismert. Korábbi tanulmányokból tudjuk, hogy az ERK aktivitás nagysága és időbeli lefolyása alapvetően meghatároz bizonyos biológiai folyamatokat [62, 63]. Nevezetesen, patkány phaeochromocytoma eredtű PC12 sejteken az epidermális növekedési faktor (EGF)indukálta átmeneti ERK aktiváció sejtproliferációt, míg neuronális növekedési faktor (NGF)-indukálta

elhúzódó

ERK

aktiváció

differenciációt

eredményez

[64].

Gasztrointesztinális epitélsejteken növekedési faktorok hatására átmeneti ERK aktiváció és következményes sejtnövekedés figyelhető meg, viszont PKC aktiváció hatására az ERK aktiváció tartós és jelentős mértékű és sejtciklus gátlást eredményez [65]. Még kevéssé ismert, hogy milyen jelentőséggel bír az ERK aktiváció kinetikája emberi hasnyálmirigy daganatsejtek proliferációjában,. Kisfalvi és munkatársai kimutatták, hogy MiaPaca-2

sejteken

neurotenzin

és

epidermális

24

növekedési

faktor

együttes

Bevezetés

alkalmazásakor azok egymás hatását erősítve fokozzák a DNS szintézist. A folyamat hátterében az ERK aktiváció megnövekedett időtartama áll [66]. Mivel a DNS szintézisre és sejtnövekedésre kifejtett fenti hatások akár napokon keresztül fennmaradhatnak, az ERK aktiváció vizsgálata hosszabb perióduson keresztül is indokolt lehet.

A külső elválasztású mirigyek szekréciós és proliferációs folyamatainak neurohumorális szabályozása A tápcsatorna epitéliális mirigyei esetében a szekréció legfontosabb endogén aktivátora maga a táplálékfelvétel, valamint a tápcsatorna felső szakaszában végbement emésztő folyamatok által keletkezett bomlástermékek közvetlen stimuláló hatása. A felvett tápanyagok tekintetében elmondható, hogy a nyálmirigy és pancreas szekréciós működése elsősorban a táplálék fehérjetartalmával van egyenes arányban. Míg a hasnyálmirigyben nyugalmi szekréció nem jellemző, addig a nyálmirigyekben bazális szekréció zajlik, és ez tartja fenn a szájüreg homeosztázisát. Táplálkozás hatására azonban a bőségesen termelődő nyál elősegíti a szájképletek nedvesítését és elkezdi a bevitt táplálék emésztését [67]. A szekréciós válasz a kiváltó ingerek szerint három fő csoportba osztható. A cefalikus fázisban, a szekréció kiváltásában a táplálékkal kapcsolatos látási, ízlelési, szaglási ingerek, valamint a szájnyálkahártya mechanikai ingerlése játszik szerepet, mely az enzimszekréció kolinerg aktivációját indítja. A gasztrikus fázisban a gyomor disztenziója atropinnal gátolható, reflexes enzinmszekréció növekedést hoz létre. A duodenumba jutott, részlegesen lebontott tápanyagok szolgálnak a legerősebb ingerként a pancreas szekréciós folyamatainak serkentésében. Kísérletes adatok szerint az intesztinális fázisban a felső gasztrointesztinális traktusban a lebontó folyamatok során keletkezett oligopeptidek, aminosavak, közepes lánchosszúságú zsírsavak stimuláló hatást fejtenek ki az acináris enzimszekrécióra. Ezen ingerek által indukált szekréció folyamatát elsődlegesen a vegetatív idegrendszer szabályozza, azonban ismert számos hormon természetű anyag jelentősége is a regulációban: számos tanulmány igazolta, hogy a hormonális rendszerben történt változások jelentős hatással voltak a mirigysejtek működésére és proliferációjára [68]. A vegetatív idegrendszerben jó néhány

25

Bevezetés

neurotranszmitter játszhat szerepet a szekréció szabályozásában. A muszkarinerg (más néven kolinerg) receptornak számos altípusa létezik, melyek a különböző szövetekben más és más mintázattal expresszálódnak [69]. Másodlagos hírvivő mechanizmusaik tekintetében sem egységesek: néhányuk PIP2 hasításán keresztül, mások pedig cAMP szint emelésén keresztül hatnak, vagy akár mindkét mechanizmus szerepet játszhat a jeltovábbításban [70]. A nyálmirigyek acinussejtjeiben muszkarinerg vagy α-adrenerg stimuláció hatására PIP2-bontás, míg β-adrenerg stimuláció hatására cAMP-képződés következik be. Az acináris és duktális szekréciós folyamatok szabályozásában a vegetatív idegrendszer mellett különböző hormonok és neurotranszmitter természetű peptidek is résztvesznek [71] (1). Specifikus ingerek hatására a sejtekből ezek az anyagok kiáramlanak és parakrin módon a környezetükben lévő egyéb sejtekre hatnak, vagy autokrin módon az őket termelő sejtekre. Mások stimuláló hatásra kiválasztódnak a vérbe, így a vér közvetítése révén jutnak el a célszervekhez és célsejtekhez, melyek azonnali válasszal reagálnak. Az epitéliális mirigyek szekréciós aktivitásának szabályozásában fontos szerepet játszanak a gasztrointesztinális reguláló peptidek (pl. szekretin, kolecisztokinin, bombezin-szerű peptidek), a nukleotidok (pl. ATP, UTP), valamint különböző ionok (pl. az extracelluláris kalcium). A példaként felsorolt anyagok kémiai természete igen különböző, ám van egy közös tulajdonságuk: G-protein kapcsolt receptorokon keresztül hatnak. A receptorok aktivációja katalizálja a G-fehérjén a GDP GTP-re történő cseréjét, aminek következtében a G-fehérje három alegységre (α, β, γ) disszociál. A GTP a Gα alegységhez kapcsolódva aktiválja annak működését, míg a β és γ alegységek dimert alkotnak. Az alegységek variabilitása biztosítja sejten belüli effektorok aktiválásából eredő eltérő hatásokat. A Gαi-n keresztül különböző ioncsatornák, a cAMPátalakulás, a foszfolipázok és a foszfodiészterázok gátlódnak. A Gαs-n keresztül a ciklikus foszfodiészteráz aktivitása fokozódik, így a cAMP-szint emelkedik. A Gαq-n keresztül a foszfolipáz-Cβ (PLCβ ) aktiválódik, minek hatására foszfatidilinozitol-4,5biszfoszfát hasításából (PIP2) diacilglicerol (DAG) és inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) keletkezik. IP3 hatására Ca2+ szabadul fel az intracelluláris raktárakból. A DAG a proteinkináz-C-t (PKC) aktiválja.

26

Bevezetés

Noha

a

gasztrointesztinális

(GI)

traktus

működésében

szerepet

játszó

hormonszerű anyagokat korábban kizárólag endokrin eredetű termékeknek tartottuk, mára már világos, hogy a szekréciót szabályozó hormonális hatásokon túl autokrin, vagy parakrin módom hatva fontos szerepet játszanak számos sejtszintű folyamat szabályozásában is. Ugyanakkor a GI hormonok neurogén stimulusok hatására felszabadulva a véredényeken keresztül neurokrin módon hatva befolyásolnak számos sejt- és szövetszintű folyamatot. A regulátorok proliferációra kifejtett hatását GPCR-en keresztül aktiválódó szerin-treonin kinázok (ERK és MAPK) közvetítik [72]. A MAPK kinázok

aktivációjukat

követően

a

sejtmagba

transzlokálódnak

és

különböző

transzkripciós faktorok foszforilációját szabályozva a sejtnövekedésért felelős gének expresszióját regulálják [73]. Emellett a gasztrointesztinális traktus számos daganatos megbetegedése is expresszál hormonkötő receptort, kísérletes körülmények között a CCK és gasztrin szerepe a daganatok kialakulásában bizonyított. Ezen megfigyelésekből kiindulva érthető, hogy a hormonok elválasztását vagy kötődését blokkoló vegyületek potenciális adjuváns terápiát jelenthetnek a daganatos megbetegedésekben, de fontos szerepet játszhatnak egyéb kórképek kezelésében is. Gasztrointesztinális peptidek: Az ismert gasztrointesztinális peptidek alapvetően hét családba sorolhatók. Ezek közül az első a szekretin-család, melynek tagjai a szekretin, a glukagon, a glukagon-szerű peptidek (GLP I és GLP II), a vazoaktív intesztinális peptid (VIP), a gastric inhibitory peptide (GIP), a növekedési hormont felszabadító hormon (GHRH), a peptid hisztidin izoleucin és az agyalapi adenil ciklázt aktiváló peptid (PACAP). A második, a gasztrinkolecisztokinin-család peptidjei az emlős gasztrin és kolecisztokinin (CCK) polipeptidek különböző molekulaszerkezetű variánsaiból tevődnek össze, valamint fontos még megemlíteni a cöruleint és a cionint. A harmadik, tachykinin/bombezin család tagjai a substance P, a neurokinin B, a gastrin releasing peptide (GRP) és a bombezin. A negyedik, pankreatikus polipeptid családba a pancreatikus polipeptid (PP), a neuropeptid Y (NPY) és a peptid YY (PYY) peptidek tartoznak. A szomatosztatin-család tagjai a szomatosztatin és a kortikosztatin. Az EGF-családba az epidermális növekedési faktor (EGF), a transzformáló növekedési faktor-α (TGFα) és az amfiregulin tartoznak. Az

27

Bevezetés

inzulin-családot az inzulin és az I és II inzulin-szerű növekedési faktor (IGF-I, -II) alkotják. Kísérleteinkben az alábbi regulátorok hatását vizsgáltuk: Szekretin A szekretint, az első azonosított hormont [74], proximális vékonybél villusaiban található szekretin sejtek (S-sejtek) termelik. Felszabadulásának legfőbb szabályozója a duodenális pH, azonban a posztprandiális szekretin felszabadulásban ettől független, nonacid faktoroknak is szerepük lehet. A szekretin a pancreas HCO3-- és folyadékszekréciójának leghatásosabb ismert stimulátora emberben és más fajokban. A táplálék főbb összetevői közül a zsírsavak (mint például olajsav) emelni képesek a plazma szekretin szintjét és ezáltal a HCO3--szekréciót. Az epe a felső vékonybél szakaszban szintén serkenti a szekretin felszabadulást. A duodenalis pH 2,0-2,5 értékénél fiziológiás körülmények között felszabadult szekretin önmagában csak minimális bikarbonát szekréció növekedést okoz, ezzel szemben egyidejűleg szecernálódott CCK és neurális kolinerg ingerület azonban együttesen, potencírozó hatásuk révén fokozza a szekretin bikarbonát szekréciót stimuláló hatását. Szuprafiziológiás dózisokban a szekretin stimulálja az alsó oesophagealis sphincter kontrakcióját, az inzulin felszabadulását, a duodenum Brunner-mirigyeinek elválasztását, a vese víz- és elektrolitkiválasztását, a percvolument, a splanchnicus vérátáramlást, valamint a lipolízist a zsírsejtekben. A daganatos sejtek proliferációjában kifejtett hatása azonban nem bizonyított, kísérletes körülmények között szekretin adása nem befolyásolta a MiaPaCa-2 és Panc-1 sejtek proliferációját [75]. Ugyanakkor Howatson és munkatársai leírták a szekretin serkentő hatását N-nitrozobisz (2-oxipropil) amin (BOP) indukálta karcinogenezisre hörcsög hasnyálmirigyben [76]. A szekretin receptor-családba tartozik a szekretinen kívül a vazoaktív intesztinális peptid (VIP), a pituitary adenylate-cyclase activating peptide (PACAP), a gastric inhibitory peptide (GIP), a glukagon, gastrin-like peptide (GLP), a kalcitonin, és a calcitonin gene-related peptide (CGRP) [77, 78].

28

Bevezetés

Kolecisztokinin A kolecisztokinint (CCK) eredetileg a gasztrointesztinális traktusban mutatták ki mint olyan peptidet, mely az epehólyag kontrakcióját fokozza, később ismerték fel pancreas enzimszekréciót fokozó, valamint sejtproliferációt indukáló hatását [79]. Felszabadulásának legfőbb aktivátora az emésztés során keletkező hidrolitikus termékek, mint például az aminosavak és a zsírsavak. A CCK elsősorban a vékonybél proximális kétharmadában elhelyezkedő I-sejtekben termelődik, azonban kisebb mennyiségben megtalálható enterális neuronokban és a hasnyálmirigy szigeteiben is. A CCK receptorok megtalálhatóak a gasztrointesztinális traktusban és az idegrendszerben. Két CCK receptor típust különböztetünk meg, a CCK-ra szelektív CCK1 [80] és a CCK-t és gasztrint is egyaránt nagy affinitással kötő CCK2 [81] receptort (korábbi elnevezésük: A „alimentary” és B „brain” receptorok) [82, 83]. A CCK-nak széles körű élettani hatásait ismerjük. Szinte minden hatása valamilyen módon kapcsolatban áll a táplálkozás egyensúlyával. A emésztésre gyakorolt főbb hatásait tehát a CCK1 receptoron keresztül fejti ki. Ennek során serkenti a hasnyálmirigy acinus sejtjeinek szekrécióját [82], valamint fokozza az epehólyag simaizom sejtjeinek kontrakcióját, fokozza a pylorus kontrakcióját, ezáltal késlelteti a gyomorürülést, és optimális tápanyagmennyiséggel segíti az emésztést [84]. Kevésbé körülírt hatásai között szerepel az enterális és colon transzport modifikációja, a savszekréció csökkentése, melyet szomatosztatin-felszabadító hatása révén fejt ki. Emellett inzulinotróp [85](3.), valamint a pancreas növekedését [86] és regenerációját [87] (2.) szabályozó hatása is ismert. Fontos neuronális hatása, hogy csökkenti az étvágyat [88]. A CCK2 receptoroknak nem ismert élettani szerepe a hasnyálmirigy növekedésében, sem annak exokrin szekréciójában, sem pedig az epe szekrécióban. Ugyanakkor a periférián először a gyomorban kimutatott CCK2-receptor fontos szerepet játszik a gasztrin gyomorsav szekrécióra kifejtett hatásának közvetítésében [89]. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálatai alátámasztották, hogy a gasztrin/CCK peptid család tagjaival stimulált gyomorsav szekréció gasztrin/CCK2-receptorokon keresztül valósul meg.

29

Bevezetés

A CCK gasztrointesztinális peptidként nem csak az exokrin szekréció szabályozásában vesz részt, de feltételezhető, hogy jelentős szerepe van a normál és daganatos sejtproliferáció regulációjában is. In vitro kísérletekben bizonyították a CCK és analógjának emberi hasnyálmirigy sejtek növekedésének szabályozásában betöltött szerepét Panc-1 [90] és Capan-1 sejtvonalon [91]. Camostate tartós adagolása a megnövekedett plazma CCK szintnek köszönhetően növelte a hasnyálmirigy tömegét, valamint fehérje- és DNS tartalmát [92]. Hasonlóan, exogén CCK adása stimulálta a hasnyálmirigy növekedését. A CCK a MAPK kaszkád aktivációján keresztül az ERK és p38MAPK stimulációt eredményez [93]. Ugyanakkor ismert más szignalizációs utak szerepe is a folyamatban. Hirata és munkatársai szerint a CCK-8 (a CCK különböző molekuláris megjelenés formáinak egyike) PKC aktiváción keresztül emeli a metalloproteináz-9 szintjét hasnyálmirigy daganatos sejteken, felvetve ezáltal a CCK szerepét a pancreas daganatok invazivitásában és a metasztázis képződésben [94]. Patkányban a CCK felszabadulását serkentő tripszin-inhibitor tumor-indukciós hatással bírt [95]. Vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP) A vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP) élettanilag fontos neuropeptid, mely felszabadul mind a periférián, mind pedig a központi idegrendszerben és a biológiai hatások széles spektrumáért felelős az emlős szervezetekben. VIP-et tartalmazó idegeket és VIP hatásokat leírtak az emésztőtraktusban, a kardiovaszkuláris rendszerben, a légutakban, a reproduktív rendszerben, az immunrendszerben, az endokrin mirigyekben és az agyban. A VIP relaxálja az alsó oesophagealis sphinctert, az Oddi sphinctert és az anális sphinctert, szabályozza a perisztaltikus reflex deszcendáló relaxációját, valamint úgy tűnik, hogy szerepe van a vékonybél reflex vazodilatációjában. A VIP szintén stimulálja a pancreas duktuszok és az epe bikarbonát- és folyadékszekrécióját, stimulálja a pancreas acinusok enzimszekrécióját, szabályozza az intesztinális kloridszekréciót, azonban a szekréció közvetlen szabályozásában betöltött pontos szerepe még nem ismert. Az exokrin elválasztásra, hormonszekrécióra, izomrelaxációra és metabolizmusra kifejtett közvetlen hatásai mellett kimutatták a VIP növekedést szabályozó hatását foetusban és tumorsejtekben, valamint az embrionális agy fejlődésében [96]. Újabb eredmények

30

Bevezetés

szerint a VIP-nek fontos szerepe van a fájdalomérzékelésben [97], továbbá kimutatták gyulladáscsökkentő hatását is. Végül a VIP-nek nagy jelentőséget tulajdonítanak a watery diarrhea szindrómában (VIP-oma), valamint nagy lehetőségeket látnak a VIP terápiás alkalmazásában impotencia, asztma, tüdősérülés, különböző tumorok és neurodegeneratív betegségek esetében [96]. A VIP a szekretin-családba tartozik [98]. A családon belül szerkezet és funkció tekintetében a VIP és a PACAP áll a legközelebb egymáshoz. A VIP receptorok magas affinitással kötik a VIP-et (IC50: 1 nM) és viszonylag alacsony affinitással a szekretint (IC50: 1 µM). Mindkettő aktiválja a kétféle receptortípust, a VPAC1-t és VPAC2-t, melyek mind a VIP, mind pedig a PACAP iránt magas affinitást mutatnak [77]. Ezek a receptorok a többi, fentebb említett VIP-szerű peptid receptorával együtt egy külön alcsaládot alkotnak a G-protein-kötött receptorok szupercsaládjában [78]. Neurotenzin (NT) A neurotenzint először borjú hypothalamusból izolálták [99]. Elsősorban a központi idegrendszerben (hypothalamusban és hypophysisben) található meg, de kimutatható ileum és a jejunum endokrin sejtjeiben is [100]. A béllumenben megemelkedő zsírkoncentráció hatására felszabaduló NT serkenti a hasnyálmirigy szekréciós működését [101], gátolja a gyomor és a vékonybelek motilitását [102], elősegíti a zsírsavak felszívódását [103] és fontos szerepet játszik számos emésztőszerv növekedésének szabályozásában. A neurotenzin prekurzorából, a preproneurotenzinből képződik, amelyik tartalmazza az NT-1-13-at és a neuromedin-N fehérjét. Az NT 1-13 a proneurotenzin végtermékeként a vékonybélben és az agyban keletkezik, amely a szekréciókor vagy kevéssel utána a biológiailag inaktív NT 1-8-cá és a hatásokért felelős NT 9-13-má hasad. A substance P, muszkarinerg agonisták (karbachol), katekolaminok, és a gastrin-releasing peptid (GRP) serkenti az NT felszabadulását, jelezve ezáltal a komplex idegi, humorális és közvetlen intraluminális folyamatok szerepét a neurotenzin felszabadulásában. Mivel egyes megfigyelések szerint a a specifikus CCK-A receptor antagonista L-364718 gátolja a neurotenzin indukálta protein elválasztást, feltételezhető, hogy az NT az intrapankreatikus CCK-erg neuronok közvetítésével is részt vesz a hasnyálmirigy

szekréciós

működésének

31

szabályozásában

[104].

A

cörulein

Bevezetés

alkalmazásához hasonlítva az NT százszoros dózisban történő tartós adása jelentős hasnyálmirigy hiperpláziát okoz, így a sejtnövekedés szabályozását tekintve gyenge agonistaként viselkedik [105]. Az a megfigyelés, hogy a NT receptor előszeretettel expresszálódik emberi duktális adenocarcinomákban, ugyanakkor nem kimutatható endokrin eredetű daganatokban, normál hasnyálmirigy szövetben, az NT receptor kimutatását meghatározó lépéssé tette a duktális adenokarcinómák diagnosztikájában [106]. Ugyanakkor további vizsgálatokat igényel annak tisztázása, hogy az emberi hasnyálmirigy daganatokban - a MiaPaCa-2 daganatos sejtvonalhoz hasonlóan – az NT-t a daganatsejtek maguk termelik-e. Így a neurotenzin nem csak a szekréciós működés fontos szabályozó faktoraként, hanem a daganatos sejtproliferáció mediátoraként is terápiás célponttá válhat. Feurle és munkatársai szerint NT alkalmazása nem csak a hasnyálmirigy tömegében, DNS-, RNS-, és fehérje tartalmában jelentett szignifikáns növekedést, hanem a lipáz- és amiláz koncentrációban is [107]. Hasonló eredményeket publikáltak Wood és mtsai is neurotenzin tartós alkalmazásáról [105]. A CCK-hoz hasonlóan az NT is stimulálja a hasnyálmirigy daganatsejtek proliferációját és MiaPaCa2 sejteken serkenti az ERK kaszkád működését és emeli az AP-1 kötő aktivitást [108]. Purinerg jelátvitel: Az adenozin vegyületek – amellett, hogy makroerg kötések révén az energiaraktározásban, valamint a nukleinsavak felépítésében játszanak fontos szerepet – az emberi szervezetben jelátviteli molekulákként is nélkülözhetetlenek. Az extracelluláris adenozinok szignalizációban betöltött esetleges szerepéről először Szent-Györgyi és munkatársai számoltak be [109]. Azóta kimutatták szimpatikus, paraszimpatikus idegvégződésben, és a neuromuszkuláris junkcióban is. Jónéhány mechanizmus állhat az ATP felszabadulás hátterében, ugyanakkor máig nem világos, vajon ezek a folyamatok milyen mintázattal jelennek meg a különböző sejttípusokban. Ismert, hogy a hasnyálmirigy acinusok kolinerg stimuláció hatására emésztőenzimeket és ATP-t választanak el [110]. Jelen ismereteink szerint a konstitutív vezikuláris vagy nonvezikuláris ATP felszabadulást különböző stimulusok, regulátorok felülvezérlik. A folyamatban a CFTR-nek szintén lehetséges szerepet tulajdonítanak. Epitéliális sejtekben ugyanis mechanikus stressz hatására a CFTR vagy más ATP-kötő fehérje képes az ATP

32

Bevezetés

direkt transzportjára. A hipotézis ellenzői ugyanakkor a connexin szerepét hangsúlyozzák a transzportban. Cotrina és munkatársai szerint ATP felszabadulásakor felszaporodó connexin saját maga is képes az ATP transzportjára és képes a transzportért felelős intracelluláris struktúrák, vezikulák mozgásának regulációjára [111]. A purinoceptorok az emberi szervezet majd minden sejttípusán megtalálhatóak. Fontos szerepet játszanak a trombociták aggregációjának szabályozásában, az exokrin szekréció modulálásában, endotélsejtek vazodilatációjában, a gyulladásos reakciókban. Ugyanakkor a trófikus purinerg hatások jelentősége a differenciáció, apoptózis, sejtproliferáció folyamatában, a malignus daganatok kialakulásában szintén nem kérdéses. Astrocytákban kimutatták, hogy ATP/UTP stimulálja a mitogén-aktiválta protein kinázok (MAPK) és az ERK kaszkád működését, Ca2+ független PKC és a foszfolipáz D (PLD) bevonásával. Vese eredetű mezangiális sejteken UTP G-fehérjéken keresztül aktiválja a stressz-aktiválta protein kinázt (SAPK). A nukleotidok alapvetően kétféle sejtfelszíni receptorhoz kapcsolódva fejtik ki hatásaikat: az adenilát ciklázhoz kapcsolt P1-purinoceptorok (adenozin receptorok) és a purin- és pirimidin nukleotidok által aktivált P2-purinoceptorok. A P2 receptoroknak két fő családját különböztetjük meg: a P2X és P2Y receptorokat. A P2X receptorok tulajdonképpen ioncsatornákként működnek, aktivációjukkor az ioncsatornák nyitása extracelluláris Ca2+ beáramlásához vezet, a sejtek depolarizációja pedig a feszültségfüggő Ca2+ csatornák aktiválásával a belső raktárak ürítésén keresztül tovább emeli az intracelluláris [Ca2+]-t. A P2Y receptorok részben G-protein aktivációján keresztül serkentik a PLC-t és az így felszaporodott IP3 indukálja a citoplazma [Ca2+]-ának növekedését és a PKC aktivációját, részben pedig a P2Y12 receptor aktivációja az adenilcikláz gátlása vagy serkentése révén G-protein kapcsolt módon vesz részt a jelátvitelben. Egyes közlemények szerint a P2 receptorok fejlődési stádiumtól és kortól függő eltérő expressziós mintázata alapvető szerepet játszhat a hasnyálmirigy sejtek proliferációjának, sejthalálának szabályozásában is [112]. Emellett apikálisan és bazolaterálisan ható ATP/UTP különböző szignáltranszdukciós útvonalakat aktivál, még ha a receptorok expressziója ugyanaz is a két oldalon, jelezve ezáltal az ATP-indukálta bikarbonát szekréció polarizáltságát [110].

33

Bevezetés

Az intracelluláris Ca2+ és az iontranszportfolyamatok vizsgálatával nyilvánvalóvá vált, hogy a hasnyálmirigy acináris sejtek kevesebb, mint 20%-a expresszál funkcionális P2 receptorokat [113]. A purinoceptorok szerepe ugyanakkor a duktális folyamatok szabályozásában nem elhanyagolható. A patkány hasnyálmirigy duktuszsejteken bazolaterálisan P2Y2 és P2Y4 G-protein kapcsolt purinoceptorokat, luminálisan pedig P2X2 és P2X4 purinoceptor ioncsatornákat mutattak ki [114]. A bazolaterálisan ható UTP és ATP P2Y2 és P2Y4 receptorokon hatva intracelluláris Ca2+-felszabadulást és Ca2+beáramlást okoz, ugyanakkor tengerimalacban a bazolaterális K+-csatornák zárása révén gátolja a nedvszekréciót [115]. A luminális P2X2 és P2X4 receptorok stimulációja Ca2+és Na+-beáramláshoz vezet [114], ami önmagában nem indítja be a szekréciót, viszont potenciálja a szekretin hatását [116]. Epehólyagban, epevezetékben, valamint hasnyálmirigy duktális sejteken ATP/UTP serkenti az elektrogenikus HCO3- transzportot, mely lehet Cl- függő, vagy attól független és Ca2+ függő csatornák közreműködésével megvalósuló. Ugyanakkor néhány tanulmány szerint CFTR-t expresszáló szövetekben az ATP-UTP alkalmazásának elhanyagolható hatása van a bikarbonát szekrécióra, míg cisztikus fibrózisban a sejtek sokkal érzékenyebbek a purinerg stimulációra. ATP alkalmazása aktiválja a Ca2+függő Cl- csatornák, a Cl-/HCO3- kicserélők és K+ csatornák működését, bikarbonát szekréciót eredményezve ezáltal [3]. UTP és ATP bazolaterális P2Y2 és P2Y4 receptorok stimulációján keresztül vezet Ca2+ felszabaduláshoz, melynek végső hatása minden bizonnyal a K+ csatornák zárása [114]. Hasnyálmirigyben az ATP feltehetően az acinusok és duktuszok közötti szignáltranszdukció koordinálásában vesz részt. Az acinusok acetilkolin hatására emésztőenzimek mellett ATP-t választanak el. A luminális ATP a szekretin hatását potencírozva stimulálja a duktális ion- és folyadéktranszportot [115]. Ezen tény ismerete további kérdéseket vet fel. Az ATP epitéliális mirigyekben kifejtett hatása bazolaterális receptorok közvetítésével valósul meg. A luminálisan elválasztott ATP szerepe, hatásmechanizmusa azonban még messze nem teljesen tisztázott. A rágóizomzat mozgása mechanikus stimulációt jelentve fokozza az ATP elválasztását a nyálmirigyek acinusaiban, amely autokrin/parakrin módon hatva stimulálja a szekréciót. Korábbi vizsgálatokból ismert, hogy a purin nukleotidok parotisz acinussejtekben emelik a K+ konduktanciát és az amiláz felszabadulást [117]. Az elmúlt

34

Bevezetés

évek világossá tették, hogy az ion-és folyadékszekréció stimulációja, az enzimszekréció serkentése G-proteinektől és a foszfatidil-inozitol hidrolízisétől független [118] P2Z típusú receptor közvetítésével megy végbe. Emellett a nyálmirigy acinusok P2X7 és magas affinitású P2X4 receptorokat is expresszálnak. A P2Y (ezen belül is a P2Y2 és Y1) receptorok expresszióját a fő vezeték lekötése serkenti, míg a mirigyfejlődés szakaszában kifejeződésük csökken. Ugyanakkor a P2X receptorok nem a dinamikus, hanem statikus mirigyfunkciókban vállalnak szerepet: serkentik az NHE, az NKCC működését, befolyásolják a folyadék szekréciót, serkentik az amiláz felszabadulást [119]. A receptorok polarizáltsága, az annak hátterében álló különböző szignáltranszdukciós utak szerepe, az abból fakadó eltérő hatások mechanizmusa azonban – a hasnyálmirigy duktuszokban megfigyeltekhez hasonlóan - máig nem tisztázott.

35

Célkitűzés

CÉLKITŰZÉS Jelen tanulmány céljai az alábbiak voltak: 1. modellrendszer felállítása az epitéliális mirigyek duktális transzportfolyamatainak vizsgálatára 2. gasztrointesztinális peptidek szerepének vizsgálata epitéliális mirigyek bikarbonát szekréciójának szabályozásában 3. purinerg jelátviteli rendszer szerepének vizsgálata epitéliális mirigyek bikarbonát szekréciójának szabályozásában 4. gasztrointesztinális peptidek szerepének vizsgálata emberi hasnyálmirigy daganatos sejtek differenciációjának szabályozásában 5. PKC izoformák szerepének vizsgálata a sejtosztódás szabályozásában és az ERK aktivációban emberi hasnyálmirigy daganatos sejtvonalon 6. az ERK aktiváció kinetikájának vizsgálata a proliferáció szabályozásában emberi hasnyálmirigy daganatos sejtvonalon

36

Alkalmazott módszerek

ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Szekréciós vizsgálatok: Oldatok és anyagok Standard HEPES-puffer oldat tartalma: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukóz és 10 mM HEPES, felhasználás alatt 100% oxigénnel átáramoltatva. A standard HCO3- puffer oldat: 115 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glükóz. Az oldatot 95% O2 és 5% CO2 keverékével áramoltattuk át. Valamennyi oldat pH-ját 7.4-re állítottuk be 37°C-on. A Na+-mentes oldatok a Na+ helyett ekvimoláris mennyiségű N-methyl-D-glucamine-t (NMDG) tartalmaztak. A 20mM NH4+ tartalmú oldat Na+ koncentrációját a helyes ozmolaritásnak megfelelően csökkentettük. 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA), nigericin, bumetanid, 4,4'-dinitrostilben-2,2'disulfonsav (DNDS), forskolin, ATP, UTP beszerzése a Sigma-Aldrich Hungary Kft-től, a 2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF, AM),

dihidro-4,4’-diisothiocyanatodihydrostilbene-

2,2’-disulfonsav

(H2DIDS)

beszerzése a Molecular Probes-tól történt. RT-PCR TRI reagens segítségével total RNS-t izoláltunk Capan-1 sejtekből. Human pancreasból, agyból és veséből (Stratagene, La Jolla, CA) származó total RNS-t használtunk pozitív kontrollként. Mintánként 5 µg total RNS-ből cDNS-t készítettünk SuperScript II (Life Technologies, San Diego) enzim és oligo(dT) primerek felhasználásával. A cDNS-t Primer3 software-rel (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA) tervezett

PCR primerekkel amplifikáltuk, a kiválasztott

transzporterekkel való specificitás biztosítására. A PCR-t Taq polimeráz (Promega, Madison,

WI)

alkalmazásával

végeztük.

A

duplaszálú

templát

DNS

szálait

hődenaturációval elválasztjuk egymástól 95°C-on 2 percig, 35 ciklusnyi amplifikáció után a mintákat 72°C-on további 5 percig inkubáltuk. A PCR termékeket ethidiumbromidot tartalmazó agaróz gélen futtatjuk. Belső kontrollként XS13 riboszómális foszfoproteint használtunk.

37

Alkalmazott módszerek

Sejttenyésztés A Capan-1 sejteket az American Type Culture Collection-ból (HTB-79, ATCC, Manassas, VA) vásároltuk. A sejteket Iscove's Modified Dulbecco's Medium oldatban tenyésztettük glutaminnal és HEPES-sel (IMDM, Gibco) kiegészítve 10% fetal bovine serum (Gibco), 50 U/ml penicillinnel és 50 μg/ml streptomycinnel. A mikrofluorometriás mérésekhez 5x105 sejtet ültettünk ki egy kollagénnel fedett PTFE membránra (12mm átmérőjű és 0,4 µm pórusméretű Transwell COL). A kísérleteket 3-5 nap elteltével végeztük, amikor a monolayer transzepitéliális ellenállása (TER) szignifikáns mértékben megemelkedett. A patkány parotisból származó sejtvonal - Par-C10 - David Quissell (Department of Pharmacology, School of Medicine, University of Missouri, Columbia, Missouri 65212, USA) laboratóriumából származik. A sejteket F12 HAM tápoldatban tenyészettük 10% borjúszérum, 50 U/ml penicillin és 50 μg/ml streptomycin hozzáadásával. A sejteket Transwell Clear (Corning Incorporated, NY, USA) membrán felületére ültettük és tenyésztő oldatban 37°C-on 5% CO2 / 95% O2 keverékben 3-5 napig inkubáltuk. A monolayerek konfluenciáját a transzepitéliális rezisztencia (transepithelial electrical resistance - TER) mérésével kontrolláltuk EVOM epitéliális voltohmmeter (World Precision Instruments, Hamden, CT, USA) segítségével. Intracelluláris pH (pHi) mérése Az intracelluláris pH-t mikrofluorometriás módszerrel mértük. A konfluens monolayereket HEPES pufferben oldott 2µM pH-szenzitív fluoreszcens anyaggal, BCECF-AM-mel 30 percig szobahőmérsékleten töltöttük. Ezután a membránt nyitott perfúziós kamrába helyeztük, melyben lehetőség nyílt a monolayer két oldalának szeparált perfúziójára. Az egész kamrát egy Nikon inverz mikroszkóp objektívje alatt helyeztük el. A kamrát perisztaltikus pumpa segítségével 2 ml/perc áramlási sebességgel perfundáltuk, állandó 37 °C-os hőmérsékleten tartottuk. Az epitélium kis részletét 440 és 490 nm hullámhosszú fénnyel váltakozva megvilágítottuk és a fluoreszcens intenzitást (F440 és F490) mértük 530 nm-en. Az intracelluláris pH-t az F490/F440 arányból számoltuk. A rendszer kalibrálását Thomas szerint nigericin/K+ módszerrel végeztük [120], melynek

38

Alkalmazott módszerek

lényege, hogy a K+/H+-antiporter, nigericin jelenlétében az intracelluláris pH egy meghatározott értékre áll be a kísérlet végére. A K+ tartalmú oldatokat különböző pH értékekre titráljuk úgy, hogy a [K]i/[K]o=[H]i/[H]o egyenlőség teljesüljön. Ezen egyenlőség meredekségének és az y interceptjének felhasználásával tudjuk konvertálni a kísérletek során meghatározott F490/F440 arányokat intracelluláris pH értékekre. A

mért

intracelluláris

pH

változásának

intenzitását

(meredekségét)

a

számítógéppel illesztett egyenes segítségével határoztuk meg. Immunhisztokémia A Capan-1 sejteket 10-14 napon át Transwell Col membránon tenyésztettük, majd 10 percen keresztül paraformaldehiddel szobahőmérsékleten fixáltuk. A fixálást követően háromszor mostuk Tris pufferoldattal, 0,5%-os Triton-X-100 oldattal 7 percig kezeltük, majd ismét mostuk. A sejteket ezután 2%-os kecske szérumban és 2% BSA-ban egy órán át szobahőmérsékleten kezeltük, majd egy éjszakán át 4ºC-on a primer antitestekkel inkubáltuk. Az egérből származó monoklonális anti-occludint (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) 1:50-es higításban alkalmaztuk és FITC-cel (Stratech Laboratories, Cambridge, UK) kapcsolt másodlagos egér-ellenes antitest segítségével detektáltuk. A filtereket TBS-ben mostuk, majd propidium-jodidot tartalmazó Vectashield médiumba helyeztük (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, England). A képeket konfokális pásztázó lézer mikroszkóppal készítettük (Nikon Eclipse TE300 mikroszkópra épített Biorad MRC 1024MP). 40-50 db 0.5 µm vastag optikai metszetből származó összetett képeket Confocal Assistant software segítségével dolgoztuk fel. Statisztikai analízis Statisztikai összehasonlításhoz varianciaanalízist, valamint Bonferroni post-hoc tesztet alkalmaztunk (Instat, GraphPad Software). A pHi változásának mértékét lineáris regresszió

segítségével

hatátoztuk

meg,

a

koncentráció-hatás

összefüggés

megállapításánál Prism szoftver (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) segítségével polinomiális görbét illesztettünk, aminek segítségével megállapítottuk az EC50, valamint a maximális válasz értékét. Az átlag szórását (± S. E. M.) számoltuk.

39

Alkalmazott módszerek

Proliferációs vizsgálatok: Sejttenyésztés Emberi CCK1 receptorral transzfektált Panc-1C sejteket (Detjen 1997) Dr. Craig D. Logsdontól (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA) kaptuk. A sejteket Dulbecco’s Modified Eagle Mediumban (Sigma) tenyésztettük 10% magzati borjúszérum (FBS) és 200 µg/ml G418 hozzáadásával 37°C-on, 5% CO2 tartalmú közegben. [3H]-timidin-inkorporáció A kiültetett Panc-1C sejteket (2×104db sejt/lyuk) 24 lyukú plate-ben egy éjszakán át tenyésztettük. A második napon a tenyésztőoldatot 24 órára szérum-mentes médiumra cseréltük. A sejteket ezután aginosták vagy gátlószerek jelenlétében vagy anélkül további 24 órán át inkubáltuk. A kezelési idő leteltét követően 2 órára 1 μCi/ml [3H]-timidint adtunk a sejtekhez, majd kétszer mostuk hideg foszfát pufferrel (PBS) és triklórecetsavval fixáltuk. A csapadékot 0.1 M NaOH-ban oldottuk és mértük a radioaktivitást. Immunoblotting A Panc-1C sejteket 6cm-es petricsészébe ültettük egységes sejtszámmal (4×105 sejt/csésze), egy éjszakán át inkubáltuk, majd 24 órán át szérum-mentes oldattal blokkoltuk a növekedésüket. A nyugvó sejteket agonistákkal vagy gátlószerekkel kezeltük. A sejteket hideg foszfát pufferrel öblítettük, 1×SDS-PAGE lizáló pufferrel (100 mM TrisHCl pH6.8, 1 mM EDTA, 3% SDS, 5% glycerol és 2% 2-mercaptoethanol) kezeltük, majd 6%-os (minden PKC izoforma, Raf-1), 10%-os (ERK2, phospho-ERK, cyclin D1) vagy 12%-os (p21Cip1) gélen SDS-PAGE elektroforézist végeztünk, majd a fehérjéket polyvinyl difluoride membránra (Fluka) vittük. A blottolást leállítottuk, 0.1% Tween-20-at és 2% ECL Advance Blocking Reagenst (Amersham, Budapest, Hungary) tartalmazó Tris-pufferben (TBS) a megfelelően higított első antitesttel (1:5000 AntiACTIVE MAPK-hez és 1:1000 a többi antitesthez) kezeltük, mostuk, majd a második antitesttel inkubáltuk. A reakciót Amersham ECL Advance chemiluminescent detektáló rendszerrel jelenítettük meg. 40

Eredmények

EREDMÉNYEK Szekréciós vizsgálatok: A felső gasztrointesztinális traktusban a nyálmirigyek és a pancreas által szekretált bikarbonát fontos szerepet játszik az adott funkcionális egység pH-jának beállításában, hiszen az adott területen működő emésztőenzimeknek meghatározott pH-ra van szükségük aktivitásukhoz. A bikarbonát szekréció veleszületett vagy szerzett zavaraiban a csökkent bikarbonát elválasztás következményeképpen létrejövő koncentrált nedv fontos oki tényezőként szerepelhet a kialakuló másodlagos krónikus mirigygyulladásban. A sűrű nedvben képződő protein dugók ugyanis elzárják a kivezetőcsöveket, az elzáródás mögött pangó váladék pedig gyulladáshoz, lokális önemésztődéshez vezethet.

Ezek alapján

érthető, hogy az emésztőtraktus ion- és folyadékszekrécióját szabályozó mechanizmusok megértése és befolyásolása akár terápiás jelentősséggel is bírhat. Transzporterek és receptorok kimutatása RT-PCR segítségével Kulcsszerepet játszó elektrolit transzporterek mRNS expresszióját PCR vizsgálatokkal határoztuk meg normál emberi hasnyálmirigy szövetből, valamint Capan1 sejtekből származó cDNS-ek alkalmazásával. A PCR termék mérete alapján azonosítottuk

a

CFTR-t,

NHE1-et,

pNBC1-et

és

NKCC1-et

mind

normál

hasnyálmirigyben, mind Capan-1 sejtekben. Kimutatuk ezen kívül a szekretin, VPAC1 és VPAC2 receptor expresszióját. A vizsgált purinoceptorok közül pozitív eredményt kaptunk a P2Y1, P2Y2, P2Y4 és P2Y6, valamint P2X1, P2X4 és P2X5 receptorokra, ugyanakkor P2X2, P2X6 és P2X7 receptorok expressziója nem volt kimutatható (6. ábra). Összességében elmondható, hogy a vizsgált transzporterek és receptorok expressziós mintázata hasonló volt Capan-1 és normál hanyálmirigy sejtek esetében.

41

Eredmények

CFTR M

K

P

C

M

B

C -

P2Y1 R P C -

P

C

NKCC1

pNBC1

NHE1 -

-

C

-

B

K

M

PACAP R B P C -

M

VPAC1 R B P C -

M

B

M

B

P2Y2 R P C

-

M

K

P2Y4 R P C

M

B

M

B

P2X4 R P C -

M

500 bp 300 bp

P

M

M

P

C

-

100 bp Secretin R 500 bp 300 bp

M

K

M

B

M

B

P

VPAC2 R P

C

-

P2Y6 R P C

-

100 bp

500 bp 300 bp

-

100 bp

500 bp 300 bp

P2X1 R P C

-

B

P2X5 R P C -

100 bp

6. ábra Receptorok és transzporterek mRNS expressziójának kimutatása reverz-transzkriptáz polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) Capan-1 sejteken. A különböző elektrolit transzporterek (CFTR, NHE1, pNBC1 és NKCC1), peptid receptorok (secretin, PACAP, VPAC1 és VPAC2) és purinoceptorok (P2Y1,2,4,6 és P2X1,4,5) mRNSének expressziója Capan-1 sejtekben (C), normál emberi hasnyálmirigy szövetben (P) és emberi kontroll szövetekben (K, vese; B, agy). M, markerek; -, RT negatív kontroll

Áteresztő membránon növesztett monolayerek polarizációja Ahhoz, hogy bizonyítsuk, hogy az áteresztő felszínen növekedő sejtek polarizált monolayert alkotnak, a sejttenyésztési időszakban folyamatosan monitoroztuk a transzepiteliális ellenállást (TER). Előzetes eredményeink alapján Par-C10 patkány parotisz eredetű dagantsejteket Transwell CLEAR membránon növesztve szignifikáns növekedés (2540 ± 132 Ωcm2) volt megfigyelhető az üres membrán ellenállásához viszonyítva. Ezt az értéket a 3-5. napon tudtuk mérni. A fentiektől kissé eltérően Capan1 sejtek esetében a TEER folyamatos növekedést követően a 8-12. napon 50-150 Ω cm2 között érte el maximumát. Ezen értékek megfelelnek a korábban részletezett “áteresztő epitélium” tulajdonságainak [5].

42

Eredmények

Konfokális mikroszkóp segítségével vizsgáltuk az ismert tight-junction fehérje, az occludin jelenlétét a Capan-1 sejtek memránjában. Eredményeink azt mutatták, hogy az occludin jelölés – a tight junction kacsolatok elhelyezkedésének megfelelően - a plazma membrán területére lokalizálódott és a sejtek apikális felszíne közelében jellegzetes hálós megjelenést mutatott (7. ábra).

A

20 µm

B

7. ábra A tigh-junction protein occludin kimutatása monolayert alkotó Capan-1 sejteken konfokális mikroszkóppal. Az áteresztő membránon növesztett összefüggő Capan-1 monolayereket fixáltuk, majd occludin-ellenes monoklonális antitesttel (zöld) jelöltük. A sejtmagot propidium jodiddal festettük (piros). A. Hosszanti metszet a tight-junction fehérjék magasságában az occludin jelölés a jellegzetes “dróthálós” szerkezetet mutatja. B. Az A. ábrán sárga vonallal jelzett terület keresztmetszete

Bazolaterális Na+/H+ kicserélő (NHE) kimutatása Hogy azonosítsuk duktális epitélsejtekben a HCO3− felvételért és H+ effluxért felelős mechanizmusokat, ammónium pulzus technikát alkalmazva tanulmányoztuk a mesterséges alkalizáció-acidifikáció hatását az pHi-ra. 20mM NH4Cl-ot adva a rendszerhez az NH3 szabadon átjárva a membránt belép a sejtbe, H+-t köt meg, ezáltal a pHi

gyorsan

emelkedik

(alkalizáció).

A

sejtek

ugyanakkor

aktív

transzportmechanizmusok segítségével az optimális pH elérésére törekednek, ezért az

43

Eredmények

intracelluláris pH lassan csökkenni kezd. Az NH4Cl elvételét követően az NH3 kilép a sejtből, a H+ szabaddá válik, így a pHi hirtelen zuhan (acidifikáció), majd ezt ismét egy aktív pH kompenzációs fázis követi bikarbonát beáramlással és proton kiáramlással. Abból a célból, hogy Capan-1 sejteken vizsgáljuk, vajon mesterséges acidifikációt követő pH emelkedés függ-e a luminális és bazolaterális Na+ jelenlététől, a monolayereket HEPES pufferoldattal áramoltattuk.

AA

9.5

BL

NH4+

0.25

0 Na+

0.2

7.5

b

a

ΔpHi/Δt (min-1)

pHi

8.5 c

6.5 5.5

NH4+

0

B

9.5

BL

NH4+

0 Na

0 Na+

800

-0.05

pHi

c b

6.5 5.5

0

C

*

*

a

b

c

0.25

EIPA

7.5 a

0

1200

8.5

AP

0.05

+

40 0 idő (sec)

B

+

0.1

ΔpHi/Δt (min-1)

AP

0.15

0.2 0.15

+

0.1 0.05

NH4

+

400

+

0 Na

idő (sec)

1200

80 0

0 -0.05

C

*

*

a

b

c

8. ábra A pHi változása savterhelést követően HCO3−/CO2-mentes környezetben. Capan-1 sejteket mindkét oldalon 20 mM NH4+-mal 3 percig perfundáltuk, majd a Na+-ot NMDG+-re cseréltük. A. A Na+ visszaadása az apikális (AP), majd bazolaterális oldalra (BL). A jobb oldalon a jelzett pontoknak megfelelő pHi visszatérés meredekségeinek átlaga (n = 4); C a kontroll kísérletekben mért meredekséget mutatja, amikor az ammónium pulzust követően Na+ jelen volt az oldatban (n=4). B. A Na+ visszaadása a bazolaterális oldalra a Na+/H+ kicserélő szelektív gátlószerének jelenlétében (EIPA 3 μM) (n = 5). * P < 0.001 a kontrollhoz (C) hasonlítva; + P < 0.001 a b szakaszhoz hasonlítva.

44

Eredmények

Az ammónium pulzust követően a pufferoldatban a Na+-ot NMDG+-vel helyettesítettük. A görbe meredeksége alapján kimutatható, hogy Na+ mentes környezetben az intracellularis pH nem tér vissza a normál értékre, azaz a sejtben nem kimutatható olyan Na+-független mechanizmus, amely a bikarbonát felvételért felelős lehetne (mint pl. a H+-ATPáz). Nem volt ugyanakkor pH változás akkor sem, amikor a Na+-t visszaadtuk az apikálisan alkalmazott perfúziós folyadékba (8. A. ábra). Mindezek alapján feltételezhető, hogy aktív Na+-függő H+-pumpa nincs a Capan-1 sejtek apikális membránjában. Amikor a bazolateralis oldalon adtuk vissza a Na+-ot a perfúziós oldatba, az pHi határozott növekedést mutatott, ami Na+-függő H+ transzport mechanizmus jelenlétére utal a bazolaterális membránban. Mivel a pHi növekedés 3 μM EIPA alkalmazásával teljes mértékben gátolható volt, a bazolaterális H+ pumpa feltehetően egy Na+/H+ kicserélő, nevezetesen a mindenütt jelen lévő NHE1 (8. B. ábra). Bazolaterális Na+-HCO3− kotranszporter (NBC) kimutatása A fentiekhez hasonló kísérleteket végeztünk bikarbonát tartalmú közegben is. Capan-1 sejteken ammónium pulzust követően extracelluláris Na+ elvétele után is kisfokú, de szignifikáns emelkedés volt megfigyelhető az intracelluláris pH-ban (9.A. ábra). A pHi emelkedést 1 μM bafilomycin A1 alkalmazása nem gátolta, tehát annak hátterében

a

vakuoláris

típusú

H+-ATPáz

(V-ATPáz)

aktív

működése

nem

valószínűsíthető (9.B. ábra). Ugyanakkor a fenoménért felelős transzportfolyamat egyelőre tisztázatlan. Capan-1 sejteken Na+ apikális visszaadását követően nem volt számottevő változás az pHi emelkedésében, amiből feltételezhető a Na+-függő H+-pumpa vagy HCO3−-transzporter hiánya a luminális membránban. Azonban fenti kíséreletkkel ellentétben miután a Na+-t visszadtuk a bazolaterális oldalra, az pHi gyors emelkedése volt megfigyelhető. Ezen emelkedés 3 μM EIPA és 500 μM H2DIDS együttes alkalmazásával gátolható volt. Ugyanakkor H2DIDS elvételekor az EIPA folyamatos alkalmazása mellett az intracelluláris pH szignifikáns növekedést mutatott. Mindezekből következik, hogy a bazolaterális membránban az NHE működése mellett feltételezhető egy H2DIDS-szenzitív, Na+-függő HCO3−-felvevő mechanizmus is, legnagyobb valószínűség szerint az RT-PCR-rel kimutatott Na+-HCO3− kotranszporter NBC1 (9.C. ábra).

45

Eredmények

BL

NH4

+

0 Na

+

-1

9.5

ΔpHi/Δt (min )

AA pHi

8.5

0.25

+ 0.2 0.15

7.5 0.1

c a

5.5

0 Na

400

0

B B

NH4

+

9.5 BL

NH4

+

0 Na

0.05

800

0

1200

+

Ba f

7.5 a

b

*

*

+

idő (sec)

8.5 pHi

b

-1

AP

ΔpHi/Δt (min )

6.5

C

a

b

0.25 0.2 0.15

*

0.1

6.5 AP 5.5

NH4

0 Na

+

0 0

9.5

400

BL

NH4

+

idő (sec)

0 Na

+

1200

C

a

b

0.25

EIPA H2DIDS

+

0.2 -1

8.5 pHi

800

ΔpHi/Δt (min )

C C

*

0.05 +

c

7.5

c b

a

6.5 AP 5.5 0

0.15 0.1 0.05

NH4

+

0 Na 400

*

*

a

b

+

idő (sec)

0 800

1200

C

c

9. ábra A pHi változása savterhelést követően HCO3−/CO2-tartalmú környezetben. Capan-1 sejteket mindkét oldalon 20 mM NH4+-mal 3 percig perfundáltuk, majd a Na+-ot NMDG+-re cseréltük. A. A Na+ visszaadása az apikális (AP), majd bazolaterális oldalra (BL). A jobb oldalon a jelzett pontoknak megfelelő pHi visszatérés meredekségeinek átlaga (n = 4); C a kontroll kísérletekben mért meredekséget mutatja, amikor az ammónium pulzust követően Na+ jelen volt az oldatban (n=4). B. A V-ATPáz inhibitor bafilomycin A1 (Baf, 1 μM) hatása a pHi visszatérésre Na+ mentes környezetben (n=3). C. A Na+ visszaadása a bazolaterális oldalra a Na+/H+ kicserélő és Na+-HCO3− kotranszporter szelektív gátlószerének jelenlétében (EIPA 3 μM és H2DIDS 500 μM) (n = 4). * P < 0.001 a kontrollhoz (C) hasonlítva; + P < 0.001 a b szakaszhoz hasonlítva.

46

Eredmények

Bazolaterális Na+-K+-2Cl− kotranszporter (NKCC) kimutatása Az ammónium pulzus alatt a hirtelen alkalizációt követő lassú pHi csökkenésben egy lehetséges faktorként szerepet játszhat a NH4+ felvétel savanyító hatása, mely a Na+K+-2Cl− kotranszporter (NKCC1) működésének köszönhető. A transzporter NH4+-t vesz fel és K+-t ad le a sejtből. Hogy bizonyítsuk a NKCC1 jelenlétét Capan-1 sejtek membránjában, megmértük a pHi csökkenés mértékét az ismert NKCC1 gátlószer, bumetanid jelenlétében is. 500 μM bumetanid bazolaterális alkalamzását követően az alkalizációt követő lassú acidifikáció mintegy 60%-kal lassult (10. ábra). Mindez igazolja az RT-PCR kísérletekkel kimutatott NKCC1 aktív működését a sejtben.

+

NH4 9.5

+

0.15

BL -1

C

ΔpHi/Δt (min )

Bum

8.5 pHi

NH4

B

7.5 6.5 AP 5.5 0

0.12 0.09 0.06

*

0.03 NH4

+

400

+

NH4 800 1200 idő (sec)

0 1600

2000

C

B

10. ábra A bazolaterális NH4+ felvétel NKCC1-en keresztül történik. Capan-1 sejteket mindkét oldalon 20 mM NH4+-mal 3 percig perfundáltuk, majd a kísérletet megismételtük bumetanide (Bum, 500 μM) bazolaterális alkalmazásával, hogy gátoljuk az NKCC1-en keresztüli NH4+ felvételt. A jobb oldalon a pHi visszatérés meredekségeinek átlaga kontroll kísérletekben (C) és bumetanide jelenlétében (B) (n=4). * P < 0.001 a kontrollhoz (C) hasonlítva.

A transzepitéliális HCO3− szekéció mérése Epitéliális mirigyek duktális sejtjeiben az intracelluláris pH a bikarbonát szekréciós folyamat alatt állandó marad, hiszen a luminális HCO3− efflux acidifikáló hatásával egyensúlyt tart a bazolaterális HCO3− beáramlás alkalizáló effektusa. Ezek

47

Eredmények

alapján érthető, hogy az apikális HCO3− szekrécióra következtetni tudunk, ha bazolaterális transzporterek blokkolásával egyidejűleg mérjük az intracelluláris pH változását. Ha ugyanis a bazolaterális bikarbonát utánpótlásért felelős NHE és NBC transzportereket 2μM EIPA and 500 μM H2DIDS alkalmazásával gátoljuk, a luminális membránon keresztüli folyamatos HCO3- efflux következtében a pHi csökken, mivel a sejt bázist veszít. A pHi-t ábrázoló görbe csökkenésének kezdeti meredeksége tehát szoros összefüggésben áll a HCO3- szekrécióval és így ezen meredekség számolása alkalmazható a duktális bikarbonát szekréció vizsgálatára [121, 122]. Kísérleteinkben ezen technikát alkalmazva vizsgáltuk a vektoriális bikarbonát elválasztás fiziológiás szabályozó tényezőit Par-C10 sejtek esetében. Előzetes, nem publikált eredményeink alapján bazolaterális gátlószerek alkalmazása kismértékű, de szignifikáns csökkenést eredményezett az pHi-ban a kontrollhoz viszonyítva. Ezen eredmények egybecsengenek azon a bevezetésben részletesen tárgyalt megfigyelésekkel, miszerint nyálmirigy duktuszok esetében a bikarbonát szekréció nem stimulált esetben kismértékű, azonban stimuláció hatására többszörösére növekszik (11. A. ábra). Capan-1 sejteken bazolaterálisan alkalmazott 3μM EIPA kismértékű és visszafordítható csökkenést eredményezett az pHi-ban, ugyanakkor a pHi csökkenése szignifikánsan nagyobb volt EIPA és 500 μM H2DIDS együttes alkalmazásakor (11. B. ábra). A bazolaterális NBC tehát kulcsszerepet játszik az alap bikarbonátszekrécióban nem stimulált duktuszsejtek esetében. Forskolin hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra Előzetes eredmények alapján Par-C10 sejteken – Capan-1 sejtekhez újfent hasonlóan – forskolin önmagában nem okozott változást a pHi-ban. A bazolaterális bikarbonát

utánpótlásának

gátlásával

párhuzamosan

viszont

forskolin

adása

szignifikánsan gyorsabb pHi csökkenést eredményezett, mint nem stimulált sejtek esetében (11. A. ábra). Capan-1 sejteken forskolin perfúziója önmagában nem jelent változást az intracelluláris

pH-ban,

azonban

a

nem

stimulált

duktuszok

eredményeivel

összehasonlítva forskolin és a bazolaterális inhibitorok (EIPA és H2DIDS) szimultán adásakor a pHi csökkenés meredeksége megkétszereződött. Ezen eredményekből

48

Eredmények

nyilvánvaló, hogy a forskolin serkenti a luminális bikarbonát szekréciót Capan-1 sejtek esetében (11. B. ábra).

8,5

EIPA

EIPA

H2DIDS

H2DIDS

BL

forskolin

C

7,5

a

0,08 ΔpHi/Δt (min-1)

A

pHi

A A

9

400

800 idő (sec)

EIPA

EIPA

0

1600

EIPA EIPA

H2DIDS 8

1200

H2DIDS Forskolin

C

0.15 ΔpHi/Δt (min-1)

B B

0,04 0,02

AP 6,5 0

0,06

a

*

0.12 0.09 0.06

7

C

pHi

F

0.03 0

6 0

1000

2000

C

F

idő (sec)

11. ábra A HCO3− szekréció mérése Par-C10 és Capan-1 sejteken a bazolaterális HCO3− felvétel egyidejű gátlása mellett. A. Par-C10 sejteken a pHi változásai EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és forskolin (10 μM) stimuláció hatására. A jobb oldalon a pHi csökkenés meredekségeinek átlaga EIPA és H2DIDS együttes adásakor nem stimulált sejteken (C) és forskolin stimuláció mellett (F) (n = 4, * P < 0.001). B. Capan-1 sejteken a pHi változásai EIPA (3 μM), majd EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és forskolin (10 μM) stimuláció hatására. A jobb oldalon a pHi csökkenés meredekségeinek átlaga EIPA és H2DIDS együttes adásakor nem stimulált sejteken (C) és forskolin stimuláció mellett (F) (n = 5, * P < 0.001).

49

Eredmények

Szekretin és VIP hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra A

szekretin

erős

fiziológiás

stimulust

jelent

a

hasnyálmirigy

bikarbonátszekréciójára. Akárcsak forskolin esetében, szekretin egyedüli alkalmazása sem jelentett változást az pHi-ban Capan-1 sejteken. Ugyanakkor EIPA és H2DIDS együttes perfúziója következében létrejövő pH esés szignifikánsan felgyorsult akár szekretin, akár VIP adásakor, méghozzá koncentráció-függő módon. A 12. ábra mutatja, hogy a szekretin és VIP koncentráció-hatás görbéje hasonló morfológiát mutat, a maximális stimuláció 50%-át 10nM nagyságrendben érik el. A szekretin hatáserőssége ugyanakkor harmadakkora, mint a VIP-é, logEC50 értéke7.56 ± 0.20 szemben a VIP 8.00 ± 0.15 értékével.

ΔpHi/Δt (min-1)

0.13

0.11

VIP Szekretin

0.09

0.07 -11

-10

-9

-8 -7 log M

-6

-5

12. ábra A HCO3− szekréció mérése Capan-1 sejteken a bazolaterális HCO3− felvétel egyidejű gátlása mellett. B. A VIP és szekretin által stimulált bikarbonát szekréció koncentráció-hatás görbéje. Az adatok a pHi változás kezdeti meredekségeinek átlagát mutatják (szekretin, n = 5; VIP, n = 5) EIPA és H2DIDS egyidejű alkalmazása mellett. EC50 értéket szigmoid-görbe illesztés segítségével határoztuk meg.

ATP és UTP hatása a transzepitéliális HCO3− szekécióra Par-C10 sejteken ATP luminális alkalmazása – a bazolaterális bikarbonát felvétel egyidejű gátlásakor – szignifikáns pHi csökkenést eredményezett a kontroll eredményhez viszonyítva. Apikálisan alkalmazott ATP tehát serkenti a transzepitheliális bikarbonát

50

Eredmények

szekréciót Par-C10 sejteken (14. A. ábra). Ugyanakkor a hasnyálmirigy eredetű Capan-1 sejteken végzett kísérletektől eltérően – bazolaterálisan alkalmazott ATP hasonló stimuláló hatással bírt a bazolaterális inhibitor EIPA indukálta pHi csökkenésre (14. B. ábra). A purin nukleotidok másik képviselője, az UTP luminális alkalmazása hasonló módon serkentette a transzepitheliális bikarbonát szekréciót, viszont bazolaterális alkalmazása nem volt szignifikáns hatással az pHi-ra (ábrán nem ábrázolva).

BL

E IP A

E IP A

0,08

H 2 D ID S

H 2 D ID S

0,06

C

7,5

ΔpHi/Δt (min-1)

8,5

pHi

A

A

0,02

A TP

AP

0,04

6,5

8,5

BL

800 idő (sec)

7,5

1200

E IP A

E IP A

H 2 D ID S

H 2 D ID S

C

A

C

A

U

0,08

A TP A

0,04 0,02

AP 6,5 0

0

1600

0,06

C

pHi

B

400

ΔpHi/Δt (min-1)

0

400

800 idő (sec)

1200

1600

0

U

14. ábra Luminális és bazolaterális ATP és UTP hatása a HCO3− szekrécióra Par-C10 sejteken. A. A pHi változásai EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és apikálisan alkalmazott ATP (1 μM) stimuláció hatására. A jobb oldalon a pHi csökkenés meredekségeinek átlaga EIPA és H2DIDS együttes adásakor nem stimulált sejteken (C) és ATP (A, n = 4) és UTP (1 μM) (U, n = 4) stimuláció mellett (F). B. A pHi változásai EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és bazolaterálisan alkalmazott ATP (1 μM) stimuláció hatására. A kísérletek átlagai a jobb oldalon. (A, n = 5; U, n = 5). * P < 0.05 a kontrollhoz (C) hasonlítva.

A nemzetközi irodalomból ismert, hogy az emberi hasnyálmirigy nedvben is kimutatható [123] ATP serkenti a bikarbonát szekréciót tengerimalac hasnyálmirigy

51

Eredmények

duktuszban [115]. Megvizsgáltuk, vajon az ATP és UTP hasonló hatást fejt-e ki Capan-1 sejteken is. 1 μM ATP és UTP apikális alkalmazásakor a bikarbonát utánpótlás EIPA-val és H2DIDS-val történő egyidejű gátlása esetén a pHi csökkenés szignifikánsan gyorsabb volt a nem stimulált sejtekével összehasonlítva (13. A. ábra). Ugyanakkor meglepő módon a purin nukleotidok bazolaterális perfúziója az EIPA és H2DIDS kiváltotta pHi csökkenés meredekségét szignifikánsan csökkentette. Eredményeink szerint tehát Capan1 sejteken – akárcsak tengerimalacok esetében – ATP és UTP apikális adása serkenti, míg bazolaterális alkalmazása gátolja a transzepitéliális HCO3− szekréciót (13. B. ábra).

AA EIPA

EIPA

H2DIDS

H2DIDS

0.15 ΔpHi/Δt (min-1)

9 BL

pHi

8 C

A

0.12

*

*

0.09 0.06

7 AP 6 0

400

0.03 ATP 800

0 1200

C

1600

A

U

idő (sec) 9

EIPA

EIPA

H2DIDS

H2DIDS

BL 8 pHi

ATP C

A

0.15 ΔpHi/Δt (min-1)

B B

0.12 0.09

*

0.06

7

0.03

AP 6

0 0

*

400

800 idő (sec)

1200

1600

C

A

U

13. ábra Luminális és bazolaterális ATP és P hatása a HCO3− szekrécióra Capan-1 sejteken. A. A pHi változásai EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és apikálisan alkalmazott ATP (1 μM) stimuláció hatására. A jobb oldalon a pHi csökkenés meredekségeinek átlaga EIPA és H2DIDS együttes adásakor nem stimulált sejteken (C) és ATP (A, n = 4) és UTP (1 μM) (U, n = 4) stimuláció mellett (F). B. A pHi változásai EIPA (3 μM) és H2DIDS (500 μM) együttes adására nem stimulált sejteken és bazolaterálisan alkalmazott ATP (1 μM) stimuláció hatására. A kísérletek átlagai a jobb oldalon. (A, n = 5; U, n = 5). * P < 0.05 a kontrollhoz (C) hasonlítva.

52

Eredmények

Proliferációs vizsgálatok: Protein kináz Cε sejtosztódásra kifejtett hatása Elsőként is azt vizsgáltuk, vajon mely PKC izoformák felelősek a neurotenzin (NT) indukálta sejtproliferációért, valamint a CCK-1 receptor aktivációja, illetve forbol észterek okozta direkt PKC aktiváció következtében fellépő sejtnövekedés gátlásért CCK-1 receptorral transzfektált Panc-1 emberi hasnyálmirigy daganatos sejtek (Panc-1C)

[3H]-thymidine inkorporáció, a kontroll %-ában

esetében.

150

inhibitor nékül

200 nM R o-34-0432

100

#

#

*

50

*

0 kontroll

[3H]-thymidine inkorporáció, a kontroll %-ában

*

#

200

PM A

inhibitor nélkül

CCK

NT

20 nM G ö6983

*

ns

150 100

*

50

*

0 kontroll

ns

ns

PM A

CCK

NT

15. ábra Forbol-12-mirisztát-13-acetát (PMA), kolecisztokinin (CCK) és neurotenzin (NT) PKCεfüggő módon szabályozza a DNS szintézist CCK1 receptorral transzfektált Panc-1 sejteken (Panc1C). Nyugvó Panc-1C sejteket 30 percig inkubáltuk 200 nM Ro-32-0432-vel vagy oldószerrel (felső panel) és 20 nM Gö6983-mal vagy oldószerrel (alsó panel), majd 100 nM PMA-val vagy 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel kezeltük 24 órán át. A sejteket 2 óráig 1 μCi/ml [3H]-thymidine-nel jelöltük, majd meghatároztuk a beépült radioaktivitást. 200 nM Ro-32-0432, amely cPKCα, -βI és nPKCε inhibitora meggátolta (felső panel), míg 20 nM Gö6983, amely cPKCα, -β, -γ és nPKCδ inhibitora, nem befolyásolta (alsó panel) a PMA, CCK és NT DNS szintézisre kifejtett hatását. Az adatok feldolgozása ANOVA-val, majd Bonferroni-féle post teszttel történt. *: p<0.05 kontrollhoz hasonlítva. #: p<0.05 az inhibitorok nélküli kísérletekhez hasonlítva. ns: nem szignifikáns. Az ábra három különböző kísérlet eredményét mutatja.

53

Eredmények

A

kísérletekben

alkalmazott

koncentrációk

azon

korábbi

tanulmányok

megfigyelésein alapultak, melyek szerint 100 nM PMA [52], 10 nM CCK [124] és 50 nM NT [125, 126] fejt ki maximális hatást a sejtnövekedésre. Guha [54] és Detjen [52, 124] eredményeinek megfelelően kísérleteinkben a NT serkenti, míg a CCK gyengén, a PMA pedig erőteljesen gátolja a DNS szintézist (15. A-B. Ábra, üres oszlopok). A különböző PKC izoformák részvételének meghatározására a sejteket a kísérletek előtt 30 percig szelektív gátlószerekkel kezeltük. Gö6983 egy bisindolylmaleimide származék, mely a következő IC50 értékekkel rendelkezik a különböző PKC izoformák tekintetében: α és β: 7 nM, γ: 6 nM, δ: 10 nM, ζ: 60 nM és μ: 20 μM [127]. A vizsgálatainknál ezért 20 nM Gö6983-at alkalmaztunk, amely ebben a koncentrációban gátolja a PKCα, -β, -γ és -δ izoformálkat, de elhanyagolható hatása van a ζ és μ-re. A Ro 32-0432 IC50 értéke 9 nM PKCα, 28 nM βI és 108 nM ε tekintetében [128], ezért kísérleteinkben 200 nM Ro 32-0432-t használtunk a PKCα, -βI és -ε gátlására. Az indolocarbazol vegyület Gö6976 gátló hatásának IC50 értéke PKCα esetében 2.3 nM, PKCβI esetében 6.2 nM és PKCμ esetében 20 nM, ugyanakkor nem fejt ki gátló hatást PKC δ és -ε izoformákra, így PKCα, -βI és -μ gátlására 40 nM Gö6976-ot alkalmaztunk (ábrán nem ábrázolva). Míg Ro 320432 gátolta a PMA, CCK és NT sejtproliferációra kifejtett hatását Panc-1C sejteken (15. A. ábra), addíg a Gö6983 hatástalannak bizonyult (15. B. ábra). Akárcsak a Gö6983, a Gö6976 sem gátolta a PMA, CCK és NT hatását. Összefoglalva az eredményeket vilagosan látszik, hogy Panc-1C hasnyálmirigy daganatos sejtekben a PKC aktiváció növekedésre kifejtett szabályozó hatásáért egy bizonyos izoforma, nevezetesen a PKCε a felelős, legyen szó akár PMA általi közvetlen vagy natív NT – és transzfektált CCK receptorok általi közvetett hatásról. PKC aktivációjának szerepe az ERK kaszkád stimulációjában Az ERK kaszkád a proliferációt és differenciációt szabályozó sejtfolyamatok egyik legfontosabb szereplője [59] és feltételezhetően szerepet játszik a hasnyálmirigy daganatsejtek apoptózisában, proliferációjában és a metasztázis képződésben [60]. Kísérleteinkben azt vizsgáltuk, hogy vajon a PKC direkt vagy indirekt serkentése aktiválja-e az ERK kaszkádot Panc-1C sejtekben.

54

átlagos pERK denzitás,

BB

PMA CCK NT

6000 5000

[3H]-thymidine inkorporáció, a kontroll %-ában

hr

hr hr

min min min

A A

min min

Eredmények

200

inhibitor nélkül

20 microM PD98059

*

150 100 50

*

#

*

ns

#

0 kontroll PMA

CCK

NT

4000 3000 2000 1000 0 0

2

6

12 30 min

60

180 360

16. ábra PMA, CCK és NT különböző kinetikával aktiválja az ERK kaszkádot és ERK-függő módon szabályozza a sejtnövekedést Panc-1C sejteken. A: Nyugvó Panc-1C sejteket 100 nM PMA-val, 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel kezeltük 2 perctől 6 óráig tartó időintervallumnak megfelelően. A sejteket 1×SDS-PAGE pufferben lizáltuk, elekroforézist követően PVDF membránra vittük, majd foszfo-ERK1/2 és ERK2 ellenes antitestekkel kezeltük. Felső panel: a nyilak foszfo-ERK1/2 és a total ERK1/2pozicióját jelölik. Az ábra három különböző kísérlet eredményét mutatja. Alsó panel: Az eredményekcANOVA analízist követő Dunnett post teszt után. *: p<0.05 a kontrollhoz hasonlítva. B: A nyugvó Panc-1C sejteket 30 percig 20 μM PD98059-cel (tele oszlopok) vagy oldószerrel (üres oszlopok) előkezeltük, majd 100 nM PMA-val, 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel 24 óráig kezeltük. A sejteket 2 óráig 1 μCi/ml [3H]thymidine-nel jelöltük, majd meghatároztuk a beépült radioaktivitást. Az adatok feldolgozása ANOVA-val, majd Bonferroni-féle post teszttel történt. *: p<0.05 a kontrollhoz hasonlítva. #: p<0.05 a PD98059 nélküli kezelésekhez hasonlítva. ns: nem szignifikáns. Az ábra három különböző kísérlet eredményét mutatja.

A sejteket 24 órás szérum megvonással nyugvó állapotba hoztuk, 100 nM PMAval, 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel kezeltük 2 perctól 6 óráig terjedő időtartamban, majd immunoblot vizsgálatot végeztünk. A kísérlet során kétféle antitestet használtunk: az ERK-hez kacsolódó anti-ERK2-t és a foszforilált, azaz aktivált ERK-hez kacsolódó anti-ACTIVE MAPK-t. Eredményeink azt mutatják, hogy az ERK kaszkád aktivációja különböző kinetikával történik: PMA kezelés foszfo-ERK szintjének növekedését legkevesebb 6 óráig serkentette, míg a CCK 30 percig, az NT pedig mindössze 2 percig.

55

Eredmények

Az ERK szint ugyanakkor mindvégig állandó volt (16. A. ábra). Mindezek alapján feltételezzük, hogy az ERK aktiváció kinetikája a DNS szintézissel korrelál: PMA elhúzódó ERK aktivációt indukál, ugyanakkor drámaian csökkenti a proliferációt, NT tranziens ERK aktivációt eredményez a növekedés stimulálásával, míg a CCK-hoz köthető átmeneti időtartamú ERK aktiváció mérsékelt növekedési gátlással jár együtt. Annak bizonyítására, hogy a PKC aktiváció a DNS szintézist ERK-függő módon szabályozza, ERK foszforilációt gátló MEK inhibitort, 20 μM PD98059-t alkalmaztunk. Eredményeink alapján a NT serkenti, a CCK mérsékelten, a PMA pedig drámaian gátolja a DNS szintézist (16. B. ábra, üres oszlopok). Miután a sejteket 20 μM PD98059-cel egymagában kezeltük, a DNS szintézis több, mint 50%-kal csökkent (16. B. ábra, kontroll, teli oszlop), ugyanakkor PD98059 kezelés gátolta az NT serkentő és a PMA gátló hatását, visszaállítva a [3H]-thymidine beépülés mértékét a kontroll szintre. A PD98059 nem csökkentette a CCK mérsékelt gátló hatását, melynek hátterében feltehetően a DNS szintézisre kifejtett önmagában is erősebb gátló hatás állhat (16. B. ábra, teli oszlopok). A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy milyen szerepet játszik az ERK kaszkád a PKC aktiváció proliferációt szabályozó folyamatában. Két sejt ciklus gén, a cyclin D1 és a p21Cip1 tumor szuppresszor expresszióját vizsgáltuk. A sejteket 24 órás szérum megvonással nyugvó állapotba hoztuk, 20 μM PD98059-cel 30 percig inkubáltuk és 100 nM PMA-val, 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel kezeltük 0, 5, 16 és 24 órán át. Ezt követően a sejteket lizáltuk, majd cyclin D1 és p21Cip1 expresszióját immunoblot vizsgálattal határoztuk meg. A 17. A. ábra mutatja, hogy a PMA, a CCK és a NT a cyclin D1 gén expresszióját serkentette, míg a p21Cip1 expressziója PMA és CCK hatására fokozódott, azonban a NT erre nem volt szignifikáns hatással (17. B. ábra). PD98059 előkezelés a PMA, a CCK és a NT sejtciklus gének expressziójára kifejtett fenti hatását csökkentette (17. A-B. ábra). Mindezen eredményekből nyilvánvaló, hogy az indirekt vagy direkt PKC aktiváció a Panc-1C sejtek osztódását az ERK kaszkádon keresztül befolyásolja.

56

Eredmények

•5

•16

•24

− −

− +

− +

− +

+ +

+ +

+ +

•5

•16

•24

+ +

•24

+ +

•24

+ +

•16

− +

•16

− +

•5

− +

•5

óra:

− − •0

+

PD: kezelés:

•0

+

•24

+

•16

óra:

−

•5

PD:

W B: cyclin D1 expresszió

•0

CA

PMA

CCK NT

+

óra:

+

+

•24

−

•16

PD:

•5

W B: p21 Cip1 expresszió

•0

B D

PD: kezelés:

óra: PMA

CCK NT 17. ábra. A PMA, a CCK és a NT különböző kinetikával aktiválja az ERK kaszkádot és ERK-függő módon szabályozza a sejtnövekedést Panc-1C sejteken. A, B: A nyugvó Panc-1C sejteket 30 percig 20 μM PD98059-cel vagy oldószerrel előkezeltük, majd 100 nM PMA-val, 10 nM CCK-val vagy 50 nM NTvel 0, 5, 16 és 24 óráig kezeltük. A sejteket 1×SDS-PAGE pufferben lizáltuk, elekroforézist követően PVDF membránra vittük, majd cyclin D1 (A) vagy p21Cip1 (B) ellenes antitestekkel kezeltük. Az ábra három különböző kísérlet reprezentatív eredményét mutatja. WB: western blot. PD: 20 μM PD98059;

PKC izoformák szerepe a PMA, CCK és NT indukálta ERK stimulációban Következő kísérleteinkben azt kívántuk bizonyítani, hogy a PMA, a CCK és a NT PKC-függő módon stimulálja az ERK kaszkádot. Nyugvó Panc-1C sejteket PMA-val, 57

Eredmények

CCK-val és NT-vel kezeltük PKC izoforma-szelektív inhibitorokkal történő előkezeléssel vagy anélkül. A kezeléseket PMA esetében 6 percig, CCK-nál és NT-nél 2 percig végeztük a megfelelő ERK aktiváció biztosítására. 200 nM Ro-32-0432 előkezelés csökkentette a PMA, a CCK és a NT által kifejtett ERK aktivációt, míg 20 nM Gö6983 vagy 40 nM Gö6976 alkalmazásánál ilyen hatás nem volt megfigyelhető. Mindezek alapján feltételezhető, hogy az ERK kaszkád aktivációjáért a PKCε a felelős (18. ábra).

k ezelés C O N P M A C C K N T g á tlá s − + − + − + − + pERK 1 pERK 2

R o -32 -043 2

ERK1 ERK2

pERK 1 pERK 2

G ö69 83 ERK1 ERK2

pERK 1 pERK 2

G ö69 76

ERK1 ERK2

18. ábra. A PMA, a CCK és a NT PKCε-függő módon szabályozza az ERK kaszkád aktivációját Panc-1C sejeken. Nyugvó Panc-1C sejteket 30 percig 200 nM Ro-32-0432-vel vagy oldószerrel (felső panel), 20 nM Gö6983 vagy oldószerrel (középső panel) és 40 nM Gö6976 vagy oldószerrel (alsó panel) előkezeltük, majd 100 nM PMA-val (6 percig), 10 nM CCK-val vagy 50 nM NT-vel (2-2 percig) kezeltük. A sejteket 1×SDS-PAGE pufferben lizáltuk, elekroforézist követően PVDF membránra vittük, foszfoERK1/2 és ERK2 ellenes antitestekkel kezeltük. A nyilak a foszfo-ERK1/2 és a total ERK2 helyét mutatják. Az ábra három különböző kísérlet reprezentatív eredményét mutatja.

58

Megbeszélés

MEGBESZÉLÉS Az emésztőcsatorna felső szakaszán az enzimatikus folyamatok lezajlásához az adott pH biztosítása elengedhetetlen. Így a szájüregben 6 feletti, a duodenumban 7,5 - 8 pH érték szükséges, melyet az adott területen, vagy annak közelében előforduló epitélsejtek által termelt bikarbonátban gazdag alkalikus nedv biztosít. Máig nem rendelkezünk

kiforrott

modellrendszerrel

az

epitéliális

mirigyek

bikarbonát

szekréciójával kapcsolatosan. A nyálmirigyben jelenleg elfogadott teória szerint a szekréció két lépcsőben zajlik: az acinussejtek izotóniás folyadékot választanak el, melyet a duktális sejtek aktív transzportfolyamatok segítségével módosítanak, előállítva ezzel a végső, hypotóniás nyálat. Azonban ezen folyamatokban résztvevő transzporterek pontos működése emberben nem teljesen világos. Hasonló a helyzet a hasnyálmirigy exokrin működésével kapcsolatosan is. A hasnyál HCO3− koncentrációja mind emberben, mind tengerimalacban 140 mM. Az elmúlt tíz év tengerimalacból izolált hasnyálmirigy duktuszokon végzett kísérletei alapján számos részlet világossá vált a HCO3− szekréció pontos mechanizmusával kacsolatosan. Azt azonban máig nem tudjuk pontosan, vajon ugyanazon mechanizmusok felelősek az emberi hasnyálmirigy bikarbonát szekréciós folyamataiért, mint tengerimalac esetében vagy más helyen kell keresni a megoldást. Ezen epitélsejtek szekrécióját az idegi és hormonális tényezők mellett bioaktív anyagok is befolyásolják, melyek lehetnek gasztrointesztinális peptidek, nukleotidok, vagy akár exogén anyagok is. Azonban ezek a bioaktív anyagok nem csak az exokrin szekréció

szabályozásában

játszanak

jelentős

szerepet,

hanem

a

mirigysejtek

differenciációjának, proliferációjának regulációjában is alapvető fontossággal bírnak. Ezen folyamatok megértése alapvető fontossággal bírhat nem csak az epitéliális mirigyek exokrin szekréciós zavarával járó megbetegedések kezelésénél, hanem lehetőséget teremthetnek a mirigyekből kiinduló daganatok terápiájára is. Szekréciós vizsgálatok: Par-C10 és Capan-1 sejtek permeábilis membránon növesztve polarizált monolayert formálnak Par-C10 parotisz eredetű daganatsejteket permeábilis felületen, Transwell CLEAR membránon növesztve szignifikánsan magasabb transzepiteliális ellenállási

59

Megbeszélés

értékek mérhetők. Ezen megfigyelések ellentétesek a nyálmirigy acinusokról korábban alkotott képpel, miszerint “áteresztő” epitéliumként funkcionálnak. Turner és munkatársai vizsgálatainak megfelelően a Par-C10 sejtek magas transzepitéliális ellenállása egyértelműan polarizált felépítéséből fakad [1]. Ugyanakkor Capan-1 sejtek a legkülönbözőbb transzepitheliális ellenállási értékekkel jellemezhetők. Rotoli és mtsai 3000 Ωcm2-es értéket említenek [6], mások azonban “áteresztőbb” epitéliumról beszélnek 100-300 Ωcm2 körüli ellenállás értékekkel [5]. Hogy az ellentétnek mi lehet az oka, egyelőre nem világos. Ugyanakkor a mi eredményeink is az utóbbi tanulmányokkal korrelálnak, erősítve azt a nézetet, hogy natív hasnyálmirigy duktuszok esetében is jelentős paracelluláris permeablilitás mutatható ki [129]. A monolayerek alacsony ellenállása ellenére occludin ellenes antitestekkel történt immunhisztokémiai vizsgálataink igazolják, hogy a Capan-1 sejtek Transwell membránon növesztve polarizált epitéliumot formálnak, tökéletesen kialakult sejt-sejt közötti kapcsoló struktúrákkal egyetemben. A

polarizált epitélium funkcionális bizonyítékai – a bazolaterális oldal anion

transzporterei A

Capan-1

monolayerek

polarizált

felépítését

funkcionális

kísérleti

eredményekkel is alátámasztottuk. HCO3−/CO2 mentes környezetben savterhelést követő pHi emelkedés jelentős mértékben függött a Na+ jelenlététől, azonban a kompenzációt a luminális Na+ nem befolyásolta. Az acidifákciót követő pHi emelkedés bazolaterális EIPA adásával teljes mértékben blokkolható volt, ami az NHE jelenlétére utal a bazoletrális membránban. RT-PCR eredmények alapján valószínűsíthető Capan-1 sejtekben is – mint ahogyan a legtöbb emlős szervezet duktális epitéliumában – NHE1 izoforma jelenléte. Az apikális NHE hiánya viszont arra utal, hogy Capan-1 sejtekben nem történik HCO3− reabszorpció. Ezen sejtek néhány faj duktális sejtjeitől eltérően [130] inkább a kis duktuszok fenotípusára hasonlítanak. HCO3−/CO2 tartalmú közegben ammónium pulzus alkalmazásával elsőként bizonyítottuk az NBC jelenlétét a Capan-1 sejtek bazolaterális membránjában. Eredményeink alapján Na+ bazolaterális visszaadását követően a pHi kompenzáció EIPA adásával részlegesen, EIPA és H2DIDS adásával teljes mértékben gátolható volt. RT-

60

Megbeszélés

PCR vizsgálatok alapján a membránban az pNBC1 izoforma jelenléte igazolható. Korábban a transzporter jelenlétét igazolták patkány [131], illetve tengerimalac hasnyálmirgy duktuszokban [132], valamint CFPAC-WT sejteken [46]. Az apikális NBC hiánya pedig újfent a HCO3- reabszorpció ellen szól. HCO3−/CO2

tartalmú

közegben

ammónium

pulzus

technikát

alkalmazó

+

vizsgálatink eredményei azt mutatták, hogy van valamilyen Na -független transzporter a bazolateralis membránban, amelyet kezdetben az irodalmi adatok alapján a vakuoláris típusú H+-ATPáz-nak gondoltunk [45, 131]. Azonban a bafilomycin A1 hatástalansága a feltételezett transzporter jelenléte ellen szól. Az, hogy milyen mechanizmus felelős ezért a jelenségért, további kísérletes vizsgálatokat igényel. Ugyanakkor érdekes megjegyezni, hasonló jelenség volt megfigyelhető tengerimalac hasnyálmirigy duktuszokon végzett kísérletek esetében is [133]. Az ammónium pulzus kísérletek során észlelt pHi változások felvetették a Na+K+-2Cl− kotranszporter jelenlétét is a mebránban. Mindezeket alátámasztotta, hogy az RT-PCR vizsgálatokkal igazolni tudtuk az NKCC1 expresszióját Capan-1 sejteken. Adott volt tehát a feladat, hogy megvizsgáljuk, vajon az ismert NKCC inhibitor bumetanide milyen hatással van az alkalizációt követő NH4+ felvételre. Eredményeink funkcionálisan is aktív NKCC jelenlétét igazolták a bazolaterális membránban. Korábbi vizsgálatokból ismert, hogy Capan-1 sejteken a szekretin kiváltotta Isc létrejöttében a bumetanide szenzitív mechanizmusoknak kiemelt jelentőssége van [5]. Így feltehető, hogy az NKCC1-n keresztül történő Na+-kapcsolt Cl− felvétel a bazolaterális membrán felől szolgáltatja a hajtóerőt az apikális Cl- szekréciónak. Ez azonban ellentétes a bevezetőben részletezett teóriával, ami a HCO3−-ban gazdag nedv elválasztását hivatott magyarázni [134]. A transzporter jelenléte Capan-1 sejtekben ugyanakkor arra utal, hogy a sejtek inkább az emberi hasnyálmirigy nagy duktuszaiból eredeztethetők, ahol is a bazolaterális transzporterek expressziós mintázata jelentősen különbözik a HCO3−-ot nagy mennyiségben szekretáló kisebb interkaláris és intralobuláris duktuszokétól.

61

Megbeszélés

A transzepitéliális bikarbonát szekréció és szabályozása – gasztrointesztinális peptidek szerepe Előzetes eredményeink alapján Par-C10 sejteken a bazolaterális bikarbonát utánpótlás gátlása kisfokú, de szignifikáns csökkenést eredményezett a pHi-ban. Egyidejű forskolin stimuláció azonban jelentős pHi esést indukált, jelezve ezzel a bikarbonát szekréció cAMP-függő szignifikáns fokozódását. Ezen megfigyelések megfelelnek a fiziológiás körülmények között is tapasztalt szekréciós sajátosságoknak, miszerint nyugalomban minimális nyálszekréció stimuláció hatására a többszörösére növekedhet. Kimutattuk ugyanakkor, hogy Capan-1 sejteken a bazolaterális HCO3− felvétel legfőbb transzporterei a NBC és NHE. Ezért, ha a bazolaterális bikarbonát utánpótlás legfőbb transzportereit gátoljuk, párhuzamosan működő, kifelé irányuló bikarbonát efflux mellett az intracelluláris pH csökken. Kísérleteink során két inhibitor (NHE gátlására az EIPA, NBC gátlására pedig H2DIDS) szimultán alkalmazását követően a pHi csökkenését tapasztaltuk, s ez a folyamat láthatóan felgyorsult az ismert szekréció stimulátor forskolin előkezelés hatására. EIPA és H2DIDS együttes alkalmazása forskolin stimulációval párhuzamosan gyorsabb esést eredményezett az intracelluláris pH-ban EIPA egyedüli adásához viszonyítva. Ezen megfigyelés alapján feltételezhető, hogy – akárcsak tengerimalac duktuszok esetében [78] – az NBC a szekréció során alapvető szerepet játszik a bikarbonát felvételben. Mindezek azonban némiképp ellentmondanak Cheng és munkatársai vizsgálatainak, akik Capan-1 sejtekben az NBC elhanyagolható szerepét feltételezték [5]. Kísérleteikben H2DIDS ugyanis nem volt gátló hatással a forskolin indukálta rövid zárlati áramra. Ugyanakkor meg kell jegyeznünk, hogy a vizsgálatban alkalmazott 150 μM koncentrációban a H2DIDS véleményünk és az irodalmi adatok alapján az NBC aktivitására minimális hatással bír. Noha számos anyagról – mint például a szekretin, VIP és PACAP - tudjuk, hogy intracelluláris cAMP szint emelésén keresztül stimulálja a hasnyálmirigy duktális bikarbonát szekréciót, a pontos receptoriális hatásmechanizmus nem minden esetben ismert [121, 135, 136]. Jelen ismereteink szerint egyetlen szekretin receptor típus létezik [137], bár farmakológiai adatok szerint ennek a receptornak többféle megjelenési formája lehet [138]. Ezen receptorok megtalálhatóak egér, patkány és tengerimalac pancreas acinus sejteken [139, 140], de kimutatták jelenlétüket emberi pancreas acinusokon [141],

62

Megbeszélés

valamint patkány [78] és tengerimalac duktuszokon [121] is. Holtmann vizsgálatai alapján [142] a szekretin receptor szekretin mellett jóval alacsonyabb affinitással köti a VIP-et,

mely

receptor-ligand

kötődés

eredményeként

a

receptor

aktiválódik.

Munkacsoportunk korábbi vizsgálataiból ismert, hogy tengerimalac duktuszban mind a szekretin, mind a VIP legalább részben szekretin receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat a bikarbonát elválasztásra. Ugyanakkor néhány tanulmány szerint a VIP nem potens stimulátora a pancreas szekréciónak patkányban [143, 144]. A VPAC1 és VPAC2 receptorok mind a VIP-et, mind a PACAP-ot magas (EC50=1-10 nM), a szekretint pedig relatív alacsony affinitással (EC50=1-30 µM) kötik [77]. Korábbi kutatások [145, 146] felvetették mind a szekretin mind a VIP receptor expressziójának lehetőségét Capan-1 sejteken. Az irodalmi adatokhoz hasonlóan RTPCR vizsgálatokkal kimutattuk szekretin, VPAC1 és VPAC2 receptorok mRNS expresszióját. Ezeken túl funkcionális kísérletekkel is szolgáltattunk evidenciát a szekretin és VIP receptorok jelenlétére és aktív működésére. Mindkét peptid egyértelműen serkentő hatással bír a HCO3− szekrécióra, azonban a szekretin hatáserőssége némiképp elmarad a VIP-éhez viszonyítva, megfelelve a nemzetközi irodalomból ismert patkány, valamint tengerimalac hasnyálmirigy szekréciós vizsgálatok eredményeinek [42, 78, 121]. A transzepitéliális bikarbonát szekréció és szabályozása – a purinerg jelátvitel szerepe Par-C10 sejteken a bazolaterális bikarbonát felvétel gátlásával egyidőben luminálisan és bazolaterálisan alkalmazott ATP hasonlóképpen növelte az pHi csökkenését. Ugyanakkor UTP luminális alkalmazása serkenti, bazolaterális alkalmazása viszont nem befolyásolja a transzepitéliális bikarbonát szekréciót. Lee és munkatársai szerint izolált szubmandibuláris nyálmirigy acinussejtek legalább két különböző P2 receptor típust expresszálnak a luminális és bazolaterális membránban: ATP ugyanis a [Ca2+]i növekedését eredményezi, a sejtnek bármelyik oldalán is alkalmazták, míg bzATP csak luminálisan adva, UTP pedig csak bazolaterálisan alkalmazva serkentette az [Ca2+]i-t [147]. Előzetes eredményeink alapján feltételezhető, hogy Par-C10 sejteken a luminális membránban P2Y2 receptor expresszálódik. Az egér parotisz eredetű acináris sejteken kimutatott, extracelluláris ATP aktiválta Cl- áramlás egy új ATP-kapcsolt Cl- transzport

63

Megbeszélés

mechanizmus jelenlétére utal, melynek feltehetően fontos fiziológiás szerepe van a nyálmirigy

folyadékszekréciójának

szabályozásában

[110].

Ezen

megfigyelések

magyarázatul szolgálhatnak arra a korábban tett megfigyelésre, miszerint ATP hatására a Ca2+ és cAMP közvetítette jelátviteli utak egyszerre aktiválódnak szinergista módon működve, lehetőséget teremtve ezáltal a receptorok és jelátviteli utak sokféleségéből adódó változatos hatások kialakulására. A szekretoros granulumokból felszabaduló ATP által aktivált apikális Cl- csatornák a Ca2+-aktiválta Cl− csatornákkal együttműködve fokozzák a szekréciót. A folyamat élettani szerepe abban állhat, hogy a megnövekedett folyadékszekréció a szekretoros granulumokból felszabadult fehérjéket végigmossa a duktuszfán [148]. Mikroperfundált

tengerimalac

duktuszokban

ATP

és

UTP

alkalmazása

bazolaterális majd luminális oldalon ellentétes hatást eredményezett: a nukleotidok luminális adása stimulálta, míg bazolaterális perfúziójuk gátolta a HCO3− szekréciót [115]. Megfigyeléseink szerint Capan-1 sejteken ATP és UTP apikális alkalmazása a bikarbonát felvétel EIPA-val és H2DIDS-szel történő egyidejű gátlása mellett gyorsította a pHi csökkenést a kontrollhoz viszonyítva, azonban a purin nukleotidok bazolaterális alkalmazása lassította azt. Noha RT-PCR vizsgálataink mind P2Y, mind P2X receptorok mRNS-ének expresszióját bizonyították Capan-1 sejtek membránjában, az ATP és UTP hasonló hatása feltételezi, hogy a purinerg aktiváció a sejt mindkét oldalán P2Y receptorhoz kötött [119]. Capan-1 sejteken folytatott korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az ATP az apikális Cl−/HCO3− cserét Ca2+-függő módon serkenti, amely egyúttal CFTR jelenlétéhez is kötött [149]. Ugyan a folyamat részletei nem teljesen tisztázottak, mégis segíthet megmagyarázni az apikálisan adott ATP stimuláció hátterében meghúzódó lehetséges mechanizmusokat. A megfigyelésünk, miszerint az emberi hasnyál szignifikáns mennyiségben tartalmaz ATP-t [123], méginkább megerősítheti, hogy az ATP fontos parakrin mediátorként vesz részt a hasnyálmirigy duktális bikarbonát szekréció szabályozásában [150]. A bazolaterálisan adott ATP gátló hatását azonban nehezebb megmagyarázni. Mind Capan-1 sejteken [149], mind tengerimalac hasnyálmirigy duktuszon [115] emeli az inracelluláris Ca2+ koncentrációt. Patkány duktális sejteken a P2Y2 (és valószínűleg

64

Megbeszélés

P2Y4) receptor stimulációja emeli az intracelluláris Ca2+ koncentrációt, ugyanakkor egyidejűleg csökkenti a teljes sejt K+ konduktanciáját [114]. Ha ez utóbbi hatás a K+ csatornák lokalizációjának megfelelően a bazolaterális membránhoz kötött helyi szignalizációs folyamatokat aktivál, a következményes depolarizáció pedig gátolja a HCO3− szekréciót.

Proliferációs vizsgálatok: A protein kináz C fontos szerepét jó néhány sejttípus proliferációjának szabályozásában már korábban kimutatták [50, 151, 152]. A PKC forbol-észter mediált és GPCR mediált aktivációja részt vesz az emberi hasnyálmirigy daganatsejtek növekedésének szabályozásában, akár serkentő, akár gátló hatással. Így a 12-Otetradecanoylforbol-13-acetát (TPA) gátolja a DanG, AsPc-1, Capan-2, Panc-1 és MiaPaCa-2 emberi hasnyálmirigy daganatos sejtvonalak kötőhely-függő növekedését [52, 53] és serkenti a MiaPaCa-2 kötőhely-független fejlődését [53]. Ismert ezenkívül, hogy a saját, specifikus GPCR receptorain keresztül ható neurotenzin által kifejtett indirekt PKC aktiváció serkenti a Panc-1C sejtek kötőhely-függő növekedését [54, 125]. Ezen változatos eredmények hátterében számos folyamat állhat: TPA hatására a legkülönbözőbb PKC izoformák expressziója és aktivációja figyelhető meg és a különböző sejtvonalakban különböző járulékos utak aktiválódnak. Ugyanakkor a fenti tanulmányoknál a kísérleti körülmények is jelentős különbözőségeket mutatnak. Éppen ezért elsődleges célunk volt, hogy a PKC aktiváció lehetséges útvonalait és a DNS szintézisre kifejtett hatásait egyetlen sejtvonalon ugyanazon kísérleti körülmények között vizsgáljuk. PKC izoformák hatása a sejtnövekedésre Panc-1C sejteken kimutatható a natív NTR-1 neurotenzin receptor [126], nem rendelkezik viszont natív CCK receptorral [124], azonban számos PKC izoformákat expresszál [125]. Kísérleteinkben CCK-1 receptorral transzfektált Panc-1 sejteket alkalmaztunk, hogy vizsgáljuk a G protein kapcsolt NTR-1, a transzfektált CCK-1 receptor vagy forbol észterek által indukált PKC aktiváció hatását a DNS szintézisre.

65

Megbeszélés

Eredményeink azt mutatják, hogy nyugvó Panc-1C sejtekben a különböző PKC izoformák aktivációja eltérő hatást fejt ki a sejtnövekedésre. Korábbi megfigyelésekhez hasonlóan [52, 124], a forbol észter-kiváltotta direkt PKC aktiváció a DNS szintézis jelentős csökkenését eredményezi, míg a transzfektált CCK-1 receptorok aktivációja mérsékelten gátolja, natív NT receptorok aktivációja pedig serkenti a sejtnövekedést. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk, vajon különböző PKC izoformák felelősek-e a PMA, CCK és NT növekedésre kifejtett ellentétes hatásaiért, izoforma-szelektív PKC inhibítorokat alkalmaztunk. Kimutattuk, hogy a klasszikus PKC izoformák (cPKC) és nPKCε gátlása felfüggeszti a PMA, CCK és NT hatását a DNS szintézisre Panc-1C sejteken, míg a klasszikus izoformák kizárólagos gátlás nem vált ki ilyen hatást. Így eredményeink alapján a proliferációra kifejtett hatás PKCε függő módon megy végbe. Ugyanakkor további vizsgálatok szükségeltetnek a folyamatok részletes tisztázására. Egyes PKC izoformákról kimutatták, hogy fontos szerepet játszanak bizonyos emberi hasnyálmirigy daganatsejtvonalak növekedésének szabályozásában. DanG emberi hasnyálmirgy daganatsejteken a forbol-észterek gátló hatása feltehetően a PKCα izoformának tulajdonítható [52], míg a PKCδ a PKCα-val együtt serkenti a MiaPaCa-2 sejtek kötőhely-független növekedését [53]. Íly módon nem zárható ki a PKCε-on felül más PKC izoformák aktivációja sem. Az ERK kaszkád aktivációjának kinetikája a proliferáció szabályozásában Az

ERK

kaszkád

kiemelkedő

fontossággal

bír

olyan

sejtfolyamatok

szabályozásában, mint a proliferáció vagy differenciáció [59] és szerepet játszik az apoptózis és metasztázis képződés regulációjában [60]. A neurotenzin-indukálta PKC aktiváció ERK-függő módon serkenti a sejtnövekedést Panc-1C sejteken [54] és forbolészterek kiváltotta PKC aktiváció szintén az ERK kaszkádon keresztül stimulálja a MiaPaCa-2 sejtek kötőhely-független növekedését [53]. Vizsgálataink tárgya éppen ezért az volt, hogy vajon a PMA és a CCK által kifejtett növekedés gátlás, valamint a NT indukálta proliferáció ERK aktivációval jár-e együtt. Eredményeink szerint a PMA, a CCK és a NT stimulálja az ERK kaszkádot, de alapvetően különböző kinetikával. A növekedést szabályozó hatás feltehetően az ERK aktiváció időtartamával mutat szoros összefüggést: átmeneti aktiváció a proliferációval, tartós ERK aktiváció pedig a

66

Megbeszélés

növekedés gátlással hozható kapcsolatba. Ezen eredmények azonban kétségtelenül nem korrelálnak Kisfalvi és munkatársai eredményeivel [66]. Panc-1C sejteken végzett kísérleteik alapján tartós ERK aktiváció erősebb növekedés stimulációval járt, mint tranziens aktiváció esetében, míg a mi vizsgálatain szerint átmeneti aktiváció a sejtnövekedés

serkentésével,

míg

elnyújtott

aktiváció

annak

gátlásával

van

összefüggésben. Ugyanakkor nem publikált eredményeink alapján a szérum hatását hasonlítva az NT hatásához azt találtuk, hogy Panc-1C sejteket szérummal stimulálva jóval elnyújtottabb ERK aktivációt (több, mint 30 perc a 2 perccel szemben) kapunk erőteljesebb növekedés stimulációval (2-3-szoros az 1,4-1,6-szorossal szemben). Ezek alapján valószínű, hogy az ERK aktivációnak létezik egy optimális időtartama, amely a legnagyobb növekedést eredményezi a DNS szintézisben. Annak bizonyítására, hogy a PMA, CCK, és NT ERK-függő módon szabályozza a Panc-1C sejtek növekedését, specifikus MEK1 MAP kináz inhibitort, a PD98059-t használtuk. A PMA, CCK vagy NT alkalmazását megelőző inhibitoros kezelés a DNS szintézis mértékét kontroll szintre állítja vissza. Ezen eredmények azt mutatják, hogy legalábbis PMA és NT esetében a proliferációra kifejtett hatás ERK-mediálta módon megy végbe. Annak érdekében, hogy további részleteiben tanulmányozuk az ERK kaszkád szerepét a PKC aktiváció növekedést szabályozó hatásában, megvizsgáltuk a PMA, a CCK és a NT két sejtciklus fehérjére kifejtett hatását PD98059 jelenlétében. Azt találtuk, hogy a PMA, a CCK és a NT ERK-függő módon szabályozza a cyclin D1 és p21Cip1 szintjét. Ezen eredmények egybecsengenek kolorektális daganatos sejteken és fibroblasztokon találtakkal [153, 154], ahol az ERK szignál időtartama meghatározza, hogy cyclin D1 egyedül indukálódik serkentve ezáltal a proliferációt, vagy a cyclin D1 expresszió fokozódásával együtt jár a p21Cip1 indukciója is, ami növekedés gátláshoz vezet. Az ERK kaszkád szerepe a sejtproliferációban Összefoglalva eredményeinket, az ERK kaszkád tehát Panc-1C sejtekben kulcsszerepet játszik a PKC aktiváció sejtproliferációra kifejtett negatív és pozitív hatásainak közvetítésében. Az ERK kaszkád aktivációjának különböző időtartama különböző sejtciklus gének indukciójával fejt ki változatos hatást a DNS szintézisre. Az

67

Megbeszélés

ERK aktiváció kinetikájának különbözőségéből eredő eltérő hatásról más sejttípusok esetében is beszámoltak. Tartós ERK aktiváció szükséges hörcsög fibroblaszt sejtek proliferációjához [155], míg epidermális növekedési faktor (EGF) indukálta átmeneti ERK aktiváció proliferációt, neuronális növekedési faktor (NGF) indukálta tartós ERK aktiváció differenciációt eredményez PC12 sejteken [64]. Gasztrointesztinális epitél sejteken a növekedési faktorok átmeneti ERK aktivációt okoznak, mely sejtosztódáshoz vezet, míg PKC aktivációt követő ERK aktiváció erős és tartós, sejtciklus gátlást eredményezve [65]. De hogyan képesek érzékelni a sejtek az ERK aktiváció kinetikáját? Korábbi tanulmányok fibroblaszt sejteken olyan közvetlen korai géntermékeket azonosítottak, melyek szerepet játszhatnak az ERK szignál érzékelésében: tartós ERK aktiváció szabályozza ezen szenzorok posttranszlációs módosítását, szabályozva stabilitásukat G1S fázisban [63, 156]. Ugyanakkor hasonló érzékelő mechanizmusok jelenléte emberi hasnyálmirigy daganatsejteken még bizonyításra vár. Következő fontos kérdés, hogy hogyan alakulhat ki ennyire különböző ERK aktivációs mintázat. Potenciálisan több út is nyílik az átmeneti vagy tartós ERK szignál létrehozására. A ligand koncentráció kis változtatásai, receptor internalizáció aránya, receptor downreguláció vagy a receptorszám különbségei vezethetnek ilyen hatáshoz [62]. Ezen megfigyelések alapján fenntartással figyelendő minden olyan tanulmány, mely bizonyos receptorok funkcióját overexpressziós vizsgálatokkal tanulmányozza. Ugyanis az overexpresszióval megemelt recetorszám akár önmagától, akár internalizáció vagy downreguláció segítségével a natív receptortól alapvetően különböző jelet generálhat. Mindezek következtében a sejtek bizonyos stimulusokra különböző

válaszokkal

reagálhatnak. Ez akár jelen kísérleteinkre is igaz lehet, mivel a Panc-1 hasnyálmirigy daganatsejtek normál körülmények között nem expresszálnak CCK-1 receptort, azt mi transzfekcióval juttattuk a sejtbe [124]. Ezen rendszerünkben a transzfektált recetor aktivációja növekedés gátláshoz vezet, noha patkány hasnyálmirigy sejtekben a CCK fontos növekedési faktor [93, 157]. A CCK emberben és patkányban megnyilvánuló ellentétes hatása akár faj-specifikus különbségekből is eredhet, de valószínűbb, hogy a transzfektált receptor eltérő karakterisztikája eredményezi a különbségét. Csakugyan, eredményeink mutatják, hogy egy másik szabályozó fehérje, a neurotenzin natívan

68

Megbeszélés

expresszált receptora ugyancsak ERK szignált generál, azonban egészen más karakterisztikával és serkentve a proliferációt. PKC izoformák szerepe az ERK kaszkád aktivációjában Kimutattuk, hogy a CCK és a NT receptorok aktivációja vagy a nem specifikus PKC aktivátor PMA által szabályozott növekedés mind PKCε-, mind ERK kaszkádfüggő módon megy végbe. Azt kívántuk igazolni, hogy az ERK aktivációja PKCε közreműködésével zajlik-e. Ha izoforma-szelektív inhibítorokkal előkezelt Panc-1C sejteket PMA-val, CCK-val vagy NT-vel kezeltük és mértük a foszforilált ERK mennyiségét, azt találtuk, hogy az ERK foszforiláció mértéke a PKCε-tól, nem pedig a klasszikus PKC izoformáktól vagy PKCδ-tól függ. Ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy Panc-1C emberi hasnyálmirigy daganatsejteken az ERK kaszkád aktivációjáért a PKCε a felelős. Más tanulmányok alapján – mi eredményeinkhez hasonlóan - egér és patkány fibroblaszt sejteken is PKCε felelős a Raf-1 aktivációjáért [158-160]. Panc-1C emberi hasnyálmirigy daganatsejteken a PKC aktiváció növekedést szabályozó hatását a következő modellrendszer magyarázza. Natív NTR-1, transzfektált CCK-1 receptorok aktivációja és forbol-észterek általi direkt stimuláció különféle PKC izoformák, beleértve a PKCε Raf-1-hez kapcsolódó aktivációját eredményezik. PKCε serkenti a Raf-1-et, az ERK kaszkád aktivációját eredményezve. Az ERK szignál időtartama PMA, CCK és NT kezelés hatására eltérő lehet, ami a sejtciklus gének különböző indukcióját jelenti serkentve vagy gátolva ezáltal a proliferációt. A részletes mechanizmus tisztázása azonban további vizsgálatokat igényel.

69

Következtetések

KÖVETKEZTETÉSEK Összefoglalásként elmondható, hogy 1. Par-C10

és

Capan-1

sejtek

permeábilis

membránon

növesztve

kiváló

modellrendszerként szolgálnak az epitéliális transzportfolyamatok tanulmányozására. 2. a sejtekben kimutatható szabályozott transzepitéliális bikarbonát szekréció. 3. Capan-1 sejteken a bikarbonát utánpótlásért a bazolaterális oldalon kimutatott Na+/H+ kicserélő (feltehetően az NHE1) és Na+-HCO3− kotranszporter (feltehetően pNBC1) együttesen a felelős. 4. Capan-1 sejteken a Cl- szekrécióhoz a hajtóerőt a bazolaterális membrán Na+-K+2Cl− kotranszportere (feltehetően NKCC1) szolgáltatja. 5. Capan-1 sejteken az NHE és NBC működése szekretin, VIP és forskolin alkalmazásával cAMP-függő módon serkenthető, fokozott luminális HCO3− transzportot eredményezve. 6. Capan-1 és Par-C10 sejteken mind a bazolaterális, mind a luminális membránban lokalizálódó purinoceptorok részt vesznek a bikarbonát szekréció szabályozásában, csak különböző receptorok és jelátviteli utak aktiválásával. 7. a reguláló peptidek a szekréció szabályozásán túl részt vesznek a proliferációs folyamatok regulálásában: Panc-1C sejteken NT serkenti, míg a CCK gyengén, a PMA pedig erőteljesen gátolja a DNS szintézist. 8. a PKC aktiváció növekedésre kifejtett szabályozó hatásáért a PKCε izoforma a felelős. 9. az indirekt vagy direkt PKC aktiváció Panc-1C sejtek növekedését az ERK kaszkádon keresztül befolyásolja, méghozzá különböző kinetikával. 10. az ERK kaszkád aktivációjáért a PKCε a felelős.

70

Összefoglalás

ÖSSZEFOGLALÁS Előzmények: Tanulmányoztuk az epitéliális bikarbonát- és folyadékszekréciót nyálmirigy - és hasnyálmirigy eredetű daganatos sejtvonalakon (Par-C10 és Capan-1), vizsgáltuk a hasnyálmirigy daganatos sejtvonalak (Panc-1C) proliferációs folyamataiban szerepet játszó protein-kináz C (PKC) és az extracelluláris jelvezérelt kináz (ERK) működésének mechanizmusait, valamint kutattuk a gasztrointesztinális peptidek szerepét ezen

folyamatokban

szekréciójának

szabályozásában.

tanulmányozására

Módszerek:

RT-PCR-t,

Az

epitéliális

immunhisztokémiát,

mirigyek valamint

3

mikrofluorometriát alkalmaztunk, a proliferációs mechanizmusokat [ H]-timidininkorporáció, és immunoblotting segítségével vizsgáltuk. Eredmények: Par-C10 és Capan-1 sejtek permeábilis membránon növesztve polarizált monolayert formálnak. Capan-1 sejteken a savterhelést követő pHi regeneráció a bazolaterális oldalon alkalmazott EIPA-val valamint H2DIDS-szel gátolható. Capan-1 sejteken a vektoriális bikarbonát szekréció koncentráció-függő módon stimulálható szekretin és VIP alkalmazásával. Capan-1 sejteken ATP és UTP apikális alkalmazása serkentette, míg bazolaterális alkalmazása gátolta a HCO3- szekréciót, Par-C10 sejteken bazolaterálisan alkalmazott purin nukleotidok serkentették (ATP) a HCO3- szekréciót, vagy hatástalannak bizonyultak (UTP). Panc-1C sejteken a PMA és a CCK a DNS szintézisre kifejtett gátló, valamint a NT stimuláló hatását Ro-32-0432 alkalmazásával gátolni lehetett, míg Gö6983 hatástalannak bizonyult. A PMA, CCK és NT okozta ERK aktiváció Ro-32-0432 alkalmazásával gátolható. PMA, CCK és NT kezelés PD98059-cel gátolható módon aktiválta a cyclin D1-et, azonban p21CIP1 expresszió csak PMA és CCK hatására növekedett. Megbeszélés: Bizonyítottuk a vektoriális bikarbonát transzport jelenlétét ParC10 és Capan-1 sejtekben. Capan-1 sejteken azonosítottuk a bazolaterális bikarbonát felvételben legfontosabb szerepet játszó NHE1 és pNBC1, valamint a Cl- szekréció hajtóerejét biztosító NKCC1 jelenlétét a membránban. Par-C10 és Capan-1 sejtekben a szekretin, VIP és forskolin, valamint purin nukleotidok különböző mechanizmusokkal vesznek részt a bikarbonát szekréció szabályozásában. Panc-1C sejteken bizonyítottuk a PKCε szerepét az ERK aktiváció és sejtnövekedés szabályozásában. Ezen folyamatokat szabályozó gasztrointesztinális peptidek szerepének pontos tisztázása új terápiás lehetőségekhez vezethet az epitéliális mirigyek krónikus gyulladásos és daganatos elváltozásainak kezelésében.

71

Summary

SUMMARY Background: Our aim was to determine the HCO3- transport mechanisms in salivary gland and human pancreatic cell line (Par-C10 and Capan-1), to study the mechanism of PKC and ERK activation on proliferation in Panc-1C cells and to investigate the role of regulatory peptide in the processes mentioned above. Methods: Intracellular pH was measured

by

microfluorometry.

Epithelial

polarization

was

assessed

by

immunolocalization of occludin. Expression of mRNA for key electrolyte transporters and receptors was evaluated by RT-PCR. DNA synthesis was studied by measuring [3H]thymidine incorporation, PKC and ERK cascade activation was detected with immunoblotting. Results: Par-C10 and Capan-1 cells grown on permeable supports formed confluent, polarized monolayers with well developed tight junctions. In Capan-1 cells the recovery of pHi from an acid load can be blocked by and H2DIDS. In Capan-1 cells dose-dependent increases in HCO3- secretion were observed in response to stimulation of both secretin and VPAC receptors. ATP and UTP applied to the apical membrane stimulated HCO3--secretion but were inhibitory when applied to the basolateral membrane in Capan-1 cells. However in Par-C10 cells application of ATP to the luminal and basolateral membrane resulted in a same accelerated fall in pHi caused by the inhibitors, UTP stimulated HCO3- secretion when applied to the luminal side, while basolateral administration was without effect. In Panc-1C cells PMA and CCK inhibited, NT stimulated DNA synthesis. These effects were inhibited by Ro-32-0432 but not by Gö6983. PMA, CCK and NT caused an ERK activation that was inhibited by Ro-320432. PMA, CCK and NT all activated cyclin D1, while p21CIP1 expression was increased by only PMA and CCK, but not by NT; each of these effects was inhibited by PD98059. Conclusion: In Capan-1 cells, at the basolateral membrane, an Na+/H+ exchanger (probably NHE1) and an Na+-HCO3- cotransporter (probably pNBC1) contribute to the cellular accumulation of HCO3-. There is also an Na+-K+-2Clcotransporter (probably NKCC1) which may generate a driving force for Cl- secretion. Secretin, VIP and forskolin all stimulate HCO3- secretion across the apical membrane in Par-C10 and Capan-1 cells. We have also shown that both apical and basolateral purinoceptors regulate HCO3-secretion. Our results provide evidence for PKCε-mediated differential ERK activation and growth regulation in Panc-1C cells. Identification of the mechanisms by which these key signaling pathways are modulated could provide a basis for the development of novel therapeutic interventions to treat pancreatic cancer.

72

Irodalomjegyzék

IRODALOMJEGYZÉK 1.

Turner, J.T., R.S. Redman, J.M. Camden, L.A. Landon, and D.O. Quissell, A rat parotid

gland

cell

line,

Par-C10,

exhibits

neurotransmitter-regulated

transepithelial anion secretion. Am J Physiol, 1998. 275(2 Pt 1): C367-74. 2.

Steward, M.C., H. Ishiguro, and R.M. Case, Mechanisms of bicarbonate secretion in the pancreatic duct. Annu Rev Physiol, 2005. 67: 377-409.

3.

Zsembery, A., M. Strazzabosco, and J. Graf, Ca2+-activated Cl- channels can substitute for CFTR in stimulation of pancreatic duct bicarbonate secretion. Faseb J, 2000. 14(14): 2345-56.

4.

Steagall, W.K., T.J. Kelley, R.J. Marsick, and M.L. Drumm, Type II protein kinase A regulates CFTR in airway, pancreatic, and intestinal cells. Am J Physiol, 1998. 274(3 Pt 1): C819-26.

5.

Cheng, H.S., P.Y. Leung, S.B. Cheng Chew, P.S. Leung, S.Y. Lam, W.S. Wong, Z.D. Wang, and H.C. Chan, Concurrent and independent HCO3- and Clsecretion in a human pancreatic duct cell line (CAPAN-1). J Membr Biol, 1998. 164(2): 155-67.

6.

Rotoli, B.M., O. Bussolati, V. Dall'Asta, G. Orlandini, R. Gatti, and G.C. Gazzola, Secretin increases the paracellular permeability of CAPAN-1 pancreatic duct cells. Cell Physiol Biochem, 2000. 10(1-2): 13-25.

7.

Hollande, E., M. Fanjul, S. Claret, M.E. Forgue-Lafitte, and J. Bara, Effects of VIP on the regulation of mucin secretion in cultured human pancreatic cancer cells (Capan-1). In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1995. 31(3): 227-33.

8.

al-Nakkash, L., N.L. Simmons, J.M. Lingard, and B.E. Argent, Adenylate cyclase activity in human pancreatic adenocarcinoma cell lines. Int J Pancreatol, 1996. 19(1): 39-47.

9.

Cheng, H.S., W.S. Wong, K.T. Chan, X.F. Wang, Z.D. Wang, and H.C. Chan, Modulation of Ca2+-dependent anion secretion by protein kinase C in normal and cystic fibrosis pancreatic duct cells. Biochim Biophys Acta, 1999. 1418(1): 31-8.

73

Irodalomjegyzék

10.

Cheng, H.S., S.C. So, S.H. Law, and H.C. Chan, Angiotensin II-mediated signal transduction events in cystic fibrosis pancreatic duct cells. Biochim Biophys Acta, 1999. 1449(3): 254-60.

11.

Racz, G.Z., A. Kittel, D. Riccardi, R.M. Case, A.C. Elliott, and G. Varga, Extracellular calcium sensing receptor in human pancreatic cells. Gut, 2002. 51(5): 705-11.

12.

Ishiguro, H., M.C. Steward, A.R. Lindsay, and R.M. Case, Accumulation of intracellular HCO3- by Na(+)-HCO3- cotransport in interlobular ducts from guinea-pig pancreas. J Physiol, 1996. 495 ( Pt 1): 169-78.

13.

Egerbacher, M. and P. Bock, Morphology of the pancreatic duct system in mammals. Microsc Res Tech, 1997. 37(5-6): 407-17.

14.

Robyt, J.F. and D. French, The action pattern of porcine pancreatic alphaamylase in relationship to the substrate binding site of the enzyme. J Biol Chem, 1970. 245(15): 3917-27.

15.

Rosenblum, J.L., C.L. Irwin, and D.H. Alpers, Starch and glucose oligosaccharides protect salivary-type amylase activity at acid pH. Am J Physiol, 1988. 254(5 Pt 1): G775-80.

16.

Scannapieco, F.A., G.I. Torres, and M.J. Levine, Salivary amylase promotes adhesion of oral streptococci to hydroxyapatite. J Dent Res, 1995. 74(7): 1360-6.

17.

Hamosh, M. and R.O. Scow, Lingual lipase and its role in the digestion of dietary lipid. J Clin Invest, 1973. 52(1): 88-95.

18.

Harries, J.T., Fat absorption in the newborn. Acta Paediatr Scand Suppl, 1982. 299: 17-23.

19.

Hamosh, M. and W.A. Burns, Lipolytic activity of human lingual glands (Ebner). Lab Invest, 1977. 37(6): 603-8.

20.

Abrams, C.K., M. Hamosh, V.S. Hubbard, S.K. Dutta, and P. Hamosh, Lingual lipase in cystic fibrosis. Quantitation of enzyme activity in the upper small intestine of patients with exocrine pancreatic insufficiency. J Clin Invest, 1984. 73(2): 374-82.

21.

Gresz, V., T.H. Kwon, P.T. Hurley, G. Varga, T. Zelles, S. Nielsen, R.M. Case, and M.C. Steward, Identification and localization of aquaporin water channels in

74

Irodalomjegyzék

human salivary glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001. 281(1): G247-54. 22.

Baum, B.J., Principles of saliva secretion. Ann N Y Acad Sci, 1993. 694: 17-23.

23.

Foskett, J.K., [Ca2+]i modulation of Cl- content controls cell volume in single salivary acinar cells during fluid secretion. Am J Physiol, 1990. 259(6 Pt 1): C998-1004.

24.

Zeng, W., M.G. Lee, and S. Muallem, Membrane-specific regulation of Clchannels by purinergic receptors in rat submandibular gland acinar and duct cells. J Biol Chem, 1997. 272(52): 32956-65.

25.

Nauntofte, B. and S. Dissing, K+ transport and membrane potentials in isolated rat parotid acini. Am J Physiol, 1988. 255(4 Pt 1): C508-18.

26.

Case, R.M., M. Hunter, I. Novak, and J.A. Young, The anionic basis of fluid secretion by the rabbit mandibular salivary gland. J Physiol, 1984. 349: 619-30.

27.

Evans, R.L., K. Park, R.J. Turner, G.E. Watson, H.V. Nguyen, M.R. Dennett, A.R. Hand, M. Flagella, G.E. Shull, and J.E. Melvin, Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice. J Biol Chem, 2000. 275(35): 26720-6.

28.

Paulais, M., I.H. Valdez, P.C. Fox, R.L. Evans, and R.J. Turner, Ion transport systems in human labial acinar cells. Am J Physiol, 1996. 270(1 Pt 1): G213-9.

29.

Fujikawa-Adachi, K., I. Nishimori, S. Sakamoto, M. Morita, S. Onishi, S. Yonezawa, and M.A. Hollingsworth, Identification of carbonic anhydrase IV and VI mRNA expression in human pancreas and salivary glands. Pancreas, 1999. 18(4): 329-35.

30.

Li, J., N.Y. Koo, I.H. Cho, T.H. Kwon, S.Y. Choi, S.J. Lee, S.B. Oh, J.S. Kim, and K. Park, Expression of the Na+-HCO3- cotransporter and its role in pHi regulation in guinea pig salivary glands. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006. 291(6): G1031-40.

31.

Evans, R.L., S.M. Bell, P.J. Schultheis, G.E. Shull, and J.E. Melvin, Targeted disruption of the Nhe1 gene prevents muscarinic agonist-induced up-regulation of Na(+)/H(+) exchange in mouse parotid acinar cells. J Biol Chem, 1999. 274(41): 29025-30.

75

Irodalomjegyzék

32.

Zhao, H., X. Xu, J. Diaz, and S. Muallem, Na+, K+, and H+/HCO3- transport in submandibular salivary ducts. Membrane localization of transporters. J Biol Chem, 1995. 270(33): 19599-605.

33.

Komwatana, P., A. Dinudom, J.A. Young, and D.I. Cook, Characterization of the Cl- conductance in the granular duct cells of mouse mandibular glands. Pflugers Arch, 1994. 428(5-6): 641-7.

34.

Paulais, M., E.J. Cragoe, Jr., and R.J. Turner, Ion transport mechanisms in rat parotid intralobular striated ducts. Am J Physiol, 1994. 266(6 Pt 1): C1594-602.

35.

Luo, X., J.Y. Choi, S.B. Ko, A. Pushkin, I. Kurtz, W. Ahn, M.G. Lee, and S. Muallem, HCO3- salvage mechanisms in the submandibular gland acinar and duct cells. J Biol Chem, 2001. 276(13): 9808-16.

36.

Hegyi, P., Z. Rakonczay, Jr., L. Tiszlavicz, A. Varro, A. Toth, G. Racz, G. Varga, M.A. Gray, and B.E. Argent, Protein kinase C mediates the inhibitory effect of substance P on HCO3- secretion from guinea pig pancreatic ducts. Am J Physiol Cell Physiol, 2005. 288(5): C1030-41.

37.

Dinudom, A., P. Poronnik, D.G. Allen, J.A. Young, and D.I. Cook, Control of intracellular Ca2+ by adrenergic and muscarinic agonists in mouse mandibular ducts and end-pieces. Cell Calcium, 1993. 14(9): 631-8.

38.

Valdez, I.H. and R.J. Turner, Effects of secretagogues on cytosolic Ca2+ levels in rat submandibular granular ducts and acini. Am J Physiol, 1991. 261(2 Pt 1): G359-63.

39.

Dehaye, J.P. and R.J. Turner, Isolation and characterization of rat submandibular intralobular ducts. Am J Physiol, 1991. 261(3 Pt 1): C490-6.

40.

Case, R.M., K.R. Lau, M.C. Steward, P.D. Brown, and A.C. Elliott, Epithelial electrolyte transport: interrelationships between H+, HCO3- and Cl. Biochem Soc Trans, 1989. 17(5): 803-5.

41.

Novak, I., Keeping up with bicarbonate. J Physiol, 2000. 528 Pt 2: 235.

42.

Ishiguro, H., S. Naruse, M.C. Steward, M. Kitagawa, S.B. Ko, T. Hayakawa, and R.M. Case, Fluid secretion in interlobular ducts isolated from guinea-pig pancreas. J Physiol, 1998. 511 ( Pt 2): 407-22.

76

Irodalomjegyzék

43.

Ishiguro, H., S. Naruse, J.I. San Roman, M. Case, and M.C. Steward, Pancreatic ductal bicarbonate secretion: past, present and future. Jop, 2001. 2(4 Suppl): 192-7.

44.

Argent, B.E., S. Arkle, M.J. Cullen, and R. Green, Morphological, biochemical and secretory studies on rat pancreatic ducts maintained in tissue culture. Q J Exp Physiol, 1986. 71(4): 633-48.

45.

Fernandez-Salazar, M.P., P. Pascua, J.J. Calvo, M.A. Lopez, R.M. Case, M.C. Steward, and J.I. San Roman, Basolateral anion transport mechanisms underlying fluid secretion by mouse, rat and guinea-pig pancreatic ducts. J Physiol, 2004. 556(Pt 2): 415-28.

46.

Shumaker, H., H. Amlal, R. Frizzell, C.D. Ulrich, 2nd, and M. Soleimani, CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am J Physiol, 1999. 276(1 Pt 1): C16-25.

47.

O'Reilly, C.M., J. Winpenny, B.E. Argent, and M.A. Gray, Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator currents in guinea pig pancreatic duct cells: inhibition by bicarbonate ions. Gastroenterology, 2000. 118(6): 1187-96.

48.

Dekker, L.V. and P.J. Parker, Protein kinase C--a question of specificity. Trends Biochem Sci, 1994. 19(2): 73-7.

49.

Liu, W.S. and C.A. Heckman, The sevenfold way of PKC regulation. Cell Signal, 1998. 10(8): 529-42.

50.

Rozengurt, E., Signal transduction pathways in the mitogenic response to G protein-coupled neuropeptide receptor agonists. J Cell Physiol, 1998. 177(4): 507-17.

51.

Nishizuka, Y., The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature, 1988. 334(6184): 661-5.

52.

Detjen, K.M., F.H. Brembeck, M. Welzel, A. Kaiser, H. Haller, B. Wiedenmann, and S. Rosewicz, Activation of protein kinase Calpha inhibits growth of pancreatic cancer cells via p21(cip)-mediated G(1) arrest. J Cell Sci, 2000. 113 ( Pt 17): 3025-35.

53.

Ishino, K., H. Fukazawa, M. Shikano, M. Ohba, T. Kuroki, and Y. Uehara, Enhancement of anchorage-independent growth of human pancreatic carcinoma

77

Irodalomjegyzék

MIA PaCa-2 cells by signaling from protein kinase C to mitogen-activated protein kinase. Mol Carcinog, 2002. 34(4): 180-6. 54.

Guha, S., J.A. Lunn, C. Santiskulvong, and E. Rozengurt, Neurotensin stimulates protein kinase C-dependent mitogenic signaling in human pancreatic carcinoma cell line PANC-1. Cancer Res, 2003. 63(10): 2379-87.

55.

Widmann, C., S. Gibson, M.B. Jarpe, and G.L. Johnson, Mitogen-activated protein kinase: conservation of a three-kinase module from yeast to human. Physiol Rev, 1999. 79(1): 143-80.

56.

Gutkind, J.S., The pathways connecting G protein-coupled receptors to the nucleus through divergent mitogen-activated protein kinase cascades. J Biol Chem, 1998. 273(4): 1839-42.

57.

Cai, H., U. Smola, V. Wixler, I. Eisenmann-Tappe, M.T. Diaz-Meco, J. Moscat, U. Rapp, and G.M. Cooper, Role of diacylglycerol-regulated protein kinase C isotypes in growth factor activation of the Raf-1 protein kinase. Mol Cell Biol, 1997. 17(2): 732-41.

58.

Marais, R., Y. Light, C. Mason, H. Paterson, M.F. Olson, and C.J. Marshall, Requirement of Ras-GTP-Raf complexes for activation of Raf-1 by protein kinase C. Science, 1998. 280(5360): 109-12.

59.

Davis, R.J., The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J Biol Chem, 1993. 268(20): 14553-6.

60.

Seufferlein, T., Novel protein kinases in pancreatic cell growth and cancer. Int J Gastrointest Cancer, 2002. 31(1-3): 15-21.

61.

Detjen, K.M., J.P. Kehrberger, A. Drost, A. Rabien, M. Welzel, B. Wiedenmann, and S. Rosewicz, Interferon-gamma inhibits growth of human neuroendocrine carcinoma cells via induction of apoptosis. Int J Oncol, 2002. 21(5): 1133-40.

62.

Marshall, C.J., Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell, 1995. 80(2): 179-85.

63.

Murphy, L.O., J.P. MacKeigan, and J. Blenis, A network of immediate early gene products propagates subtle differences in mitogen-activated protein kinase signal amplitude and duration. Mol Cell Biol, 2004. 24(1): 144-53.

78

Irodalomjegyzék

64.

Traverse, S., N. Gomez, H. Paterson, C. Marshall, and P. Cohen, Sustained activation of the mitogen-activated protein (MAP) kinase cascade may be required for differentiation of PC12 cells. Comparison of the effects of nerve growth factor and epidermal growth factor. Biochem J, 1992. 288 ( Pt 2): 351-5.

65.

Clark, J.A., A.R. Black, O.V. Leontieva, M.R. Frey, M.A. Pysz, L. Kunneva, A. Woloszynska-Read, D. Roy, and J.D. Black, Involvement of the ERK signaling cascade in protein kinase C-mediated cell cycle arrest in intestinal epithelial cells. J Biol Chem, 2004. 279(10): 9233-47.

66.

Kisfalvi, K., S. Guha, and E. Rozengurt, Neurotensin and EGF induce synergistic stimulation of DNA synthesis by increasing the duration of ERK signaling in ductal pancreatic cancer cells. J Cell Physiol, 2005. 202(3): 880-90.

67.

Huang, Y., G. Hajishengallis, and S.M. Michalek, Induction of protective immunity against Streptococcus mutans colonization after mucosal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium expressing an S. mutans adhesin under the control of in vivo-inducible nirB promoter. Infect Immun, 2001. 69(4): 2154-61.

68.

Bixler, D., J.C. Muhler, R.C. Webster, and W.G. Shafer, Changes in submaxillary gland ribonucleic acid following hypophysectomy, thyroidectomy and various hormone treatments. Proc Soc Exp Biol Med, 1957. 94(3): 521-4.

69.

Tobin, G., D. Giglio, and B. Gotrick, Studies of muscarinic receptor subtypes in salivary gland function in anaesthetized rats. Auton Neurosci, 2002. 100(1-2): 19.

70.

Felder, C.C., Muscarinic acetylcholine receptors: signal transduction through multiple effectors. Faseb J, 1995. 9(8): 619-25.

71.

Hegyi, P. and Z. Rakonczay, Jr., The inhibitory pathways of pancreatic ductal bicarbonate secretion. Int J Biochem Cell Biol, 2007. 39(1): 25-30.

72.

Benali, N., P. Cordelier, D. Calise, P. Pages, P. Rochaix, A. Nagy, J.P. Esteve, P.M. Pour, A.V. Schally, N. Vaysse, C. Susini, and L. Buscail, Inhibition of growth and metastatic progression of pancreatic carcinoma in hamster after somatostatin receptor subtype 2 (sst2) gene expression and administration of

79

Irodalomjegyzék

cytotoxic somatostatin analog AN-238. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(16): 9180-5. 73.

Davis, R.J., Transcriptional regulation by MAP kinases. Mol Reprod Dev, 1995. 42(4): 459-67.

74.

Bayliss, W.M. and E.H. Starling, The mechanism of pancreatic secretion. J. Physiol. (London), 1902. 28: 325-353.

75.

Douziech, N., A. Lajas, Z. Coulombe, E. Calvo, J. Laine, and J. Morisset, Growth effects of regulatory peptides and intracellular signaling routes in human pancreatic cancer cell lines. Endocrine, 1998. 9(2): 171-83.

76.

Howatson, A.G. and D.C. Carter, Pancreatic carcinogenesis: effect of secretin in the hamster- nitrosamine model. J Natl Cancer Inst, 1987. 78(1): 101-5.

77.

Harmar, A.J., A. Arimura, I. Gozes, L. Journot, M. Laburthe, J.R. Pisegna, S.R. Rawlings, P. Robberecht, S.I. Said, S.P. Sreedharan, S.A. Wank, and J.A. Waschek, International Union of Pharmacology. XVIII. Nomenclature of receptors for vasoactive intestinal peptide and pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide. Pharmacol Rev, 1998. 50(2): 265-70.

78.

Ulrich, C.D., 2nd, M. Holtmann, and L.J. Miller, Secretin and vasoactive intestinal peptide receptors: members of a unique family of G protein-coupled receptors. Gastroenterology, 1998. 114(2): 382-97.

79.

Varga, G., A. Balint, B. Burghardt, and M. D'Amato, Involvement of endogenous CCK and CCK1 receptors in colonic motor function. Br J Pharmacol, 2004. 141(8): 1275-84.

80.

Sankaran, H., I.D. Goldfine, C.W. Deveney, K.Y. Wong, and J.A. Williams, Binding of cholecystokinin to high affinity receptors on isolated rat pancreatic acini. J Biol Chem, 1980. 255(5): 1849-53.

81.

Innis, R.B. and S.H. Snyder, Distinct cholecystokinin receptors in brain and pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 77(11): 6917-21.

82.

Jensen, R.T., S.A. Wank, W.H. Rowley, S. Sato, and J.D. Gardner, Interaction of CCK with pancreatic acinar cells. Trends Pharmacol Sci, 1989. 10(10): 418-23.

80

Irodalomjegyzék

83.

Wank, S.A., R. Harkins, R.T. Jensen, H. Shapira, A. de Weerth, and T. Slattery, Purification, molecular cloning, and functional expression of the cholecystokinin receptor from rat pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(7): 3125-9.

84.

Green, T., R. Dimaline, S. Peikin, and G.J. Dockray, Action of the cholecystokinin antagonist L364,718 on gastric emptying in the rat. Am J Physiol, 1988. 255(5 Pt 1): G685-9.

85.

Hegyi, P., Z. Rakonczay-Jr, R. Sari, L. Czako, N. Farkas, C. Gog, J. Nemeth, J. Lonovics, and T. Takacs, Insulin is necessary for the hypertrophic effect of cholecystokinin-octapeptide

following

acute

necrotizing

experimental

pancreatitis. World J Gastroenterol, 2004. 10(15): 2275-7. 86.

Miyasaka, K., M. Ohta, K. Tateishi, A. Jimi, and A. Funakoshi, Role of cholecystokinin-A (CCK-A) receptor in pancreatic regeneration after pancreatic duct occlusion: a study in rats lacking CCK-A receptor gene expression. Pancreas, 1998. 16(2): 114-23.

87.

Hegyi, P., T. Takacs, K. Jarmay, I. Nagy, L. Czako, and J. Lonovics, Spontaneous and cholecystokinin-octapeptide-promoted regeneration of the pancreas following L-arginine-induced pancreatitis in rat. Int J Pancreatol, 1997. 22(3): 193-200.

88.

Dourish, C.T., A.C. Ruckert, F.D. Tattersall, and S.D. Iversen, Evidence that decreased feeding induced by systemic injection of cholecystokinin is mediated by CCK-A receptors. Eur J Pharmacol, 1989. 173(2-3): 233-4.

89.

Sandvik, A.K. and H.L. Waldum, CCK-B (gastrin) receptor regulates gastric histamine release and acid secretion. Am J Physiol, 1991. 260(6 Pt 1): G925-8.

90.

Smith, J.P., S.T. Kramer, and T.E. Solomon, CCK stimulates growth of six human pancreatic cancer cell lines in serum-free medium. Regul Pept, 1991. 32(3): 3419.

91.

Swift, I.R. and J.P. Smith, Cholecystokinin analog, JMV-180, stimulates growth of human pancreatic cancer. Dig Dis Sci, 1994. 39(5): 1007-13.

92.

Niederau, C., R.A. Liddle, J.A. Williams, and J.H. Grendell, Pancreatic growth: interaction of exogenous cholecystokinin, a protease inhibitor, and a cholecystokinin receptor antagonist in mice. Gut, 1987. 28 Suppl: 63-9.

81

Irodalomjegyzék

93.

Williams, J.A., Intracellular signaling mechanisms activated by cholecystokininregulating synthesis and secretion of digestive enzymes in pancreatic acinar cells. Annu Rev Physiol, 2001. 63: 77-97.

94.

Hirata, M., A. Tsuchida, T. Iwao, T. Sasaki, K. Matsubara, S. Yamamoto, K. Morinaka, Y. Kawasaki, Y. Fujimoto, H. Inoue, K. Kariya, and G. Kajiyama, Cholecystokinin regulates the invasiveness of human pancreatic cancer cell lines via protein kinase C pathway. Int J Oncol, 1999. 14(6): 1129-35.

95.

Lamers, C.B., J.B. Jansen, and R.A. Woutersen, Cholecystokinin and gastrointestinal cancer. J Steroid Biochem Mol Biol, 1990. 37(6): 1069-72.

96.

Gozes, I., M. Fridkinb, J.M. Hill, and D.E. Brenneman, Pharmaceutical VIP: prospects and problems. Curr Med Chem, 1999. 6(11): 1019-34.

97.

Dickinson, T. and S.M. Fleetwood-Walker, VIP and PACAP: very important in pain? Trends Pharmacol Sci, 1999. 20(8): 324-9.

98.

Mutt, V., Vasoactive intestinal polypeptide and related peptides. Isolation and chemistry. Ann N Y Acad Sci, 1988. 527: 1-19.

99.

Carraway, R. and S.E. Leeman, The isolation of a new hypotensive peptide, neurotensin, from bovine hypothalami. J Biol Chem, 1973. 248(19): 6854-61.

100.

Evers, B.M., M. Izukura, C.M. Townsend, Jr., T. Uchida, and J.C. Thompson, Differential effects of gut hormones on pancreatic and intestinal growth during administration of an elemental diet. Ann Surg, 1990. 211(5): 630-6; discussion 636-8.

101.

Baca, I., G.E. Feurle, A. Schwab, U. Mittmann, W. Knauf, and T. Lehnert, Effect of neurotensin on exocrine pancreatic secretion in dogs. Digestion, 1982. 23(3): 174-83.

102.

Andersson, S., S. Rosell, U. Hjelmquist, D. Chang, and K. Folkers, Inhibition of gastric and intestinal motor activity in dogs by (Gln4) neurotensin. Acta Physiol Scand, 1977. 100(2): 231-5.

103.

Armstrong, M.J., M.C. Parker, C.F. Ferris, and S.E. Leeman, Neurotensin stimulates [3H]oleic acid translocation across rat small intestine. Am J Physiol, 1986. 251(6 Pt 1): G823-9.

82

Irodalomjegyzék

104.

Nustede, R., W.E. Schmidt, H. Kohler, U.R. Folsch, and A. Schafmayer, Role of neurotensin in the regulation of exocrine pancreatic secretion in dogs. Regul Pept, 1993. 44(1): 25-32.

105.

Wood, J.G., H.D. Hoang, L.J. Bussjaeger, and T.E. Solomon, Effect of neurotensin on pancreatic and gastric secretion and growth in rats. Pancreas, 1988. 3(3): 332-9.

106.

Reubi, J.C., B. Waser, H. Friess, M. Buchler, and J. Laissue, Neurotensin receptors: a new marker for human ductal pancreatic adenocarcinoma. Gut, 1998. 42(4): 546-50.

107.

Feurle, G.E., B. Muller, and E. Rix, Neurotensin induces hyperplasia of the pancreas and growth of the gastric antrum in rats. Gut, 1987. 28 Suppl: 19-23.

108.

Ehlers, R.A., Y. Zhang, M.R. Hellmich, and B.M. Evers, Neurotensin-mediated activation of MAPK pathways and AP-1 binding in the human pancreatic cancer cell line, MIA PaCa-2. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 269(3): 704-8.

109.

Drury, A.N. and A. Szent-Györgyi, The physiological activity of adenine compounds with special reference to their action upon the mammalian heart. . J. Physiol. (London), 1929. 68: 213-237.

110.

Novak, I., ATP regulation of epithelial Cl- channels--new challenges? J Physiol, 2003. 547(Pt 1): 1.

111.

Cotrina, M.L., J.H. Lin, J.C. Lopez-Garcia, C.C. Naus, and M. Nedergaard, ATPmediated glia signaling. J Neurosci, 2000. 20(8): 2835-44.

112.

Coutinho-Silva, R., M. Parsons, T. Robson, and G. Burnstock, Changes in expression of P2 receptors in rat and mouse pancreas during development and ageing. Cell Tissue Res, 2001. 306(3): 373-83.

113.

Novak, I., R. Nitschke, and J. Amstrup, Purinergic receptors have different effects in rat exocrine pancreas. Calcium signals monitored by fura-2 using confocal microscopy. Cell Physiol Biochem, 2002. 12(2-3): 83-92.

114.

Hede, S.E., J. Amstrup, B.C. Christoffersen, and I. Novak, Purinoceptors evoke different electrophysiological responses in pancreatic ducts. P2Y inhibits K(+) conductance, and P2X stimulates cation conductance. J Biol Chem, 1999. 274(45): 31784-91.

83

Irodalomjegyzék

115.

Ishiguro, H., S. Naruse, M. Kitagawa, T. Hayakawa, R.M. Case, and M.C. Steward, Luminal ATP stimulates fluid and HCO3- secretion in guinea-pig pancreatic duct. J Physiol, 1999. 519 Pt 2: 551-8.

116.

Brown, E.M., Extracellular Ca2+ sensing, regulation of parathyroid cell function, and role of Ca2+ and other ions as extracellular (first) messengers. Physiol Rev, 1991. 71(2): 371-411.

117.

Tojyo, Y., A. Tanimura, S. Matsui, and Y. Matsumoto, Effects of extracellular ATP on cytosolic Ca2+ concentration and secretory responses in rat parotid acinar cells. Arch Oral Biol, 1997. 42(5): 393-9.

118.

Soltoff, S.P., M.K. McMillian, E.J. Cragoe, Jr., L.C. Cantley, and B.R. Talamo, Effects of extracellular ATP on ion transport systems and [Ca2+]i in rat parotid acinar cells. Comparison with the muscarinic agonist carbachol. J Gen Physiol, 1990. 95(2): 319-46.

119.

Novak, I., ATP as a signaling molecule: the exocrine focus. News Physiol Sci, 2003. 18: 12-7.

120.

Thomas, J.A., R.N. Buchsbaum, A. Zimniak, and E. Racker, Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry, 1979. 18(11): 2210-8.

121.

Szalmay, G., G. Varga, F. Kajiyama, X.S. Yang, T.F. Lang, R.M. Case, and M.C. Steward, Bicarbonate and fluid secretion evoked by cholecystokinin, bombesin and acetylcholine in isolated guinea-pig pancreatic ducts. J Physiol, 2001. 535(Pt 3): 795-807.

122.

Hegyi, P., M.A. Gray, and B.E. Argent, Substance P inhibits bicarbonate secretion from guinea pig pancreatic ducts by modulating an anion exchanger. Am J Physiol Cell Physiol, 2003. 285(2): C268-76.

123.

Kordas, K.S., B. Sperlagh, T. Tihanyi, L. Topa, M.C. Steward, G. Varga, and A. Kittel, ATP and ATPase secretion by exocrine pancreas in rat, guinea pig, and human. Pancreas, 2004. 29(1): 53-60.

124.

Detjen, K., M.C. Fenrich, and C.D. Logsdon, Transfected cholecystokinin receptors mediate growth inhibitory effects on human pancreatic cancer cell lines. Gastroenterology, 1997. 112(3): 952-9.

84

Irodalomjegyzék

125.

Guha, S., O. Rey, and E. Rozengurt, Neurotensin induces protein kinase Cdependent protein kinase D activation and DNA synthesis in human pancreatic carcinoma cell line PANC-1. Cancer Res, 2002. 62(6): 1632-40.

126.

Ryder, N.M., S. Guha, O.J. Hines, H.A. Reber, and E. Rozengurt, G proteincoupled receptor signaling in human ductal pancreatic cancer cells: neurotensin responsiveness and mitogenic stimulation. J Cell Physiol, 2001. 186(1): 53-64.

127.

Gschwendt, M., S. Dieterich, J. Rennecke, W. Kittstein, H.J. Mueller, and F.J. Johannes, Inhibition of protein kinase C mu by various inhibitors. Differentiation from protein kinase c isoenzymes. FEBS Lett, 1996. 392(2): 77-80.

128.

Wilkinson, S.E., P.J. Parker, and J.S. Nixon, Isoenzyme specificity of bisindolylmaleimides, selective inhibitors of protein kinase C. Biochem J, 1993. 294 ( Pt 2): 335-7.

129.

Novak, I. and R. Greger, Electrophysiological study of transport systems in isolated perfused pancreatic ducts: properties of the basolateral membrane. Pflugers Arch, 1988. 411(1): 58-68.

130.

Lee, M.G., W. Ahn, J.Y. Choi, X. Luo, J.T. Seo, P.J. Schultheis, G.E. Shull, K.H. Kim, and S. Muallem, Na(+)-dependent transporters mediate HCO(3)(-) salvage across the luminal membrane of the main pancreatic duct. J Clin Invest, 2000. 105(11): 1651-8.

131.

Zhao, H., R.A. Star, and S. Muallem, Membrane localization of H+ and HCO3transporters in the rat pancreatic duct. J Gen Physiol, 1994. 104(1): 57-85.

132.

Ishiguro, H., S. Naruse, M. Kitagawa, A. Suzuki, A. Yamamoto, S.B. Ko, T. Hayakawa, M. Case, and M. Steward, Bicarbonate transport in microperfused pancreatic ducts. J Korean Med Sci, 2000. 15 Suppl: S16.

133.

Ishiguro, H., S. Naruse, M. Kitagawa, A. Suzuki, A. Yamamoto, T. Hayakawa, R.M. Case, and M.C. Steward, CO2 permeability and bicarbonate transport in microperfused interlobular ducts isolated from guinea-pig pancreas. J Physiol, 2000. 528 Pt 2: 305-15.

134.

Kyriazis, A.P., A.A. Kyriazis, D.G. Scarpelli, J. Fogh, M.S. Rao, and R. Lepera, Human pancreatic adenocarcinoma line Capan-1 in tissue culture and the nude

85

Irodalomjegyzék

mouse: morphologic, biologic, and biochemical characteristics. Am J Pathol, 1982. 106(2): 250-60. 135.

Kim, C.D., P. Li, K.Y. Lee, D.H. Coy, and W.Y. Chey, Effect of [(CH2NH)4,5]secretin on pancreatic exocrine secretion in guinea pigs and rats. Am J Physiol, 1993. 265(5 Pt 1): G805-10.

136.

Padfield, P.J., A. Garner, and R.M. Case, Patterns of pancreatic secretion in the anaesthetised guinea pig following stimulation with secretin, cholecystokinin octapeptide, or bombesin. Pancreas, 1989. 4(2): 204-9.

137.

Chow, B.K., Molecular cloning and functional characterization of a human secretin receptor. Biochem Biophys Res Commun, 1995. 212(1): 204-11.

138.

Solomon, T.E., G. Varga, N. Zeng, S.V. Wu, J.H. Walsh, and J.R. Reeve, Jr., Different actions of secretin and Gly-extended secretin predict secretin receptor subtypes. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2001. 280(1): G88-94.

139.

Dehaye, J.P., J. Winand, C. Damien, F. Gomez, P. Poloczek, P. Robberecht, A. Vandermeers, M.C. Vandermeers-Piret, M. Stievenart, and J. Christophe, Receptors involved in helodermin action on rat pancreatic acini. Am J Physiol, 1986. 251(5 Pt 1): G602-10.

140.

Jensen, R.T., C.G. Charlton, H. Adachi, S.W. Jones, T.L. O'Donohue, and J.D. Gardner, Use of 125I-secretin to identify and characterize high-affinity secretin receptors on pancreatic acini. Am J Physiol, 1983. 245(2): G186-95.

141.

Robberecht, P., P. De Neef, M. Waelbroeck, J.C. Camus, J.L. Scemama, D. Fourmy, L. Pradayrol, N. Vaysse, and J. Christophe, Secretin receptors in human pancreatic membranes. Pancreas, 1988. 3(5): 529-35.

142.

Holtmann, M.H., E.M. Hadac, C.D. Ulrich, and L.J. Miller, Molecular basis and species specificity of high affinity binding of vasoactive intestinal polypeptide by the rat secretin receptor. J Pharmacol Exp Ther, 1996. 279(2): 555-60.

143.

Alonso, R.M., A.M. Rodriguez, L.J. Garcia, M.A. Lopez, and J.J. Calvo, Comparison between the effects of VIP and the novel peptide PACAP on the exocrine pancreatic secretion of the rat. Pancreas, 1994. 9(1): 123-8.

86

Irodalomjegyzék

144.

Lee, S.T., K.Y. Lee, P. Li, D. Coy, T.M. Chang, and W.Y. Chey, Pituitary adenylate cyclase-activating peptide stimulates rat pancreatic secretion via secretin and cholecystokinin releases. Gastroenterology, 1998. 114(5): 1054-60.

145.

Jiang, S., E. Kopras, M. McMichael, R.H. Bell, Jr., and C.D. Ulrich, 2nd, Vasoactive intestinal peptide (VIP) stimulates in vitro growth of VIP-1 receptorbearing human pancreatic adenocarcinoma-derived cells. Cancer Res, 1997. 57(8): 1475-80.

146.

Ito, T., W. Hou, T. Katsuno, H. Igarashi, T.K. Pradhan, S.A. Mantey, D.H. Coy, and R.T. Jensen, Rat and guinea pig pancreatic acini possess both VIP(1) and VIP(2) receptors, which mediate enzyme secretion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2000. 278(1): G64-74.

147.

Lee, M.G., W. Zeng, and S. Muallem, Characterization and localization of P2 receptors in rat submandibular gland acinar and duct cells. J Biol Chem, 1997. 272(52): 32951-5.

148.

Melvin, J.E., D. Yule, T. Shuttleworth, and T. Begenisich, Regulation of fluid and electrolyte secretion in salivary gland acinar cells. Annu Rev Physiol, 2005. 67: 445-69.

149.

Namkung, W., J.A. Lee, W. Ahn, W. Han, S.W. Kwon, D.S. Ahn, K.H. Kim, and M.G. Lee, Ca2+ activates cystic fibrosis transmembrane conductance regulatorand Cl- -dependent HCO3 transport in pancreatic duct cells. J Biol Chem, 2003. 278(1): 200-7.

150.

Sorensen, C.E. and I. Novak, Visualization of ATP release in pancreatic acini in response to cholinergic stimulus. Use of fluorescent probes and confocal microscopy. J Biol Chem, 2001. 276(35): 32925-32.

151.

Livneh, E. and D.D. Fishman, Linking protein kinase C to cell-cycle control. Eur J Biochem, 1997. 248(1): 1-9.

152.

Rozengurt, E., Neuropeptides as growth factors for normal and cancerous cells. Trends Endocrinol Metab, 2002. 13(3): 128-34.

153.

Park, K.S., N.G. Lee, K.H. Lee, J.T. Seo, and K.Y. Choi, The ERK pathway involves positive and negative regulations of HT-29 colorectal cancer cell growth

87

Irodalomjegyzék

by extracellular zinc. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2003. 285(6): G1181-8. 154.

Roovers, K. and R.K. Assoian, Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase cell cycle machinery. Bioessays, 2000. 22(9): 818-26.

155.

Meloche, S., K. Seuwen, G. Pages, and J. Pouyssegur, Biphasic and synergistic activation of p44mapk (ERK1) by growth factors: correlation between late phase activation and mitogenicity. Mol Endocrinol, 1992. 6(5): 845-54.

156.

Murphy, L.O., S. Smith, R.H. Chen, D.C. Fingar, and J. Blenis, Molecular interpretation of ERK signal duration by immediate early gene products. Nat Cell Biol, 2002. 4(8): 556-64.

157.

Niederau, C., R. Luthen, and T. Heintges, Effects of CCK on pancreatic function and morphology. Ann N Y Acad Sci, 1994. 713: 180-98.

158.

Cacace, A.M., M. Ueffing, A. Philipp, E.K. Han, W. Kolch, and I.B. Weinstein, PKC epsilon functions as an oncogene by enhancing activation of the Raf kinase. Oncogene, 1996. 13(12): 2517-26.

159.

Hamilton, M., J. Liao, M.K. Cathcart, and A. Wolfman, Constitutive association of c-N-Ras with c-Raf-1 and protein kinase C epsilon in latent signaling modules. J Biol Chem, 2001. 276(31): 29079-90.

160.

Ueffing, M., J. Lovric, A. Philipp, H. Mischak, and W. Kolch, Protein kinase Cepsilon associates with the Raf-1 kinase and induces the production of growth factors that stimulate Raf-1 activity. Oncogene, 1997. 15(24): 2921-7.

88

Bibliográfia

BIBLIOGRÁFIA A doktori értekezés alapját képező közlemények: Szucs A, Demeter I, Burghardt B, Ovari G, Case RM, Steward MC, Varga G. Vectorial bicarbonate transport by Capan-1 cells: a model for human pancreatic ductal secretion. Cell Physiol Biochem. 2006;18(4-5):253-64. Racz GZ, Szucs A, Szlavik V, Vag J, Burghardt B, Elliott AC, Varga G. Possible role of duration of PKC-induced ERK activation in the effects of agonists and phorbol esters on DNA synthesis in Panc-1 cells. J Cell Biochem. 2006 Aug 15;98(6):1667-80. Szűcs Á, Demeter I, Hegyesi O, Nagy Á, Burghardt B, Steward MC, Varga G Vectorial bicarbonate transport by Par- C10 cells: a model for human parotid secretion Közlésre előkészítve Demeter I., Szűcs Á., Óvári G., Varga G. Capan-1 sejtek HCO3- szekréciójában szerepet játszó transzportfolyamatok vizsgálata Orvostudományi Értesítő, 2005, 78 (1): 56-60;

Idézhető konferencia absztraktok: G.Varga, Á. Szűcs, G. Szalmay, D.H. Coy, R.M. Case, M.C. Steward Effect of VIP, PACAP-38 and secretin on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea-pig ISP-2002 Congress G. Varga, G. Szalmay, A. Szucs, D.H. Coy, R.M. Case, M.C. Steward Involvement secretin, VIP and PACAP receptors in bicarbonate secretion in isolated guinea-pig pancreatic ducts Gordon Research Conferences, 2003

89

Bibliográfia

A. Szucs, I. Demeter, G. Ovari, R.M. Case, M.C. Steward, G. Varga Basolateral NBC1 and NHE1 regulate intracellular pH in Capan-1 cells EPC meeting, Padova, Italy 2004 G. Varga, A. Szucs, I. Demeter, G. Ovári, R.M. Case, M.C. Steward Basolateral pNBC1 and NHE1 regulate intracellular pH and transepithelial bicarbonate secretion in Capan-1 cells Gordon Research Conferences, Harbortown Ventura, CA, USA, 2005 G. Varga, Á . Szucs, I. Demeter, G. Ovári, R.M. Case, M.C. Steward Pharmacological model for epithelial bicarbonate secretion – polarized Capan-1 cells 6th International Congress of Wordwide Hungarian Medical Academy, Budapest, 2005 Á. Szűcs, B. Burghardt, I. Demeter, G. Óvári, R.M. Case, M. C. Steward, G. Basolateral NBC1 and NHE1 regulate intracellular pH and transcellular HCO3- secretion in Capan-1 cells EPC meeting, Graz, Austria, 2005 Á. Szűcs, I. Demeter, B. Burghardt, G. Óvári, R.M. Case, M.C. Steward, G. Varga Vectorial bicarbonate transport by Capan-1 cells: a model for human pancreatic ductal secretion International Symposium on Basic Gastrointestinal Research, Budapest, 2005 Á. Szűcs, I. Demeter, B. Burghardt, G. Óvári, R.M. Case, M.C. Steward, G. Varga Vectorial transport by Capan-1 cells: a model for human pancreatic ductal bicarbonate secretion Focused Meeting of The Physiological Society, Manchester, UK, 2006 G. Varga, Á. Szűcs, Á. Nagy, I. Demeter, M.C. Steward, B. Burghardt Transepithelial bicarbonate transport of polarized Par-C10 parotid acinar cells IADR PEF Conference, Dublin, 2006

90

Bibliográfia

G. Varga, Á. Szűcs, Á. Nagy, I. Demeter, M.C. Steward, B. Burghardt Polarized Par C10 parotid acinar cells as a model for epithelial vectorial bicarbonate transport FAOP, Seoul, Korea, 2006 G. Varga, Á. Szucs, Á. Nagy, I. Demeter, M.C. Steward, B. Burghardt Bicarbonate secretion by cultured salivary glands JSPS, Okazaki, Japan, 2006 A. Szucs, I. Demeter, A. Nagy, M.C. Steward, B. Burghardt, G. Varga Bicarbonate secretion by Par-C10 cultured salivary gland cells EPC meeting, Newcastle upon Tyne, UK, 2007

91

Köszönetnyilvánítás

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom témavezetőmnek Dr. Varga Gábornak, az MTA doktorának, aki már diákéveim alatt bevezetett a tudományos kutatómunka szépségébe és akinek szakmai segítsége és tanácsai nélkül e munka nem készülhetett volna el. Külön köszönöm dr. Rácz Gábornak a sok szakmai és emberi segítség mellett a közös publikáció lehetőségét. Köszönöm Martin C. Steward rengeteg segítségét, ösztönző tanácsait! Hálával tartozom munkatársaimnak, akik fáradságot és időt nem kímélve, nagy segítségemre voltak a dolgozat elkészítésében: Barabás Kornéliának, Dr. Burghardt Beátának, Demeter Irmának, Óvári Gabriellának és Szlávik Vandának. Köszönöm A SE-FOK Orálbiológiai Tanszék minden munkatársának segítségét, különös tekintettel Simon György Professzor Úrra, aki jóságával és szakmai kritikáival segítette pályafutásomat. Hálás vagyok dr. Szalmay Gábornak, hogy kutatómunkám első perceitől kezdve tanácsaival ösztönzött a tudományos munkára. Végül, de nem utolsósorban szeretném megköszönni Családomnak és Barátaimnak a lehetőséget, türelmet, megértését és ösztönzést, amivel a munkám minden percében mellettem álltak.

92