Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra experimentální biologie rostlin
Postranní kořeny a kořenové hlízky - podobnosti a rozdíly
Bakalářská práce Tereza Šnajdrová
Školitel: RNDr. Aleš Soukup, Ph.D. Praha, 2012
Poděkování:
Ráda bych srdečně poděkovala svému školiteli, RNDr. Aleši Soukupovi, Ph.D., za jeho pevné nervy, dobré rady a stálý úsměv na rtech. Díky patří také RNDr. Olze Votrubové, CSc. za dobré rady a povzbuzení. A konečně pak mé rodině, zejména mému příteli, za podporu a motivaci k práci.
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze, 27. 08. 2012
Podpis
2
Abstrakt Postranní orgány kořene, kořenové hlízky a postranní kořeny, se zakládají endogenně, a až na výjimky mimo apikální meristém. Tyto orgány mohou být různě modifikovány. Některé rostliny mají, právě díky těmto postranním orgánům, schopnost vstupovat do symbiotických interakcí s jinými organismy. Při vzniku symbiotické, dusík-fixující hlízky se uplatňuje signalizace obou budoucích partnerů, aby byl zajištěn vstup do kořene pouze organismu hostitelsky specifickému k rostlině. Pronikání bakterie Rhizobium či Frankia do kořene se standardně děje přes kořenový vlásek pokožkové buňky, ale není to jediný možný mechanismus vstupu. Zároveň s tímto vstupem se začne vytvářet hlízkové primordium. Pletivo, z něhož se hlízka vytváří, i výsledná podoba hlízky, se liší u různých rostlin. V centrální zóně dospělé hlízky dochází, díky nitrát reduktáze, k fixaci vzdušného dusíku. Tato vlastnost zvýhodňuje rostliny, schopné této hlízkové symbiózy, při kolonizaci půdy, chudé na dusík. Postranní kořeny se zakládají v pericyklu, aktivací malého počtu jeho buněk. Po výstupu z pletiv mateřského kořene dochází k aktivaci meristému bočního kořene. Oba tyto postranní orgány spolu s primárním kořenem tvoří dynamický kořenový systém, regulovaný vnitřními i vnějšími faktory. Klíčová slova postranní kořen, kořenová hlízka, pericykl, primární kůra Rhizobium, Frankia, Arabidopsis
Abstract Lateral root organs, as root nodules and lateral roots, are induced endogenously, and with some exceptions outside of the apical root meristem. These organs may be variously modified. Some plants have, because of these lateral organs, ability to enter some symbiotic interactions with other organisms. At the inception of the symbiotic, nitrogen-fixating nodules applies the signaling of both future partners, to ensure access to root only organism specific to the host-plant. Infection of bacteria Rhizobium or Frankia in root is normally done through the root hairs of epidermal cells, but it is not not the only possible mechanism of entry. Simultaneously with the infection, a nodule primordium starts to create. The tissue, from which nodules are produced, and the final form of nodule, is different for different plant species. In the central zone of adult nodules occurs, due to the nitrate reductase, fixation of atmospheric nitrogen. This feature favors plants capable of this nodule symbiosis at the colonization of substrate, poor in nitrogen. Lateral roots are based in pericycle, by activating a small number of cells. After emerging the parent root tissues, activation of the lateral root meristem take place. Both of these lateral organs, together with the primary root, generate a dynamic root system, regulated by internal and external factors. Key words Lateral root, root nodule, pericycle, cortex, Rhizobium, Frankia, Arabidopsis
3
Obsah Seznam použitých zkratek ........................................................................................... 5 1) Úvod ................................................................................................................ 6 2) Postranní kořeny ........................................................................................... 8 (1) Od páru buněk pericyklu k primordiu............................................. 8 (2) Transport auxinu ........................................................................... 9 (3) Lokalizace postranních kořenů ......................................................11 (4) Regulace vývoje postranních kořenů .............................................11 (a) Regulace fytohormony .............................................................11 (i) Auxin...................................................................................12 (ii) Cytokininy ...........................................................................12 (iii) Kyselina abscisová .............................................................13 (iv) Etylén ..................................................................................13 (v) Brasinosteroidy ...................................................................14 (vi) Gibereliny ............................................................................14 (vii) Ostatní..................................................................................14 (b) Environmentální ovlivnění kořene..............................................15 (i) Dusík.....................................................................................15 (ii) Fosfor....................................................................................17 (iii) Síra........................................................................................17 (iv) Železo....................................................................................17 3) Dusík – fixující kořenové hlízky........................................................................18 (1) Vnitřní stavba hlízek ..........................................................................19 (2) Evoluční vznik hlízek u luskovin.........................................................21 (3) Nod faktory.........................................................................................22 (4) Infekce – jak proniknout do rostlinné buňky.......................................23 (5) Vznik hlízky je úzce spjat s infekcí.....................................................25 (6) Regulace vývoje hlízek.......................................................................27 (i) Auxin.......................................................................................27 (ii) Cytokininy...............................................................................28 (iii) Etylén......................................................................................28 4) Postranní kořeny a kořenové hlízky – srovnání............................................. 30 5) Závěr................................................................................................................... 34 6) Citovaná literatura ............................................................................................ 35
4
Seznam použitých zkratek:
SYMRK – symbiotická receptorová kináza NFR1 a 5 – Nod faktorový receptor 1 a 5 LNP – Nod faktory – vázající protein LHK1 – cytokininový receptor NFK – kyselina 1-naftylftalamová, inhibitor transportu auxinu ARF – faktory, zprostředkovávající odpověď na auxin NRT1.1 – dusičnanový přenašeč a receptor ACC – prekurzor eylénu, kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová Pi – anorganický fosfát H2PO4-
5
1. Úvod Postranní orgány kořene, ať už boční kořeny, symbiotické kořenové hlízky, či jejich modifikace, umožňují využít dostupné zdroje a dávají rostlinám, spolu s dalšími faktory jako schopnost fotosyntézy či relativní všudypřítomnost potřebných látek, možnost žít celý život na jednom místě. Postranní kořeny jsou rostlinou vysílány do okolního substrátu s cílem zajistit přístup vody a potřebných minerálních látek. Kořenový systém rostlin je velmi dynamická struktura, ovlivňovaná geneticky i environmentálně. V radikule embrya se zakládá hlavní kořen, postranní orgány vznikají postembryonálně a endogenně, stimulací dělení určitých buněk za vytvoření primordia, které se dále vyvíjí a diferencuje (Mathesius, 2008). Postranní kořeny zvětšují absorpční plochu, upevňují rostlinu v substrátu a umožňují interakce s jinými organismy. Některé nemykorhizní rostliny, náležící do čeledí Proteaceae, Casuarinaceae, Fabaceae či Myricaceae jsou v půdách chudých na živiny schopné tvořit klastrové, nebo též proteroidní kořeny. Ty jsou charakterizovány velkým množstvím krátkých, determinovaných postranních kořenů, vyrůstajících synchronně z krátkého úseku primárního kořene. Za účelem získání minerálů vylučují do půdy asimiláty, zejména malát (Shane & Lambers, 2005). Mykorhiza, mutualistický vztah kořene rostliny s houbovým myceliem, umožňuje rostlině výměnou za asimiláty získávat cenné minerální látky, zejména fosfor a dusík, a vodu. Mykorhizní symbiózy je schopná převážná většina rostlin (Smith & Smith, 2011). Dusík může rostlina získat také symbiózou s diazotrofním prokaryotickým organismem, schopným vázat molekulární dusík do využitelných sloučenin. Tyto prokaryotické organismy využívají pro fixaci dusíku specifický enzym, který jim umožňuje redukovat trojnou vazbu v dvouatomární molekule dusíku. První objev kořenů, jakožto větvících se struktur odlišných od prýtu, je datován do svrchního devonu, asi 400 milionů let zpět. Před 375 miliony let kořeny pronikly do substrátu a umožnily tím příjem vody a minerálních látek (Raven & Edwards, 2001). Luskoviny se vyvinuly na počátku třetihor, asi před 60 miliony let, tvorba hlízek se odhaduje na 58 milionů let zpět (Sprent, 2007). Vznik
Obrázek 1: Rostlinné druhy, schopné v reakci na své
mykorhizy je časově řazen ještě před přechod
endosymbionty tvorby hlízky, bobovité a aktinorhizní rostliny, patří společně do skupiny Rosids I, tudíž mající společného předka (Pawlowski & Demchenko, 2012), převzato od Soltis et al., 1995.
rostlin na souš (Markmann et al., 2008).
Bakteriemi zprostředkovaná fixace dusíku je známá již u některých kapradin a cykasů, následně i u jednoděložných rostlin, u nichž však nedochází k tvorbě hlízek, bakterie (rodu Azoarcus či Azospirillum) či sinice (Nostoc) žijí jen v asociaci s kořeny (Markmann & Parniske, 2009). Například cykasy jsou 6
schopny symbiózy s vláknitou sinicí Nostoc, obsahující buňky schopné vázat dusík, heterocysty. V tomto typu soužití se vytváří specializované, agravitropické boční kořeny, tzv koraloidní kořeny, v jejichž mezibuněčných prostorech v primární kůře sinice žije, a způsobuje prodlužování buněk kořene. Meristém těchto modifikovaných bočních kořenů brzy ztrácí aktivitu. Symbiotické sinice ve srovnání s volně žijícími vykazují vyšší fixaci dusíku díky vyššímu počtu heterocyst, a heterotrofní výživu díky nepřítomnosti světla (Lindblad, 2009). Rostlina může do symbiózy také zainvestovat, ubytovat mikroorganismus ve svých buňkách a vytvořit mu adekvátní prostředí pro fixaci dusíku, symbiotickou hlízku. Takovéto endosymbiózy se vyskytují jen u určitých skupin rostlin, a to u rostlin bobovitých (a Parasponia), u nichž nacházíme mnohé odlišnosti hlízek od postranních kořenů, a to ve vzniku, v anatomii, vývoji i genetickém naprogramování (Ann et al, 1997). Symbiotickým partnerem je bakterie rodu Rhizobium a jí podobné, a touto symbiózou se bude tato práce zejména zabývat. Jiný typ hlízkové symbiózy se uplatňuje u osmi dřevinných skupin z řádů Fagales, Cucurbitales a Rosales, s půdní, aerobní aktinobakterií rodu Frankia (Pawlowski & Demchenko, 2012), nacházející se v buňkách primární kůry hlízky v podobě hyf či vezikulů. Tyto bakteriální struktury jsou obaleny rostlinnou membránou (Huss-Danell & Bergman, 1990). Takto vzniklé hlízky jsou, při pohledu na jejich morfologii a vývoj, modifikované boční kořeny (Ann et al., 1997). Bakterie a sinice, schopné vázat dusík, a mykorhizní houby žijí volně v půdě či ve vodě. Tyto bakterie umožňují svým hostitelům osídlit, coby pionýrské rostliny, stanoviště chudá na živiny, jako odpad z důlní těžby, písečné duny či půdní sesuvy (Sen & Misra, 2012). Těchto organismů je hojně využíváno v zemědělství pro zlepšování výnosů či zkvalitňování půdy. Například vodní kapradina Azolla, žijící v symbióze se sinicí, je pěstována na polích společně s rýží. Pole je tím obohacováno o dusík, což umožňuje pěstování rýže stále na stejném místě. Stejně tak jetel se vysívá na pole pro zvýšení obsahu dusíku. Studium bočních kořenových orgánů je aktuální tématikou, umožňující nahlédnout do regulačních mechanismů, uplatňujících se v těchto interakcích, a pokusit se je využít pro zvýšení úrody, obnovu přírodních porostů či ochranu ohrožených druhů.
7
2. Postranní kořeny Meristém primárního kořene má u Arabidopsis thaliana, podobně jako u ostatních rostlin, základ již v embryu (Malamy & Benfey, 1997). Na rozdíl od stonkového meristému však tento standardně neprodukuje postranní orgány, pouze pletiva vlastního kořene. Boční kořeny se tvoří z pericyklu, vrstvy buněk obklopujících střední válec, po jejich stimulaci k dělení. Primordium bočního kořene poté prorůstá tkáněmi mateřského, formuje vlastní meristém a jako zcela funkční kořen může dát vznik dalším bočním kořenům vyšších řádů (Benková & Bielach, 2010). Postranní kořeny tedy vznikají u Arabidopsis. thaliana postembryonálně, akropetálně a nezávisle na apikálním meristému v prodlužující a diferenciační zóně kořene (Dubrovsky et al., 2000). U některých jednoděložných a většiny dvouděložných rostlin, včetně A. thaliana, buňky pericyklu, aktivované pro dělení a tvorbu postranního kořene, přiléhají ke xylémovým pólům kořene. Známe mnoho rozdílů mezi buňkami pericyklu u xylémových a floémových oblastí, ale přesný důvod této lokalizace vzniku postranních kořenů není dosud znám (Benková & Bielach 2010). Buňky u xylémových oblastí mají větší meristematický potenciál zřejmě díky hustší cytoplazmě a své robustnosti (Parizot et al., 2008). Především u jednoděložných, například u kukuřice (Zea mays) však dochází k přerušení pericyklu v oblastech přilehlých ke xylému, proto k iniciaci větvení kořene dochází v oblasti pericyklu u floému. V těchto buňkách je vytvořeno lokální auxinové maximum, vedoucí k iniciaci dělení pericyklu a vedoucí k tvorbě postranního kořene (Jansen et al., 2012). Pro zahájení tvorby bočního kořene, i pro jeho následný vývoj, je nezbytná přítomnost auxinu (Dubrovsky, 2008 24 /id), což je evolučně zachovaný mechanismus iniciace tvorby bočního kořene (Jansen et al., 2012).
i) Od páru buněk pericyklu k primordiu Pericykl dává, spolu s jinými pletivy kořene, vznik kambiu, felogenu a postranním kořenovým orgánům. Je tvořen apikálním meristémem kořene a u určitých rostlin, včetně Arabidopsis, jeho buňky pokračují v buněčném cyklu ještě v prodlužující a diferenciační zóně kořene (Dubrovsky et al., 2000). Dělení pericyklu, následované tvorbou primordia laterálního kořene, probíhá u většiny rostlin postembryonálně. Vyjímkou je například okurka setá, Cucumis sativum, z čeledi tykvovitých, a některé další rostliny z čeledí áronovitých či modráskovitých, u nichž se primordia bočních kořenů zakládají již v apikálním meristému primárního kořene, a u kapraďorostů je jejich vznik vázán na buňky a brzké deriváty meristému (Dubrovsky et al., 2000). K iniciaci dělení pericyklu u Arabidopsis dochází v oscilační zóně kořene, mezi meristémem a prodlužující části kořene, kde dochází k pravidelné oscilaci aktivity genové exprese. Klíčovým krokem iniciace je určení několika málo zakladatelských buněk (Founder cells), jejichž chování se liší od ostatních buněk pericyklu (Dubrovsky et al., 2001) a účastní se zakládání primordia kořene. Tato specifikace zakladatelských buněk je řízena auxinem (Dubrovsky, 2008 24 /id). Akumulace auxinu v konkrétních pericyklových buňkách vyvolá jejich asymetrické dělení. Takto vznikají dva typy buněk: krátké zakladatelské buňky, podléhající následně dalšímu koordinovanému dělení, a delší buňky, 8
přiléhající k zakladatelským, se schopností antiklinálního dělení (Benková & Bielach, 2010). Zakladatelskou buňkou u Arabiodopsis může být kterákoliv buňka pericyklu v oblasti xylému, nicméně stávají se jimi jen dvě vybrané buňky, určené akumulací auxinu. Mitotická aktivita je, po prvním asymetrickém dělení, aktivována i u přilehlých buněk pericyklu (Casimiro et al., 2003), neboť minimální počet buněk pro vytvoření LRP u Arabidopsis jsou 3 (Dubrovsky et al., 2000). Inhibice auxinového transportu při určování zakladatelských buněk, např. pomocí N-1-naftylftalamové kyseliny (NFK), vede k zadržování pericyklových buněk v G1 fázi buněčného cyklu. Přidání auxinu buňkám umožní přechod do S fáze, aktivují se geny pro cykliny typu D nutné pro G1 – S přechod a komplexy cyklin-dependentních kináz, čímž se aktivuje buněčný cyklus a umožní se tím vznik postranního kořene (Stals & Inzé, 2001). Aktivované zakladatelské buňky podstupují sérii symetrických a Obrázek 2: Fáze vývoje primordia bočního kořene u Arabidospis thaliana. I-zakladatelské buňky, lemované delšími buňkami; IIperiklinální dělení, oddělující vnější a vnitřní vrstvu primordia, pokračující až do fáze IV, kde je primordium čtyřvrstevné; V-vyšší aktivita antiklinálního dělení umožňuje primordiu průnik kořenem; VI-ve středu primordia jsou patrné protáhlé buňky prokambia; VIIcharakteristická struktura primordia 8x8x8 buněk; VIII-průnik primordia kořenem. Eendodermis, C-primární kůra, EP-epidermis. Podle Casimiro et al., 2003
asymetrických dělení, vedoucí k vytvoření primordia bočního kořene. Autoři Malamy a Benfey rozdělili tyto události, vedoucí k vytvoření primordia, na 8 fází, jak ukazuje obrázek 2 (Malamy & Benfey, 1997). U Arabidopsis se postranní kořeny zakládají akropetálně, po 13 až 16 hodinách od opuštění apikálního meristému pericyklem, ve vzdálenosti 3 až 8 mm od kořenového vrcholu (Dubrovsky et al., 2000) Inhibice cyklin-dependentních kináz, zapojených v buněčném cyklu pericyklových buněk Arabidopsis, je patrná v pericyklových buňkách kořene semenáčku díky zvýšené expresi genu KRP2. Se zvětšující se vzdáleností od špičky kořene se, díky auxinu,
snižuje exprese KRP2, a část buněk pericyklu, v nichž akumulace auxinu inhibuje expresi KRP2, může přejít z G1 do S fáze. V buňkách pericyklu, jež se nebudou účastnit větvení kořene, se exprese KRP2 opět aktivuje a je v nich utlumen signál auxinu (Himanen et al, 2002). Auxin je pro vývoj primordia nezbytný až do zformování funkčního meristému (Laskowski et al., 1995).
ii) Transport auxinu Hlavním místem syntézy auxinu jsou listová primordia stonkového apikálního meristému, odkud je auxin veden akropetálním transportem centrálním válcem do špičky kořene (syntéza auxinu probíhá i zde, ale v menší míře). Zde je auxinový tok otočen, přerozdělen a bazipetálně pokračuje kořenem vzhůru. Oba typy auxinového transportu mají vliv na formování LRs (akropetální na vývoj, bazipetální na získání 9
identity zakladatelských buněk pericyklu) (De Smet et al., 2007). Vtok auxinu do buňky zajišťují AUX1, aktivně transportující disociovaný auxinový anion do buňky, symportem se dvěma vodíkovými kationty, a LAX (Like AUX1) proteiny. Výtok auxinu z buňky je zajištěn PIN proteiny, jejichž exprese je, stejně jako exprese LAX3 (Swarup et al., 2008) pozitivně regulována auxinem samým (Casimiro et al., 2001). U kořenů, jimž chybí AUX1 přenašeč, nedochází k akumulaci auxinu v kořenové špičce (nedochází k transportu auxinu do buněk cévních svazků, jimiž probíhá akropetální transport) (Swarup et al., 2001), což vede k nižší produkci bočních kořenů. Proteiny LAX3 jsou zodpovědné za tvorbu enzymů, napomáhajících změnám ve struktuře buněčné stěny, což umožňuje primordiu kořene snáze pronikat pletivy rodičovského kořene (viz Obrázek 3) (Swarup et al., 2008).
Obrázek 3: Role LAX3 proteinů při pronikání bočních kořenů tkáněmi mateřského kořene Arabidopsis thaliana: a) Auxin (IAA) z dělících se buněk pericyklu indukuje, degradací represoru v buňce endodermis, syntézu enzymů pro narušení buněčné stěny (CWR); b) zvýšení koncentrace auxinu v buňce endodermis (End)vede, přes degradaci SLR/IAA14, k syntéze vtokových přenašečů auxinu LAX3 v sousední korové buňce(C) (c); d) auxin indukuje syntézu LAX3 (a následné narušení buněčné stěny) i v pokožkové buňce (Epi), po jejím dosažení primordiem. Hladina auxinu je znázorněna modře. Převzato od Swarup et al., 2008.
V případě lax3 mutantu Arabidopsis thaliana se snižuje počet LRs (Fukaki & Tasaka, 2009). AXR4, jehož mutace se fenotypově jeví jako mutace AUX1, ovlivňuje transport auxinu prostřednictvím vlivu na lokalizaci proteinu AUX1, který se u mutanta vyskytuje v membráně endoplasmatického retikula (Fukaki & Tasaka, 2009). Při nefunkčnosti genu pro auxinový tok zprostředkovaný PIN proteiny, např. GNOM, spolu s MIZ1 a 2, je u Arabidopsis inhibován polární tok auxinu, což způsobuje defektní dělení buněk pericyklu a produkci abnormálních, agravitropických a hydrotropických, či žádných primordií bočních kořenů (Miyazawa et al., 2009; Moriwaki et al., 2011). Auxinové transportní proteiny jsou do membrány i z ní přenášeny dynamickým, cyklickým vezikulárním transportem, a zvýšená koncentrace auxinu v buňce inhibuje endocytózu těchto proteinů, čímž zvyšuje jejich množství v membráně a tím i transport auxinu směrem ven z buňky (Tomasz Paciorek, 2005).Tímto auxinovým transportem na dlouhé i krátké vzdálenosti je ovlivňováno mnoho vývojových procesů, dochází k polarizaci rostliny, a k lokální akumulaci auxinu, jež vede i k organogenezi LRs (Vieten et al., 2005).
10
iii) Lokalizace postranních kořenů Rozložení bočních kořenů koreluje s reakcí primárního kořene na gravitaci, s ohybem. Gravitropická odpověď závisí na auxinovém přenašeči AUX1 i PIN. Rostlina na gravitaci reaguje přerozdělením bazipetálního transportu auxinu, mění se lokalizace PIN proteinů v membráně buněk protoxylému, což ovlivňuje akumulaci auxinu. Na spodní straně špičky kořene je proud auxinu silnější, dochází zde k jeho zadržování a, protože citlivost na auxin se v kořeni a stonku liší, je růst buněk na spodní straně kořene inhibován. Na opačné, horní straně je proud auxinu slabší, stimuluje dlouživý růst buněk a dochází k ohybu kořene směrem dolů (Benková & Bielach, 2010). Při tomto zakřivení v diferenciační zóně kořene dojde na vypouklé (konvexní) straně kořene k deformaci pletiva vlivem jeho natažení. Toto poškození vede ke zvýšení hladiny auxinu pomocí proteinů PIN a AUX1, zejména v buňkách pericyklu, což vede k určení zakladatelských buněk a k zahájení tvorby primordia bočního kořene (Laskowski et al., 2008). Stejný efekt na lokalizaci větvení kořene má i jeho manuální ohnutí, postranní kořen se vytvoří na vnější straně ohybu. Kořeny Arabidopsis thaliana, ohýbané gravitací, vykazovaly u rostlin pěstovaných na agarových plotnách střídavé rozmístění LRs vpravo-vlevo, u mechanicky ohýbaných byl vznik vázán vždy na vnější stranu ohybu (Ditengou et al., 2008). V bazálním meristému kořene, nacházejícím se pod apikálním, dochází k pravidelným lokálním oscilacím auxinu. Nejvyšší hladina auxinu odpovídá zahájení vzniku laterálního kořene, u Arabipospis vždy mezi meristémem a prodlužovací zónou kořene. U Arabidopsis je tento interval asi 15 hodin (De Smet et al., 2007). Frekvence a vzdálenost mezi vznikajícími kořeny této modelové rostliny odráží měnící se environmentální faktory, není konstantní. Při iniciaci vzniku primordia postranního kořene je klíčový přísun auxinu z kořenového apikálního meristému, v pozdějších stádiích vývoje je pak auxin přiváděn bazipetálním transportem z nadzemní části rostliny. Vztah mezi vyvíjejícími se primordiem a rostoucími bočními kořeny je konkurenční, jedná se o zpětnou vazbu, kdy již rostoucí LR může inhibovat vznik LRP (Lucas et al., 2008).
iv) Regulace vývoje postranních kořenů
(1) Regulace fytohormony Fytohormony jsou nízkomolekulární látky, ovlivňující pleiotropicky fyziologii rostliny i při velmi malých koncentracích jako endogenní, rostlinou syntetizované signalizační molekuly. Jako pro mnoho pochodů v rostlině, i pro vznik a vývoj laterálních kořenů, jsou fytohormony nezbytné, a to pro jejich pozitivní i negativní regulaci (Fukaki & Tasaka, 2009). Environmentální podmínky, jako dostupnost zdrojů či stres, nutí rostlinu dynamicky se přizpůsobovat okolnímu prostředí, což se děje mnoha způsoby, mezi nimiž i
11
pomocí fytohormonů. Interakce mezi jednotlivými hormony však nejsou zcela známé (Fukaki & Tasaka, 2009). (a) Auxin Auxin je nejvýznamnější fytohormon pro vznik i vývoj postranních kořenů, stimuluje buněčné dloužení a vyskytuje se v několika formách. Je nezbytný pro aktivaci buněčného cyklu buněk pericyklu (Fukaki et al., 2007). Signalizační dráha, spouštěná při odpovědi na auxin, zahrnuje auxinový receptor TIR1, faktory zprostředkovávající odpověď na auxin (ARF), dále pak proteiny fungující jako represory transkripce těchto faktorů (AUX/IAA), a komplex ubiqitinové ligázy SCFTIR1 s proteolytickou funkcí (proteasom 26S). Tato ligáza interaguje prostřednictvím auxinu s represorickými proteiny AUX/IAA za jejich ubiqitinace a následné degradace, čímž jsou aktivovány, spouštěče vlatní odpovědi na auxin. Interakce mezi proteiny AUX/IAA a SCFTIR1 je zprostředkována specifickou doménou proteinu. U auxinrezistentních mutantů je tato doména narušená, nedochází k vazbě s ligázou a k následné odpovědi na auxin. Celkově tedy vysoká koncentrace auxinu tedy uvolňuje z represe faktory, zajišťující odpověď na auxin (Kepinski & Leyser, 2005). U mutanta Arabidopsis solitary root 1 (slr1) je narušena tato auxinová signalizace, což vede k blokaci formování LRs, díky mutaci v doméně AUX/IAA proteinů (konkrétně IAA14), čímž je inaktivována funkce ARF a spolu s ní i LR iniciace. Tato blokace je vázána na remodelaci chromatinu. U slr1 mutantů je narušen buněčný cyklus pericyklových buněk, což je způsobeno právě defektní auxinovou signalizací. Při správné funkci faktorů pro odpověď na auxin dochází k přenosu signálu auxinové odpovědi na jaderné proteiny LBD/ASL rodiny, což u jednoděložných rostlin vyvolává formování nejen laterálních, ale i adventivních kořenů (Liu et al., 2005). Přidáním cyklinů D-typu se buněčný cyklus obnoví, nevede však k tvorbě LRs díky blokaci antiklinálního dělení (Vanneste et al., 2005). Tento mutant má jen primární kořen, bez náznaků kořenů laterálních, a je defektní i ve formování kořenových vlásků a v odpovědi na gravitaci. Proto je protein SLR/IAA14 důležitým kontrolním bodem při vzniku bočních kořenů (Fukaki et al., 2002). (b) Cytokininy Cytokininy se obecně vyznačují schopností vyvolávat dělení buněk, díky regulaci aktivace genu pro cyklin typu D. Hlavní místo jejich syntézy je právě apikální meristém kořene, odkud jsou dále transportovány bazipetálně xylémem. V určitých ohledech mohou působit antagonisticky k auxinu. Cytokininy negativně ovlivňují organogenezi postranních kořenů. Mutant Arabidopsis thaliana s poruchou regulátorů odpovědi na cytokininy typu B vykazoval zvýšení počtu LRs, prodloužení kořenů a indukci tvorby kalusu (Mason et al., 2005). Však mutace v regulátorech odpovědi na cytokininy typu A (v 6-ti z nich), zajišťujících negativní regulaci signalizace cytokininů, vede ke snížení počtu bočních kořenů. Zkrácení kořenů tohoto mutanta je patrné i při pěstování bez přítomnosti cytokininů, a v jejich přítomnosti 12
je kořen k jejich účinku citlivější (To et al., 2004). Cytokininy blokují přechod G2 – M u buněk pericyklu, a naopak stimulují G1 – S přechod, čímž podporují prodlužování již vyvíjejících se postranních kořenů. Tuto cytokininovou blokaci buněčného cyklu, a s tím spojenou blokaci iniciace vývoje postranních kořenů u Arabidopsis, nezruší vnější přidání auxinu (závisí to na koncentraci cytokininu a auxinu, od určitého poměru auxinová stimulace překoná cytokininovou represi vývoje LRs) (Li et al., 2006), ale přidání auxinu inhibuje syntézu cytokininů, což svědčí o rozdílných signalizačních drahách auxinů a cytokininů, jež se však mohou metabolicky ovlivňovat (Nordström et al., 2004). Cytokininy inhibují expresi proteinů PIN v buňkách pericyklu, díky čemuž neumožní vytvoření auxinového gradientu a správný vývoj postranních kořenů (Laplaze et al., 2007). (c) Kyselina abscisová Abscisová kyselina je především stresový hormon, vyskytující se téměř ve všech buňkách. Primordium postranního kořene je touto látkou inhibováno ve vývoji ještě před aktivací svého meristému, a má specifickou strukturu pre-aktivovaného primordia (Casimiro et al., 2003). Tento hormon se uplatňuje zejména při stresu z nedostatku vody, kdy řídí zavírání průduchů a stimuluje prodlužování primárního kořene, a při výživovém stresu, například z dusičnanů (Smith et al., 2012). Exogenní přidání abscisové kyseliny inhibovalo pronikání vyvíjejícího se postranního kořene pletivy kořene mateřského. Přidání auxinu tuto blokaci u Arabidopsis nezvrátí, což svědčí o existenci kontrolního bodu, ovlivňovaného abscesovou kyselinou, nikoliv však auxinem (Fukaki & Tasaka, 2009). (d) Etylén Regulace etylénem je spjata s auxinem, konkrétně s jeho polárním transportem, který etylen zvyšuje. Etylén, či jeho prekurzor, kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová (ACC), mění aktivitu AUX1 a stimulují expresi PIN3 a PIN7, což zabraňuje akumulaci auxinu v buňkách kořene (Smith & De Smet, 2012). Rostliny Arabidopsis s mutací v transportních proteinech auxinu, jako aux1, pin3, pin3 či lax3, jsou méně citlivé na stimulaci auxinového transportu pomocí ACC, ale mutanty pin2 a abcb19 vykazují standardní fenotypy odpovědi na ACC. ACC zvyšuje expresi auxinem indukovaných genů v kořenové špičce, ale snižuje jejich expresi v místech utváření postranních kořenů. ACC tedy pozitivně modifikuje transport auxinu stimulací AUX1, PIN3 a PIN7 transportních proteinů, akropetální i bazipetální, což ale neplatí pro etylén-nesenzitivní mutanty (Lewis et al., 2011). Vysoká hladina ACC zabraňuje tvorbě postranních kořenů, ale podporuje růst kořenů již vytvořených, proniklých na povrch. Současná aplikace auxinu a ACC nezabraňuje vývoji již se dělících pericyklových buněk, budoucích primordií, ale k nové iniciaci již nedojde (Ivanchenko et al., 2008). Interakce etylénu je pozorovatelná i s kyselinou abscisovou. Při stresu, například z deficitu vody, dochází k nadměrné produkci etylenu, je postižen růst primárních kořenů a zvyšuje se množství reaktivních forem kyslíku v prodlužovací zóně kořene. Naopak inhibice produkce etylénu, za přítomnosti abscisové 13
kyseliny, zabraňuje zvýšení hladiny reaktivních forem kyslíku a obnovuje růst kořenů, což svědčí o opačném působení etylénu a ABA (Sharp, 2011). (e)
Brasinosteroidy
Tyto látky podporují dlouživý růst buněk, jejich účinky jsou podobné jako u auxinu (Smith & De Smet, 2012). Stimulují diferenciaci svazků vodivých pletiv, syntézu celulózy, prodlužování kořenových vlásků a vývoj kořenového systému díky stimulaci tvorby postranních kořenů. Brasinosteroidy stimulují akropetální auxinový transport. Mechanismus této stimulace je však zatím nejasný (Smith & De Smet, 2012). Současné působení brasinosteroidů a auxinu urychluje větvení kořene, a nízká koncentrace tohoto hormonu stimuluje prodlužování kořenů nezávisle na auxinu. Cytokininy působí proti brasinosteroidům díky expresi PIN proteinů, které zabraňují akumulaci auxinu (Fukaki & Tasaka, 2009). (f)
Gibereliny
Podporují dělení a růst buněk stonku, jejich funkce ve větvení kořene není jasná. Odpověď kořene na gibereliny je u Arabidopsis regulována auxinem, a ovlivňuje růst primárního kořene (Fu & Harberd, 2003). U rostlin hrachu byl prokázán pozitivní efekt giberelinů na počet LRs a hlízek (Ferguson et al., 2005), což ale nemusí být zcela prokazatelné, neboť u většiny druhů se hlízky, na rozdíl od LRs, zakládají v kortexu, ale u hrachu a několika dalších se hlízky zakládají v pericyklu. (g)
Ostatní
Strigolaktony, vycházející z karotenoidů, stimulují větvení stonku a inhibují větvení kořene díky inhibici bazipetálního auxinového transportu, a prodlužují kořenové vlásky (Kapulnik et al., 2011). Jsou také zapojeny v interakcích parazitických rostlin a při arbuskulární mykorhize. Strigolaktony nejspíše ovlivňují i morfogenezi kořene. Rostliny necitlivé na tyto hormony vykazují redukovaný růst primárního kořene a nárůst větvení kořene. Jejich aktivita zřejmě působí změny v auxinovém transportu, pravděpodobně strigolaktony regulují vezikulární transport PIN proteinů (Smith & De Smet, 2012). I jiné látky fytohormonální povahy ovlivňují růst a vývoj rostlin, zejména ve stresových a obranných mechanismech, jako jasmonáty spolu se systeminem, polyaminy, kyselina salicylová či oligosachariny. Hlavním fytohormonem, regulujícím produkci bočních kořenů, je auxin. Ale i ovlivnění ostatními fytohormony, pozitivní či negativní, zasahuje do různých fází vývoje LRs a udržuje rovnováhu rostliny. Hormony vzájemně interagují, ovlivňují vzájemně svou syntézu, signalizaci či transport, a absence či chyba v této síti je zpravidla patrná na fenotypu rostliny. Fytohormony také obstarávají reakci na podmínky vnějšího prostředí.
14
(2) Environmentální ovlivnění kořene Postranní kořeny vybočují z osy kořene hlavního, a kořenové vlásky usnadňují vstřebávání rozpustných látek, čímž si rostliny, alespoň do jisté míry, kompenzují nemožnost mobility. Nutrientní zóny, místa v substrátu s vyšším množstvím živin, podněcují vznik postranních kořenů. Jak konkrétně fungují a jakou mají podobu receptory pro vnímání množství živin v okolním substrátu a jaké jsou mechanismy odpovědi, je zatím v mnoha případech otázkou bádání (Beeckman & Friml, 2010). Odpověď kořenové architektury na množství živin může být upravována mimo jiné i pomocí fytohormonů, zejména pak auxinu, cytokininů, etylenu či ABA (López-Bucio et al., 2003). Ovlivnění růstu kořene environmentálními faktory, jako je dostupnost vody a živin, vlastnosti půdy, teplota či interakce s jinými organismy, je komplexní proces (Smith & De Smet, 2012). Je několik prvků, jejichž dostupnost v půdě není rovnoměrná a reguluje množství a vývoj bočních kořenů, zejména dusík a fosfor. (a) Dusík Esenciální prvek pro rostlinu, čtvrtý nejčastější prvek biosféry, vyskytuje se hojně v organických i anorganických sloučeninách, však pro rostlinu je však dostupný pouze ve formě určitých anorganických iontů (dusičnanový anion, amonný kation), coby produkt rozkladu jiných organizmů, nebo v aminokyselinách. Studium dusičnanů je klíčové i pro zemědělství. Nízká hladina dusičnanů v půdě stimuluje vývoj postranních kořenů, což zvětšuje kořenovou plochu pro jejich snazší získávání. Však při rovnoměrném a vysokém množství dusičnanů v půdě dochází naopak k inhibici jejich prodlužování. Podle studie mutantů Arabidopsis, pěstovaných v nízkých a vysokých koncentracích dusičnanů byl protein podobný chitináze (chitinase-like1, CTL1) identifikován jako transdukční signál pro zprostředkování vlivu koncentrace dusičnanů na vývoj kořenového systému. Studie genů, zapojených v této nutričně-závislé regulaci, se snaží převést tyto poznatky z Arabidopsis na pěstované plodiny (Hermans, 2012). Studium Arabidopsis odhalilo tři různé mechanismy působení dusičnanů na regulaci vývoje kořenové architektury (Casimiro et al., 2003). U rostlin, pěstovaných v substrátu s nízkou hladinou dusičnanů, dochází k lokální stimulaci tvorby postranních kořenů. Rostliny, pěstované v přiměřeném množství dusičnanů, Obrázek 4: Srovnání vývoje kořenového systému geneticky neupravené Arabidopsis a lin1 mutantu. Podle Malamy a Ryan, 2001.
vykazovaly inhibici větvení kořene po přidání NO3-. Třetím typem odpovědi na dusičnany je, při vysokém poměru sacharózy k dusičnanům,
represe vývoje bočních kořenů, způsobená překážkou v auxinovém transportu z prýtu do kořene. Tím 15
dochází k delokalizaci auxinu, což bylo dokázáno díky lin1 mutantu (lateral root iniciation), který v těchto, pro geneticky neovlivněnou rostlinu represivních, podmínkách, vykazoval fenotyp dobře se větvícího kořenového systému (Casimiro et al., 2003). Auxin se z nadzemní části rostliny nedostal do kořene a docházelo k jeho akumulaci v hypokotylu. Exogenní dodání auxinu obnovilo formování postranních kořenů u většiny mutantů této modelové rostliny (výjimku tvoří mutanti nesenzitivní k auxinu, například slr, kteří na exogenní auxin reagují minimálně, nebo vůbec). Mutant lin1 je schopen v reakci na auxin zvýšit počet LRs, ale nemají na něj vliv nepříznivé podmínky poměru C:N (Malamy & Ryan, 2001). Ze zkoumání lin1 také plyne, že je jen málo genů, jež samy o sobě odpovídají za větvení kořenů, ale spoustu genů, jež mohou v závislosti na vnějších podmínkách ovlivnit jejich signální dráhy (Casimiro et al., 2003). Půdy s lokálně zvýšeným množstvím dusičnanů vyvolají prodlužování buněk tvořících se primordií, což rostlině umožňuje rozpínat se do šířky v důsledku dusičnanové signalizace. Ta vyžaduje expresi genu pro NITRATE TRANSPORTER1 (NRT1.1), nutného též pro příjem dusičnanů, a ztráta funkce tohoto proteinu vylučuje kolonizaci území chudého na půdní dusičnany. NRT1.1 také modifikuje auxinový transport, čímž při nízké koncentraci dusičnanů stimuluje tvorbu postranních kořenů. Antagonista NRT1.1 stimuluje větvení kořene jen za vysokých koncentrací NO3- (Krouk et al., 2010). NRT1.1 je u Arabidopsis lokalizován na antiklinálních membránách epidermis primordiální špičky, a pomocí odpovědi na dusičnany usměrňuje tok auxinu – v případě nízké hladiny dusičnanů podporuje bazipetální transport auxinu, akumulovaného v kořenové špičce, nutného pro iniciaci tvorby postranních kořenů. Naproti tomu mutant nrt1.1 udržuje akumulovaný auxin ve špičce, čímž inhibuje větvení kořene i při nízké koncentraci dusičnanů (Hermans, 2012). Dusičnany indukovaný specifický gen je klíčový pro vývoj kořenů Arabidopsis. V případě potlačení jeho exprese se mění citlivost na vysokou hladinu NO3-, a jí indukovaný efekt už není stimulační, nýbrž inhibiční, jako u geneticky neupravených rostlin (Zhang & Forde, 1998). Při inhibici vysokou koncentrací dusičnanů se uplatňuje i kyselina abscisová, mutanti, necitliví k tomuto hormonu, jsou méně citliví na inhibici vývoje LRs dusičnany (De Smet et al., 2003). Amonný kation stimuluje větvení kořenů, jejich následné prodloužení obstarávají hlavně dusičnany (Lima et al., 2010). Prodlužování primárního kořene Arabidopsis nevykazuje změny v reakci na hladinu dusičnanů v půdě. Však u kukuřice (Zea mays) byla zaznamenána stimulace prodlužování kořene při středně vysoké hladině dusičnanů (Smith & De Smet, 2012). Dusík tedy může mít negativní i pozitivní vliv na regulaci formování LRs. Dusičnany slouží jako tvůrci signálu, i vlastní signální molekuly. Jejich působení ovlivňuje činnost jiných fytohormonů, zejména auxinu.
16
(b) Fosfor Fosfor je rostlinou přijímán v podobě anorganického fosfátu H2PO4-, který je ve vodě dobře rozpustný, ale je vázaný na půdní částice přes železo či hliník. Koncentrace využitelného fosforu v půdě je tedy velmi nízká, v buňce rhizodermis je o tři řády vyšší, což svědčí o nutnosti jeho aktivního transportu do buněk přenašečem, jež je zpětně regulován množstvím fosforu v buňce. Míra mobility fosforu v půdě je nízká, rostliny si proto k fosforu dopomáhají endomykorhizou (Smith & De Smet, 2012). Fosfor je klíčový pro strukturální biomolekuly, jako nukleové kyseliny, fosfolipidy, a ovlivňuje metabolismus uhlíku (Ticconi, 2006). Nedostatek fosforu způsobuje tvorbu a růst kořenových vlásků, které jsou řízeny cestou nezávislou na fytohormonech, kde fosfát, coby signální molekula, přímo ovlivňuje expresi genů pro tvorbu kořenových vlásků, což bylo u Arabidopsis dokázáno studií mutantů (Ticconi, 2006 73 /id). Kořeny, pěstované na substrátu s nízkým množstvím fosfátu, exprimovaly geny pro přenašeče fosfátu (Pi), na úkor aktivity meristému. Při nízkých koncentracích Pi tedy dochází k inhibici růstu primárního kořene vlivem změny transportu auxinu, a dochází ke zvýšení tvorby postranních kořenů, u některých druhů až třetího řádu. Dochází ke stimulaci větvení kořene cytokininy, které potlačují expresi genů pro regulaci nízké hladiny Pi. Rostliny pěstované na médiu s vyšší koncentrací Pi vykazovaly vysokou, auxinem podporovanou meristematickou aktivitu a nízkou expresi fosfátových přenašečů. (López-Bucio et al., 2003). U mutanta, přecitlivělého na nedostatek Pi, dochází k inhibici buněčného dělení, mající za následek ztrátu funkce primárního kořenového meristému a smrt buněk. Meristémy kořenů vyšších řádů fungují normálně, což svědčí o existenci spínače, monitorujícího koncentraci Pi (Ticconi, 2006). (c) Síra Rostliny síru přijímají jako ion SO42-, příjem je aktivní symportem se 3 H+. Je zapotřebí k syntéze cysteinu, a účastní se odpovědi na stres. Síra nepůsobí přímo jako faktor, nutný pro přežití rostliny. Při nedostatku síry rostlina produkuje delší kořeny s velkým množstvím kořenů postranních, a to na úkor růstu nadzemní části rostliny. Alexandra Kutz s kolegy uvádí, že deficience síry u Arabidopsis zvyšuje syntézu auxinu, jež vede k rozrůstaní kořenového systému, za účelem dosažení nového ložiska síry (síranového aniontu) (Kutz et al., 2002). (d) Železo Železo patří mezi mikrobiogenní prvky, v půdě se vyskytuje v hydroxidech v oxidačním čísle Fe3+. Rostliny vylučují do půdy H+ ionty, jimiž okolní půdu okyselují, a organické kyseliny coby chelátory, na něž se železo naváže a je dopraveno do buněk (Pavlová, 2005). Horizontálně lokalizované zdroje železa v nehomogenním agarovém substrátu Arabidopsis vedlo ke zdvojnásobení délky laterálních kořenů, ne však ke změně jejich počtu. U mutanta, neschopného přijímat železo, byl silně inhibován vývoj postranních kořenů, ale umělá aplikace železa tuto inhibici prolomila, za spuštění jejich prodlužování. Tato schopnost železa prodlužovat boční kořeny a napomáhat pronikání primordií rodičovským kořenem 17
je závislá na transportu auxinu, protože právě aktivace AUX1 železem ve vrcholech bočních kořenů vede k jejich prodloužení, ale extrémně vysoké lokální dávky železa růst postranních kořenů naopak inhibují. Lokalizovaný zdroj železa stimuluje i hustotu LRs, jejich počet a větvení až do třetích řádů, ale tato stimulace nebyl (Giehl et al., 2012). Sucho obvykle indukuje prodlužování primárního kořene na úkor jeho větvení. Rostliny se na sucho mohou adaptovat. Například čirok (Sorghum) v podmínkách sucha inhibuje kořenové větvení, za tvorby téměř vertikálního kořenového systému. Salinita u Arabidopsis naopak inhibuje prodlužování primárního kořene a stimuluje jeho větvení (Smith & De Smet, 2012). Mnohé reakce na environmentální vlivy, stejně jako reakce na stres, způsobené nedostatkem vody či minerálních prvků, salinitou, teplotou, světlem či patogeny, ovlivňují rostliny prostřednictvím signálních látek, nejčastěji fytohormonů, což má za následek změnu kořenové architektury. Rostliny reagují na podněty dynamicky, intenzitu reakce hlídají mnohé zpětné vazby. Kromě fytohormonů se regulace účastní i jiné typy signalizace, mezi něž lze zahrnout receptor-like kinázy účastnící se peptidové signalizace. Příkladem takovéto kinázy je ARABIDOPSIS CRINKLY 4, exprimující se v dělících se buňkách pericyklu a podílející se tím na iniciaci tvorby postranního kořene. Později ARABIDOPSIS CRINKLY 4 omezuje nadpočetné dělení buněk po zahájení organogeneze. Tato kináza má tudíž duální funkci, a proces, který bude v dané situaci aktivován, určuje mírou autonomity procesu sama buňka (Smith & De Smet, 2012). Vývoj postranních kořenů je ovlivňován i geneticky.
3) Dusík – fixující kořenové hlízky Organismy, schopné pomocí nitrogenázy vázat dusík, mohou vstupovat do symbiózy s rostlinnými partnery. Tímto vznikla hlízková endosymbióza bakterií s rostlinami, v níž dochází k výměně rostlinných asimilátů, zejména pyruvátu, vody a dikarboxylových kyselin za cenný amonný kation NH4+, který je okamžitě asimilován do organických látek, nejčastěji glutaminu. Tato asimilace probíhá, v závislosti na původu amonného kationtu, buď v cytosolu, nebo v plastidech (Kistner & Parniske, 2002). Tato velice efektivní symbióza je však omezena jen na určitou skupinu rostlin, a k nim hostitelsky specifických bakterií. Leghemoglobin, protein obsahující hemovou prostetickou skupinu, obsažený ve vnější membráně bakterie, reguluje její přístup ke kyslíku. Na syntéze molekuly leghemoglobinu se podílí rostlina i bakterie (Pavlová, 2005). Symbióza s jednobuněčnými, dusík fixujícími Gram-negativními bakteriemi, nazývanými souborně Rhizobia, však byla popsána jen u řádu Fabales (bobotvaré), v podskupině Fabaceae (bobovité), v kontextu hlízkové symbiózy častěji uváděné jako Leguminosae (luskoviny), dělící se na 3 podskupiny (Caesalpinioideae, Mimosoideae and Papilionoideae), systém převzat od (Lewis et al., 2005). Tomuto podobná, taktéž hlízková symbióza s Grampozitivními bakteriemi rodu Frankia se nalézá ve třech řádech (Fagales, Cucurbitales a Rosales), hlízky 18
nalézáme převážně u dřevin, například u olše (Alnus spp.), rakytníku (Hippohae) či dryádky (Dryas). Obě tyto symbiózy jsou hostitelsky specifické (Sprent, 2007). i) Vnitřní stavba hlízek Hlízky dělíme, v závislosti na jejich vývoji, na determinované a nedeterminované (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). V obou typech hlízek se ve střední části vyskytují infikované i neinfikované buňky, a až na výjimky je typ hlízky rostlinně specifický. Determinované hlízky se zakládají ve vnějších vrstvách primární kůry. Meristém hlízek tohoto typu se brzy diferencuje a přestává se dělit, což vede k jejich malé velikosti a kulovitému tvaru. Hlízka není strukturně diferenciována, ve srovnání s hlízkou nedeterminovanou, a po dozrání odumírá. Determinované hlízky tvoří například štírovník (Lotus japonicus), z tropických luskovin pak sója (Glycine max) či mungo (Phaseolus aureus). Nedeterminované hlízky mají trvalý meristém, kde se buňky dělí, a v nově vyvíjených pletivech dochází k infekci. Z anatomického pohledu v hlízce najdeme apikální meristém, systém vodivých pletiv, endodermis a na povrchu několik vrstev primární kůry (Markmann, 2009 4 /id). Tento typ hlízek lze rozdělit na 4 vývojové zóny (Vasse et al., 1990). Zóna I, neobsahující bakterie, je zónou meristematickou. Zóna II je infekční zóna, dochází zde k rané diferenciaci buněk. Buňky v této oblasti obsahují velké množství škrobu, a to díky tomu, že hlízka působí jako silný sink v transportu asimilátů. V zóně III probíhá fixace dusíku, a v senescentní, IV. zóně dochází k odumírání bakteriodních i rostlinných buněk. Cévní svazky mohou být periferní, oblopující centrální pletivo kde probíhá fixace dusíku, podobné anatomii stonku, jako u luskovin (Oldroyd & Downie, 2008), nebo centrálně lokalizované, podobné kořenovým, vyskytující se u rostlin s aktinorhizální symbiózou či u Parasponia. Rostliny, vykazující nedeterminovanou nodulaci, jsou třeba Medicago sativa, Medicago truncatula, či Pisum sativum. Tyto hlízky se mohou i větvit (Dudeja et al., 2012). Struktura hlízky je dána hostitelskou rostlinou, fixace dusíku je však kontrolována bakteriálním endosymbiontem (Desbrosses, 2011 38 /id). Na bakterii Rhizobium meliloti byly demonstrovány i typy vývoje bakteroidů (Vasse et al., 1990).
Obrázek 6: Srovnání struktury determinované (vlevo) a nedeterminované hlízky. NC=primární kůra; NE=endodermis; NP=hlízkový parenchym; VB=systém vodivých pletiv; NF, III=oblast fixace dusíku; S=senescentní zóna. Převzato z Wikimedia Commons.
19
První vrstva buněk kořene luskovin, stimulovaná pro dělení při tvorbě symbiotické hlízky, může být jen pericykl, primární kůra (Pisum sativum) či obě vrstvy najednou (Medicago sativo) (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Primordium a vlastní hlízka ale vždy vznikají hlavně z primární kůry. Při mitotické reaktivaci buněk primární kůry dochází k expresi mitotických cyklinů a nodulačních genů (Mylona et al., 1995). Jen určitá část buněk primární kůry je citlivá k iniciaci dělení vlivem Nod faktorů. Tropické luskoviny, jako sója, mají na aktivaci dělení citlivé jen buňky vnější vrstvy primární kůry, z nichž se vyvíjí determinovaná hlízka. Naopak luskoviny mírného pásma jako hrách, štírovník či vikev tvoří hlízky z aktivovaných buněk ve vnitřní vrstvě primární kůry, obvykle nacházející se proti protoxylémovému pólu. Buňky primární kůry před aktivací buněčného cyklu se nachází v G0 či G1 fázi (Vasse et al., 1990). Na tuto aktivaci má klíčový vliv auxin, jehož transport je bakteriemi, resp Nod faktory, lokálně inhibován, což vede k akumulaci auxinu k oblasti primární kůry poblíž místa infekce, a to je také místo vzniku hlízkového primordia u nedeterminovaných hlízek. U determinovaných hlízek (u sóji) nebyla tato role auxinu prokázána. Tato akumulace, spojená s narušením auxinového transportu, byla pozorována u jetele plazivého či u vikve (Mathesius et al., 1998). Bylo dokázáno, že flavonoidy mohou také regulovat tok auxinu v Medicago a tím i jeho lokální akumulace, opětovně obnovit jeho transport a tím zvýšit počet nedeterminovaných nodulů (Mathesius et al., 1998; Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Stejně tak inhibice polárního transportu auxinu pomocí N-(1-naftyl) ftalamové kyseliny, vede k formování pseudonodulů u Medicago, vykazujících determinovaný růst, a to i v přítomnosti využitelného dusíku (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Aktinorhizní hlízky se strukturou a vývojem podobají postranním kořenům (Ann et al., 1997), mají centrální vaskulární systém, infikované buňky se nachází v mohutně se rozrůstající primární kůře. Hlízka je laločnatá, každý lalok se podobá postrannímu kořeni a může být rozdělen na oblast meristému a na tři funkční zóny, infekční, fixační a senescentní (Pawlowski & Demchenko, 2012). U rostliny Datisca glomerata z řádu Cucurbitales bylo prokázáno zvýšení počtu sekundárních plasmodesmat v buňkách primární kůry hlízek, zejména pak v buňkách infikovaných bakteriemi Frankia, ve srovnání s buňkami kořene. Toto zvýšení symplastického transportu, spolu se zvýšenou expresí monosacharidového přenašeče s nízkým optimem pH, pomáhá rostlině díky změnám v turgoru kontrolovat růst infekčních vláken (Schubert et al., 2011). I v luskovinových hlízkách je hlavní transport asimilátů symplastický. Je to zřejmě způsobeno i tím, že v případě hlavního transportu asimilátů apoplastem by měly bakterie v infekčních vláknech neomezený přístup k rostlinným sacharidům bez nutnosti pronikat do buněk hostitelského kořene. Škrob je hromaděn v obou typech hlízek (Schubert et al., 2011). Frankia plynule kolonizuje určitou oblast kořene Datisca glomerata, infikované buňky tvoří kompaktní útvar, na rozdíl od luskovinných hlízek, v nichž se infikované a neinfikované buňky navzájem oblopují (Newcomb & Pankhurst, 1982). Oproti rhizobiálním hlízkám však v aktinorhizních nevzniká mikroaerobní prostředí. U Datisca glomerata byl prokázán vznik lenticel na lalocích hlízky, které umožňují přístup vzduchu do
20
hlízky (Pawlowski, 2012 49 /id). Infikované buňky u Coriaria arborea jsou mnohojaderné a mají, stejně jako infikované buňky kořene luskovin, velkou centrální vakuolu (Newcomb & Pankhurst, 1982).
Obrázek 7: Schematická struktura hlízek. Vlevo aktinorhizní, vprostřed nedeterminovaná a vpravo determinovaná. Černou barvou jsou znázorněna vodivá pletiva. Převzato od Diouf et al., 2004 .
ii) Evoluční vznik hlízek u luskovin Luskoviny se vyvinuly na počátku třetihor. Pokles hladiny CO2 přišel až po éře jejich hlavního vývoje, proto nedisponují C4 fotosyntézou. Díky relativní příbuznosti taxonů, v nichž nacházíme hlízkotvorné (nodulující) druhy se uvažuje o genetické predispozici k nodulaci u společného předka (Sprent, 2007). Byl dokázán společný původ obou typů nodulací, rhizobiální i aktinorhizní, lišící se v partnerských bakteriích, morfogenezi i způsobu infekce. Fakt, že genetické predispozice pro nodulaci byly získány od společného předka, byl prokázán na základě skenování genu rbcL chloroplastů nodulujících skupin rostlin, a tyto rostliny v následné fylogenetické analýze tvořily, spolu s několika skupinami nevykazujícími nodulaci, monofyletický taxon (Soltis et al., 1995). Existuje nejméně sedm genů podmiňujících rhizobiální nodulaci, zejména pak gen pro symbiotickou receptorovou kinázu (SYMRK), která je nutná pro interakci luskovin s bakteriemi rodu Rhizobia i pro aktinorhizu bakterie Frankia se zástupci Fagales, dokonce i pro arbuskulární mykorhizu (Markmann et al., 2008). SYMRK existuje minimálně ve třech, strukturou odlišných variantách, kdy ta nejkratší, vyskytující se například u rajčete či rýže, zprostředkovává právě arbuskulární mykorhizu, ta nejúplnější naopak tvorbu funkčních hlízek. Autoři zde vyslovili hypotézu o evolučním vzniku symbiotických hlízek právě díky změnám v signalizační síti SYMRK arbuskulární mykorhizy. Vznik tohoto mutualistického vztahu rostliny s houbou je časově řazen ještě před přechod rostlin na souš (Markmann et al., 2008). Asi nejpůvodnější příklad intracelulární symbiózy dusík-fixujících bakterií s buňkami kořene hostitelské rostliny nacházíme u Caesalpinioideae, jejichž symbiotické bakterie zůstávají uzavřené v infekčních vláknech (viz níže), sloužících k pronikání hostitelským kořenem k hlízkovému primordiu, ale v případě 21
těchto rostlin jsou infekční vlákna lemována i rostlinnou buněčnou stěnou, probíhá v nich fixace dusíku a jsou nazývány fixačními vlákny (Sprent, 2007), což je pravděpodobně nejstarší forma symbiózy těchto bakterií s rostlinami. U evolučně pokročilejších rostlin již fixace dusíku prokaryontními organismy probíhá ve specializovaném, sekundárně utvářeném membránovém kompartmentu buňky, k jehož utvoření je však potřeba genetického naprogramování u obou partnerů (Markmann & Parniske, 2009).
iii) Nod faktory Kořeny rostlin uvolňují do rhizosféry fenolické látky, jako flavonoidy, betainy či kyselinu aldonovou, a na tyto metabolity reagují v půdě volně žijící, dusík-fixující bakterie. Flavonoidy jsou syntetizovány ve všech rostlinách a mají mnoho funkcí (Winkel-Shirley, 2001). Bylo identifikováno více než 4 000 různých flavonoidů (Dudeja et al., 2012). Bakterie reagují na rostlinnou signalizaci kladnou chemotaxí, zvýšením syntézy auxinu (Mathesius, 2008) a je u nich indukována exprese genů pro produkci nodulačních (Nod) faktorů, konkrétně genů nodABC (Giraud et al., 2007). Rostlinný flavonoid se naváže na bakteriální protein NodD, změní jeho konformaci, a takto aktivovaný protein po svém navázání na promotor nod genů spouští jejich expresi (Dudeja et al., 2012). Pro umožnění této symbiózy byla pro rostliny klíčová schopnost vnímání Nod faktorů, lipochito-oligosacharidů, produktů bakteriálního metabolismu, zahajujících proces nodulace, specifickými receptory. Tyto nodulaci vyvolávající látky jsou bakteriální produkty, které se však v určitých ohledech chovají jako rostlinné hormony (Oldroyd & Downie, 2008). Jejich difuzní signalizace ovlivňuje vývojové procesy v rostlině, a to jak v epidermis kořene, což umožní vstup bakterií Rhizobia do kořene (infekci), tak i v primární kůře kořene, kde dělením buněk vznikne nodulový meristém (Oldroyd & Downie, 2008). U Lotus japonicus, příbuzného s u nás rostoucím štírovníkem růžkatým, je vnímání Nod faktorů zprostředkováno Nod faktorovým receptorem 1 (NFR1) a 5 (NFR5), díky nimž rostlina rozpozná konkrétní kmen bakterií Rhizobia, které se liší právě v chemické struktuře Nod faktorů (Markmann et al., 2008), konkrétně v délce a stupni nasycenosti mastných kyselin a aminokyselinových zbyků (Oldroyd & Downie, 2008). O hostitelské specifitě však nerozhodují jen Nod faktory, nýbrž i lipopolysacharidový povrch bakterie při následném přímém kontaktu s kořenem rostliny. Přímý důkaz pro ovlivnění syntézy těchto bakteriálních exopolysacharidů rostlinnými flavonoidy nemáme, ale po kontaktu bakterie s rostlinnými signálními látkami tropických luskovin, jako sóji, dojde k uvolňování a případné metylaci fragmentů bakteriálních povrchových polysacharidů, které pak slouží jako další faktor při určování hostitelské specifity (Dudeja et al., 2012). Receptor Nod faktorů u Lotusu, NFR5, blokuje kinázovou aktivitu, dokud není fosforylován NFR1, čímž je spuštěna odpověď na Nod faktory. Nod faktory jsou rozpoznávány extracelulární LysM doménou NFR1 a 5, a změna v LysM receptorové doméně působí modifikaci či ztrátu schopnosti vnímání těchto signálních látek. Například dvě molekuly Nod faktoru, lišící se v jednom aminokyselinovém zbytku, jsou specifické každá pro jiný druh Lotusu, a to díky specifitě LysM domény NFR5, vážící jen určitý Nod faktor. Pokud však geny pro receptory Nod faktorů od Lotus japonicus necháme exprimovat v jiných nodulujících rostlinách, například 22
v tolici (Medicago truncatula), rozšíříme tím spektrum bakterií, vyvolávajících u této transgenní tolice úspěšnou rhizobiální infekci a vznik téměř zcela funkční hlízky (Radutoiu et al., 2007). LNP je extracelulární apyrýza, protein vázající Nod faktory za hydrolýzy ATP. Exprese LNP byla prokázána u sóji po naočkování bakteriemi (Oldroyd & Downie, 2008). I u rostlin, netvořících hlízky, nalézáme podobné receptory s LysM doménou, ty však slouží pro detekci přítomnosti hub pomocí chitooligosacharidů, fragmentů jejich buněčné stěny, a vyvolávají obrannou reakci rostliny. Tato obranná signální dráha nenodulujících i nodulujících rostlin je, minimálně v počáteční fázi, společná se signální drahou Nod faktorů, což svědčí o jejich společném evolučním vzniku (Wan et al., 2008). Například, CERK1, receptor chitinu u Arabidopsis, se v intracelulární doméně jen drobně liší od NFR1 (Madsen & Stougaard, 2012). Půdní houba, která je pro rostlinu mykorhizní partner a ne patogen, je rozpoznána taktéž pomocí lipochitin-polysacharidových, hostitelsky specifických signálních látek. U arbuskulární mykorhizy se tyto látky nazývají Myc faktory (Parniske, 2008). Luskoviny mají oddělené receptory pro vnímání Nod faktorů a signálních látek endomykorhizních hub (Radutoiu et al., 2003), i když genetická regulace počátečních fází infekce je společná. U aktinorhizní symbiózy se molekulární signalizace bakterií Frankia liší od té rhizobiální, signální látka je jiná než Nod faktory (Markmann et al., 2008). iv) Infekce – jak proniknout do rostlinné buňky První kontakt rostliny a Rhizobium se uskutečňuje přes rhizodermis, což je také první překážka vstupu bakterií do kořene. K infekci luskovin bakteriemi Rhizobium dochází nejčastěji v epidermálních buňkách s kořenovými vlásky (kořenové vlásky ale nejsou pro infekci nezbytné, k nodulaci dochází i u mutanta Lotus japonicus s defektem tvorby kořenových vlásků) (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Až 25% luskovin je schopno infekce mimo kořenové vlášení a bez infekčních vláken, kde jsou bakterie obklopeny zatím neidentifikovanou matrix (Dudeja et al., 2012). Na povrchu rostlinných buněk se nachází lektiny, které k sobě nespecificky, slabě a vratně váží povrchové exopolysacharidy hlízkových bakterií, čímž se podílí na vzniku endosymbiotického vztahu těchto partnerů. Bakteriemi produkovaný rykadhezin váže, za současného navázání Ca2+ iontu, Rhizobium k povrchu kořenového vlásku. Interakce mezi kořenovými vlásky hrachu (Pisum sativum) a buňkami jemu specifických hlízkových bakterií, je negativně ovlivňována nedostatkem vápenatých iontů (Rodríguez-Navarro et al., 2007). Následně dochází k nevratné syntéze celulózních vláken bakterií za pevného navázání ke kořeni. V buněčných stěnách kořenové pokožky dochází k akumulaci Nod faktorů, je bráněno jejich volnému pronikání kořenem, což napovídá, že do přímého kontaktu s Nod faktory přichází jen pokožka, nikoliv primární kůra (Oldroyd & Downie, 2008). V odpovědi na bakteriální Nod faktory dochází ke změnám v uspořádání cytoskeletu, zejména aktinu (Staiger, 2000 55 /id), k inhibici růstu kořenových vlásků a jejich následné ohýbání kolem bakteriálních buněk (Oldroyd & Downie, 2008). Vlastní ohyb kořenového vlásku je způsoben narušením růstu 23
buněčné stěny (Brewin, 2004). Rhizobium svým dělením tvoří infekční ložiska, kde dochází k akumulaci Nod faktorů a odkud je rostlinou zahájena tvorba specializovaných infekčních vláken. Bakterie vnikají do buňky právě v těchto infekčních vláknech, trubicovitých, větvících se útvarech, vzniklých invaginací plasmatické membrány a buněčné stěny hostitelské buňky, a v nich se Rhizobium dělí, překonávají buněčné bariéry několika vrstev buněk při průniku kořenem až do dělících se buněk primární kůry. Ke vzniku infekčního vlákna dojde jen při kontaktu rostliny s Nod faktory hostitelsky specifického druhu (Oldroyd & Downie, 2008), což je u Medicago truncatula, a jejího endosymbionta z kmene Sinorhizobium meliloti, regulováno receptorovou kinázou LysM typu 3 a 4 (Oldroyd & Downie, 2008). Růst těchto infekčních vláken je orientován pomocí cytoskeletu (Staiger, 2000), a je spojen s procesy buněčného dělení bakterií v lumen infekčního vlákna. Infekční vlákno může pronikat kořenem buď intracelulárně, skrz buňky, nebo intercelulárně mezi buňkami. V tomto druhém případě v rostlině dochází k lignifikaci buněčných stěn buněk přiléhajících k rostoucímu infekčnímu vláknu (Pawlowski & Demchenko, 2012). Po kontaktu bakteriálního glykokalyxu s polysacharidovými komponenty membrány rostlinné buňky dojde k endocytóze buněk endosymbionta (Brewin, 2004). Dochází k nárůstu koncentrace Ca2+ iontů ve špičce kořenových vlásků (Oldroyd & Downie, 2008) a dochází k periodickému zvyšování hladiny vápníku v buňkách pokožky celého kořene. Exprese většiny brzkých nodulačních genů je indukována zejména v zóně vzniku kořenových vlásků, což ukazuje na schopnost buněk kořene vnímat Nod faktorové signály. K mírnějším oscilacím Ca2+ dochází i ve vnější vrstvě buněk primární kůry, kde oscilace také regulují expresi brzkých genů nodulace. Redukce frekvence Ca2+ oscilací, například pomocí jasmonové kyseliny, zpomaluje expresi těchto genů (Miwa et al., 2006). Tato transdukční dráha, od recepce Nod faktorů k oscilaci vápníku a indukci brzkých nodulačních genů, je podmíněna geneticky. Například mutanti dmi u Medicago trunculata ovlivňují oscilaci vápenatých iontů, jakožto i odpověď na Nod faktory. Mutanti dmi1 a dmi2 ve fenotypu zcela blokují vápníkovou signalizaci, ale dmi3 naopak zvyšuje citlivost rostliny na Nod faktory aktivací jejich transdukční dráhy, vedoucí k expresi Ca2+/kalmodulin závislé proteinové kinázy, což se projeví zvýšenou oscilací Ca2+ (Oldroyd et al., 2001). U tolice vojtěšky (Medicago trunculata) byla první exprese brzkého nodulačního genu prokázána 3 až 6 hodin po naočkování bakteriemi Sinorhizobium meliloti, v buňkách s vyvíjejícími se kořenovými vlásky, a to u kořene primárního, i u kořenů postranních. K vlastní infekci došlo o 1 až 2 dny později. Čtyři dny po naočkování bakteriemi byl zkoumaný brzký nodulační gen exprimován v celé centrální části vznikající hlízky. Nejintenzivnější transkripce tohoto genu probíhala před začátkem fixace dusíku. Po 2 až 3 týdnech od naočkování, v již zralé hlízce, exprese brzkého nodulačního genu byla omezena jen na malou oblast hlízky, kde dochází k uvolňování bakterií z infekčních vláken a k jejich následné endocytóze rostlinnými buňkami (Journet et al., 2001). U některých tropických zástupců luskovin, jako u semiaquatické Sesbania rostrata, pěstovaných hydroponicky, je etylénem inhibován vstup bakterií do buňky přes pokožkové buňky. Proto dochází k infekci v místě poškození pokožky, většinou v její trhlině, zaviněné prorůstáním bočního kořene. Tím Azorhizobium caulinodans obejde nutnost pronikání pokožkou, a pronikne infekčním vláknem z trhliny rovnou do buněk primární kůry na bázi vznikajícího 24
bočního kořene. V místě trhliny, kudy bakterie infikují kořen, chybí pokožka, ve které jsou uloženy receptory pro Nod faktory. Proto tato trhlinová bakteriální infekce, vyvolaná tvorbou bočního kořene, není závislá na Nod faktorové signalizaci (Holsters et al., 2004). Takto vzniklé hlízky u Sesbania jsou determinované a mohou vznikat i na prýtu. Hlízky vzniklé na vzduchu vstupem bakterií Azorhizobium caulinodans přes kořenové vlásky jsou nedeterminované (Fernandez-Lopez et al., 1998). Aktinobakterie Frankia, též schopná vázat dusík, vstupující do symbiózy s aktinorhizními rostlinami, může do kořene proniknout intracelulárně pomocí infekčních vláken z ohnutých kořenových vlásků, stejně jako bakterie Rhizobium. Jinou možností je intercelulární průnik, kde lignin v buněčných stěnách nedovoluje vstup infekčních vláken do buňky. Mechanismus vstupu závisí na druhu hostitelské rostliny. Tvorba primordia hlízky je podobná bočnímu kořeni, také je aktivován pericykl.
Obrázek 5: Mechanismus infekce hyfou bakterie Frankia: a) Intracelulární. Po vzájemné signalizaci se začínají dělit buňky vnější vrstvy primární kůry, které jsou vzápětí infikovány. Hyfa dále prorůstá do buněk pericyklu proti xylému, kde indukuje tvorbu primordia hlízky. b) Intercelulární. Hyfa pronikne mezi buňky pokožky a indukuje dělení pericyklu proti xylému. Mezibuněčnými prostory pronikne do vznikajícího hlízkového primordia. {Pawlowski, 2012 49 /id}
v) Vznik hlízky je úzce spjat s infekcí Bakteriální endosymbióza s rostlinou vzniká díky dvěma evolučním krokům – vstupu bakterií do buňky kořene a vytvoření hlízek pro množení bakterií a udržování symbiózy (Perrine-Walker et al., 2011). Vývojové procesy, probíhající v pokožce a v primární kůře se liší, a při studiu mutantů od sebe dokonce mohou být zcela odděleny (Oldroyd & Downie, 2008). Nodulace, resp. dělení buněk primární kůry, vedoucí k vytvoření hlízky, je v případě rhizobiální infekce indukováno Nod faktory, jak bylo uvedeno výše. Bakterie Rhizobium i Frankia mohou infikovat jen ty buňky primární kůry, které byly vytvořeny až po vzájemné signalizaci obou partnerů (Pawlowski & Demchenko, 2012). K aktivaci mitózy v buňkách primární kůry, nacházejících se pod místem infekce bakteriemi, dochází u Medicago truncatula, Vicia sativa a Pisum sativum současně s odpovědí epidermálních buněk na Nod faktory (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Při mitotické reaktivaci buněk primární kůry dochází k expresi mitotických cyklinů a nodulačních genů (Mylona et al., 1995). Buňky primární kůry, čekající na průchod infekčních vláken, jsou drženy v G2 fázi buněčného cyklu, a po jeho reaktivaci se stávají buňkami meristematickými (Dudeja et 25
al., 2012). Tvorbu nedeterminovaných hlízek u Medicago truncatula spouští signalizační dráha Nod faktorů, při které zvýšení hladiny a následná oscilace vápenatých iontů aktivuje Ca2+/kalmodulin závislou proteinovou kinázu v primární kůře. Tím jsou aktivovány specifické transkripční faktory, indukující expresi brzkého nodulačního genu Enod11 v epidermis i v hlízkovém primordiu, čímž stimulují dělení buněk primární kůry a pericyklu (Saur et al., 2011). To značí, že pro zahájení nodulace není nezbytná přítomnost Nod faktorů, ale aktivace Ca2+/kalmodulin závislé proteinové kinázy, například ziskovou mutací. Ta postačuje pro spuštění nodulačních procesů, bez rhizobiální infekce. Takto vzniklá hlízka má veškeré náležitosti hlízky nedeterminované (Oldroyd & Downie, 2008). Inhibice transportu auxinu, mající za následek jeho lokální akumulaci, také stimuluje dělení buněk primární kůry za tvorby hlízky (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Signální dráha cytokininů u Medicago truncatula, kterou také aktivují bakterie Rhizobium, začíná cytokininovým receptorem CRE1. Tato cytokininová nodulační dráha se schází se signální drahou Nod faktorů v bodě aktivace specifických transkripčních faktorů a vede k vytvoření hlízky (Saur et al., 2011). Rostliny se schopností spontánní nodulace tvořily, po vnější aplikaci cytokininů či inhibitorů auxinového transportu, hlízkám-podobné struktury (Murray et al., 2007). K zahájení tvorby hlízky je třeba indukce exprese specifických genů, mezi něž patří brzký nodulační gen Enod40, k jehož expresi nedochází v pokožkových buňkách po kontaktu s Nod faktory, ale jen v primární kůře. U transgenní Medicago truncatula se zvýšenou expresí enod40 byla dokázána zvýšená citlivost na signály pro zahájení nodulace, vyšší rychlost tvorby hlízky a větší počet vznikajících primordií. Došlo také k prodloužení kořene, vlivem stimulace dělení buněk primární kůry v blízkosti kořenového vrcholu. Z tohoto vyplynulo, že enod40 podporuje efekt Nod faktorů na nodulaci. Naopak, snížení exprese tohoto genu vedlo k utváření nižšího počtu malých, ve vývoji i funkci poškozených, anatomicky nedifernciovaných hlízek bez meristematické organizace. Z tohoto lze vyčíst nepostradatelnost tohoto genu při utváření symbiotických hlízek u tolice vojtěšky (Charon et al., 1999). Symbiotické procesy v pokožce jsou řízeny transdukcí signálů Nod faktorů, v primární kůře mají řídící úlohu fytohormony (Oldroyd & Downie, 2008). Jak již bylo uvedeno, po kontaktu infekčních vláken s buňkami tvořící se hlízky dojde k propuštění bakterií z jejich infekčních vláken (Gonzalez-Rizzo et al., 2009), a bakterie jsou endocyticky přepraveny do buněk hlízkového primordia, díky čemuž jsou obaleny rostlinnou membránou, nazývanou symbiozom, zprostředkující výměnu látek mezi rostlinou a bakterií (Oldroyd & Downie, 2008). Podobný typ membránového přenosu se uplatňuje i u olše (Alnus) s bakterií Frankia. Bakterie jsou diferenciovány a získávají schopnost fixovat dusík. Pro tuto diferenciaci je nutná nízká hladina kyslíku (Dudeja et al., 2012). Dusík fixující Rhizobia, žijící uvnitř buněk hostitelské rostliny, jsou nazývány bakteroidy. Spolu s diferenciací bakterií na bakteroidy se hlízkové primordium mění ve zralou hlízku. Při senescenci endosymbiotických bakteriálních buněk se symbiozom mění v lysozom (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). U dvou kmenů fotosyntetických bakterií Bradyrhizobium však byla nodulace prokázána i bez exprese nodABC genů, tudíž bez syntézy Nod faktorů, využitím derivátů purinů jako signálních molekul pro iniciaci nodulace (Giraud et al., 2007). 26
vi)
Regulace vývoje hlízek
Tři hlavní fytohormony ovlivňují vznik a vývoj hlízek: auxin, cytokininy a etylén. Lze je rozdělit na vnitřní a vnější regulátory, kdy vnějšími jsou etylén a auxin, a vnitřními auxin a cytokininy. Nod faktory blokují auxinový transport, následkem čehož dochází k jeho lokální akumulaci (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Stejně tak lokální akumulace cytokininů vyvolá tvorbu hlízek.
(a) Auxin Auxinový transport může být pozměněn regulací aktivity či lokalizace membránových auxinových transportních proteinů, zejména PIN a AUX1, jejichž transport probíhá vezikulárně. Některé flavonoidy u Arabidopsis thaliana jsou schopny měnit fenotyp prýtu a modifikovat auxinový transport, díky změnám v expresi a lokalizaci PIN proteinů (Mathesius, 2008). Flavonoidy, konkrétně flavonoly, se mohou v určitých buňkách akumulovat, jejich další transport z těchto buněk zatím nebyl prokázán (Kuhn et al., 2011). Právě v buňkách se zvýšenou koncentrací flavonolů dochází k inhibici auxinového transportu. Snížení hladiny flavonolů opět uvolní auxinové přenašeče (Kuhn et al., 2011). Polární auxinový transport je u nedeterminovaných hlízek Medicago truncatula inhibován i působením Nod faktorů (Grunewald et al., 2009), naproti tomu ale Lotus japonicus, tvořící determinované hlízky, nevykazoval změny v auxinovém transportu po aplikaci Nod faktorů. Naopak, u Lotus dodání inhibitorů auxinového transportu mělo dopad na vývoj a počet hlízek (Takanashi et al., 2011). Důsledkem blokace auxinového transportu je jeho snížená dostupnost v místě iniciace dělení buněk, kde se díky tomu změní relativní poměr mezi auxinem a cytokininy, aktivátory nodulace (Mathesius, 2008). Právě auxin stimuluje expresi cyklinu, jenž reaktivuje buněčný cyklus, a to u nodulace, i při tvorbě bočních kořenů. Auxin zvyšuje de novo transkripci tohoto cyklinu v buňkách primární kůry před xylémovými poli (Kondorosi et al., 2005). Pro správnou, dusík-fixující funkci hlízky dochází v buňkách centrálního pletiva k endoreduplikaci, k procesu mnohočetného kopírování genetické informace, vlivem oscilací cyklin-dependentní kinázy, která buňku nutí stále opakovat S fázi buněčného cyklu. Buňky, u nichž byla endoreplikace uměle blokována, byly vzrůstově menší a nebyly schopné fixovat dusík. K této regulované polyploiditě dochází v obou typech hlízek, determinovaných i nedeterminovaných (Kondorosi et al., 2005). Hladina auxinu v nodulech Frankia je vyšší v porovnání s kořeny. U aktinorhizní symbiózy, v níž se primordium hlízky zakládá z pericyklu, je role auxinu znatelnější než u hlízek rhizobiálních (Pawlowski & Demchenko, 2012).
27
(b) Cytokininy Na zvýšení hladiny cytokininů reagovala bakteriemi naočkovaná tolice Medicago trunculata zvýšením počtu shluků dělících se buněk v primární kůře, vlivem modifikace auxinového transportu, zejména PIN proteinů (Dudeja et al., 2012). Ale u Lotus japonicus při iniciaci tvorby hlízkového primordia, nebyl exprimován gen pro cytokininovou odpověď, což ukazuje na roli cytokininů v pozdější fázi, konkrétně v udržování dělení buněk. Změny v distribuci cytokininů však mohou změnit lokální akumulaci auxinu, což vede k vlastní nodulaci, či ke zvýšení počtu hlízek (Kondorosi et al., 2005). Lotus japonicus, tvoří po vnější aplikaci cytokininů viditelné kořenové hlízy, díky stimulaci exprese brzkých nodulačních genů. I vlastní aktivace dělení kortikálních buněk je podle autora závislá na vnímání cytokininů receptorem LHK1 a na přítomnosti transkripčních regulátorů v primární kůře, zodpovědných za transkripci příslušných nodulačních genů (Heckmann et al., 2011). Cytokininy také, u mutanta L. japonicus s vyšší schopností být infikován, přímo či nepřímo ovlivňují pronikání infekčních vláken pletivy kořene (Murray et al., 2007). Cytokininy jsou u L. japonicus akumulovány v kořenových vláskách a dělících se buňkách primární kůry (Lohar et al., 2004). Tvorbu hlízek Giraud s kolegy (2007) prokázal i u dvou kmenů fotosyntetických bakterií Bradyrhizobium a to bez exprese nodABC genů, tudíž bez Nod faktorů. Tyto bakterie namísto Nod faktorů používaly purinové deriváty, strukturou podobné právě cytokininům (Giraud et al., 2007). Lokalizace hlízky proti protoxylému může být určena cytokininy pozměněným auxinovým tokem, nebo akumulací etylénu a uridinu mezi těmito protoxylémovými oblastmi (Stougaard, 2000). Cytokininy tedy nemají vliv na reaktivaci buněčného dělení, ale na jeho udržování, podílí se na pronikání infekčních vláken a zprostředkovaně mohou regulovat počet nodulů. Funkcí i strukturou jsou blízko k Nod faktorům. Cytokininová regulace exprese brzkých nodulačních genů je závislá na cytokininovém receptoru (CRE1), ale bakteriální regulace je závislá na Nod faktorové signalizaci (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Cytokininy jsou dostačující a zároveň nezbytné pro organogenezi hlízek. (c) Etylén Etylén se také účastní regulace vzniku kořenových hlízek. Stimuluje spolu s auxinem prodlužování kořenových vlásků, pozitivně ovlivňuje syntézu auxinu v kořenech, vedoucí ke stimulaci buněčného dělení. Naopak, spolu s gibereliny a peroxidem vodíku se účastní buněčné smrti, klíčové při infekci (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Po aplikaci etylénu na Pisum sativum byla inhibována tvorba hlízek, docházelo k zastavení infekčních vláken pokožce, nebo ve vnější vrstvě primární kůry. Kořen hrachu při vystavení světlu zvýšil expresi etylénu, a tím míru potlačování nodulace. Zároveň autoři dospěli k názoru, že dusičnany, ač taktéž inhibují nodulaci, způsobují nižší syntézu etylénu než na kořenech, vystavených světlu, a že inhibiční efekt dusičnanů působí v různých stádiích vývoje hlízky (Lee & LaRue, 1992). Etylénový prekurzor, kyselina 1-aminocyklopropan-1-karboxylová (ACC), se syntetizuje v pericyklu kořene. Některé bakterie Rhizobium kódují ACC deaminázu, degradující ACC, čímž tlumí obrannou reakci rostliny a zvyšují tím šanci na úspěšnou infekci. Etylén také po kontaktu s Nod faktory 28
inhibuje signalizaci vápenatých iontů (jejich oscilaci) v kořenových vláskách, a spolu s tím i expresi brzkých nodulinových genů (Desbrosses & Stougaard, 2011). U Sesbania rostrata etylén ovlivňuje vstup bakterií do kořene, a tím i typ utvářené hlízky (Desbrosses & Stougaard, 2011). Etylén též reguluje buňky klidového centra meristémů. V nedeterminovaných hlízkách upravuje lokalizaci dělení primární kůry. Syntéza etylénového prekurzoru totiž probíhá v pericyklu, konkrétně v jeho částech, přiléhajícím k oblastem floému, čímž hlízkám dává vzniknout v oblastech primární kůry, přiléhajícím ke xylému (Dudeja et al., 2012). Je nutné, aby rostlina měla nad tvorbou hlízek kontrolu – kde, jak a kolik jich vytvoří. Jedním z možných regulačních mechanismů je autoregulace. Při iniciaci dělení primární kůry buňky vyšlou do prýtu molekulu prekurzoru inhibitoru dělení. V prýtu je tato molekula aktivována, přeměněna na inhibitor a transportována zpět do kořene. Zde pak inhibuje vývoj mladší hlízky, aby starší pronikla kořenem jako první (Dudeja et al., 2012). Množství hlízek negativně reguluje i kyselina abscisová, a z prýtu transportované brassinosteroidy i jasmonáty, jejichž účinky však byly potvrzeny jen u málo druhů luskovin (Dudeja et al., 2012). Přítomnost využitelného dusíku taktéž inhibuje nákladný vznik hlízek (Mathesius, 2008).
29
4) Postranní kořeny a kořenové hlízky - srovnání U postranních kořenů dochází nejprve k dělení pericyklu, u kořenových hlízek se na vzniku podílí primární kůra, a spolu s ní různou měrou i pericykl. Postranní orgán bývá spojen s vodivými pletivy mateřského kořene. Systém vodivých pletiv postranních kořenů je centrální, u hlízek může být i centrální, jako u aktinorhizních hlízek, i periferní, nacházející se u hlízek luskovin. Rozdílná je doba trvání aktivity meristémů orgánů, meristematická aktivita determinovaných hlízek je ukončena brzy po jejím zahájení, naproti tomu u postranních kořenů, nedeterminovaných či aktinorhizních hlízek je meristém trvalý.
Obrázek 8: Srovnání anatomické struktury postranního kořene (vlevo), nedeterminované hlízky (uprostřed) a determinované hlízky. m=meristém, vodivá pletiva jsou zvýrazněna tmavě. Převzato od Diouf et al., 2004
Zajímavé sloučení kořenové hlízky a postranního kořenu nám ukazují ektopické kořeny, vznikající u Phaseolus vulgare při symbióze s mutantní Rhizobium etli. V tomto případě je postižená schopnost tvorby hlízky. Dochází zde k brzkým krokům nodulace avšak záhy po vytvoření infekčních vláken dochází k jejich přerušení, neexprimují se pozdní nodulační geny, a tvoří se výrůstky na kořenech, bez vyvinuté apikální části, ale s velmi dobře vyvinutými cévními svazky, z nichž obvykle vyrůstá malý počet agravitropických ektopických kořenů, prodlužujících se ve všech směrech. Tato tvorba ektopických kořenů byla popsána jen u této dvojice organismů (Ferraioli et al., 2004).
30
Obrázek 9: Srovnání tvorby postranního kořene (nahoře), kořenové hlízky (dole) a ektopických kořenů, vyskytujícího se jen u Phaseolus vulgare v interakci s mutantní Rhizobium etli. Zeleně jsou značena vodivá pletiva, červeně meristematická pletiva a modře symbiotické prokaryontní organismy. Převzato od Ferraioli et al., 2004.
Nod faktory mohou být také zapojeny v ovlivňování kořene. U sóji se po aplikaci Nod faktorů zvýšila délka a suchá hmotnost kořenů (Souleimanov et al., 2002). U Vicia sativa, Lotus japonicus a Sesbania Nod faktory stimulovaly formování kořenových vlásků (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Jejich efekt na větvení kořenů však nebyl prokázán. Reakce na environmentální podněty, zejména živiny jako fosfor a dusík, je nápadnější u větvení kořenů. Dusičnany mohou regulovat vývoj postranních kořenů různým způsobem v závislosti na své koncentraci, jak je popisováno v příslušné kapitole. Raný vývoj hlízek je u Pisum sativum inhibován dostupností využitelného dusíku, snížením množství infekcí. Tuto inhibici zprostředkovává etylén (Lee, 1992 42 /id). Podobnou represi nodulace, ne však infekce, u hrachu vyvolává i světlo, díky blokaci vývoje infekčních vláken. Tato inhibice je rovněž zprostředkovaná etylénem, a je vratná aplikací jeho represoru, například stříbra (Lee & LaRue, 1992). Dostupnost fosfátu je hlavním limitujícím faktorem vývoje postranních kořenových orgánů. Deficit se projevuje tvorbou postranních kořenů na úkor růstu kořene primárního a stimuluje růst kořenových vlásků (Ticconi, 2006). Fosfor je esenciálním prvkem pro vývoj hlízek i fixaci dusíku. U sóji je symbiotická fixace proces, vyžadující relativně velká množství fosforu. Při deficitu fosforu je aktivováno mnoho (u sóji 44) genů obou symbiotických partnerů, což svědčí o potřebě tohoto prvku pro úspěšnou symbiotickou interakci (Chen et al., 2011). Další společný bod postranních kořenů a hlízek je jejich fytohormonální regulace. Transport auxinu je klíčový pro vznik postranních kořenů, jeho narušení má negativní vliv na jejich tvorbu. Naopak inhibice
31
auxinového transportu indukuje tvorbu determinovaných pseudonodulů s centrálními cévními svazky (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Tvorba těchto pseudonodulů, iniciovaných v pericyklu a tvořených buňkami primární kůry, vyžaduje expresi genů, jež jsou exprimovány i při vývoji bočních kořenů. Je možné, že tyto struktury, spíše než nodulací, vznikají fůzí a následnou elongací kořenových primordií (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Auxin je nezbytný pro aktivaci buněčného cyklu buněk pericyklu (Fukaki & Tasaka, 2007). Infekce rhizobii či aplikace Nod faktorů modifikuje auxinový transport, auxinové maximum je vytvořeno v místě budoucího hlízkového primordia (Mathesius et al., 1998). Při vývoji hlízek i postranních kořenů dochází ke zvyšování hladiny auxinu v buňkách (Swarup et al., 2008). Rostliné flavonoidy se účastní regulace lokální akumulace auxinu, a při inhibici auxinového transportu přenášejí Nod faktorové signály (Mathesius, 1998 36 /id). Cytokininy se podílí na tvorbě infekčních vláken, udržují meristematické buňky v buněčném cyklu díky aktivaci genu pro cyklin D, a mohou pozměňovat auxinový tok. Cytokininy také pozitivně ovlivňují nodulaci, mají účinky podobné Nod faktorům, dokonce i signální látky nějakých druhů bakterií jsou jim strukturou podobné. Gen pro odpověď na cytokininy (ARR) je silně exprimován v deformovaných kořenových vláskách a v dělících se buňkách primární kůry (Lohar et al., 2004). Při vývoji laterálních kořenů u Lotus japonicus cytokininy, resp. geny zprostředkovávající odpověď na ně, ARR, nebyly detekovatelné v dělících se buňkách brzkých stádií vývoje primordia, ale posléze byla jejich vysoká exprese prokázána na bázi vznikajícího bočního kořene. Kořenový vrchol exprimoval cytokininy v průběhu celého vývoje bočního kořene (Lohar et al., 2004). U transgenního Lotusu redukce cytokininů vede k inhibici tvorby hlízek, ale ke zvýšení tvorby postranních kořenů (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Mutantní Lotus s poruchou cytokininového receptoru ukazuje zvýšení počtu infekčních vláken, zároveň však inhibici nodulace (Murray et al., 2007). Postranní orgány jsou ovlivňovány lokální akumulací cytokininů a auxinu, a jejich poměrem. Brzké fáze vývoje nodulů cytokinin stimuluje, vývoj primordií laterálních kořenů inhibuje. Etylén, ovlivňující reakci na vnější prostředí, syntetizovaný ze svého prekurzoru ACC, negativně ovlivňuje vývoj obou typů bočních orgánů. Jeho vliv je vratný stříbrem, či ACC deaminázou některých bakterií. Zvyšuje auxinový transport stimulací PIN a AUX1 proteinů, čímž zabraňuje akumulaci auxinu, potřebné pro vznik postranních orgánů (Lewis et al., 2011). Produkce etylénu se zvyšuje při rhizobiální ínfekci, či při přidání Nod faktorů. Etylén ovlivňuje prostorový vznik hlízky, a jeho vyšší hladina snižuje počet hlízkových primordií i samotných interakcí luskoviny s bakterií (Oldroyd et al., 2001). Etylén také inhibuje signální dráhu Nod faktorů – oscilaci vápenatých iontů a následnou indukci exprese nodulačních genů (Oldroyd et al., 2001). U Sesbania rostrata etylén rozhoduje o dráze vstupu bakterií do kořene, čímž i o typu vznikajícího nodulu (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Kyselina abscisová je hlavní kandidát pro látku, udržující rovnováhu mezi noduly a postranními kořeny. Řídí reakci na stres, regulací syntézy celulózy pomáhá řídit i prodlužování buněk. Inhibuje vznik bočních 32
kořenů, konkrétně zabraňuje aktivaci jejich meristému (De Smet et al., 2003). ABA též blokuje brzké kroky infekce bakteriemi, čímž snižuje počet nodulů. To je vratné glukózou, nebo snížením její hladiny pomocí inhibitorů, což vede k opětovnému zvýšení počtu hlízek (De Smet et al., 2003). Signální cesty ABA a auxinu jsou však propojené. Vývoj postranních kořenů je inhibován signalizací ABA, ovšem i její mutací (Parcy et al., 1994). ABA má tedy negativní vliv na počet nodulů, ale pozitivní vliv na postranní kořeny u nodulujících luskovin (Gonzalez-Rizzo et al., 2009). Salicylová kyselina hraje roli zejména ve vztahu k patogenům. U nedeterminovaných hlízek Vicia sativa zvýšená koncentrace tohoto fytohormonu vedla k inhibici tvorby nodulů, ale k brzkým událostem, deformaci kořenových vlásků, došlo. Však u determinované nodulace Lotus japonicus k inhibici nedošlo (van Spronsen et al., 2003). Byl dokázán pozitivní vliv giberelinů na počet bočních kořenů i hlízek u hrachu (Ferguson, 2005 60 /id), což je ale pravděpodobně způsobeno tím, že iniciace nodulace i větvení kořene je indukována v pericyklu. Odpověď na gibereliny je regulována auxinem (Fu, 2003 61 /id). Přenašeč malátu, vyskytující se v klastrových kořenech, je totožný s přenašečem, uplatňujícím se při výměně živin mezi rostlinou a endosymbiontem u rhizobiální i aktinorhizní hlízkové symbiózy. Ale ne všechny rostliny schopné tvorby nodulů mohou tvořit i klastrové kořeny a naopak. To vyvolává otázku, zda v evoluci vznikly dříve hlízky či nahloučené kořeny (Pawlowski & Demchenko, 2012).
33
5) Závěr Architektura kořene rostliny je dynamická struktura, tvořená primárním kořenem a postranními kořenovými orgány, a ovlivňovaná mnoha faktory vnějšího prostředí i vnitřní regulací. Tvorba bočních orgánů je pro rostlinu poměrně náročný proces, proto je řádně regulován a kontrolován. Kořenové hlízky mají schopnost ubytovat prokaryontní organismy, žijící standardně volně v půdě či vodě, a žít s nimi v úzce definovaném soužití. Postranní kořeny mohou vstupovat do symbiózy s mykorhizními houbami, v obou případech je soužití spojené s oboustranně prospěšnou výměnou látek. Vývoj postranních orgánů je nejlépe prostudován na konkrétních modelových organismech, a ne vždy lze tyto poznatky uplatnit i u jiných druhů rostlin. Ačkoliv došlo za posledních několik let k obrovskému nárůstu získaných informací, pro správné pochopení komplexity, podobnosti a evolučního vzniku mechanismů, ovlivňujících vývoj bočních kořenových orgánů různých druhů a jejich interakce s jinými organismy bude potřeba ještě mnoho studií.
34
6) Citovaná literatura: 1 2 3 4 5
6
7
8
9
10
11
12 13
14 15 16
17
18 19
Ann MH, LaRue TA, Doyle DJ. 1997. Is the legume nodule a modified root or stem or an organ sui generis? Critical Reviews in Plant Sciences 16: 361-392. Beeckman T, Friml J. 2010. Nitrate contra auxin: nutrient sensing by roots. Developmental cell 18: 877-878. Benková E, Bielach A. 2010. Lateral root organogenesisfrom cell to organ. Current opinion in plant biology 13: 677-683. Brewin NJ. 2004. Plant Cell Wall Remodelling in the Rhizobium Legume Symbiosis. Critical Reviews in Plant Sciences 23: 293-316. Casimiro I, Marchant A, Bhalerao RP, Beeckman T, Dhooge S, Swarup R, Graham N, Inzé D, Sandberg G, Casero PJ. 2001. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. The Plant Cell Online 13: 843-852. Casimiro I, Beeckman T, Graham N, Bhalerao R, Zhang H, Casero P, Sandberg G, Bennett MJ. 2003. Dissecting Arabidopsis lateral root development. Trends in Plant Science 8: 165-171. Charon C, Sousa C, Crespi M, Kondorosi A. 1999. Alteration of enod40 expression modifies Medicago truncatula root nodule development induced by Sinorhizobium meliloti. The Plant Cell Online 11: 1953-1966. Chen Z, Cui Q, Liang C, Sun L, Tian J, Liao H. 2011. Identification of differentially expressed proteins in soybean nodules under phosphorus deficiency through proteomic analysis. Proteomics. De Smet I, Signora L, Beeckman T, Inzé D, Foyer CH, Zhang H. 2003. An abscisic acidsensitive checkpoint in lateral root development of Arabidopsis. The Plant Journal 33: 543-555. De Smet I, Tetsumura T, De Rybel B, dit Frey NF, Laplaze L, Casimiro I, Swarup R, Naudts M, Vanneste S, Audenaert D. 2007. Auxin-dependent regulation of lateral root positioning in the basal meristem of Arabidopsis. Development 134: 681-690. Desbrosses GJ, Stougaard J. 2011. Root Nodulation: A paradigm for how plantmicrobe symbiosis influences host developmental pathways. Cell Host & Microbe 10: 348-358. Diouf D, Diop TA, Ndoye I. 2004. Actinorhizal, mycorhizal and rhizobial symbioses: how much do we know? African Journal of Biotechnology 2: 1-7. Ditengou FA, Teale WD, Kochersperger P, Flittner KA, Kneuper I, Van Der Graaff E, Nziengui H, Pinosa F, Li X, Nitschke R . 2008. Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 18818. Dubrovsky JG, Doerner PW, Colón-Carmona A, Rost TL. 2000. Pericycle cell proliferation and lateral root initiation in Arabidopsis. Plant Physiology 124: 1648-1657. Dubrovsky JG, Rost TL, Colón-Carmona A, Doerner P. 2001. Early primordium morphogenesis during lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Planta 214: 30-36. Dubrovsky JG, Sauer M, Napsucialy-Mendivil S, Ivanchenko MG, Friml J, Shishkova S, Celenza J, Benkov+í E. 2008. Auxin acts as a local morphogenetic trigger to specify lateral root founder cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 8790. Dudeja SS, Sheokand S, Kumari S. 2012. Legume root nodule development and functioning under tropics and subtropics: perspectives and challenges. Legume Research-An International Journal 35: 85-103. Ferguson BJ, Ross JJ, Reid JB. 2005. Nodulation phenotypes of gibberellin and brassinosteroid mutants of pea. Plant Physiology 138: 2396-2405. Ferraioli S, Taté R, Rogato A, Chiurazzi M, Patriarca EJ. 2004. Development of ectopic roots from abortive nodule primordia. Molecular plant-microbe interactions 17: 1043-1050.
35
20 Fu X, Harberd NP. 2003. Auxin promotes Arabidopsis root growth by modulating gibberellin response. Nature 421: 740-743. 21 Fukaki H, Tameda S, Masuda H, Tasaka M. 2002. Lateral root formation is blocked by a gainoffunction mutation in the SOLITARYROOT/IAA14 gene of Arabidopsis. The Plant Journal 29: 153-168. 22 Fukaki H, Okushima Y, Tasaka M. 2007. AuxinMediated Lateral Root Formation in Higher Plants. International review of cytology 256: 111-137. 23 Fukaki H, Tasaka M. 2009. Hormone interactions during lateral root formation. Plant molecular biology 69: 437-449. 24 Giehl RFH, Lima JE, von Wirén N. 2012. Localized Iron Supply Triggers Lateral Root Elongation in Arabidopsis by Altering the AUX1-Mediated Auxin Distribution. The Plant Cell Online 24: 33-49. 25 Giraud E, Moulin L, Vallenet D, Barbe V, Cytryn E, Avarre JC, Jaubert M, Simon D, Cartieaux F, Prin Y. 2007. Legumes symbioses: absence of Nod genes in photosynthetic bradyrhizobia. Science's STKE 316: 1307. 26 Gonzalez-Rizzo S, Laporte P, Crespi M, Frugier F. 2009. Legume root architecture: a peculiar root system. Annual Plant Reviews Volume 37: Root Development 239-287. 27 Grunewald W, van Noorden G, Van Isterdael G, Beeckman T, Gheysen G, Mathesius U. 2009. Manipulation of Auxin Transport in Plant Roots during Rhizobium Symbiosis and Nematode Parasitism. Plant Cell 21: 2553-2562. 28 Heckmann AB, Sandal N, Bek AS, Madsen LH, Jurkiewicz A, Nielsen MW, Tirichine L, Stougaard J. 2011. Cytokinin induction of root nodule primordia in Lotus japonicus is regulated by a mechanism operating in the root cortex. Molecular plant-microbe interactions 24: 1385-1395. 29 Hermans CRM. Arabidopsis Root Architecture in Response to Nitrate Supply. Plant and Animal Genome XX Conference (January 14-18, 2012) . 2012. Plant and Animal Genome. Ref Type: Conference Proceeding 30 Himanen K, Boucheron E, Vanneste S, de Almeida Engler J, Inzé D, Beeckman T. 2002. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. The Plant Cell Online 14: 2339-2351. 31 HOLSTERS M, CAPOEN W, GOORMACHTIG S. 2004. Rhizobium infection: lessons from the versatile nodulation behaviour of water-tolerant legumes. Trends in Plant Science 9: 518-522. 32 Huss-Danell K, Bergman B. 1990. Nitrogenase in Frankia from root nodules of Alnus incana (L.) Moench: immunolocalization of the Fe-and MoFe-proteins during vesicle differentiation. New Phytologist 443-455. 33 Ivanchenko MG, Muday GK, Dubrovsky JG. 2008. EthyleneÇôauxin interactions regulate lateral root initiation and emergence in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 55: 335-347. 34 Jansen L, Roberts I, De Rycke R, Beeckman T, Jansen L, Roberts I, De Rycke R, Beeckman T. 2012. Phloem-associated auxin response maxima determine radial positioning of lateral roots in maize. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 367: 1525-1533. 35 Journet EP, El-Gachtouli N, Vernoud V, De Billy F, Pichon M, Dedieu A, Arnould C, Morandi D, Barker DG, Gianinazzi-Pearson V. 2001. Medicago truncatula ENOD11: a novel RPRP-encoding early nodulin gene expressed during mycorrhization in arbusculecontaining cells. Molecular plant-microbe interactions 14: 737-748. 36 Kapulnik Y, Delaux PM, Resnick N, Mayzlish-Gati E, Wininger S, Bhattacharya C, S+ejalon-Delmas N, Combier JP, B+ecard G, Belausov E. 2011. Strigolactones affect lateral root formation and root-hair elongation in Arabidopsis. Planta 233: 209-216. 37 Kepinski S, Leyser O. 2005. The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor. Nature 435: 446-451. 38 Kistner C, Parniske M. 2002. Evolution of signal transduction in intracellular symbiosis. Trends in Plant Science 7: 511-518. 36
39 Kondorosi E, Redondo-Nieto M, Kondorosi A. 2005. Ubiquitin-mediated proteolysis. To be in the right place at the right moment during nodule development. Plant Physiology 137: 1197-1204. 40 Krouk G, Lacombe B, Bielach A, Perrine-Walker F, Malinska K, Mounier E, Hoyerova K, Tillard P, Leon S, Ljung K. 2010. Nitrate-regulated auxin transport by NRT1. 1 defines a mechanism for nutrient sensing in plants. Developmental cell 18: 927937. 41 Kuhn BM, Geisler M, Bigler L, Ringli C. 2011. Flavonols accumulate asymmetrically and affect auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiology 156: 585-595. 42 Kutz A, Müller A, Hennig P, Kaiser WM, Piotrowski M, Weiler EW. 2002. A role for nitrilase 3 in the regulation of root morphology in sulphurstarving Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 30: 95-106. 43 Laplaze L, Benkova E, Casimiro I, Maes L, Vanneste S, Swarup R, Weijers D, Calvo V, Parizot B, Herrera-Rodriguez MB. 2007. Cytokinins act directly on lateral root founder cells to inhibit root initiation. The Plant Cell Online 19: 3889-3900. 44 Laskowski M, Grieneisen VA, Hofhuis H, Colette A, Hogeweg P, Marée AFM, Scheres B. 2008. Root system architecture from coupling cell shape to auxin transport. PLoS biology 6: e307. 45 Laskowski MJ, Williams ME, Nusbaum HC, Sussex IM. 1995. Formation of lateral root meristems is a two-stage process. Development 121: 3303-3310. 46 Lee KH, LaRue TA. 1992. Ethylene as a possible mediator of light-and nitrate-induced inhibition of nodulation of Pisum sativum L. cv Sparkle. Plant Physiology 100: 1334. 47 Lewis DR, Negi S, Sukumar P, Muday GK. 2011. Ethylene inhibits lateral root development, increases IAA transport and expression of PIN3 and PIN7 auxin efflux carriers. Development 138: 3485-3495. 48 Lewis G, Schrire BM, Lock M. 2005. Legumes of the World. Recherche 67: 02. 49 Li X, Mo X, Shou H, Wu P. 2006. Cytokinin-mediated cell cycling arrest of pericycle founder cells in lateral root initiation of Arabidopsis. Plant and cell physiology 47: 11121123. 50 Lima JE, Kojima S, Takahashi H, von Wirén N. 2010. Ammonium triggers lateral root branching in Arabidopsis in an AMMONIUM TRANSPORTER1; 3-dependent manner. The Plant Cell Online 22: 3621-3633. 51 Lindblad P. 2009. Cyanobacteria in symbiosis with cycads. Prokaryotic symbionts in plants 225-233. 52 Liu H, Wang S, Yu X, Yu J, He X, Zhang S, Shou H, Wu P. 2005. ARL1, a LOBdomain protein required for adventitious root formation in rice. The Plant Journal 43: 47-56. 53 Lohar DP, Schaff JE, Laskey JG, Kieber JJ, Bilyeu KD, Bird DMK. 2004. Cytokinins play opposite roles in lateral root formation, and nematode and rhizobial symbioses. The Plant Journal 38: 203-214. 54 Lucas M, Guédon Y, Jay-Allemand C, Godin C, Laplaze L. 2008. An auxin transportbased model of root branching in Arabidopsis thaliana. PLoS One 3: e3673. 55 Madsen EB, Stougaard J. 2012. Receptor Kinases Mediating Early Symbiotic Signalling. Receptor-like Kinases in Plants 93-107. 56 Malamy JE, Benfey PN. 1997. Organization and cell differentiation in lateral roots of Arabidopsis thaliana. Development 124: 33-44. 57 Malamy JE, Ryan KS. 2001. Environmental regulation of lateral root initiation in Arabidopsis. Plant Physiology 127: 899-909. 58 Markmann K, Giczey G, Parniske M. 2008. Functional adaptation of a plant receptorkinase paved the way for the evolution of intracellular root symbioses with bacteria. PLoS biology 6: e68. 59 Markmann K, Parniske M. 2009. Evolution of root endosymbiosis with bacteria: how novel are nodules? Trends in Plant Science 14: 77-86.
37
60 Mason MG, Mathews DE, Argyros DA, Maxwell BB, Kieber JJ, Alonso JM, Ecker JR, Schaller GE. 2005. Multiple type-B response regulators mediate cytokinin signal transduction in Arabidopsis. The Plant Cell Online 17: 3007-3018. 61 Mathesius U, Schlaman HRM, Spaink HP, Of Sautter C, Rolfe BG, Djordjevic MA. 1998. Auxin transport inhibition precedes root nodule formation in white clover roots and is regulated by flavonoids and derivatives of chitin oligosaccharides. The Plant Journal 14: 23-34. 62 Mathesius U. 2008. Goldacre paper: Auxin: at the root of nodule development? Functional Plant Biology 35: 651-668. 63 Miwa H, Sun J, Oldroyd GED, Allan Downie J. 2006. Analysis of calcium spiking using a cameleon calcium sensor reveals that nodulation gene expression is regulated by calcium spike number and the developmental status of the cell. The Plant Journal 48: 883-894. 64 Miyazawa Y, Takahashi A, Kobayashi A, Kaneyasu T, Fujii N, Takahashi H. 2009. GNOM-mediated vesicular trafficking plays an essential role in hydrotropism of Arabidopsis roots. Science's STKE 149: 835. 65 Moriwaki T, Miyazawa Y, Kobayashi A, Uchida M, Watanabe C, Fujii N, Takahashi H. 2011. Hormonal regulation of lateral root development in Arabidopsis modulated by MIZ1 and requirement of GNOM activity for MIZ1 function. Plant Physiology 157: 1209-1220. 66 Murray JD, Karas BJ, Sato S, Tabata S, Amyot L, Szczyglowski K. 2007. A cytokinin perception mutant colonized by Rhizobium in the absence of nodule organogenesis. Science's STKE 315: 101. 67 Mylona P, Pawlowski K, Bisseling T. 1995. Symbiotic nitrogen fixation. The Plant Cell 7: 869. 68 Newcomb W, Pankhurst CE. 1982. Fine structure of actinorhizal root nodules of Coriaria arborea (Coriariaceae). New Zealand Journal of Botany 20: 93-103. 69 Nordström A, Tarkowski P, Tarkowska D, Norbaek R, Astot C, Dolezal K, Sandberg G. 2004. Auxin regulation of cytokinin biosynthesis in Arabidopsis thaliana: a factor of potential importance for auxinÇôcytokinin-regulated development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 8039. 70 Oldroyd GED, Mitra RM, Wais RJ, Long SR. 2001. Evidence for structurally specific negative feedback in the Nod factor signal transduction pathway. The Plant Journal 28: 191-199. 71 Oldroyd GED, Downie JA. 2008. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes. Annu.Rev.Plant Biol. 59: 519-546. 72 Parcy F, Valon C, Raynal M, Gaubier-Comella P, Delseny M, Giraudat J. 1994. Regulation of gene expression programs during Arabidopsis seed development: roles of the ABI3 locus and of endogenous abscisic acid. The Plant Cell Online 6: 1567-1582. 73 Parizot B, Laplaze L, Ricaud L, Boucheron-Dubuisson E, Bayle V, Bonke M, De Smet I, Poethig SR, Helariutta Y, Haseloff J . 2008. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiology 146: 140-148. 74 Parniske M. 2008. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Reviews Microbiology 6: 763-775. 75 Pavlová L. 2005. Fyziologie rostlin. Karolinum. 76 Pawlowski K, Demchenko KN. 2012. The diversity of actinorhizal symbiosis. Protoplasma 1-13. 77 Perrine-Walker F, Gherbi H, Imanishi L, Hocher V, Ghodhbane-Gtari F, Lavenus J, Meriem Benabdoun F, Nambiar-Veetil M, Svistoonoff S, Laplaze L. 2011. Symbiotic signaling in actinorhizal symbioses. Current Protein and Peptide Science 12: 156-164. 78 Radutoiu S, Madsen LH, Madsen EB, Felle HH, Umehara Y, Gr+anlund M, Sato S, Nakamura Y, Tabata S, Sandal N. 2003. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases. Nature 425: 585-592. 79 Radutoiu S, Madsen LH, Madsen EB, Jurkiewicz A, Fukai E, Quistgaard EMH, Albrektsen AS, James EK, Thirup S, Stougaard J. 2007. LysM domains mediate 38
lipochitinoligosaccharide recognition and Nfr genes extend the symbiotic host range. The EMBO journal 26: 3923-3935. 80 Raven JA, Edwards D. 2001. Roots: evolutionary origins and biogeochemical significance. Journal of Experimental Botany 52: 381-401. 81 Saur IML, Oakes M, Djordjevic MA, Imin N . 2011. Crosstalk between the nodulation signaling pathway and the autoregulation of nodulation in Medicago truncatula. New Phytologist. 82 Sen A, Misra AK. 2012. Frankia and Actinorhizal Symbiosis. Microorganisms in Sustainable Agriculture and Biotechnology 113-126. 83 Shane M, Lambers H. 2005. Cluster roots: a curiosity in context. Root physiology: from gene to function 101-125. 84 Sharp RE. 2011. Abscisic acid: interactions with ethylene and reactive oxygen species in the regulation of root growth under water deficit. 85 Smith S, De Smet I, Smith S, De Smet I. 2012. Root system architecture: insights from Arabidopsis and cereal crops. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 367: 1441-1452. 86 Smith SE, Smith FA. 2011. Roles of arbuscular mycorrhizas in plant nutrition and growth: new paradigms from cellular to ecosystem scales. Annual review of plant biology 62: 227-250. 87 Soltis DE, Soltis PS, Morgan DR, Swensen SM, Mullin BC, Dowd JM, Martin PG. 1995. Chloroplast gene sequence data suggest a single origin of the predisposition for symbiotic nitrogen fixation in angiosperms. Proceedings of the National Academy of Sciences 92: 2647. 88 Souleimanov A, Prithiviraj B, Smith DL. 2002. The major Nod factor of Bradyrhizobium japonicum promotes early growth of soybean and corn. Journal of Experimental Botany 53: 1929-1934. 89 Sprent JI. 2007. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the occurrence of nodulation. New Phytologist 174: 11-25. 90 Staiger CJ. 2000. Signaling to the actin cytoskeleton in plants. Annual review of plant biology 51: 257-288. 91 Stals H, Inzé D. 2001. When plant cells decide to divide. Trends in Plant Science 6: 359364. 92 Stougaard J. 2000. Regulators and regulation of legume root nodule development. Plant Physiology 124: 531-540. 93 Swarup K, Benková E, Swarup R, Casimiro I, P+ęret B, Yang Y, Parry G, Nielsen E, De Smet I, Vanneste S. 2008. The auxin influx carrier LAX3 promotes lateral root emergence. Nature Cell Biology 10: 946-954. 94 Swarup R, Friml J, Marchant A, Ljung K, Sandberg G, Palme K, Bennett M. 2001. Localization of the auxin permease AUX1 suggests two functionally distinct hormone transport pathways operate in the Arabidopsis root apex. Genes & Development 15: 2648. 95 Takanashi K, Sugiyama A, Yazaki K. 2011. Involvement of auxin distribution in root nodule development of Lotus japonicus. Planta 234: 73-81. 96 Ticconi CA. 2006. A genetic analysis of phosphate deficiency responses in Arabidopsis. 97 To JPC, Haberer G, Ferreira FJ, Deruere J, Mason MG, Schaller GE, Alonso JM, Ecker JR, Kieber JJ. 2004. Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. The Plant Cell Online 16: 658-671. 98 Tomasz Paciorek EZ. 2005. Auxin inhibits endocytosis and promotes its own efflux from cells. Nature 435: 1251-1256. 99 van Spronsen PC, Tak T, Rood AMM, van Brussel AAN, Kijne JW, Boot KJM. 2003. Salicylic acid inhibits indeterminate-type nodulation but not determinate-type nodulation. Molecular plant-microbe interactions 16: 83-91. 100 Vanneste S, De Rybel B, Beemster GTS, Ljung K, De Smet I, Van Isterdael G, Naudts M, Iida R, Gruissem W, Tasaka M. 2005. Cell cycle progression in the pericycle 39
is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell Online 17: 3035-3050. 101 Vasse J, De Billy F, Camut S, Truchet G . 1990. Correlation between ultrastructural differentiation of bacteroids and nitrogen fixation in alfalfa nodules. Journal of bacteriology 172: 4295-4306. 102 Vieten A, Vanneste S, Wi+Ťniewska J, Benkov+í E, Benjamins R, Beeckman T, Luschnig C, Friml J. 2005. Functional redundancy of PIN proteins is accompanied by auxin-dependent cross-regulation of PIN expression. Development 132: 4521-4531. 103 Wan J, Zhang XC, Neece D, Ramonell KM, Clough S, Kim S, Stacey MG, Stacey G. 2008. A LysM receptor-like kinase plays a critical role in chitin signaling and fungal resistance in Arabidopsis. The Plant Cell Online 20: 471-481. 104 Winkel-Shirley B. 2001. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology 126: 485-493. 105 Zhang H, Forde BG. 1998. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrientinduced changes in root architecture. Science 279: 407-409. 106 Schubert M, Koteyeva NK, Wabnitz PW, Santos P, Büttner M, Sauer N, Demchenko K, Pawlowski K. 2011. Plasmodesmata distribution and sugar partitioning in nitrogen-fixing root nodules of Datisca glomerata. Planta 233: 139-152.
40
