Mendelova zemědělská a lesnická univerzita Agronomická fakulta Ústav genetiky
Polymorfismus vybraných kandidátních genů pro znaky jatečné hodnoty prasat
DOKTORSKÁ DISERTAČNÍ PRÁCE
Brno 2000
Michal Kopečný
Doktorand: Ing. Michal Kopečný Školitel: Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc. Vědní obor : 41 - 04 - 9 obecná zootechnika Specializace: Genetika živočichů Předkládaná práce byl zpracována na Ústavu genetiky Agronomické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a na Ústavu živočišné fyziologie a genetiky AV ČR v Liběchově v letech 1994 – 2000. Práce byla zpracována s podporou grantů GA ČR 523/97/1305 a EC ERBIC15CT960902, a MSM 432100001.
Na tomto místě bych chtěl poděkovat prof. Ing. Josefu DvořákRvi, CSc. Za odborné vedení a vytvoření dobrých pracovních podmínek a Ing. Antotínu Stratilovi, DrSc. Za spolupráci v Oddělení biochemické a molekulární genetiky ÚŽFG AV ČR v Liběchově. Dále bych chtěl poděkovat celému kolektivu tohoto oddělení, zvláště pak paní Marii Datlové, za vytvoření příjemného pracovního prostředí a všestrannou pomoc a také prof. Dr. Hermanu Geldermanovi za poskytnutí vzorků DNA prasat z PiGMaP rodin vytvořených na Hohenheimské Univerzitě.
Obsah 1. Úvod......................................................................................................................... 4 2. Cíl práce ................................................................................................................... 5 3. Literární přehled....................................................................................................... 6 3.1. Struktura savčího genomu a genu ..................................................................... 6 3.1.1. Struktura savčího genomu.......................................................................... 6 3.1.2. Struktura savčího genu............................................................................... 8 3.2. Mapování genomů hospodářských zvířat, genetické markery a QTL .............. 8 3.2.1. Genetické markery ..................................................................................... 9 3.2.2. Mapování genomů hospodářských zvířat ................................................ 10 3.2.3. Lokusy kvantitativních znaků .................................................................. 11 3.3. Molekulárně-biologické metody detekce a testování polymorfismů DNA .... 12 3.3.1. PCR .......................................................................................................... 12 3.3.1.1. Princip metody .................................................................................. 13 3.3.1.1.1. Taq polymeráza.......................................................................... 13 3.3.1.2. PCR primery...................................................................................... 14 3.3.1.3. Optimalizace PCR............................................................................. 15 3.3.1.3.1. Složení reakční směsi................................................................. 15 3.3.1.3.2. Teplotní režim PCR ................................................................... 17 3.3.2. RFLP – Polymorfismus délky restrikčních fragmentů............................. 18 3.3.3. PCR – RFLP............................................................................................. 18 3.3.4. SSCP (konformační polymorfismus jednořetězcové DNA) .................... 19 3.3.5. DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza)........................... 20 3.3.5.1. CDGE (gelová elektroforéza při konstantní koncentraci denaturantu) ........................................................................................................................ 21 3.3.5.2. TTGE (gelová elektroforéza při teplotním gradientu) ...................... 21 3.3.6. Heteroduplexní analýza............................................................................ 22 3.3.7. Sekvenování ............................................................................................. 22 3.4. Studované kandidátní geny pro užitkové vlastnosti u prasete ........................ 23 3.4.1. Leptinový receptor (LEPR)...................................................................... 23 3.4.2. Nervový růstový faktor beta (NGFB) ...................................................... 24
1
3.4.3. Myostatin (MSTN).................................................................................... 25 3.4.4. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ).................. 26 3.4.5. 54 - a 56 - kDa isoformy vakuolární H+-ATPázové podjednotky (ATP6) ............................................................................................................................ 26 3.4.6. Na+-, K+- ATPáza, podjednotka B1 (ATP1B1) ........................................ 27 4. Materiál a metodika ............................................................................................... 29 4.1. Zvířata ............................................................................................................. 29 4.2. Použité roztoky ............................................................................................... 29 4.3. PCR ................................................................................................................. 34 4.3.1. LEPR ........................................................................................................ 35 4.3.2. NGFB ....................................................................................................... 36 4.3.3. MSTN ....................................................................................................... 36 4.3.4. PPARγ ...................................................................................................... 37 4.3.5. ATP6......................................................................................................... 37 4.3.6. ATP1B1 .................................................................................................... 38 4.4. Štěpení restrikčními endonukleázami ............................................................. 38 4.5. Elektroforéza v agarózovém gelu ................................................................... 40 4.6. Denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE)................................. 40 4.7. Sekvenování .................................................................................................... 41 5. Výsledky a diskuse................................................................................................. 45 5.1. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu LEPR .............................. 45 5.2. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu NGFB ............................. 50 5.3. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu MSTN.............................. 53 5.4. Studium polymorfismu genu PPARγ .............................................................. 56 5.5. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu ATP6............................... 57 5.6. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu ATP1B1 ......................... 60 6. Souhrn .................................................................................................................... 67 7. Summary ................................................................................................................ 70 8. Seznam použitých zkratek ..................................................................................... 73 9. Seznam použité literatury....................................................................................... 75 10. Životopisné údaje a seznam publikací ................................................................. 86 10.1. Životopisné údaje.......................................................................................... 86
2
10.2. Původní práce uveřejněné v oponovaných časopisech ................................. 86 10.3. Původní práce uveřejněné na konferencích .................................................. 87 10.4. Další publikace.............................................................................................. 88 11. Přílohy.................................................................................................................. 89
3
1. Úvod První zvířata byla domestikována asi 10 000 let př.n.l. a od těch dob člověk využívá různých vlastností (markerů) pro šlechtění pomocí selekce. Toto časné „genetické inženýrství“ vedlo k vytvoření obrovské variability znaků u hospodářských zvířat. Rozdíl ve velikosti mezi plemeny koní Shire a Shetlandský pony je názorným příkladem diverzity získané umělou selekcí. Začátkem tohoto století vedlo spojení biometriky a mendelistické genetiky ke vzniku kvantitativní genetiky a k vytvoření teorie šlechtění používané dodnes. Od 40-tých let se rozšiřuje vědecké šlechtění založené především na selekci produkčních znaků. Tato biometrická éra genetiky zvířat byla neobyčejně úspěšná ve zvyšování produktivity všech hlavních druhů hospodářských zvířat. Jako příklad může posloužit zvýšení mléčné produkce ve Spojených státech ze 4 500 kg na více než 6 800 kg mléka na dojnici a rok za méně než dvacet let (Pearson et al., 1990) nebo ztrojnásobení hmotnosti kuřat v roce 1991 oproti kuřatům stejného věku a při stejné dietě jako v roce 1957 (Havenstein et al., 1994). Avšak tradiční metody mají svá omezení. Fenotyp zvířete je jako „černá skříňka“ a my nejsme schopni určit, vůči kterým individuálním genům, respektive alelám byla selekce uplatněna. V důsledku intenzivní selekce na jeden znak dochází často i selekci negativní vlastnosti, což vede k narůstání problémů s reprodukcí, ke snížení odolnosti zvířat proti stresu a chorobám a také ke snížení jakosti živočišných produktů. Šlechtitelé a producenti proto požadují rozšíření znalostí o biologických a genetických drahách ovlivňujících důležité vlastnosti, zkvalitnění šlechtitelské strategie s ohledem na kvalitu a zdraví, zachování genetické variability a vypracování metod šlechtění kombinujících fenotypovou a genotypovou informaci v plemenné hodnotě. V současnosti nejmodernější a nejpřesnější způsob jak toho dosáhnout, je studium kandidátních genů pro užitkové vlastnosti na úrovni DNA. Popsaný genetický marker lze pak využít pro konstrukci genetických map, detekci lokusů kvantitativních genů (QTL) a v praxi pro selekci zvířat (MAS).
4
2. Cíl práce Předkládaná práce měla tyto základní cíle: 1. Zvládnout metody molekulární genetiky pro studium polymorfismu genů na úrovni DNA. 2. Vybrat vhodné kandidátní geny pro znaky jatečné hodnoty prasat, připravit amplifikaci jejich fragmentů metodou PCR (navržení primerů, optimalizace podmínek reakce) a pomocí metod PCR-RFLP, DGGE a sekvenování detekovat polymorfismus. 3. Na základě zjištěných polymorfismů popsat molekulárně-genetické markery a vypracovat metodiky pro rutinní testování zvířat. 4. U vybraných populací prasat určit genotypy vybraných markerů pro další genetické studie – vazbové mapování, mapování QTL.
5
3. Literární přehled 3.1. Struktura savčího genomu a genu 3.1.1. Struktura savčího genomu Studium genomů hospodářských zvířat vychází z dosavadních znalostí o struktuře genomu eukaryot – z nich pak především člověka. Genom člověka, ale i prasete a skotu je tvořen v haploidní buňce DNA s přibližně 3 – 3,5 miliardami bazí, což představuje asi 100 000 genů. Schmitz et al. (1992) uvádějí u prasete 2,72 x 109 párů bazí pro haploidní jádro s X chromozómem a 2,62 x 109 párů bazí pro jádro s chromozómem Y. Pouze 5 – 10 % genomu je funkční, to znamená, že je transkribováno (geny) nebo transkripci řídí, a pouze 2 – 3 % tvoří exony. Přesný počet genů není znám, ale obecně se uvádí u obratlovců v rozmezí 50 000 – 100 000, v závislosti na velikosti genomu. Sekvence nukleotidů v DNA obsažené v genomu lze rozdělit na jedinečné a na opakované, repetitivní. Mnoho sekvencí, z nich pak především kódující geny, se vyskytuje v celém genomu pouze jedenkrát. Značná část genomu je však tvořena repetitivními sekvencemi, které je možno rozdělit na tandemové repetice a roztroušené repetice – vmezeřené elementy. Vmezeřené elementy roztroušené po celém genomu je možno rozdělit do několika kategorií. Z hlediska využití v genetice hospodářských zvířat málo významné DNA a RNA pohyblivé elementy (transpozóny a retropozóny) a retroviry. Větší význam mají sekvence označované jako LINE a SINE – dlouhé a krátké roztroušené nukleární elementy. LINE jsou třídou retropozónů vyvinuté z endogenních retrovirů. SINE jsou krátké elementy okolo 200 párů bazí, které se přemísťují přes RNA mezistupeň. U prasete se vyskytují 3 rodiny, z nichž PRE – 1 rodina (prasečí repetitivní element) se vyskytuje nejčastěji (Singer et al., 1987). Ellegren (1993) uvádí výskyt PRE – 1 na každých 12 000 bazí, Takahashi et al. (1992) odhadují jejich počet na 500 000. Tandemové repetice jsou tvořeny od mnohonásobně opakovaných sekvencí malých a nefunkčních jednotek až po méně opakované, někdy funkční, sekvence, např.
6
ribozomální RNA geny. Minisatelity jsou tvořeny několikanásobně opakovanou sekvencí – motivem – o velikosti 9 – 64 (a více) bazí. Pro jejich hypervariabilitu v počtu tandemových opakování jsou někdy nazývány VNTR (variable number tandem repeats) (Nakamura et al., 1987). Také mikrosatelity představují VNTR, ale opakující se krátký motiv (1 – 6 nukleotidů) a menší počet opakování umožňují jednoduchou amplifikaci pomocí PCR. Mikrosatelity, kterých je extrémně vysoký počet a které jsou náhodně roztroušeny v celém genomu, tak představují ideální genetické markery, o čemž svědčí vazbové mapy mnoha savčích druhů, založené právě na mikrosatelitech. Teloméry a konce chromozómů mají speciální vlastnosti, které je chrání před degradacemi a fúzemi s odlomenými částmi chromozómů. Běžná DNA polymeráza není schopna syntetizovat DNA ke konci diskontinuálně rostoucího vlákna, což by způsobovalo zkracování konců chromozómů během duplikace. Bylo zjištěno, že savčí chromozómy obsahují na konci hexamer (TTAGGG)n (Blackburn, 1991), jehož kopie mohou představovat 10 – 15 kb u člověka a 100 – 150 kb u hlodavců. Tato sekvence je komplementární k RNA telomerázy, která dosyntetizovává konce chromozómů u zárodečných linií buněk. V somatických buňkách není telomeráza exprimována a tudíž během duplikací se snižuje počet opakování hexameru. Toto zkracování chromozómů je považováno za jeden z důvodů stárnutí a smrti buňky. U savců, podobně jako u jiných organismů, jsou některé repetitivní sekvence exprimovány a plní důležité funkce v buňce. V některých případech je repetice genu nutná k dosažení adekvátní úrovně exprese, v jiných případech se duplikovaný gen může evolučně přeměnit v gen s novou funkcí. K dosažení vysokého stupně exprese jsou geny pro 18S, 5,8S a 28S rRNA sestaveny do skupiny a počet těchto skupin se pohybuje v rozmezí 150 – 300. U prasete jsou tyto skupiny lokalizovány na chromozómech 8, 10 a 16. Geny pro 5S rRNA jsou také tandemově opakovány a u prasete se nachází na chromozómu 14. Také vysoká potřeba tRNA může být kryta pouze transkripcí většího počtu kopií daného genu. V genomu se vyskytuje až několik set kopií genů pro jednotlivé tRNA řazených do skupin. Některé geny jsou velmi podobné (sekvencí a funkcí) a označují se jako genová rodina. U savců je mnoho genových rodin kódujících proteiny, jejíž členové vykazují
7
vývojově nebo tkáňově specifickou expresi. Známým příkladem je globinová genová rodina. Dále je možno jmenovat genovou rodinu ATP1 (Na+, K+-ATPasa), nebo kaseinovou rodinu mléčných proteinů. V rámci genových rodin se vyskytují i pseudogeny, které jsou inaktivovány mutacemi, jako posunem čtecího rámce, ztrátou či změnou promotoru apod.
3.1.2. Struktura savčího genu Sekvence typického savčího genu je rozdělena do několika funkčních částí. Na 5´-konci je lokalizována promotorová oblast obsahující v pozici –30 GoldbergHognessův box (tzv. TATA-box), důležitý pro správné navázání RNA polymerázy II a pro iniciaci transkripce. Začátek přepisu je určen adenosinem v pozici +1 a iniciační (start) metioninový kodon (ATG), který označuje začátek translace všech eukaryotických genů, je umístěn obvykle v poloze +64. Sekvence mezi začátkem transkripce a start kodonem se označuje jako 5´-UTR (nepřekládaná oblast). Dále následuje různý počet exonů oddělených introny, které začínají donorovým (GT) a končí akceptorovým (AG) místem sestřihu. V posledním exonu se nachází stop kodon následovaný 3´-UTR, která obsahuje sekvenci AATAAA, představující polyadenylační signál. Kromě těchto obecných částí se vyskytují další regulační oblasti důležité pro tkáňově a vývojově regulovanou expresi. Jsou to vazebná místa transkripčních
faktorů
lokalizovaná
v promotoru,
zesilovače
transkripce,
představované delšími sekvencemi umístěnými před nebo za genem a zeslabovače transkripce, tvořené krátkými, často opakovanými sekvencemi.
3.2. Mapování genomů hospodářských zvířat, genetické markery a QTL Přirozeně existující, nebo uměle vytvořená genetická variabilita je zásadním předpokladem šlechtění hospodářských zvířat. Většina hlavních produkčních vlastností patří mezi kvantitativní znaky a vykazují kontinuální proměnlivost. Jsou determinovány alelami většího počtu genů - lokusů kvantitativních znaků (QTL quantitative trait loci) a jsou často dosti ovlivněny faktory vnějšího prostředí. Jejich
8
heritabilita je v rozpětí od méně než 5% do více než 50%. Zatím nemáme jasnou představu o počtu, lokalizaci a působení lokusů kvantitativních znaků. V posledním desetiletí však byly pomocí molekulárně-genetických metod vytvořeny detailní genetické mapy založené na DNA markerech umožňující disekci kvantitativních znaků. Hlavním cílem studia QTL je nalezení takového markeru, který může být zařazen do šlechtitelského schématu – v rámci selekce podporované markery (MAS – marker assisted selection).
3.2.1. Genetické markery Jako genetický marker označujeme polymorfní znak, jehož varianty vykazují mendelistickou dědičnost a mohou být asociovány s variabilitou užitkových vlastností. Genetické markery lze rozdělit do dvou skupin: a) Markery typu I – exprimované geny, které mohou být z hlediska fyziologické funkce kandidátními geny pro QTL. b) Markery typu II – nekódující vysoce variabilní sekvence DNA, většinou mini- a mikrosatelity. Brascamp et al. (1995) definovali podmínky pro praktické využití genetických markerů ve šlechtění zvířat: a) kodominantní dědičnost, b) jednotková heritabilita – h2= 1, c) stanovení genotypu markeru může být provedeno kdykoliv bez ohledu na věk a pohlaví zvířete, d) metoda detekce markeru by měla být jednoduchá, s malou pravděpodobností chyby, automatizovatelná a co nejlevnější. Prvním markerem typu I, který je od vypracování metodiky pro testování na úrovni DNA prakticky celosvětově využíván ve šlechtění prasat, je gen ryanodinového receptoru (RYR1, HAL, CRC) spojený se stresovým syndromem (PSS) a výskytem PSE masa (Fujii et al., 1991). Tento gen má zároveň vliv na zvýšení podílu maso/tuk v jatečné půlce (Webb a Simpson, 1986). Dalším markerem typu I využívaném
9
ve šlechtění prasat je např. gen estrogenového receptoru (ESR), asociovaný s větším počtem selat ve vrhu (Rothschild et al., 1996). U markerů typu II je třeba mít na zřeteli, že jsou „pouze“ ve vazbě s QTL, takže v jedné populaci může být určitá alela asociována s vyšší úrovní užitkové vlastnosti, u druhé populace s nižší a u třetí nemusí být asociována vůbec, protože zde nesegreguje (Haley, 1995). Například Georges et al. (1995) analyzovali metodou „vnuček“ 14 rodin skotu a průkazný vliv identifikovali pouze u dvou (jeden chromozomální úsek) a jedné rodiny (4 oblasti).
3.2.2. Mapování genomů hospodářských zvířat Metodické přístupy k mapování genomů hospodářských zvířat jsou stejné jako u člověka a využívají jeho výsledky. Na rozdíl od mapování genomu člověka však nemají za cíl zjištění kompletní sekvence celého genomu, ale jsou východiskem pro genetickou analýzu, genové manipulace a šlechtění (Buitkamp a Epplen, 1996). Výsledky jsou využitelné při vytváření zvířecích modelů pro výzkum lidských chorob nebo produkci lidských proteinů. Zároveň umožňují rozšířit databázi pro studium evoluce genomu savců (O’Brien et al., 1993). Genetická mapa znázorňuje rozmístění sekvencí DNA se známými i neznámými funkcemi na chromozómech a vykresluje jejich genetickou a fyzickou lokalizaci, pořadí a prostorové vazby. Vztahy mezi různými oblastmi genomu jsou popsány vzhledem ke standardnímu nomenklaturnímu systému chromozómů, určených velikostí, tvarem a specifickým barvením (pruhováním). Existuje řada navzájem se doplňujících metod mapování, které dávají vzniknout několika typům genetických map
–
cytogenetické
(chromozómové),
fyzické,
vazbové
(rekombinantní)
a srovnávací (komparativní). Za účelem sestavení cytogenetické a vazbové mapy prasete byl vypracován mezinárodní projekt mapování genomu PiGMaP (Archibald et al., 1991). V průběhu let bylo publikováno několik genových map prasete (Ellegren et al. 1994, Rohrer et al. 1994, Archibald et al. 1995, Marklund et al. 1996, Robic et al., 1996, Rohrer et al. 1996, Mikawa et al. 1999). V roce 1995 bylo cytogeneticky
10
lokalizováno 154 markerů (Yerle et al., 1995), dosud poslední cytogenetická mapa z roku 1997 obsahuje již 436 markerů, z nichž 160 tvoří geny (Yerle et al., 1997). Poslední publikovaná vazbová mapa obsahuje 1042 markerů (Rohrer et al. 1996).Genové mapy jsou s přibývajícími poznatky neustále doplňovány a aktuální stav
je
prezentován
na
internetu
(např.
http://www.ri.bbsrc.ac.uk/pigmap/
pigmap.html, http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/cyto/cyto.htm).
3.2.3. Lokusy kvantitativních znaků Detailní, nebo přiměřeně podrobné genetické mapy umožňují disekci kvantitativních znaků na mendelisticky děděné jednotky, označované jako QTL (Geldermann, 1975). Georges a Massey (1991) použili pro tyto jednotky termín ETL (economic trait loci) - lokusy ekonomických vlastností. Cílem mapování genomů hospodářských zvířat je detekce a identifikace ETL, jejich využití v selekčních programech pomocí selekce s využitím markerů (MAS), případně genové manipulace. Gen, u kterého se předpokládá významný vliv na užitkovou vlastnost, je označován jako kandidátní gen. Kromě využitelnosti v selekci (MAS) a šlechtění je identifikace genu a znalost jeho polymorfismu důležitá i pro poznání přesné biologické funkce daného genu. Při výběru kandidátního genu pro hledání polymorfismu a další genetické studie – vazbové mapování, zjišťování asociací s užitkovými vlastnostmi – je třeba vycházet z těchto hledisek: •
Biochemická
a
fyziologická
funkce
produktu
genu
zapojeného
v metabolických drahách, např. receptory hormonů, růstové faktory apod. •
Srovnání s jinými studovanými organizmy. Při známém účinku genu na některou kvantitativní vlastnost u jiného savčího druhu, lze předpokládat obdobný účinek i u prasete. Vzhledem k pokročilému stavu výzkumu u člověka a myši jsou nejčastěji čerpány informace právě z těchto oblastí.
•
Lokalizace QTL. Pokud určitý gen leží v oblasti, kde byl pomocí markerů typu II mapován QTL, může být tento gen kandidátní pro danou vlastnost.
11
Andersson et al. (1994) analyzovali pomocí 105 markerů typu II na 15 chromozómech přítomnost a rozmístění QTL. Na chromozómu 4 lokalizovali QTL ovlivňující růst, ukládání tuku a délku tenkého střeva. Pro ukládání tuku zjistili dvouvrcholovou křivku a pro růst plochou jednovrcholovou křivku statistických hodnot (F hodnot). Pravděpodobně jsou zde lokalizovány dva nebo více QTL ovlivňující uvedené znaky. Na chromozómu 13 byl zjištěn QTL ovlivňující časný růst (denní přírůstek do 30 kg). Walling et al. (1998) zjistili QTL se silným efektem na růst na chromozómu 4. Geldermann et al. (1999) analyzovali 8 chromozómů u třígeneračních rodin (PiGMaP, Hohenheim) vzniklých křížením kontrastních plemen (WxP, MxP, WxM). Vysoce průkazné efekty pro znaky jatečné hodnoty byly zjištěny na chromozómech 1 a 4 (u všech tří rodin), na chromozómu 6 (WxP a MxP) a chromozómu 7 (MxP a WxM).
3.3. Molekulárně-biologické metody detekce a testování polymorfismů DNA V této kapitole jsou uvedeny základní molekulárně-biologické metody používané pro vyhledávání a testování polymorfismů na úrovni DNA u hospodářských zvířat.
3.3.1. PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR), kterou poprvé popsali Saiki et al. (1985), je velmi rychlá a jednoduše proveditelná metoda pro mnohonásobnou enzymatickou amplifikaci specifického fragmentu DNA in vitro. PCR nachází široké uplatnění v řadě dalších aplikací a její využívání se stále rozšiřuje. Je používána pro přímé klonování genomické DNA nebo cDNA, in vitro mutagenezi a tvorbu rekombinantní DNA, genetický „fingerprinting“ (otisk prstů) v soudnictví, v humánní medicíně pro určení přítomnosti cizího genomu - infekčních agens, prenatální diagnostiku genetických chorob, určení jednotlivých alel, dále pro určení struktury transkribované RNA a přímé sekvenování genomické DNA a cDNA. V genetice hospodářských zvířat se využívání PCR plošně rozšířilo po
12
zveřejnění tzv. DNA testu pro určení genotypů ryanodinového receptoru u prasat (Fujii et al., 1991).
3.3.1.1. Princip metody PCR je tříkroková reakce, jejíž jednotlivé fáze jsou řízeny pouze teplotou v reakční směsi. Je založena na elongaci primerů, krátkých oligonukleotidů, které se komplementárně připojují k sekvenci DNA, která má být amplifikována. Geometrická syntéza přesně definovaných molekul DNA je katalyzována termostabilní DNA - dependentní - DNA polymerázou. Primery hybridizují s oběma vlákny denaturované matricové DNA v opačné orientaci, takže je syntetizována oblast mezi primery a vzniknou dva dvouvláknové produkty, které po opětovné denaturaci slouží jako templát v dalším cyklu hybridizace a syntézy. Ve třetím cyklu pak vzniknou dvě dvouvláknové molekuly DNA, představující cílovou oblast, ohraničené oběma primery. V následných cyklech denaturace, hybridizace a elongace se exponenciálně akumulují tyto specifické fragmenty DNA. Jelikož se množství molekul DNA v každém cyklu zdvojnásobí, pak z každé molekuly původního templátu vznikne 2n kopií, kde n je počet cyklů. Na příklad po 30 cyklech teoreticky vznikne 2 x 108 specifických fragmentů z výchozí jedné molekuly DNA. Amplifikace je limitována množstvím substrátu a aktivitou polymerázy a účinnost je odhadována na 60 - 85 % (Saiki et al., 1988). V původním popisu metody PCR (Saiki et al., 1985) byl použit Klenowův fragment DNA polymerázy E. coli, který z důvodů teplotní denaturace musel být přidáván v každém cyklu reakce. Průlom ve využití této metody znamenal objev Taq DNA polymerázy, vyizolované z termofilní baktérie Thermus aquaticus. Tato polymeráza zůstává aktivní i po krátkodobém zahřátí na teplotu okolo 95°C, která se používá pro oddělení jednotlivých vláken DNA. Použití Taq polymerázy umožnilo automatizovat PCR v teplotních cyklerech kontrolujících průběh reakce. Taq polymeráza rovněž umožňuje používání vyšších teplot pro hybridizaci primerů a jejich extenzi, což zvyšuje přesnost nasedání primerů a tím specifitu produktu.
3.3.1.1.1. Taq polymeráza
13
Taq polymeráza odolává opakovanému krátkodobému zahřátí na vysokou teplotu a opětnému zchlazení a syntetizuje DNA při vysoké teplotě (obvykle 72°C), při níž denaturují chybně připojené primery a oblasti lokálních sekundárních struktůr. Dlouhodobější zahřátí enzymu však snižuje jeho aktivitu a proto je někdy doporučován tzv. „hot start“, kdy je enzym přidáván až po první (obvykle delší) denaturaci PCR směsi. Zvýšení množství enzymu nad úroveň 2,5 U/reakci (25 µl) vede ke zvýšení výskytu nespecifických produktů. Taq polymeráza postrádá 3’ - 5’ korekční (proofreading) exonukleázovou aktivitu, což vede k chybám během PCR. Frekvence chybně zařazených nukleotidů byla odhadnuta na úrovni 2 x 10-4 nukleotidů za cyklus (Saiki et al., 1988). U aplikací vyžadujících vysokou přesnost je možné tento problém překonat použitím polymerázy s 3’ - 5’ exonukleázovou aktivitou. Taq polymeráza přidává netemplátové (přesahující) nukleotidy ke 3’ konci DNA řetězce, což může způsobovat problémy při klonování.
3.3.1.2. PCR primery Výběr určitého páru primerů se jeví jako klíčový pro zdárný výsledek PCR. Při výběru primerů je třeba přihlížet k několika základním parametrům ovlivňujících jejich kvalitu. Jsou to: délka oligonukleotidu, teplota tání (Tm) a obsah G+C, stabilita 3’ konce, komplementarita uvnitř primeru a mezi dvěma primery použitými v jedné reakci a specifita sekvence 3’ konce primeru. Velikost primeru ovlivňuje specifitu reakce. Kratší oligonukleotidy lépe hybridizují s templátem, ale jsou méně specifické z důvodu vyššího počtu velmi podobných nebo identických sekvencí v genomu. Delší primery jsou naopak vysoce specifické, často však tvoří vlásenky a nespecificky se párují s druhým primerem za vzniku primer - dimerové struktury, čímž se snižuje výtěžek reakce. Obvykle se používají primery v rozmezí 18 - 24 bazí, pro delší fragmenty pak v rozmezí 21 - 34 bazí. Teplota tání DNA (Tm) obou primerů by měla být stejná, nebo co nejvíce podobná. Tm je závislá především na délce primeru a obsahu G+C. Optimální je obsah G+C
14
okolo 50%. Primery s vyšší Tm jsou více specifické, což je nutné při amplifikaci delších fragmentů (Innis et al., 1990). Stabilita 3’ konce: DNA polymeráza zahájí elongaci pouze pokud je několik posledních nukleotidů primeru plně hybridizováno s templátem. Volná energie duplexu primer - templát větší než -8 kcal/mol (málo stabilní konec) vyžaduje pro vznik stabilního duplexu přesně komplementární sekvenci templátu. Naopak stabilní 3’ konce se pevně vážou jen několika komplementárními nukleotidy k templátu a DNA polymeráza pak zahajuje elongaci od nespecifického místa. Umístění energeticky silného páru na 3’ konci není vhodné z důvodů snížení specifity reakce (Rychlik a Rhoads, 1989). Vnitřní komplementarita primeru způsobuje vznik vlásenkových struktur, které prostorově brání nasednutí primeru na templát. Komplementarita mezi primery se může týkat molekul jednoho primeru nebo obou, případně více, primerů použitých v reakci. Silně komplementární primery přednostně hybridizují navzájem a v případě komplementárního 3’ konce dochází k nespecifické elongaci a vzniku dimerů primerů, což snižuje výtěžek reakce (Chou et al., 1992). Unikátnost sekvence 3’ konce primeru je klíčová pro specifitu reakce. Pokud je 3’-konec primeru komplementární k jiné sekvenci templátu, může začít elongace z tohoto nespecifického místa.
3.3.1.3. Optimalizace PCR - je postup nalezení nejvhodnějších podmínek pro amplifikaci určitého produktu. Tyto podmínky - složení reakční směsi a teplotní a časový průběh reakce - se liší pro každý jednotlivý produkt a optimalizace je nutná i při přejímání metodiky z literatury, neboť se mohou lišit podmínky mezi jednotlivými laboratořemi. 3.3.1.3.1. Složení reakční směsi.
15
PCR směs obvykle obsahuje: templátovou DNA, pracovní pufr, směs všech čtyř nukleotidů (dNTP), specifické primery pro danou oblast a termostabilní DNA polymerázu (většinou Taq), popřípadě různá aditiva. Substrátem je většinou dvouvláknová DNA získaná různým způsobem. Je důležité, aby roztok DNA neobsahoval inhibitory reakce (EDTA, detergenty, fenol). Obvykle 100 ng genomické DNA představuje dostatečné množství templátu pro následnou detekci PCR produktu pomocí ethidiumbromidu (Saiki et al., 1985, Mullis a Faloona, 1987). Pracovní pufr vytváří prostředí, ve kterém bude působit DNA polymeráza a ve kterém se budou nacházet ostatní složky reakce. Je dodáván výrobcem spolu s polymerázou a nedoporučuje se kombinovat pufr a polymerázu od jiných výrobců. PCR pufr (10 x koncentrovaný) obvykle obsahuje 500 mM KCl, 100 mM TRIS-HCl (pH 8,4 při 20°C) a 1 mg/ml želatiny. Někdy bývá součástí pufru i 15 mM MgCl2 nebo je dodáván samostatně jako 25 mM roztok. Určení optimální koncentrace MgCl2, která se může lišit pro různé primery navržené ze stejné oblasti cílové sekvence (Saiki et al., 1988), může mít enormní vliv na výsledek PCR. Volný hořčík je nutný pro vazbu Taq polymerázy na komplex templát - primer i pro vazbu dNTP a jeho koncentrace ovlivňuje přesnost nasedání primerů, teplotu disociace vláken DNA, vznik primerových dimerů, přesnost a účinnost polymerázy. Deoxyribonukleozid
trifosfáty
(dNTP)
představují
stavební
kameny
nově
syntetizovaných řetězců. Používají se většinou jako předem připravená směs ekvivalentního množství všech čtyř dNTP v koncentraci 200µM pro každý nukleotid. To představuje dobrý kompromis mezi výtěžkem rekce a přesností polymerázy. Primery svým složením určují specifitu reakce. Koncentrace primerů je závislá na jejich sekvenci a na složení nukleotidů templátové DNA. Nejpoužívanější koncentrace je v rozmezí 0,1 - 1,0 µM. Vyšší hladina primerů způsobuje snížení specifity reakce v důsledku falešného párování primerů s templátem a zvýšení pravděpodobnosti tvorby primerových dimerů.
16
DNA polymeráza katalyzuje prodlužování primeru připojováním volných nukleotidů podle sekvence templátového vlákna DNA. Obvykle se používá v množství 1 2,5 U/ 100µl reakční směsi (Lawyer et al., 1989). Nadbytečné množství zvyšuje tvorbu nespecifických produktů na úkor požadovaného fragmentu (Saiki et al., 1988). Aditiva, jako DMSO (dimethysulfoxid - 1 - 10 %), formamid (1,25 - 10 %), glycerol (5 - 20 %), mohou zvyšovat specifitu reakce nebo výtěžek (Pomp a Medrano, 1991). Látky jako formamid nebo DMSO brání tvorbě vodíkových vazeb - snižují teplotu tání - a zlepšují nasedání primerů (Mullis a Faloona, 1987). BSA (bovinní sérový albumin) a neionogenní detergenty pomáhají stabilizovat enzym. 3.3.1.3.2. Teplotní režim PCR PCR spočívá v opakovaných změnách teploty na doby nezbytné k proběhnutí procesů denaturace, anealace (připojení) primerů a syntézy nových vláken DNA a probíhá v automatických termálních cyklerech. Teploty a časy jednotlivých kroků jsou závislé na sekvenci a délce templátu a na sekvenci primerů. Dvouvláknová DNA je denaturována při krátkém zahřátí na teplotu 90 - 95°C, připojení primerů ke komplementárním sekvencím probíhá při teplotách 40 - 60°C a při teplotě 72°C (pro Taq polymerázu) jsou prodlužovány primery. Dlouhá denaturace snižuje aktivitu polymerázy, rovněž se nedoporučuje dlouhá inkubace při anealační teplotě z důvodů vzniku nespecifických produktů. Při teplotě 72°C pro syntézu nových vláken vykazuje Taq polymeráza maximální aktivitu 1000 bp za minutu. Doba inkubace při této teplotě pak závisí na délce syntetizovaného produktu. Většina teplotních profilů PCR se skládá z cyklů denaturace při 93 - 95°C po dobu 20 - 60 sekund, anealace při 50 - 65°C 15 - 30 sekund a elongace při 72°C 30 - 60 sekund (až 3 minuty pro dlouhé fragmenty) opakovaných 25 - 35 krát. Většina programů začíná delší inkubací při 95°C (obvykle 2 minuty) zajišťující dokonalou denaturaci genomické DNA a končí prodlouženou elongací (5 - 10 minut) umožňující dosyntetizování všech produktů.
17
Každou PCR reakci je nutné vzhledem k interakcím primerů s templátem a odlišným teplotním podmínkám u jednotlivých termálních cyklerů optimalizovat zvlášť.
3.3.2. RFLP – Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Vznik metody RFLP (restriction fragment length polymorphism) souvisí s objevem specifických restrikčních endonukleáz, které se váží k určité sekvenci DNA a uvnitř této sekvence dvoušroubovici rozštěpí (Smith a Wilcox, 1970). Některé endonukleázy štěpí DNA uprostřed svého rozlišovacího místa a poskytují zarovnané konce fragmentů, jiné enzymy pak štěpí posunutě a vytváří krátké jednovláknové (kohézní) úseky na konci každého fragmentu, čehož lze využít v dalších metodách. V případě mutace v restrikčním místě může toto místo zaniknout, nebo vzniknout nové. Při štěpení DNA pak vzniknou fragmenty o různé délce. U klasické RFLP je štěpena genomická DNA určitou endonukleázou a vzniklé fragmenty jsou po separaci v agarózovém nebo jiném gelu přeneseny (blotovány) na pevnou membránu (Southern, 1975). Polymorfismus ve velikosti vzniklých fragmentů lze zjistit po hybridizaci se značenou sondou DNA. Pokud je jako sonda použita komplementární
DNA
(cDNA),
je
touto
metodou
možno
identifikovat
polymorfismus uvnitř markerů typu I. Dnes se dává přednost rychlejší a jednodušší modifikaci vzniklé kombinací s PCR (PCR – RFLP).
3.3.3. PCR – RFLP Princip metody je stejný, jako u klasické RFLP, polymorfismus je však detekován pouze v relativně krátkém úseku DNA, který byl amplifikován pomocí PCR. Při štěpení určitou endonukleázou vzniknou v případě přítomnosti či absence restrikčního místa fragmenty o různé velikosti, které jsou separovány v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Vizualizace fragmentů se pak provádí většinou pomocí ethidiumbromidu (Sambrook et al., 1989). Metoda je nenáročná, avšak pravděpodobnost detekce polymorfismu (mutace) je nízká a závisí na počtu použitých restrikčních enzymů. Metoda je vhodná pro nekódujíci sekvence a pro více polymorfní geny. Zvýšit účinnost je možno sekvenováním PCR produktu
18
od několika zvířat, kdy lze přímo odhalit mutaci v určitém restrikčním místě a vhodný enzym pak použít pro testování. Sekvenováním se určí i přesná lokalizace a eventuální vliv bodové mutace na aminokyselinové složení polypeptidu.
3.3.4. SSCP (konformační polymorfismus jednořetězcové DNA) SSCP (single-strand conformation polymorphism) je pro svou jednoduchost a přizpůsobivost široce používaná metoda pro odhalování a detekci polymorfismu v krátkých úsecích DNA. Studovaný fragment je amplifikovám pomocí PCR, denaturován a elektroforeticky separován v nedenaturujícím gelu (Orita et al., 1989). Konformace (terciární struktura) jednovláknové DNA je určena (determinována) intramolekulárními interakcemi. Mutace - změna sekvence - pak způsobí změnu konformace a tím i elektroforetickou mobilitu fragmentu. Intramolekulární interakce se mohou měnit v závislosti na fyzikálních podmínkách jako teplotě (3 - 30°C), iontovém prostředí (pH), koncentraci glycerolu (0 - 10%) a mnoha dalších. Separace mutantní DNA je tedy závislá na podmínkách elektroforézy, které se ovšem pro jednotlivý fragment nedají předpovědět. Výhodou metody je vysoká citlivost, jednoduchost a mnohostranost. Metoda je vysoce citlivá u krátkých fragmentů (do délky 300 pb), ale je dostatečně citlivá i pro fragmenty okolo 800 pb délky (Kukita et al., 1997). Nevýhodou je nutnost přesné optimalizace podmínek elektroforézy. Vizualizace fragmentů se provádí autoradiograficky, barvením stříbrem (Merril et al., 1981) nebo fluorescenčně v automatických sekvenátorech (Makino et al., 1992). Delší PCR produkty (až 9 kb, Gilad et al., 1996) je nutné štěpit jednou nebo několika restrikčními endonukleázami a směs fragmentů analyzovat pomocí SSCP (restriction endonuclease fingerprinting - REF, Liu a Sommer, 1995).
19
3.3.5. DGGE
(denaturační
gradientová
gelová
elektroforéza) DGGE je obecné označení skupiny metod pro detekci bodových mutací založených na
změně
elektroforetické
mobility
částečně
rozpojených
molekul
DNA
v polyakrylamidovém gelu. Separační metody, na nichž je DGGE založena, byly poprvé popsány Fischerem a Lermanem (1983). Všechny tyto metody mají společné znaky: •
Citlivost ke změnám sekvence je dána závislostí termální stability dvoušroubovice na její sekvenci.
•
Původní a mutované molekuly jsou fyzicky separovány.
•
Separované molekuly mohou být nezměněné vyjmuty a dále použity.
•
Separace probíhá za podmínek blízkých rovnováze mezi helikální a částečně denaturovanou formou. Tyto podmínky jsou kombinací teploty a koncentrace denaturantu.
•
Citlivost
ke
změnám
sekvence
je
předpověditelná
na
základě
termodynamické a elektroforetické teorie. Uvnitř dostatečně dlouhých molekul DNA se dvoušroubovice rozplétá při zvyšující se teplotě ve více méně oddělených krocích. Báze se rozpojují v oddělených skupinách (50 - 400 bazí) nazývaných domény. V těchto doménách je tání ukončeno v malém teplotním rozsahu. Pokud je dosažena teplota tání (Tm) příslušné domény, začne se DNA částečně rozplétat, což redukuje její mobilitu v polyakrylamidovém gelu. Protože Tm těchto domén je závislá na jejich sekvenci, přítomnost mutace změní její denaturační profil, což se projeví změnou mobility v gelu oproti původní sekvenci. Pokud fragmenty denaturují kompletně, je migrace v gelu opět závislá pouze na jejich délce. U klasické DGGE je denaturační prostředí tvořeno kombinací stálé teploty (obvykle 50 - 65°C) a lineárního gradientu denaturantu. 100% chemický denaturant je tvořen 7 M močovinou a 40% formamidem. Denaturační gradient může být vytvořen kolmo (perpendikulárně) nebo paralelně ke směru elektroforézy. Perpendikulární gel je obvykle vytvořen v hraničním rozsahu 0 - 100% nebo 20 - 70% (Fischer a Lerman, 1983) a je používán k nalezení optimálního denaturačního prostředí pro normální -
20
paralelní - elektroforézu. Výsledkem je sinusoida znázorňující denaturační profil analyzovaného fragmentu. Pro elektroforézu se používá směsný vzorek a v případě polymorfismu je sinusoida rozdělena v určitém rozsahu denaturantu. Tento rozsah je pak používán pro testování jednotlivých vzorků v paralelním gelu, kde pro lepší separaci fragmentů není rozsah gradientu tak velký (např. 40 - 60%, Myers et al., 1987). Vlivem spontánní tvorby heteroduplexů během PCR se u heterozygotů vyskytují ještě dvě slabší zóny, které se z důvodů malé stability v denaturujícím prostředí silně opožďují za alelickými (hlavními) zónami. Zvýšit citlivost metody je možno přidáním několika G+C (30 - 40, tzv. GC svorka) k 5´ konci jednoho z primerů (Sheffield et al., 1989). Vizualizace výsledků se provádí barvením stříbrem nebo v roztoku ethidiumbromidu.
3.3.5.1. CDGE (gelová elektroforéza při konstantní koncentraci denaturantu) Gelová elektroforéza při konstantní koncentraci denaturantu (CDGE) je modifikací DGGE. V gelu je konstantní koncentrace denaturantu, při které jsou získávány optimální výsledky u DGGE (Borresen et al., 1991). Optimální koncentrace denaturantu je určena z maximálního posunu mezi původní a mutovanou DNA zjištěného při perpendikulární nebo paralelní DGGE. Tato metoda je vhodná pro rychlé rutinní testování polymorfismu.
3.3.5.2. TTGE (gelová elektroforéza při teplotním gradientu) Tato metoda vychází z principu DGGE, ale bez chemického denaturačního gradientu (Wiese et al., 1995). Elektroforéza amplifikovaných fragmentů DNA probíhá v polyakrylamidovém gelu s konstantní koncentrací močoviny (obvykle 6 M) za současného plynulého zvyšování teploty. Močovina přítomná v gelu snižuje teoretickou teplotu tání DNA o 2°C na každý mol močoviny (Gelfi et al., 1994) a umožňuje provádět elektroforézu při nižších teplotách (obvykle v rozsahu mezi 40 - 70°C). Nejlepší výsledky jsou dosahovány při zvyšování teploty o 1 - 3°C/hod. Výhodou této metody je, že není nutné vrstvit gradientový gel, vyžaduje však zařízení pro plynulé zvyšování teploty gelu.
21
3.3.6. Heteroduplexní analýza Heteroduplexní
analýza
(HA)
je
založena
na
konformačních
změnách
dvouvláknových DNA způsobených vznikem heteroduplexních molekul (Nagamine et al., 1989). U heteroduplexů chybné spojení v dvoušroubovici způsobuje zakřivení v obvyklé konformaci a snižuje mobilitu v polyakrylamidovém gelu oproti homoduplexním molekulám. Heteroduplexy vznikají a) během PCR u heterozygota, b) smícháním vzorků obou homozygotu před PCR, nebo c) denaturací a renaturací vzorků obou homozygotů v jedné zkumavce. Citlivost heteroduplexní analýzy je 80 - 90 % u malých fragmentů (do 300 bp, White et al., 1992) a může být zvýšena ve spojení s SSCP (Glavac a Dean, 1995).
3.3.7. Sekvenování Sekvenování je přímé určení nukleotidové sekvence specifické DNA molekuly. Byly vyvinuty dvě sekvenační techniky: chemicky degradační (Maxam a Gilbert, 1977) a terminační (syntetizační) (Sanger et al., 1977). Degradační metoda založená na specifickém částečném štěpení koncově značené DNA se dnes používá jen vyjímečně. Terminační metoda je založena na enzymatické syntéze značené DNA s použitím
speciálních
syntetických
nukleotidů,
které
ukončují
elongaci
prodlužovaného vlákna. Do sekvenační směsi se kromě normálních nukleotidů přidává nízká koncentrace 2’-3’-dideoxynukleotidů. DNA polymeráza pak s určitou frekvencí zařadí do rostoucího vlákna dideoxynukleotid, který postrádá 3’-OH skupinu nutnou pro vznik další fosfodiesterové vazby, a tak ukončí řetězec v přesně definovaném místě. Tak vznikne sada různě dlouhých produktů ukončených vždy specifickým dideoxynukleotidem. Sekvence se vyhodnocuje po elektroforéze v polyakrylamidovém gelu nebo v kapiláře. Sekvenační reakce prováděná s T7 DNA polymerázou nebo Klenowovým fragmentem se používá u fragmentů klonovaných do vektorů. Novější metodiky pro přímé sekvenování genomické DNA nebo PCR produktů pak vycházejí z cyklické reakce s použitím termostabilních polymeráz. Produkty sekvenační reakce mohou být značeny radioaktivně, chemiluminiscenčně nebo fluorescenčně několika způsoby: a) použitím značeného primeru, který je při
22
reakci prodlužován, b) inkorporací značených nukleotidů, c) značením koncových dideoxynukleotidů. Při fluorescenčním značení dideoxynukleotidů se používají čtyři barvy (pro každý ddNTP jiná) a sekvenační reakci je pak možno provádět v jedné zkumavce.
Fluorescenční
značení
umožňuje
používat
pro
elektroforézu
a vyhodnocování (polo)automatické gelové nebo kapilární sekvenátory. Pro rutinní testování polymorfismů je nutné přímé sekvenování genomické DNA nebo PCR produktů, kdy je možné z jedné sekvenační reakce odhalit heterozygota (Innis et al., 1988, Chadwik et al., 1996).
3.4. Studované kandidátní geny pro užitkové vlastnosti u prasete 3.4.1. Leptinový receptor (LEPR) Leptin je důležitý peptid podílející se na regulaci tělesné hmotnosti. Leptin vážící místo bylo nalezeno v myší choroidní pleteni a v cDNA knihovně byl identifikován leptinový receptor (LEPR) (Tartaglia et al., 1995). Gen pro LEPR je lokalizován u myši na chromozómu 4 v oblasti s recesivní mutací (db – diabetes) způsobující obezitu, velmi podobnou obezitě způsobené defektním leptinem. Parabiotické studie naznačily, že db/db myši mohou mít poškozený receptor pro leptin. Leptinový receptor je jednoduchý membránový receptor patřící do rodiny cytokinových receptorů, které iniciují transkripci genů aktivací cytosolických STAT proteinů. STAT proteiny se váží k fosfotyrozinovým zbytkům v cytoplazmatické doméně aktivovaného receptoru, kde jsou fosforylovány. Aktivované STAT proteiny dimerizují a přesouvají se do jádra, kde se váží k DNA a aktivují transkripci. Leptin aktivuje STAT3, STAT5 a STAT6 proteiny v hypotalamu u normálních myší, ale ne u db/db myší, které postrádají funkční isoformu leptinového receptoru. Hypotalamus je cílové místo pro leptin, který neaktivuje STAT proteiny v žádné další tkáni (Ghilardi et al., 1996, Vaisse et al., 1996). Tartaglia et al. (1995) nezjistili mutaci v kódující sekvenci mRNA, avšak předpokládali, že mutace bude nalezena v rozdílu sestřihu exonů, podobně jako u člověka. Lee et al. (1996) zjistili nejméně 6 alternativních sestřihových variant,
23
z nichž jedna je exprimována na vysoké úrovni v hypotalamu a u db/db myší je sestřihována abnormálně, čímž mutovaný protein postrádá cytoplazmatickou oblast. Chen et al. (1996) identifikovali alternativní transkript kódující formu LEPR s dlouhou intracelulární doménou. U db/db myší zjistili také tuto formu, avšak s insercí 106 bází, v niž je stop kodon, který předčasně ukončuje intracelulární doménu. Identifikovaná mutace vytváří donorové místo sestřihu a mění 106 bazový úsek na nový exon. Dlouhá intracelulární doména je klíčová pro iniciaci intracelulární signální transdukce a její nepřítomnost vede k obéznímu fenotypu u db/db myší. U člověka byl LEPR mapován na chromozóm 1 (Chung et al., 1996, Winick et al., 1996) a je tvořen 18 exony (Chung et al., 1996). Thomspon et al. (1996) sekvenovali lidskou DNA a uvádějí 20 exonů, z nichž 18 je kódujících a exon 1, 2 a část třetího tvoří 5’-UTR (nepřekládanou oblast). U prasete byl gen pro leptinový
receptor
lokalizován
metodou
hybridizace
somatických
buněk
na chromozóm 6q3.3 – 3.5 (Ernst et al., 1997) a byl mapován i vazbově pomocí mikrosatelitů (Vincent et al., 1997). Men et al. (1998) sekvenovali prasečí mRNA leptinového receptoru a zjistili, že kódující sekvence je tvořena 3498 bázemi, což představuje 1165 aminokyselin primárního proteinu. Stratil et al. (1998) vazbově mapovali gen pro leptinový receptor na 6. chromozómu distálně od RYR1.
3.4.2. Nervový růstový faktor beta (NGFB) Nervový růstový faktor (NGF) je polypeptid zapojený do regulace růstu a diferenciace sympatických a senzorických neuronů (Levi-Montalcini, 1987). NGF je složen ze tří typů podjednotek, alfa, beta a gamma, které specificky interagují a vytvářejí komplex o relativní molekulové hmotnosti 130 000. Tento komplex obsahuje 2 identické beta řetězce se 118 aminokyselinami, které jsou zodpovědné za biologickou aktivitu NGF. Prasečí gen NGFB byl mapován metodou hybridizace in situ na chromozóm 4q1.6q2.3 (Lahbib-Mansais et al., 1994) a také vazbově (Kopečný et al., 2000).
24
3.4.3. Myostatin (MSTN) Myostatin (růstový a diferenciační faktor-8, GDF8, MSTN) je členem nadrodiny transformujícího růstového faktoru-beta podílející se na regulaci embryonálního vývoje a na udržování homeostázy u dospělých jedinců. Myostatin je specificky exprimován ve vyvíjejících se kosterních svalech a je syntetizován v prepro- formě, která podléhá proteolytickým štěpením, při nichž se odstraní signální peptid na N-konci a pro- oblast, představující 70-75% prekurzoru. Po tomto druhém štěpení vzniká z C-konců dimer, který má plnou biologickou aktivitu (McPherron et al., 1996).
Prasečí
prekurzor
myostatinu
je
tvořen
375
aminokyselinami,
po proteolytických štěpeních však protein obsahuje aminokyseliny 267 – 375 a za tvorbu biologicky aktivního dimeru je zodpovědný cystein v pozici 339 (McPherron a Lee, 1997). Při studiu biologické funkce myostatinu (McPherron et al., 1997) byly myši s poškozeným MSTN genem signifikantně větší a vykazovaly všeobecný nárůst hmoty kosterních svalů. Jednotlivé svaly mutantních zvířat byly 2 až 3 krát těžší v porovnání se svaly normálních zvířat a zvětšení hmoty bylo způsobeno kombinací hyperplazie a hypertrofie svalových buněk. Myostatin působí jako negativní regulátor růstu kosterních svalů (McPherron et al., 1997). U několika plemen skotu je známé mimořádné osvalení označované jako „doublemuscled“ – dvojité osvalení. Double-muscled zvířata jsou charakterizována zvětšením svalové hmoty asi o 20%, které je způsobené celkovou hyperplazií kosterních svalů, tj. zvýšením počtu svalových vláken. Grobet et al. (1997) identifikovali mutaci v bovinním MSTN genu zodpovědnou za double-muscled fenotyp. Zjistili deleci 11 párů bází v kódující sekvenci pro bioaktivní C-koncovou doménu proteinu, způsobující svalovou hypertrofii pozorovanou u belgického modrého skotu. McPherron a Lee (1997) identifikovali mutace v kódující sekvenci bovinního myostatinu u 2 double-muscled plemen skotu, belgického modrého a piedmontese. U belgického modrého skotu se vyskytuje delece 11 párů bází třetího exonu, způsobující posun čtecího rámce a eliminaci aktivního místa molekuly. U plemene piedmontese bodová mutace ve třetím exonu vede k záměně tyrosinu za cystein v aktivním místě proteinu. Lidský gen pro myostatin je tvořen 3 exony a 2 introny (Gonzalez-Cadavid et al., 1998). U prasete byl MSTN gen mapován pomocí hybridizace in situ na chromozóm
25
15q2.3 (Sonstegard et al., 1998) a skládá se rovněž ze tří exonů a dvou intronů (Stratil a Kopečný, 1999).
3.4.4. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) PPARγ je člen subrodiny nukleárních hormonálních receptorů a působí jako klíčový regulátor genové exprese a diferenciace adipocytů (Spiegelman, 1998).Gen pro PPARγ obsahuje dva promotory, jejichž alternativním využitím a sestřihem vznikají dvě isoformy - γ1 a γ2 (Zhu et al., 1995).
U obézních lidí bylo zjištěno,
že polymorfismus v genu pro PPARγ je asociován s nižší hladinou leptinu v plazmě, což naznačuje potencionální roli PPARγ v regulaci příjmu potravy (Meirhaeghe et al., 1998). U prasete byla studována exprese a sekvence genu pro PPARγ (Houseknecht et al., 1998, Grindflek et al., 1998). Je známa kompletní kódující sekvence genu pro PPARγ, včetně obou promotorů určujících vznik dvou isoform. Otevřený čtecí rámec kóduje 504 aminokyselinových zbytků pro isoformu γ2, která obsahuje o 30 aminokyselin na N-konci navíc oproti isoformě γ1. Aminokyselinová sekvence vykazuje 99% shodu s lidskou sekvencí. U obou isoform byla zjištěna vysoká úroveň exprese v tukové tkáni, která byla regulována energetickým příjmem. Gen pro PPARγ byl lokalizován u člověka v oblasti 3p25 vazbovou analýzou a hybridizací somatických buněk (Greene et al., 1995), u prasete však dosud mapován nebyl.
3.4.5. 54 - a 56 - kDa isoformy vakuolární H+-ATPázové podjednotky (ATP6) Vakuolární proton-přemísťující ATPázy (ATP6) jsou složené enzymové komplexy umístěné v membránách eukaryotických buněk regulujících cytoplazmatické pH. Skládají se ze dvou hlavních částí, periferní katalytické V1 a membránového protonového kanálu V0. Obě části jsou komplexy několika podjednotek. ATP6
26
udržují cytoplazmatické pH uvnitř (v rámci) úzkého fyziologického rozmezí a jsou aktivovány nebo inhibovány množstvím látek (Brisseau et al., 1996). Protože byla zjištěna zvýšená exprese v lidském pankreatickém karcinomu, předpokládá se, že ATP6 může hrát důležitou roli v progresi tumoru (Ohta et al., 1996). Většina podjednotek ATP6 byla identifikována u kvasinkových mutantů. Ho et al. (1993) popsali gen VMA 13 kódující protein o vypočítané hmotnosti 54-kDa, který je nezbytný pro aktivitu ATP6. U prasete Hui et al. (1999) izolovali a popsali gen kódující 54- a 56-kDa ATP6 podjednotkové izoformy (dále uváděné jako ATP6). Tyto dvě izoformy vznikají alternativním sestřihem exonů. Pomocí panelu hybridních buněk a FISH analýzy byl gen pro ATP6 mapován na chromozóm 4q14-q16. Do této oblasti byly dříve mapovány geny pro Na+-K+-ATPázu α a β (Lahbib-Mansais et al., 1993, Marklund et al., 1993), což naznačuje existenci ATPázové genové skupiny na prasečím chromzуmu 4. V této oblasti (4q12-q23) byly identifikovány QTL pro růst a podíl tuku v těle (Andersson et al., 1994). Z důvodů fyziologické funkce a chromozómové lokalizace se podjednotka vakuolární H+-ATPázy jeví jako potencionální kandidátní gen. Prasečí gen pro ATP6 je tvořen 14-ti relativně krátkými exony (54 - 346 párů bazí), z nichž exon 1 je nekódující a exon 7 je alternativně sestřihován. Celý gen však zabírá přibližně 62 kilobází (Hui et al., 1999). V intronu 5 byl identifikován vysoce polymorfní mikrosatelit ((CA)13 *(CT)17), u nějž bylo popsáno 22 alel (Pfeiffer a Brenig, 1998).
3.4.6. Na+-, K+- ATPáza, podjednotka B1 (ATP1B1) Ve většině savčích buněk je vysoká koncentrace draselných (150 mM) a nízká koncentrace sodíkových iontů (15 mM) vzhledem k okolnímu prostředí. Tento iontový elektrochemický gradient je vytvářen a udržován specifickým transportním systémem, označovaným sodíková (Na+-, K+-) pumpa, a je nezbytný pro osmotickou regulaci, elektrickou dráždivost nervů a svalů a řídí aktivní transport cukrů a aminokyselin. Tento enzymový systém přispívá k postmortálnímu spotřebování ATP, což je důležité pro přeměnu svalů na maso.
27
Na+-, K+-ATPáza (ATP1) je transmembránový enzymový komplex hydrolyzující ATP pouze v přítomnosti Na+ a K+. Je složen ze dvou podjednotek, velké katalytické podjednotky (α) a menší glykoproteinové podjednotky (β) s neznámou funkcí a předpokládaná struktura enzymového komplexu je (alfa-beta)2 dimer. U člověka byly identifikovány čtyři odlišné geny pro α podjednotku (ATP1A1, ATP1A2, ATP1A3 a ATP1AL4) a tři geny pro β podjednotku (ATP1B1, ATP1B2 a ATP1B3) (Yang-Feng et al., 1988). U prasete byly geny pro ATP1A1 a ATP1B1 lokalizovány pomocí hybridizace in situ na chromozóm 4 do oblasti q1.6-q2.3 a q1.3-q2.1 (Lahbib-Mansais et al., 1993, Marklund et al., 1993). Shull et al. (1990) popsali RFLP s použitím Msp I a Pvu II v genu pro ATP1B1. Lahbib-Mansais et al.(1993) detekovali RFLP při použití BglII u genu pro ATP1A1 a MspI polymorfismus u genu ATP1B1. V této oblasti byly mapovány QTL pro růst a tučnost (Andersson et al., 1994).
28
4. Materiál a metodika 4.1. Zvířata Pro studium polymorfismu, vazbové a populační analýzy byly použity tyto soubory zvířat: Soubor pro vyhledávání polymorfismů: obsahuje nepříbuzná zvířata plemen bílé ušlechtilé (BU), landrace (L), piétrain (P), české výrazně masné (ČVM), hapshire (H), duroc (D), přeštické černostrakaté (Pc) a meishan (M). Soubory pro mapování QTL: Hohenheimské PiGMaP rodiny (Geldermann et al. 1996). Tři třígenerační (F2) rodiny vytvořené křížením geneticky vzdálených plemen: divoké prase x piétrain (WxP) – 316 potomků (zvířat) F2 generace, meishan x piétrain (MxP) – 316 zvířat F2 a divoké prase x meishan (WxM) – 347 zvířat F2. U souborů je známo 110 kvantitativních znaků a jsou charakterizovány více než 140 markery.
4.2. Použité roztoky EDTA 0,2 M pH 8,0 Di-natrium EDTA . 2 H2O
37,2 g
přidat H2O
400 ml
upravit na pH 8,0 konc. NaOH H2O
4g do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT EDTA 0,5 M pH 8,0 Di-natrium EDTA . 2 H2O
93,05 g
přidat H2O
400 ml
upravit na pH 8,0 konc. NaOH
10 g
H2O
do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT
29
Tris-Cl 1M pH 7,5 Tris
60,5 g
přidat H2O
400 ml
upravit na pH 7,5 konc. HCl H2O
30 ml do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT Tris-Cl 1M pH 8,0 Tris
60,5 g
přidat H2O
400 ml
upravit na pH 7,5 konc. HCl H2O
21 ml do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT Octan sodný 3M pH 5,2 octan sodný
61,53 g
přidat H2O
100 ml
upravit na pH 5,2 konc. kyselinou octovou H2O
do 250 ml
sterilizovat filtrací přes 0,22 µm sterilní filtr NaOH 2 M hydroxid sodný H2O
40 g do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT Etanol 70% 94% etanol H2O
87,5 ml 30 ml
30
LB médium Select Peptone Select Yeast Extract
5g 2,5 g
chlorid sodný
5g
přidat H2O
400 ml
upravit pH na 7,5 konc. NaOH H2O
do 500 ml
AUTOKLÁVOVAT (121°C 15 min) Ampicilín
50 mg/ml v H2O – sterilizovat filtrací přes 0,22 µm sterilní filtr, uložit při -20°C
Lysozym
10 mg/ml v 10 mM Tric-Cl, pH 8,0
STET 8% sacharóza
sacharóza
20 g
0,5% Triton X-100
Triton X-100
1,25 ml
50 mM EDTA pH 8,0
EDTA 0,5 M pH 8,0
25 ml
10 mM Tric-Cl pH 8,0
Tris-Cl 1 M pH 8,0
2,5 ml
H2O
do 250 ml
6x vynášecí pufr 0,25% bromfenolová modř
bromfenolová modř
62,5 mg
15% Ficoll
Ficoll
3,75 g
H2O
do 25 ml
0,9 M Tris-borát
Tris
108 g
0,02 M EDTA
Kyselina boritá
55 g
EDTA 0,5 M pH 8,0
40 ml
10x TBE
H2O AUTOKLÁVOVAT
31
do 1000 ml
TE 10 mM Tris-Cl pH 7,5
Tris-Cl 1 M pH 7,5
5 ml
1 mM EDTA pH 8,0
EDTA 0,2 M pH 8,0
2,5 ml
H2O AUTOKLÁVOVAT 50x TAE Tris
242,0 g
kyselina octová (ledová)
57,1 ml
EDTA 0,5 M pH 8,0
100,0 ml
H2O
do 1000 ml
AUTOKLÁVOVAT Ethidiumbromid Ethidiumbromid
1g
H2O
100 ml
Polyakrylamid 40% acrylamid
38,93 g
bis-acryl
1,07 g
H2O
do 100 ml
Pracovní polyakrylamid 0% denaturační gel
6% gel
40% acrylamid
15 ml
50x TAE H2O
2 ml do 100 ml
32
do 500 ml
100% denaturační gel
6% gel
40% acrylamid
15 ml
50x TAE
2 ml
formamid
40 ml
močovina
42 g
H2O
do 100 ml
10% persíran amonný persíran amonný
0,1 g
H2O
1,0 ml
2x nanášecí pufr bromfenolová modř 0,05% xylene cyanol glycerol H2O
0,05% 70% do 10 ml
33
4.3. PCR Vypracování metodik PCR pro jednotlivé geny bylo předmětem vlastní práce, ale pro přehlednost jsou uvedeny v tého kapitole. Výběr primerů Primery pro LEPR, NGFB, MSTN, PPARγ, ATP1B1 a ATP6 prasete byly vybírány na základě dostupných sekvencí v EMBL databázi (EMBL, 2000) s pomocí softwaru OLIGO ver. 4.0. (Rychlik a Rhoads, 1989). Výběr byl prováděn s ohledem na velikost primerů, teplotu tání (Tm), stabilitu na 3´-konci primerů (∆G> 8kcal/mol), vnitřní komplementaritu a komplementaritu mezi dvěma primery, energetickou stabilitu a unikátnost sekvence na 3´-konci primerů. Složení reakční směsi PCR Složení reakční směsi bylo optimalizováno pro každý gen zvlášť s ohledem na koncentraci primerů, koncentraci Mg2+, množství a druh polymerázy a přítomnost DMSO. Použité chemikálie: PCR pufr – dle dodavatele polymerázy, koncentace 10x (Top-Bio, Technologické centrum AV ČR, Praha) dNTP mix – pracovní roztok 20 mM každý dNTP (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko) primery – zásobní roztok 100pmol/µl, pracovní roztok 10 pmol/µl (Generi Biotech s.r.o., Hradec Králové, ČR) DMSO – dimethysulfoxid Mg2+ - pracovní roztok 25 mM MgCl2 (dle dodavatele polymerázy) polymeráza – Taq, nebo LA - směs Taq a Deep Vent polymerázy (TopBio), koncentrace 5U/µl Reakční směsi pro PCR byly připravovány na ledu a po přidání DNA byly vzorky umístěny do cykleru s vyhřívaným víkem (PTC 200, MJ Research). Teplotní a časový průběh PCR
34
Pro každou PCR byl optimalizován teplotní a časový režim zvlášť. PCR vždy začínala denaturací při 95°C 2 min, následovaly cykly denaturace, nasedání primerů a syntéza a celá reakce byla zakončena závěrečnou syntézou při 72°C (event. 68°C) po dobu 7 – 10 min a následným zchlazením na 10°C. Pro přehlednost jsou podmínky jednotlivých PCR uvedeny zvlášť.
4.3.1. LEPR Fragment 380 bp Sekvence primerů: přímý LEPR A 5’- CCA AAC CTC GAG GAA AGT TTA CC - 3’ zpětný LEPR B 5’ - AGG CTG CTC CTA TGA TAC CTC AA - 3’ zpětný LEPR C 5’ - GCG GGC GGC GCG GGA CGC GGG CGG GGC GGC AGG CTG CTC CTA TGA TAC CTC AA - 3’ Primery LEPR A a LEPR B byly převzaty z práce Ernst et al. (1997), u primeru LEPR C je specifická sekvence (23 bazí na 3’- konci) shodná s primerem LEPR B, obsahuje však 30 bazí tzv. GC svorky. PCR byla prováděna v celkovém množství 15 µl. Směs obsahovala 50 ng genomické DNA, 1x reakční pufr, 5 pmol přímého primeru, 5 pmol zpětného primeru (LEPR B nebo LEPR C), 200 µM každého dNTP, 2,5 mM MgCl2 a 1 U Taq polymerázy. Celkem 35 cyklů bylo tvořeno denaturací při 94°C (30 s), připojováním při 56°C (30 s) a elongací při 72°C (30 s). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 7 min. Fragment 2 kb Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
LEPR G GGA AGG CAT TTG TTT CAG CAG TAA 41,7 69,2 -5,8 LEPR H CAA GTC CTC TTT CAT CCA GCA CTG 50,0 69,5 -6,7
35
PCR směs o celkovém objemu 25 µl obsahovala 100 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 5 pmol každého primeru, 1,5 mM MgCl2 a 0,5 U Taq polymerázy. Amplifikace probíhala ve 30 cyklech při 94°C (1 min), 55°C (1 min) a 72°C (2 min). Následovala závěrečná elongace při 72°C 10 min.
4.3.2. NGFB Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
NGFB A GCA TAC AGG CAG AAC CGC ACA C
59,1 71,8 -6,4
NGFB B TTC ACC TCT CCC AAC ACC ATC AC 52,2 70,1 -6,3 PCR probíhala v celkovém objemu 15 µl a reakční směs obsahovala 50 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 5 pmol každého primeru, 2 mM MgCl2 a 0,3 U Taq polymerázy. Teplotní režim v 35 cyklech byl: 94°C (30 s), 60°C (30 s) a 72°C (45 s). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 7 min.
4.3.3. MSTN Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
MSTN A TCT GAG GGC AAA CTG CAT TAT C 45,5 66,2 -6,0 MSTN B ACC AGC AAC AAT CAG CAT AAA C 40,9 63,9 -6,1 Směs pro PCR o celkovém objemu 15 µl obsahovala 50 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 4,8 pmol každého primeru, 1,75 mM MgCl2 a 0,3 U Taq polymerázy. PCR probíhala ve 30 cyklech při teplotách 94°C (30 s), 52°C (30 s) a 72°C (90 s). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 10 min.
36
4.3.4. PPARγ Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
PPAR A TTG TCA CAG CTG GCC CCT AAC 57,1 69,1 -5,8 PPAR B AGC TCT CGG GAA TGG GAT GTC 57,1 69,4 -6,3 PPAR C TTC GCA TCT TTC AGG GGT GTC 52,4 68,9 -6,1 PPAR D GAG TGG GTG AAG GCT CAT GTC 57,1 65,9 -6,3 PPAR E CAG TTC AGC CCT GGT CCT GTG 61,9 69,4 -6,7 PPAR F CCA AAA CGG CAT CTC GGT GTC 57,1 71,5 -6,1 PPAR G CCC TGG CAA AGC ACT TGT ATG 52,4 67,4 -5,7 PPAR H TCC ACG GAG CGA AAC TGA CAC 57,1 69,9 -6,1 PCR probíhaly v celkovém objemu 25 µl. Reakční směs obsahovala 100 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 10 pmol každého primeru z jednotlivých párů (A+B, C+D, E+F, G+H), 0,5 - 3,0 mM MgCl2 a 0,5 U Taq polymerázy. Amplifikace probíhala ve 30 cyklech při 94°C (1 min), 55 - 65°C (1 min) a 72°C (2 min). Následovala závěrečná elongace při 72°C 7 - 10 min.
4.3.5. ATP6 Fragment 1309 bp Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
VATP A AAG AAT ACT GCC TGG TCC TAC 47,6 59,7 -7,0 VATP B GAC CTA ACT CTC CCC ACA TAC 52,4 59,5 -5,7 PCR probíhala v celkovém objemu 50 µl a reakční směs obsahovala 200 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 20 pmol každého primeru, 1,0 mM MgCl2 a 1,0 U Taq polymerázy. Teplotní režim v 35 cyklech byl: 94°C (45 s), 55°C (30 s) a 72°C (70 s + 1s/cyklus). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 7 min.
37
Fragment 1172 bp Primery označení sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
VATP D GAC ACT GCT CCT CGG CTC TT
60,0 66,0 -6,7
VATP E AGC AAA CCT TCT GGG CCA TAG 52,4 67,6 -6,0 PCR směs o celkovém objemu 15 µl obsahovala 50 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 0,3 µl DMSO, 200 µM každého dNTP, 4,8 pmol každého primeru, 1,2 mM MgCl2 a 0,375 U LA polymerázy. Teplotní podmínky ve 35 cyklech byly: 94°C (30 s), 58°C (30 s) a 68°C (60 s + 1s/cyklus). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 7 min.
4.3.6. ATP1B1 Primery označení
sekvence primeru 5’ → 3’
%GC Tm
∆G 3’
ATP1B A TAC AAA GAT TTG GCG CAG AAG 42,9 65,1 -6,7 ATP1B B ACC TGC ACA CTT TTC GCT CTC 52,4 66,2 -6,4 25 µl reakční směsi obsahovalo 100 ng genomické DNA, 1x PCR pufr, 200 µM každého dNTP, 10 pmol každého primeru, 2,5 mM MgCl2 a 0,5 U Taq polymerázy. Teplotní podmínky ve 35 cyklech byly: 94°C (60 s), 55°C (60 s) a 72°C (60 s). V posledním cyklu byla elongace prodloužena na 7 min.
4.4. Štěpení restrikčními endonukleázami Analýza restrikčních míst a fragmentů Pro RFLP analýzu byly u PCR produktů se známou sekvencí (z databáze EMBL, nebo z vlastního sekvenování) vybrány vhodné restrikční endonukleázy pomocí softwaru Seqaid II ver. 3.81. Tento program vyhledává štěpná místa v zadané sekvenci a určuje velikost vzniklých fragmentů. Složení reakční směsi pro RFLP a použité restrikční endonukleázy
38
Reakční směs byla připravována podle schématu: PCR produkt
5 – 8 µl
10x pufr pro RE
1,5 µl
restrikční enzym
0,5 µl (5 U)
H2O
do 15 µl
Inkubace probíhala ve většině případů při 37 °C 2 – 12 hod. Použité restrikční enzymy jsou uvedeny v tabulce 1. Tab. 1. Seznam použitých restrikčních endonukleáz Název
pufr
pozn. místo
pozn.
Název
pufr
pozn. místo
pozn.
Aci I
NEB 3
C↓CG↑C
3
Hpa II
Y+
C↓CGG
1
Alu I
Y+
AG↓CT
1
Kpn I
Kpn I
GGTAC↓C
1
Apa I
A
GGGCC↓C
2
Mnl I
G+
CCTCN7/7
1
Ava II
R+
G↓GWCC
1
Mva I
H
CC↓WGG
2
Bam HI
Bam HI
G↓GATCC
1
Pst I
O+
CTGCA↓G
1
Bcl I
G+
T↓GATCA
1, 55°C
Pvu II
G+
CAG↓CTG
1
Bgl I
O+
GCCN4↓NGGC 1
Rsa I
Y+
GT↓AC
1
Bgl II
O+
A↓GATCT
1
Sac I
Sac I
GAGCT↓G
1
Bse GI
Y+
GGATG(N)2/0↓
1, 55°C
Sal I
O+
G↓TCGAC
1
Bst 1107I O+
GTA↓TAC
1
Sau 3AI
A
↓GATC
2
Cfo I
L
GCG↓C
2
Sdu I
Sdu I
GDGCH↓C
1
Dde I
H
C↓TNAG
2
Sfu I
H
TT↓CGAA
2
Dra I
B+
TTT↓AAA
1
Sma I
Y+
CCC↓GGG
1, 30°C
Eco RI
Eco RI
G↓AATTC
1
Ssp I
G+
AAT↓ATT
1
Eco RV
B
GAT↓ATC
2
Stu I
B
AGG↓CCT
2
Hae III
M
GG↓CC
2
Taq I
Taq I
T↓CGA
1, 65°C
Hinc II
Y+
GTY↓RAC
1
Tru 9I
M
T↓TAA
2
Hind III
R+
A↓AGCTT
1
Xba I
Y+
T↓CTAGA
1
Hinf I
R+
G↓ANTC
1
Xho I
R+
C↓TCGAG
1
D = A,G,T; H = A,C,T; R = A,G; W = A,T; Y = C,T; Pozn.: 1 – MBI Fermentas, 2 – Boehringer Manheim, 3 – Biolabs, 55°C – odlišná inkubační teplota
39
4.5. Elektroforéza v agarózovém gelu Agarózové gely byly připraveny podle Sambrook et al. (1989). Agaróza byla použita od různých výrobců a gel byl obarvován přidáním ethidiumbromidu (0,5 µg/ml). Elektroforéza probíhala v 1x TBE pufru při napětí max. 5 V na 1 cm vzdálenosti elektrod. Vzorky byly nanášeny pomocí 6x vynášecího pufru a vynášené množství DNA bylo u PCR produktů 5 µl, u restrikčního štěpení pak celý objem (15 µl) štěpné směsi po uplynutí inkubace. Pro určení velikosti separovaných fragmentů DNA byly použity DNA hmotnostní markery.
4.6. Denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) Vypracování a zavedení metodik bylo předmětem vlastní práce a konkrétní metodické postupy jsou uvedeny v kapitole Výsledky a diskuse. Gely byly připravovány podle Sambrook et al. (1989) a manuálu pro The DcodeTM Universal Mutation Detection Systém (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Koncentrace akrylamidu byla 6%, poměr akrylamid:bisakrylamid 37,5:1 a velikost gelu 16x16x0,2 cm. Koncentrace denaturačních činidel byla optimalizována podle průběžných výsledků. 100% denaturační gel obsahuje 7M močovinu a 40% formamid. Pro vyhledání a optimalizaci nejvhodnějších podmínek byla provedena elektroforéza na gelu s gradientem kolmým na směr elektroforézy (perpendikulární gel) s rozpětím 20 – 70% denaturantu. Na gel byl nanesen nedenaturovaný směsný PCR produkt od několika odlišných zvířat o celkovém objemu 150 – 200 µl pomocí 2x nanášecího pufru. Podle průběhu denaturační křivky pak byly určeny mezní koncentrace gradientu pro normální – paralelní – gel. Na gel byly nanášeny jednotlivé nedenaturované PCR produkty (12 µl) pomocí 2x nanášecího pufru a elektroforéza probíhala v 1x TAE pufru při napětí 130V a konstantní teplotě (50 – 60 °C) po dobu 2,5 – 3,5 hod. Gely byly barveny v lázni 1x TAE s ethidum bromidem (0,5 µg/ml) 10 min a odbarvovány v 1x TAE pufru 20 min. Nalévání gradientních gelů a elektroforéza byly provedeny pomocí zařízení DCodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
40
4.7. Sekvenování PCR produkty byly naklonovány pomocí plazmidového vektoru pUC18 do baktérií Escherichia coli DH5α a sekvenovány s použitím fluorescenčně značených primerů a ALFExpress Sequencing System (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko). Pro přehlednost jsou uvedeny jednotlivé metodické postupy. Purifikace PCR produktů (pomocí QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, SRN) Přenést směs 25 µl PCR produktu a 125 µl PB pufru do QIAquick kolonky a centrifugovat 30 – 60 s při 13 000 ot/min. Do kolonky přidat 750 µl PE pufru a centrifugovat 60 s, po odstranění pufru recentrifugovat 60 s. Do středu kolonky přidat 30 µl EB pufru, po 60 s zcentrifugovat purifikovaný PCR produkt do nové mikrozkumavky. Příprava PCR produktu pro ligaci do vektoru (pomocí SureClone Ligation Kit, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko ) Blunting / Kinázová reakce (odstranění adenosylu nespecificky přidaného polymerázou při PCR na 3’- konec jednotlivých vláken a jejich fosforylace) Reakční směs – 16 µl purifikovaného PCR produktu, 2 µl 10x blunting/kinázového pufru, 1 µl Klenowova fragmentu a 1 µl polynukleotidové kinázy – inkubovat 30 min při 37°C. Extrahovat fenol (11 µl) / chloroformem (11 µl). Purifikace v MicroSpin kolonkách Přenést 500 µl emulze Sephacryl S – 200 do MicroSpin kolonky a centrifugovat 30 s. Extrahovaný vzorek přenést do středu kolonky a zcentrifugovat do nové mikrozkumavky.
Ligace do vektoru
41
Ligační směs, tvořenou 5 µl purifikovaného PCR produktu, 10 µl 2x ligačního pufru, 2 µl H2O, 1 µl fosforylovaného vektoru pUC18, 1 µl DTT a 1 µl T4 DNA ligázy, inkubovat 2 – 4 hod při 16°C. Transformace rekombinantních plazmidů do bakterií K rozmraženým kompetentním buňkám E.coli DH5α (50 µl) na ledu přidat 10 µl ligační směsi a inkubovat 15 min., dále 2 min při 42°C a 10 min na ledu. Ke směsi přidat 950 µl LB média bez antibiotika, inkubovat 1 hod při 37°C. Nanést 100 µl směsi na kultivační Petriho misku (agar s LB médiem + ampicilín 1 µl/ml agaru), zbytek vzorku centrifugovat 2 min při 7 500 ot/min, odsát supernatant, peletu resuspendovat 100 µl LB média a nanést na druhou kultivační misku. Inkubovat při 37°C 18 hod. Izolace rekombinantních plazmidů varem – pro kontrolní elektroforézy. Inokulovat 5 ml LB média (+ ampicilín 1 µl/ml LB) v uzavřených kyvetách (50 ml) jednou kolonií, inkubovat 12 - 16 hod při 37°C (rotační třepačka, 250 – 330 ot/min). V mikrozkumavce centrifugovat 1,5 ml kultury a peletu resuspendovat v 350 µl STET. Buňky lyzovat 27 µl lysozymu, inkubovat 40 s ve vařící lázni, okamžitě centrifugovat 10 min při 13 000 ot/min. Vzniklou peletu odstranit. DNA vysrážet 35 µl 3M octanu sodného, pH 5,2 a 420 µl isopropanolu při -20°C po dobu 10 min. Centrifugovat 10 min při 5°C a peletu opláchnout 70% etanolem (-20°C). Peletu resuspendovat v 250 µl TE a extrahovat fenol (125 µl) / chloroformem (125 µl). Centrifugovat 5 min a vodnou fázi přenést do nové mikrozkumavky. DNA precipitovat 625 µl isopropanolu 10 min při -20°C, centrifugovat 30 min při 5°C a peletu opláchnout 70% etanolem (-20°C). Po oschnutí rozpustit peletu v 50 µl TE + 0,25 µl RNAase (free of DNAase, z roztoku 10 mg/ml) a inkubovat 10 min při 37°C.
42
Izolace linearizovaných rekombinantních plazmidů z gelu – pro subklonování (s použitím QIAEX II Gel Extraction Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, SRN ) K vyřízlému gelu s plazmidem přidat 3 hmotnostní díly pufru QX1, 20 µl QIAEX II suspenze, inkubovat 10 min při 50°C a centrifugovat 30 s. Vzniklou peletu promýt 500 µl QX1, centrifugovat 30 s, 2x promýt 500 µl PE pufru, centrifugovat a peletu vysušit. Eluovat DNA 20 µl EB pufru 5 min při pokojové teplotě, centrifugovat 30 s a supernatant přenést do nové mikrozkumavky. Směs 2 µl izolovaného plazmidu a 15 µl H2O inkubovat 5 min při 45°C, přenést na led, přidat 2 µl 10x ligačního pufru a 1 µl T4 DNA ligázy, inkubovat 2 – 4 hod při 16°C. Transformovat do kompetentních buněk obvyklým způsobem. Izolace rekombinantních plazmidů pro sekvenování (pomocí QIAGEN Plasmid Mini Kit, QIAGEN GmbH, Hilden, SRN) Centrifugovat 3x 1,5 ml bakteriální kultury 1 min při 13 000 ot/min a pelety resuspendovat v celkem 300 µl pufr P1, přidat 300 µl pufru P2 a inkubovat při pokojové teplotě 5 min. Přidat 300 µl pufru P3, inkubovat na ledu 5 min, centrifugovat 10 min při 13 000 ot/min a 5°C a supernatant přenést do aktivované izolační kolonky (po promytí 1 ml QBT pufru). Plazmidy fixované na membráně 4x promýt 1 ml pufru QC a vymýt 800 µl pufru QF do nové mikrozkumavky. Plazmidovou DNA precipitovat 560 µl 100% isopropanolu, centrifugovat 30 min při 13 000 ot/min a 5°C, peletu omýt 1 ml 70% etanolu (-20°C) a centrifugovat 10 min (13 000 ot/min, 5°C). Po oschnutí peletu rozpustit v 35 µl TE pufru.
43
Sekvenační reakce (s použitím ALFexpressTM AutoReadTM Sequencing Kit, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko) 5 – 7 µg plazmidové DNA naředit na celkový objem 32 µl (pro přímý a zpětný sekvenační primer zvlášť). Přidat 8 µl 2M NaOH, inkubovat 10 min při pokojové teplotě, neutralizovat 7 µl 3M octanu sodného, pH 4,8, se 4 µl H2O. DNA precipitovat 120 µl 100% etanolu 15 min při -20°C, centrifugovat 15 min (13 000 ot/min, 5°C), peletu opláchnout 70% etanolem (-20°C), centrifugovat 10 min (13 000 ot/min, 5°C), odsát supernatant a peletu nechat vyschnout. Peletu rozpustit v 10 µl H2O, přidat 2 µl značeného primeru a 2 µl annealačního pufru, inkubovat 5 min při 65°C, 10 min při 37°C a 10 min při pokojové teplotě. Přidat 1 µl extenzního pufru, 3 µl DMSO a 2 µl naředěné (1:1 s pufrem) T7 DNA polymerázy, z toho 4,5 µl do každého sekvenačního mixu (2,5 µl mixu s ddA, ddC, ddG a ddT) a inkubovat 5 min při 37 °C. Syntézu zastavit přidáním 5 µl STOP pufru, vzorky denaturovat 2 – 3 min při 85 90°C a okamžitě umístit na led. Z takto připravených vzorků vynášet 4 - 6 µl na sekvenační gel. Příprava sekvenačního gelu a elektroforéza Opatrně smíchat 17,5 ml roztoku A s 35 ml roztoku B (ReproGelTM High Resolution, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko), nalít do připraveného nosiče a nechat polymerovat 10 min pod UV světlem (ReproSetTM, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švédsko. Elektroforéza probíhala 700 min při 50°C, 60 mA, 1500 V a 35 W.
44
5. Výsledky a diskuse 5.1. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu LEPR U prasete není dosud známa kompletní sekvence genu pro leptin receptor (LEPR). Ernst et al. (1997) navrhli primery podle lidské cDNA leptinového receptoru (přístupové číslo EMBL U43168, Tartaglia et al., 1995) pro syntézu 380 bp dlouhého fragmentu LEPR prasete. Studium polymorfismu bylo započato s těmito publikovanými primery (LEPR A, LEPR B). Sekvence primerů, složení reakční směsi i teplotní podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Pravost PCR produktu byla ověřena restrikční analýzou pomocí enzymů Alu I, Eco RI, Msp I, Pst I a Rsa I. Pro vysokou citlivost metody a vzhledem k velmi vhodné délce PCR produktu byl polymorfismus vyhledáván pomocí denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Pro nalezení vhodných podmínek separace byla elektroforéza prováděna na perpendikulárních gelech, v nichž je denaturační gradient orientován kolmo na směr elektroforézy. Pro elektroforézy byl používán směsný vzorek – PCR produkty od 4 zvířat plemen piétrain, přeštické černostrakaté, duroc a meishan. Po zjištění denaturačního rozpětí fragmentu pak byly prováděny elektroforézy na paralelních gelech. Pro zachycení polymorfismu byly testovány kombinace podmínek elektroforézy: koncentrace polyakrylamidu 6%, denaturační gradient 10 – 30%, 20 – 40%, konstantní teplota gelu 53, 54, 55, 56, 58 a 60°C a čas separace 2,5, 3, 3,5 a 4,5 hod. Při těchto podmínkách nebyl polymorfismus zjištěn. Proto byl navržen druhý reversní primer (LEPR C), jehož specifická sekvence (23 bazí na 3’- konci) je shodná s primerem LEPR B, obsahuje však 30 bazí tzv. GC svorky umístěné na 5’- konci. Tato svorka zvyšuje citlivost metody (Sheffield et al., 1989). Byla provedena elektroforéza na perpendikulárním 6% polyakrylamidovém gelu s denaturačním gradientem 30 – 70% při konstantní teplotě 50°C. V rozmezí denaturačního prostředí 35 – 41% se objevily dvě sinusoidy, představující polymorfní varianty fragmentu genu LEPR. Elektroforézy na paralelním gelu pak
45
byly prováděny za těchto podmínek: 6% polyakrylamid, denaturační gradient 30 – 50%, teplota gelu 50°C, čas separace 2,5 hod. při 130 V. Po vizualizaci ethidiumbromidem byly patrné dvě varianty (alely A a B), lišící se mobilitou. U heterozygotů pak byly přítomny ještě dvě výrazně pomalejší zóny, odpovídající heteroduplexům vzniklých při PCR (Obr.1.). Obr. 1. DGGE polymorfismus genu LEPR 6% polyakrylamid, denaturační gradient 30 – 50%, elektroforéza 2,5 hod. při 130 V, 50°C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Vzorky 1 – 7 byly získány pomocí primerů LEPR A a LEPR C (410 bp), vzorky 8 – 11 pomocí primerů LEPR A, LEPR B (380 bp) a je patrný rozdíl v mobilitě. 1, 2, 4, 7 a 9 – genotypy AA, 3, 5, 6, 8 a 11 – genotypy AB, 10 - genotyp BB
Kodominantní dědičnost byla ověřena u 39 dvougeneračních rodin PiGMaP Hohenheim (WxP a MxP). U nepříbuzných zvířat osmi plemen (landrace 12, bílé ušlechtilé 11, české výrazně masné 12, přeštické černostrakaté 7, hamshire 6, piétrain 4, duroc 2 a meishan 2) byla zjištěna pouze alela B. Alela A se vyskytovala u prasnic plemene piétrain ze souboru PiGMaP Hohenheim (3 A/B, 11 B/B). Výsledky byly publikovány v práci Kopečný et al. (1997). Pro další studium byly navrženy nové primery (LEPR G, LEPR H) podle parciální cDNA prasete pro leptinový receptor (přístupové číslo EMBL U67739, Matteri a Carroll, 1996). Primery byly vybrány tak, aby byly homologní k lidské sekvenci v exonech 4 a 5 (EMBL U59249 a U59250, Thompson et al., 1996). Charakteristika primerů je uvedena na Obr.2.
46
Obr. 2. Primery pro syntézu LEPR 2 kb Umístění primerů vzhledem k sekvenci v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer – LEPR G: poz. 289 (24-mer)
Pozitivní vlákno DNA LEPR (EMBL U67739),
GGA AGG CAT TTG TTT CAG CAG TAA 5' GGAAGGCATTTGTTTCAGCAGTAA 3' AATGACGACTTTGTTTACGGAAGG 5' Zpětný primer – LEPR H: poz. 354 (24-mer)
Negativní vlákno DNA LEPR (EMBL U67739),
CAA GTC CTC TTT CAT CCA GCA CTG 5' CAAGTCCTCTTTCATCCAGCACTG 3' 3' GTCACGACCTACTTTCTCCTGAAC 5' Přímý/Zpětný: 5' GGAAGGCATTTGTTTCAGCAGTAA 3' 3' GTCACGACCTACTTTCTCCTGAAC 5' Optimální annealační teplota: 50.1 °C Velikost produktu: 89 bp; 40.4 % GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 12.4 °C Rozdíl Tm primerů: 0.4°C Přímý: 289 (24) ->------Zpětný: 354 (24) -------<3'-konec dG: U=-5.8 L=-6.7
Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Po PCR byly fragmenty analyzovány v agarózovém gelu a jejich velikost byla přibližně 2 kb. Jelikož není známa sekvence DNA LEPR prasete, nebylo možné ověřit identitu PCR produktu obsahujícího intronovou sekvenci restrikční analýzou. PCR produkt byl proto naklonován do plazmidu pUC18 a částečně osekvenován. Koncové sekvence, obsahující části exonu, odpovídaly sekvenci prasečí cDNA pro LEPR. Velikost intronu byla přibližně 1,9 kb. Zjištěné sekvence byly uloženy v databázi EMBL pod čísly AJ223162 a AJ223163. Velikost fragmentu neumožňuje detekovat polymorfismus pomocí DGGE a proto byly použity restrikční enzymy. Polymorfismus byl nalezen s použitím endonukleáz Hpa II a Rsa I. V případě Hpa II byly alely charakterizovány přítomností fragmentů
47
2 kb (alela A) a 1450 + 550 bp (alela B) (Obr.3.). Při štěpení pomocí Rsa I se vyskytovaly fragmenty o velikostech 1 kb + 349 + 334 + 300 bp u alely A a 750 + 349 + 334 + 300 + 250 bp u alely B (Obr.4.).
Obr. 3. Polymorfismus v genu LEPR při štěpení Hpa II (fragment 2 kb) 1
2
3
4
5
6
7
8
1,5% agarózový gel: 1 – 1000-100 bp marker, 2, 4 a 6 – genotypy AB, 3 – genotyp AA, 5 – genotyp BB, 7 – PCR produkt, 8 – 1 kb DNA marker (Gibco)
Mendelistická kodominantní dědičnost byla ověřena u třígeneračních rodin PiGMaP Hohenheim (WxP). U všech testovaných zvířat kosegregovaly alely lokusu LEPR/Rsa I s alelami dříve popsaného lokusu LEPR/DGGE (LEPR/Rsa I A s LEPR/DGGE A). Frekvence alel lokusu LEPR/Hpa II u nepříbuzných zvířat různých plemen jsou uvedeny v Tab. 2. Pouze u plemen bílé ušlechtilé a hapshire byla zjištěna vyšší frekvence alely A, ani plemeno meishan, které má vysoký podíl tuku, nevykazuje odchylku od většiny plemen. Pro podrobnější populační studie bude potřeba otestovat větší soubory zvířat.
48
Obr. 4. PCR-RFLP genu LEPR s použitím Rsa I (fragment 2 kb) 1
2
3
4
5
6
7
8
1,5% agarózový gel: 1 – 1000-100 bp marker, 2, 4 a 6 – genotypy AB, 3 – genotyp AA, 5 – genotyp BB, 7 – PCR produkt, 8 – 1 kb marker (Gibco)
Tab. 2. Frekvence alel LEPR/Hpa II u různých plemen prasat plemeno
n
alely LEPR/Hpa II A
B
české výrazně masné
15
0,20
0,80
bílé ušlechtilé
14
0,50
0,50
landrace
12
0,17
0,83
přeštické černostrakaté
7
0,29
0,71
meishan
7
0,07
0,93
piétrain
6
0,25
0,75
hampshire
6
0,75
0,25
Data získaná testováním polymorfismu v lokusu LEPR/Hpa II byla použita pro vazbové mapování v rodině WxP PiGMaP Hohenheim. Dvoubodová a více bodová vazbová analýza byla provedena metodou LOD score s využitím počítačového programu CRIMAP (Green et al., 1990). Signifikantní vazba (LOD > 3) byla nalezena mezi genem LEPR a těmito lokusy: SW1057, S0087, RYR1, EAH, A1BG,
49
S0146, S0003, SW824, P3 a EAO. Výsledkem více bodové analýzy bylo toto pořadí lokusů na chromozómu 6: …A1BG-(26,8)-S0146-(9,9)-S0003-(15,6)-SW824-(10,9)LEPR-(26,0)-P3-(29,0)-EAO (čísla v závorkách udávají vzdálenost v Kosambi cM). Vincent et al. (1997) detekovali PCR-RFLP pomocí Hinf I v 3,8 kb dlouhém fragmentu LEPR prasete a v jiné PiGMaP rodině (Archibald et al., 1995) vazbově mapovali LEPR s využitím mikrosatelitů v pořadí S0059-(13,3)-S0228-(1,0)-S0003(4,4)- S0299-(4,5)-S0121-(7,9)-LEPR-(22,1)-S0146-(3,3)-S0031. Při porovnání obou analýz je patrná odlišná lokalizace mikrosatelitů S0003 a S0146. Data pro analýzy byly získány v odlišných rodinách a mohou se podstatně lišit a s přibývajícím počtem markerů budou polohy upřesňovány. Výsledky byly publikovány v práci Stratil et al. (1998).
5.2. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu NGFB Cílem práce bylo nalézt jednoduše detekovatelný polymorfismus využitelný pro genetické analýzy. Na základě neúplné sekvence genu NGFB prasete (EMBL L31898, Lahbib-Mamsais et al., 1994) byly vybrány nové primery (NGFB A, NGFB B) pro amplifikaci 448 bp dlouhého fragmentu. Tato velikost je velmi vhodná pro použití metody DGGE. Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Charakteristika primerů je znázorněna na Obr.5. Identita PCR produktu byla ověřena restrikční analýzou s použitím endonukleáz Ava II, Bam HI, Bgl I, Dde I, Dra I, Hae III, Hha I, Hinf I, Hpa II a Sau 3a. Produkty štěpení byly v souladu s fragmenty určenými programem Seqaid podle sekvence z EMBL. Při použití enzymu Hpa II u vzorku prasat plemene meishan, piétrain a bílé ušlechtilé byl pozorován polymorfismus v délkách fragmentů. Při použití tohoto enzymu však nebylo možno odlišit heterozygoty od jednoho typu homozygotů z důvodu velkého počtu fragmentů malé velikosti.
Obr. 5. Primery pro syntézu NGFB 448 bp
50
Umístění primerů vzhledem k sekvenci v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer – NGFB A: (22-mer)
Pozitivní vlákno NGFB (EMBL L31898), poz. 10
GCA TAC AGG CAG AAC CGC ACA C 5' GCATACAGGCAGAACCGCACAC 3' 3' CACACGCCAAGACGGACATACG 5' Zpětný primer – NGFB B: Negativní vlákno NGFB (EMBL L31898), poz. 435 (23-mer) TTC ACC TCT CCC AAC ACC ATC AC 5' TTCACCTCTCCCAACACCATCAC 3' 3' CACTACCACAACCCTCTCCACTT 5' Přímý/Zpětný: 5' GCATACAGGCAGAACCGCACAC 3' 3' CACTACCACAACCCTCTCCACTT 5' Optimální annealační teplota: 61.0°C Velikost produktu: 448 bp; 62.5% GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 26.5°C Rozdíl Tm primerů: 1.7°C Přímý:10 (22) ->------Zpětný:435 (23) -------<3'-konec dG: U=-6.4 L=-6.3
PCR produkty odlišných genotypů (určené pomocí Hpa II) byly použity pro optimalizaci podmínek DGGE. Pro určení rozsahu denaturačního prostředí byla elektroforéza provedena na perpendikulárním gelu s gradientem 20 – 70% při konstantní teplotě gelu 50°C. Po vyhodnocení průběhu sinusoidy byly testovány kombinace podmínek: 6% polyakrylamid, denaturační gradient 50 – 70%, teplota gelu 50 - 57°C, doba separace 2 – 3,5 hod při 130 V. Optimální podmínky dělení byly při teplotě 57°C a 2,5 hod. Byly popsány dvě varianty (A – rychlejší, B – pomalejší), u heterozygotů byly patrné dvě pomalejší zóny heteroduplexů (Obr.6.). Kodominantní mendelistická dědičnost byla ověřena u třígeneračních rodin PiGMaP Hohenheim. Bylo otestováno 154 nepříbuzných zvířat osmi plemen a frekvence alel jsou uvedeny v Tab.3. Obr. 6. DGGE polymorfismu genu NGFB (fragment 448 bp)
51
6% polyakrylamid, denaturační gradient 50 – 70%, elektroforéza 2,5 hod při 130 V, 57°C
1
2
3
4
5
6
7
1, 4 a 6 – genotypy AB, 2 – genotyp AA, 3, 5 a 7 - genotypy BB (výřez části gelu)
Tab. 3. Frekvence alel NGFB/DGGE u různých plemen prasat plemeno
n
Alely NGFB/DGGE A
B
landrace
86
0,035
0,965
piétrain
18
0,194
0,806
bílé ušlechtilé
14
0,500
0,500
české výrazně masné
14
0,000
1,000
meishan
8
0,000
1,000
přeštické černostrakaté
6
0,167
0,833
hapshire
6
0,000
1,000
duroc
2
0,000
1,000
Kromě plemene bílé ušlechtilé byla u všech plemen zjištěna vysoká frekvence alely B, a to včetně plemene meishan. Většina plemen je však zastoupena pouze malým počtem zvířat, proto bude třeba analyzovat větší soubory zvířat.
52
Pro vazbovou analýzu bylo otestováno celkem 996 zvířat z rodin WxP, MxP a WxM, z toho bylo 613 informativních pro NGFB. Pomocí programu CRIMAP (Green et al., 1990) byla metodou LOD score provedena dvou a více bodová analýza a bylo určeno pořadí lokusů na chromozómu 4 prasete: … S0073 – EAL – NGFB – Sw2435. Aktuální lokalizace na chromozómu a vzdálenosti lokusů u tří studovaných rodin jsou uvedeny v Tab.6, Tab.7 a Tab.8. PCR produkt získaný pomocí primerů NGFB A a NGFB B obsahuje sekvenci (126 bp), ve které Lahbib-Mansais et al. (1994) popsali RFLP polymorfismus s použitím enzymu Msp I. Endonukleáza Hpa II je isoschizomer Msp I (rozpoznává stejnou sekvenci, ve které štěpí molekulu DNA) a je proto velmi pravděpodobné, že se jedná o stejný polymorfismus. Metodou DGGE určený polymorfismus představuje pravděpodobně stejnou mutaci, protože však nebylo možné spolehlivě určit heterozygoty a jeden typ homozygotů u RFLP, nebylo možné ověřit kosegregaci alel s alelami určenými pomocí DGGE. Pravděpodobnost výskytu dvou polymorfních míst v tomto relativně krátkém fragmentu však nelze vyloučit. Testování polymorfismu NGFB metodou DGGE je velmi přesné a rychlé, navíc poskytuje možnost zachycení další případné mutace. Lahbib-Mansais et al. (1994) mapovali pomocí radioaktivní in-situ hybridizace gen pro NGFB prasete do chromozómové oblasti 4q1.6-q2.3 a zjistili frekvenci alely A2 (NGFB/Msp I) 0,07 u 27 zvířat plemene landrace. Rohrer et al. (1996) mapovali gen pro NGFB v relativně malé rodině USDA MARC (95 zvířat) v pozici 88 cM od lokusu SW2404, zde však nebyl zahrnut gen pro EAL.
5.3. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu MSTN U prasete byla známa pouze kódující sekvence a promotorová oblast genu pro myostatin (MSTN), genomická organizace ani polymorfismus však byly neznámé. Pro studium polymorfismu byly vybrány primery podle dostupných sekvencí (EMBL AF093798, Daneau a Silversides, 1998 a EMBL AF019623, McPherron a Lee, 1997) pro získání produktu obsahujícího promotorovou oblast a část exonu 1.
53
Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Charakteristika primerů je znázorněna na Obr.7. Obr. 7. Primery pro syntézu MSTN 1027 bp Umístění primerů vzhledem k sekvencím v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer - MSTN A: Pozitivní vlákno MSTN (EMBL AF093798 + AF019623, upraveno), poz. 290 (22-mer)
EMBL
TCT GAG GGC AAA CTG CAT TAT C 5' TCTGAGGGCAAACTGCATTATC 3' 3' CTATTACGTCAAACGGGAGTCT 5' Zpětný Primer – MSTN B: Negativní vlákno MSTN (EMBL AF093798 + EMBL AF019623, upraveno), poz. 1679 (22-mer) ACC AGC AAC AAT CAG CAT AAA C 5' ACCAGCAACAATCAGCATAAAC 3' 3' CAAATACGACTAACAACGACCA 5' Přímý/Zpětný: 5' TCTGAGGGCAAACTGCATTATC 3' 3' CAAATACGACTAACAACGACCA 5' Optimální annealační teplota: 50.6°C Velikost produktu: 1411 bp; 30.3 % GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 19.7°C Rozdíl Tm primerů: 2.3°C Přímý: 290 (22) ->------Zpětný: 1679 (22) -------<3'-konec dG: U=-6.0 L=-6.1
Očekávaná velikost PCR produktu byla 1411 bp, získaný fragment však byl kratší přibližně o 380 bp. Pro restrikční analýzu k ověření identity PCR produktu a pro vyhledávání polymorfismu byly použity enzymy: Alu I, Dde I, Dra I, Eco RI, Eco RV, Hind III, Hinf I, Mnl I, Rsa I, Sau 3a a Xba I. Polymorfismus byl nalezen při použití endonukleázy Dra I. Protože délky PCR produktu a získaných fragmentů po štěpení restrikčními enzymy neodpovídaly očekávaným, byly sekvenovány vzorky dvou zvířat, která se lišila v štěpném místě pro Dra I. Získané sekvence odpovídaly publikované sekvenci
54
promotorové oblasti MSTN (EMBL AF 093798), ale neobsahovaly úsek 384 bp odpovídající pozici 374 – 757 v sekvenci AF 093798. Srovnáním dostupných sekvencí bylo zjištěno, že tato část je opačně orientovaná a komplementární k oblasti od nukleotidu 1305 v sekvenci AF 093798 po nukleotid 45 exonu 1. Nově získaná sekvence je správná, protože všechny PCR produkty byly stejné velikosti 1027 bp. Porovnáním nově získaných sekvencí odlišných zvířat byla zjištěna záměna T → A v pozici 607 této sekvence (EMBL AJ 133580), vedoucí ke vzniku či absenci štěpného místa pro Dra I. Po separaci fragmentů v 2% agarózovém gelu bylo možné odlišit oba typy homozygotů i heterozygoty podle přítomnosti specifických fragmentů 422 bp (alela T) a 358 bp (alela A) (Obr.8.). Obr. 8. Polymorfismus v MSTN při štěpení pomocí Dra I 1
2
3
4
5
6
7
8
2% agarózový gel: 1 a 8 – 1000-100 bp marker, 2 a 5 – genotypy TA, 3 a 6 – genotypy TT, 4 – genotyp AA, 7 – PCR produkt
Kodominantní dědičnost byla ověřena u třígenerační rodiny PiGMaP Hohenheim WxM. Dále byla otestována nepříbuzná zvířata devíti plemen. Frekvence alel u čtyř plemen jsou uvedeny v Tab.4. Další studovaná plemena (piétrain 18 ks, české výrazně masné 14 ks, přeštické černostrakaté 6 ks, hampshire 6 ks a duroc 2 ks) byla monomorfní pro alelu T. Nejvyšší frekvence alely A byla zjištěna u plemene meishan, které vykazuje nejnižší podíl masa. Pro podrobnější populační studie bude třeba otestovat větší soubory prasat. Tyto výsledky a rovněž exon/intronvá struktura genu byly publikovány v práci Stratil a Kopečný (1999).
55
Tab. 4. Frekvence alel genu MSTN u různých plemen prasat plemeno
n
Alely MSTN/Dra I T
A
bílé ušlechtilé
14
0,89
0,11
landrace
11
0,95
0,05
meishan
12
0,79
0,21
miniaturní prase
4
0,87
0,13
Dvou a více bodová vazbová analýza byla provedena metodou LOD score pomocí programu CRIMAP (Green et al., 1990) a lokalizace genu pro MSTN na 15. chromozómu prasete u rodiny WxM je uvedena v Tab.5. Tab. 5. Vazbová mapa chromozómu 15 prasete u rodiny WxM Vzdálenosti lokusů jsou uvedeny v Kosambi cM
lokus
průměrná
samičí
samčí
S0148
0,0
0,0
0,0
EAG
10,7
11,9
8,9
Sw964
28,0
23,3
32,3
Sw15
44,9
38,9
51,0
MSTN
53,5
50,6
56,1
Sw2053
71,9
69,4
75,5
Sw1983
103,9
105,3
102,1
5.4. Studium polymorfismu genu PPARγ Na základě dostupných sekvencí PPARγ prasete (EMBL AF059245, Househnecht et al., 1998 a AJ006758, Grindflek et al., 1998) byly postupně vybrány primery PPAR A, PPAR B, PPAR C, PPAR D, PPAR E, PPAR F, PPAR G a PPAR H. Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. S páry primerů A,B a C,D nebyly získány po sérii experimentů kombinující anelační teplotu
56
a koncentraci hořečnatých iontů specifické produkty. Velmi silný výtěžek PCR byl získán s primery E a F. Amplifikovaný produkt (≈ 690bp) byl ligován do plazmidu pUC18, transformován do E.coli a dále sekvenován. Zjištěná sekvence při srovnání pomocí programu BLAST neodpovídala žádné sekvenci v databázi EMBL. S využitím primerů G a H byl amplifikován fragment o velikosti ≈ 1,8 kb. Jelikož výsledkem PCR nebyl jasně specifický produkt, byl tento fragment izolován z gelu a dále klonován do E.coli. a sekvenován. I v tomto případě získaná sekvence neodpovídala sekvencím v databázi.
5.5. Studium polymorfismu a vazbové mapování genu ATP6 U prasete jsou známé kompletní sekvence exonů, některých intronů a cDNA a dále neúplné sekvence některých intronů ATP6 (EMBL AJ223743 – AJ223758, Hui et al., 1999). Na základě sekvencí AJ223747 a AJ223748 byly vybrány primery VATP A a VATP B tak, aby PCR produkt obsahoval část exonu 5 a část intronu 5 včetně SINE sekvence a byla získána chybějící sekvence intronu 5. Podmínky PCR a sekvence primerů jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Charakteristika primerů je znázorněna na Obr.9. Amplifikovaný PCR produkt o velikosti ≈ 1,3 kb byl analyzován restrikčními endonukleázami Ava II, Dra I, Hinc I, Hinf I a Hpa II. Výsledné fragmenty velikostně odpovídaly předpokládaným fragmentům získaným pomocí programu Seqaid podle známé sekvence. Pro detekci polymorfismu byly dále použity enzymy: Alu I, Bam HI, Bgl I, Bgl II, Bst 1107I, Hae III, Hind III, Kpn I, Mnl I, Mva I, Pvu II, Rsa I, Ssp I, Taq I a Xba I. S žádným z těchto restrikčních enzymů nebyl nalezen polymorfismus. Pro velikost PCR produktu nebylo možné použít metodu DGGE. Byly připraveny rekombinantní klony E.coli/pUC18 nesoucí PCR produkt od dvou zvířat plemen piétrain a meishan a pomocí enzymu Bam HI subklony s fragmenty o velikostech ≈ 800 a 550 bp. Tyto klony a subklony byly sekvenovány a zjištěné sekvence porovnány se sekvencemi v EMBL pomocí programu BLAST. Bylo zjištěno, že dříve publikované sekvence AJ223747 a AJ223748 na sebe plynule navazují a v intronu 5 tedy nechybí žádná sekvence. Nebyl také zjištěn žádný polymorfismus.
57
Obr. 9. Primery pro syntézu ATP6 1309 bp Umístění primerů vzhledem k sekvencím v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer – VATP A: Pozitivní vlákno VATP (EMBL AJ223747 + AJ223748, upraveno), poz. 343 (21-mer) AAG AAT ACT GCC TGG TCC TAC 5' AAGAATACTGCCTGGTCCTAC 3' 3' CATCCTGGTCCGTCATAAGAA 5' Zpětný primer – VATP B: Negativní vlákno VATP (EMBL AJ223747 + AJ223748, upraveno), po. 1631 (21-mer) GAC CTA ACT CTC CCC ACA TAC 5' GACCTAACTCTCCCCACATAC 3' 3' CATACACCCCTCTCAATCCAG 5' Přímý/Zpětný: 5' AAGAATACTGCCTGGTCCTAC 3' 3' CATACACCCCTCTCAATCCAG 5' Optimální annealční teplota.: 53.8°C Velikost produktu: 1309 bp; 46.1% GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 31.0°C Rozdíl Tm primerů: 0.2°C Přímý:343 (21) ->------Zpětný:1631 (21) -------<3'-konec dG: U=-7.0 L=-5.7
Podle sekvence EMBL AJ223756 (Hui et al., 1999) byly vybrány primery VATP D a VATP E tak, aby amplifikovaný fragment obsahoval část intronu 13, exon 14 a 3’-UTR včetně polyA signálu a polyA místa. Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Charakteristika primerů je znázorněna na Obr.10.
58
Obr. 10. Primery pro syntézu ATP6 1172 bp Umístění primerů vzhledem k sekvenci v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer – VATP D: Pozitivní vlákno VATP (EMBL AJ223756), poz. 275 (20-mer) GAC ACT GCT CCT CGG CTC TT 5' GACACTGCTCCTCGGCTCTT 3' 3' TTCTCGGCTCCTCGTCACAG 5' Zpětný primer – VATP E: Negativní vlákno VATP (EMBL AJ223756), poz. 1426 (21-mer) AGC AAA CCT TCT GGG CCA TAG 5' AGCAAACCTTCTGGGCCATAG 3' 3' GATACCGGGTCTTCCAAACGA 5' Přímý/Zpětný: 5' GACACTGCTCCTCGGCTCTT 3' 3' GATACCGGGTCTTCCAAACGA 5' Optimální annealační teplota: 54.5°C Velikost produktu: 1172 bp; 42.1% GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 22.5°C Rozdíl Tm primerů: 1.5°C Přímý:275 (20) ->------Zpětný:1426 (21) -------<3'-konec dG: U=-6.7 L=-6.0
Získaný produkt odpovídal očekávané délce (1172 bp) a ověření identity bylo provedeno restrikční analýzou s využitím enzymů Dra I, Hae III, Hinf I, Hpa II a Rsa I. Polymorfismus byl detekován s enzymem Dra I a byly popsány alely A (fragmenty 161, 312 a 699 bp) a B (473 a 699 bp), lišící se přítomností či absencí restrikčního místa v pozici 586 sekvence AJ223756 (Obr.11.). U nepříbuzných zvířat se vyskytovala alela B pouze u plemene piétrain (18) a přeštické černostrakaté (6) ve frekvenci 0,361, respektive 0,083. Podílem prasat plemene piétrain na regeneraci a zušlechťování plemene přeštické černostrakaté (Vacková et al., 1998) je možné vysvětlit přítomnost alely B a její nízkou frekvenci u tohoto plemene.
59
Obr. 11. PCR-RFLP ATP6 pomocí Dra I 1
2
3
4
5
6
7
8
2% agarózový gel: 1 – 1031-100 bp marker (MBI Fermentas), 2 a 5 – genotypy AB, 3 a 6 – genotypy BB, 4 a7 – genotypy AA, 8 – PCR produkt
Kodominantní dědičnost byla ověřena u třígeneračních rodin WxP a MxP PiGMaP Hohenheim. Dvou a více bodová vazbová analýza byla provedena metodou LOD score pomocí programu CRIMAP (Green et al., 1990) a lokalizace genu pro ATP6 na 4. chromozómu prasete u rodin WxP a MxP jsou uvedeny v Tab.6. a Tab.7. V genu pro ATP6 prasete byl popsán polymorfní mikrosatelit v intronu 5 (Pfeiffer a Brenig, 1998), nebyly však uvedeny frekvence jednotlivých alel u plemen prasat. Yerle et al. (1996) mapovali gen pro ATP6 pomocí PCR screeningu hybridních somatických buněk na chromozóm 4q15-q16, Hui et al. (1999) lokalizovali ATP6 v oblasti 4q14-q15 metodou FISH, pomocí PCR u panelu hybridních somatických buněk určili polohu v oblasti 4q15-q16. Výsledky budou publikovány v práci Blažková et al. (2000).
5.6. Studium polymorfismu a vazbové mapování
genu
ATP1B1 Primery ATP1B1 A a ATP1B1 B byly vybrány podle sekvence cDNA pro ATP1B1 prasete (EMBL X03937, Ovchinnikov et al., 1986) a na základě porovnání s exon-
60
intronovou strukturou lidského genu pro ATP1B1 (EMBL M25160 a M25161, Lane et al., 1989) tak, aby předpokládaný PCR produkt obsahoval část exonu 3, celý intron 3 a část exonu 4. Sekvence primerů a podmínky PCR jsou uvedeny v kapitole Materiál a metodika. Charakteristika primerů je znázorněna na Obr.12. Obr. 12. Primery pro syntézu ATP1B1 1718 bp Umístění primerů vzhledem k sekvenci v EMBL, jejich komplementarita, fyzikální parametry a vnitřní energetická stabilita duplexu primer/templát. Upraveno podle programu OLIGO ver. 4.0 (Rychlik a Rhoads, 1989). Přímý primer – ATP1B1 A: Pozitivní vlákno ATP1B1 (EMBL X03937), poz. 458 (21-mer) TAC AAA GAT TTG GCG CAG AAG 5' TACAAAGATTTGGCGCAGAAG 3' 3' GAAGACGCGGTTTAGAAACAT 5' Zpětný primer – ATP1B1 B: Negativní vlákno ATP1B1 (EMBL X03937), poz. 555 (21-mer) ACC TGC ACA CTT TTC GCT CTC 5' ACCTGCACACTTTTCGCTCTC 3' 3' CTCTCGCTTTTCACACGTCCA 5' Přímý/Zpětný: 5' TACAAAGATTTGGCGCAGAAG 3' 3' CTCTCGCTTTTCACACGTCCA 5' Optimální annealační teplota: 51.0°C Velikost produktu: 118 bp; 43.2% GC Tm(prod.-nejméně stabilní primer): 19.5°C Rozdíl Tm primerů: 1.1°C Přímý: 458 (21) ->------Zpětný: 555 (21) -------<3'-konec dG: U=-6.7 L=-6.4
Po PCR byl získán produkt o velikosti ≈ 1,7 kb. Polymorfismus byl vyhledáván pomocí restrikčních enzymů: Aci I, Alu I, Apa I, Ava II, Bam HI, Bcl I, Bgl I, Bse GI, Cfo I, Dde I, Dra I, Eco RI, Eco RV, Hae III, Hinc II, Hind III, Hinf I, Hpa II, Kpn I, Mnl I, Mva I, Pst I, Pvu II, Rsa I, Sac I, Sal I, Sdu I, Sfu I, Ssp I, Stu I, Tru 9I a Xba I.
61
S použitím enzymů Aci I a Hpa II byl u prasat plemene meishan zjištěn polymorfismus v důsledku zániku restrikčních míst. Pro ověření identity byly amplifikované produkty naklonovány pomocí plazmidu pUC18 do E.coli, subklonovány s použitím enzymů Eco RI a Hinc II a sekvenovány. Získaná sekvence o celkové délce 1718 bp byla pomocí programu BLAST porovnána s dostupnými sekvencemi v databázi EMBL. Koncové části odpovídaly sekvencím exonů 3 a 4 genu pro ATP1B1 člověka (EMBL M25160) a sekvenci genu pro ATP1B1 prasete (EMBL X03937). Nově byla získána sekvence intronu 3. Porovnáním sekvencí získaných od prasat plemen piétrain a meishan byly identifikovány bodové mutace podmiňující vznik či zánik restrikčních míst. V pozici nukleotidu 358 PCR produktu byla zjištěna záměna G → A v restrikčním místě pro Hpa II (C↓CGG oproti CCGA), v jejímž důsledku není PCR produkt štěpen (alela S). Alela F je štěpena na fragmenty o velikosti 355 a 1363 bp. Výsledek štěpení a jednotlivé genotypy jsou znázorněny na Obr.13. V pozici nukleotidu 416 byla zjištěna záměna G → C, rušící poznávací místo pro Aci I (C↓CG↑C oproti CCCC). Polymorfismy v obou lokusech kosegregovali, při štěpení Aci I však vznikalo velké množství fragmentů, kdežto při použití enzymu Hpa II bylo rozlišení jednotlivých genotypů zcela jednoznačné. Proto byla pro další analýzy používána restrikční endonukleáza Hpa II. Mendelistická dědičnost byla ověřena u třígeneračních rodin MxP a WxM PiGMaP Hohenheim. Dále byla testována nepříbuzná zvířata různých plemen. Alela S (Hpa II) se vyskytovala pouze u plemene meishan (12 zvířat) ve frekvenci 0,58, kdežto plemena piétrain (19), bílé ušlechtilé (14), landrace (12), české výrazně masné (15), přeštické černostrakaté (7), hampshire (6) a duroc (2) byla monomorfní pro alelu F. Data získaná při testování rodin MxP a WxM byla použita pro dvou a více bodovou vazbovou analýzu metodou LOD score pomocí programu CRIMAP (Green et al., 1990) a lokalizace genu pro ATP1B1 na 4. chromozómu prasete u rodin MxP a WxM jsou uvedeny v Tab.7. a Tab.8. Výsledky budou publikovány v práci Blažková et al. (2000).
62
Obr. 13. Polymorfismus ATP1B1 po štěpení Hpa II 1
2
3
4
5
6
7
8
1,5% agarosový gel: 1 – 3000-100 bp marker (MBI Fermentas), 2 a 5 – genotypy FS, 3 a 6 – genotypy SS, 4 a 7 – genotypy FF, 8 – PCR produkt
63
Tab. 6. Aktuální vazbová mapa chromozómu 4 prasete, rodina WxP Vzdálenosti lokusů jsou uvedeny v Kosambi cM
lokus
průměrná
samičí
samčí
Sw489
0,0
0,0
0,0
Myc
17,9
38,1
12,2
Sw835
31,6
42,1
27,2
Swr73
39,0
49,1
39,5
Sw2128
55,1
64,0
51,8
Sw1073
63,9
74,0
59,8
Sw1089
68,3
77,2
64,9
ATP6
69,8
77,2
65,4
S0073
76,8
98,3
73,4
Oct1
80,9
95,3
75,4
ATP1A2
83,8
99,5
77,4
PKLR
88,8
108,4
77,4
EAL
92,7
113,9
77,4
NGFB
100,9
124,8
77,4
Sw2435
106,5
137,0
87,6
S0097
133,5
162,8
114,1
64
Tab. 7. Vazbová mapa chromozómu 4 prasete u rodin MxP Vzdálenosti lokusů jsou uvedeny v Kosambi cM
lokus
průměrná
samičí
samčí
Sw489
0,0
0,0
0,0
Myc
21,7
27,1
17,7
Sw835
26,0
32,5
20,7
Swr73
42,1
49,6
35,9
S0145
46,7
51,3
43,6
Sw1073
56,8
65,6
50,2
Sw1089
63,0
73,9
54,6
ATP6
65,9
78,5
55,2
ATP1B1
69,3
85,4
55,8
S0073
75,3
92,4
62,4
ATP1A2
78,6
97,5
63,1
PKLR
87,4
110,7
66,6
EAL
96,0
122,3
72,8
AMPD1
100,6
127,5
77,1
NGFB
100,6
127,8
77,1
TSHB
102,9
131,7
77,1
Sw2435
112,2
147,9
80,3
S0097
134,9
169,2
104,0
65
Tab. 8. Aktuální vazbová mapa chromozómu 4 prasete, rodina WxM Vzdálenosti lokusů jsou uvedeny v Kosambi cM
lokus
průměrná
samičí
samčí
Sw489
0,0
0,0
0,0
Myc
19,3
26,9
15,5
Sw835
24,5
31,9
21,0
Swr73
41,4
49,0
38,5
S0145
50,8
52,9
51,2
Sw1073
64,3
66,9
63,9
Sw1089
69,0
74,0
67,0
ATP1B1
72,3
77,8
69,2
S0073
73,6
79,4
71,9
ATP1A2
77,0
84,6
71,9
PKLR
79,8
89,0
74,2
EAL
87,0
98,6
79,2
AMPD1
90,6
103,0
81,5
NGFB
91,1
103,7
83,0
Sw2435
99,1
118,4
85,0
S0097
127,9
145,7
115,2
66
6. Souhrn Cílem práce bylo zvládnout metodiky molekulární biologie, vybrat vhodné kandidátní geny a amplifikovat jejich fragmenty metodou polymerázové řetězové reakce. Pomocí metod PCR-RFLP, DGGE a sekvenování detekovat v těchto genech polymorfismus na úrovni DNA a vypracovat metodiky pro rutinní testování zvířat. Dále u zkoumaných populací prasat určit genotypy a orientační frekvence alel pro další genetické studie. Hlavní náplní byl vývoj nových metodik detekce polymorfismu ve vybraných genech využitelných pro rutinní testování. Studovány byly tyto geny: LEPR, NGFB, MSTN, PPARγ, ATP6 a ATP1B1. Gen LEPR kóduje receptor leptinu – jednoduchý membránový receptor, aktivující transkripci genů v hypotalamu a významně se podílející na řízení příjmu krmiva. U myší byla popsána mutace způsobující obezitu, fenotypově velmi podobnou obezitě způsobené defektním leptinem. Pro svou fyziologickou funkci je označován jako kandidátní gen pro tučnost. Gen NGFB kóduje beta podjednotku nervového růstového faktoru, který je zapojen do regulace růstu a diferenciace sympatických a senzorických neuronů. Nervový růstový faktor je tvořen podjednotkami alfa, beta a gamma a beta podjednotka, která je zastoupena v komplexu 2x, je zodpovědná za stimulující aktivitu NGF. NGFB byl mapován cytogeneticky v QTL oblasti pro znaky jatečné hodnoty a tučnost a byl vybrán jako kandidátní gen. Produkt genu MSTN (GDF8) – myostatin, růstový a diferenciační faktor-8 – je specificky exprimován ve vyvíjejících se kosterních svalech a působí jako negativní regulátor růstu těchto svalů. Popsané mutace u myší a skotu, způsobující nefunkčnost myostatinu, vyvolávají extrémní osvalení. Vzhledem k těmto skutečnostem je MSTN označován jako kandidátní gen pro masnou užitkovost a jatečnou hodnotu. Gen PPARγ kóduje nukleární hormonální receptor, regulující genovou expresi a diferenciaci adipocytů. Vzhledem k asociačním studiím u člověka, naznačujícím roli PPARγ v regulaci příjmu potravy a působení inzulinu, je PPARγ označován jako kandidátní gen pro tučnost. Vakuolární proton-přemísťující ATPáza (ATP6) je membránový enzymový komplex regulující cytoplazmatické pH. Gen kódující podjednotku nezbytnou pro aktivitu ATP6 byl mapován v QTL oblasti pro růst a tučnost a z hlediska fyziologické funkce je považován za kandidátní gen. V této
67
oblasti je lokalizován další gen z ATPázové genové skupiny – ATP1B1 – kódující beta podjednotku Na+,K+-ATPázy. I tento gen je označován jako kandidátní gen pro podíl tuku a jatečnou hodnotu. U genu LEPR byl pomocí dříve publikovaných primerů metodou PCR amplifikován fragment o velikosti 380bp. Polymorfismus byl vyhledáván metodou DGGE a byl nalezen pouze u plemene piétrain (3 A/B, 11 B/B). Protože data z experimentálního souboru PiGMaP Hohenheim
nebyla dostačující pro vazbové mapování, byly
navrženy nové primery, pomocí nichž byl syntetizován produkt o velikosti ≈ 2 kb. Identita produktu byla ověřena sekvenováním a zjištěné sekvence byly uloženy v databázi EMBL (přístupové číslo AJ223162 a AJ223163). Polymorfismus byl nalezen s restrikčními endonukleázami Hpa II a Rsa I. U všech testovaných zvířat kosegregovaly alely LEPR/Rsa I s alelami LEPR/DGGE. Lokus LEPR/Hpa II byl více informativní a frekvence alely B u testovaných plemen byla: bílé ušlechtilé 0,50, landrace 0,83, české výrazně masné 0,80, přeštické černostrakaté 0,71, hapshire 0,25, piétrain 0,75 a meishan 0,93. Výsledky testování rodiny WxP PiGMaP Hohenheim byly použity pro vazbovou analýzu a LEPR byl mapován do vazbové skupiny na chromozómu 6 v pořadí genů a vzdálenostech v Kosambi cM …A1BG-(26,8)S0146-(9,9)-S0003-(15,6)-SW824-(10,9)-LEPR-(26,0)-P3-(29,0)-EAO. Na základě parciální sekvence prasečího NGFB byly navrženy primery pro amplifikaci fragmentu o velikosti 448bp. Identita produktu byla ověřena restrikční analýzou s použitím 10-ti enzymů. Polymorfismus byl detekován metodou DGGE a frekvence alely B u plemen prasat byla: bílé ušlechtilé 0,50, landrace 0,97, přeštické černostrakaté 0,83, piétrain 0,81 a pro plemena české výrazně masné, hapshire, duroc a meishan 1,00. NGFB byl vazbově mapován na chromozóm 4 v pořadí genů …S0073 – EAL – NGFB – Sw2435 a byl lokalizován do pozice 100,9 u rodiny WxP, 100,6 u rodiny MxP a 91,1 Kosambi cM u rodiny WxM od nejproximálnějšího markeru (Sw489). Pro PCR amplifikaci MSTN byly navrženy primery podle sekvencí promotoru a exonu 1. Amplifikovaný produkt o velikosti 1027 bp byl sekvenován, získaná sekvence byla uložena v databázi EMBL (přístupové číslo AJ133580). Nově získaná sekvence neobsahuje 384 nukleotidů, které se v dříve publikované sekvenci vyskytují navíc a to opačně orientované a komplementární k jiné části promotoru a
68
části exonu 1. K vyhledávání polymorfismu bylo použito 11 enzymů, polymorfismu byl nalezen s endonukleázou Dra I. Frekvence alely T u některých plemen byla: bílé ušlechtilé 0,89, landrace 0,95, meishan 0,79 a miniaturní prase 0,87. Ostatní studovaná plemena (piétrain, české výrazně masné, přeštické černostrakaté, hampshire a duroc) byla monomorfní pro alelu T. MSTN byl vazbově mapován v rodině WxM v pozici 53,5 Kosambi cM od nejproximálnějšího markeru na chromozómu 15 (S0148). Podle sekvence cDNA prasečího genu PPARγ byly pro studium polymorfismu navrženy 4 páry primerů. Nepodařilo se amplifikovat specifický fragment odpovídající svou sekvencí PPARγ prasete. Dva páry primerů byly navrženy pro amplifikaci fragmentů ATP6 podle sekvencí v EMBL. Polymorfismus byl nalezen ve fragmentu o velikosti 1172 bp, obsahujícím část intronu 13, exon 14 a 3’-UTR, s restrikční endonukleázou Dra I u zvířat plemen piétrain a přeštické černostrakaté. Testovány byly rodiny WxP a MxP, u nichž byl tento gen mapován vazbově do pozice 69,8 respektive 65,9 Kosambi cM od nejproximálnějšího markeru na chromozómu 4 (Sw489). Pro studium polymorfismu ATP1B1 byly navrženy primery podle prasečí cDNA. PCR produkt byl sekvenován a získaná sekvence bude uložena v databázi EMBL. Po sérii restrikčních analýz byl polymorfismus nalezen s enzymy Aci I a Hpa II u prasat plemene meishan. Alely v uvedených lokusech kosegregovaly a testování bylo provedeno s enzymem Hpa II u rodin MxP a WxM PiGMaP Hohenheim. V těchto rodinách byl ATP1B1 mapován vazbově v pozici 69,3, respektive 72,3 Kosambi cM od nejproximálnějšího markeru na chromozómu 4 (Sw489). Získané údaje slouží pro další genetické studie – vazbovou analýzu a mapování QTL v rámci mezinárodního projektu mapování genomu prasete PiGMaP.
69
7. Summary The aims of the presented Ph.D. thesis were to learn molecular biology methods, to choose candidate genes and amplify their fragments by means of PCR. Further goals were to find DNA polymorphism within chosen genes using PCR-RFLP, DDGE and sequencing, to prepare methods for their routine typing and to perform genotyping of the genes in populations under the study and to estimate their gene frequencies. The main task of this work was to develop new methods suitable for routine typing of polymorphism within chosen genes. The following genes have been studied:
LEPR, NGFB, MSTN, PPARγ, ATP6
and ATP1B1. LEPR encodes leptin receptor – simple membrane receptor which activate transcription of genes in hypothalamus and influence feed intake. In mouse obesity causing mutation was ascribed phenotypically similar to that caused by defective leptin. For its physiological function the gene is considered a candidate gene for fatness. The NGFB gene encodes nerve growth factor, beta subunit, which is involved in growth regulation and differentiation of sympathetic and sensory neurons. The nerve growth factor consists of alpha, beta and gamma. Beta subunit, which is represented two times within the complex, is responsible for stimulating activity. NGFB was cytogenetically mapped to the chromosome region with QTL affecting carcass quality and fatness and therefore the gene has been chosen as a candidate gene. MSTN
(GDF8) gene product – myostatin, growth and
differential factor-8 – is specifically exprimed in developing skeletal muscles and is a negative regular of skeletal muscle growth. Ascribed mutations, which occur in mice and cattle, cause synthesis of non-functional myostatin and extreme development of skeletal muscles. Due to these facts the MSTN gene is supposed to be a candidate gene for fattening and carcass traits. PPARγ gene encodes nuclear hormone receptor regulating gene expression and differentiation in adipocytes. Due to the fact that association studies in humans indicated involvement of the gene in feed intake regulation and insulin function the gene is considered as a candidate gene for fatness. Vacuolar proton-transferring ATPase
(ATP6) is a membrane
enzyme complex regulating cytoplasmic pH. Gene encoding subunit essential for
70
ATP6 activity was mapped to chromosome region wit QTL affecting growth and fatness and for its physiological function the gene is considered as a candidate gene. Another gene with from ATPase gene family - ATP1B1, encoding beta subunit of Na+, K+- ATPase, is also localized in above mentioned chromosome region and the gene is also considered to be a candidate gene for fatness and carcass quality. Using already published PCR primers the 380 bp PCR fragment of the LEPR gene was amplified. DGGE polymorphism was found only in Piétrain breed (3 A/B, 11B/B). Due to a low informativness of the polymorphism in PiGMaP families it was not possible to get a linkage position and there fore a new pair of primers was constructed to give an amplimer approximately 2 kb. Verification of the PCR product vas performed by sequencing and sequences were deposited to EMBL database (accession numbers AJ223162, AJ223163). Polymorphism was detected by restriction endonucleases Hpa II and Rsa I. In all animals LEPR/Rsa I alleles co-segregated with LEPR/DGGE alleles. Locus LEPR/Hpa II was a more informative compared to previous one and frequencies of allele B were as follows: Large White – 0.50, Landrace – 0.83, Czech Meat Pig - 0.80, Přeštice Paid Pig – 0.71, Hampshire – 0.25, Piétrain – 0.75, and Meishan 0.93. In WxP Hohenheim PiGMap family the LEPR gene was mapped to the chromosome 6 linkage group with the following order (distances given in Kosambi cM): A1BG-(26,8)-S0146-(9,9)S0003-(15,6)-SW824-(10,9)-LEPR-(26,0)-P3-(29,0)-EAO. On the basis of a partial sequence of porcine NGFB a pair of primers was designated to amplify 448 bp fragment of the gene. Identity of the fragment was verified by means of 10 restriction endonucleases. Polymorphism was detected by DGGE with following frequency of allele B: Large White – 0.50, Landrace – 0.97, Přeštice Paid Pig – 0.83, Hampshire – 0.25, Piétrain – 0.81, and Meishan 0.93. In Czech Meat Pig, Hampshire, Duroc and Meishan only allele was detected. NGFB was mapped by linkage analysis to chromosome 4 with the following order: S0073 – EAL – NGFB – Sw2435. In families WxP, MxP and WxM the gene was mapped to positions 100.9, 100.6 and 91.1 Kosambi cM, respectively, measured from the most proximal marker (Sw489). For amplification of 1027bp PCR fragment of the MSTN gene primers were designated on the basis of promoter and exon 1 sequences. The amplimer was
71
sequenced and sequence was deposited to EMBL database (accession number AJ133580). In this new sequence 384bp fragment was obmitted, as it was a piece of a sequence complementary to different part of promoter sequence and sequence of exon 1, which was included to the published sequence by mistake. When looking for polymorphism 11 restriction endonucleases were used. Polymorphism was detected by means of Dra I. In some breeds we found following frequencies of allele T: Large White – 0.89, Landrace – 0.95, Meishan 0.79 and Miniature Pig – 0.87. In other breeds (Piétrain, Czech Meat Pig, Black Pied Přeštice, Hampshire and Duroc) only allele T was detected. The MSTN gene was mapped by linkage analysis to the position 53.5 Kosambi cM from the most proximal marker on chromosome 15 (S0148). On the basis of porcine cDNA sequence of PPARγ four pairs of primers were designated to amplify a part of the gene, but no specific fragment was obtained. Using EMBL sequences ATP6 two pairs of primers were designated. In Piétrain and Black Pied Přeštice polymorphism was detected with Dra I in 1172bp fragment encompassing a part of intron 13, exon 14 and 3’-UTR. The gene was mapped by linkage analysis in WxP and MxP families on chromosome 4. to positions 69.8 and 65.9 Kosambi cM, respectively, measured from the most proximal marker on chromosome 4 (Sw489). To study polymorphism within the ATP1B1 gene PCR primers were constructed on the basis of porcine cDNA sequence. Obtained PCR product was sequenced and sequence will be deposited to EMBL database. After digestion with several endonucleases polymorphism was detected by means of Aci I and Hpa II in Meishan breed. Alleles in both loci co-segregated. For final typing Hpa II was used. In MxP and WxM Hohenheim PiGMap families the ATP1B1 mapped to positions 69.3 and 72.3 Kosambi cM, respectively, from the most proximal marker on chromosome 4 (Sw489). The data obtained will be used for further genetic studies, which are in progress, i.e. linkage analysis and QTL mapping.
72
8. Seznam použitých zkratek A,G,C,T – adenin, guanin, cytozin, tymin, označení jednotlivých nukleotidů ATP1A1 - Na+,K+- ATPasa, alfa podjednotka, označení genu ATP1B1 – Na+,K+- ATPasa, beta podjednotka, označení genu ATP6 – vakuolární H+- ATPasa, označení genu bp (base pair) – pár bazí CDGE (constant denaturant gel electrophoresis) – gelová elektroforéza při konstantní koncentraci denaturantu cDNA (complementary DNA) – komplementární DNA CRC (calcium releasing chanel) – vápníkový kanál, označení genu ddNTP (dideoxyribonucleotide) – dideoxyribonukleotid DNA (deoxyribonucleic acid) – deoxyribonukleová kyselina dNTP (deoxyribonucleotide) – deoxyribonukleotid DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) – denaturační gradientová gelová elektroforéza DMSO – dimethylsulfoxid dsDNA (doble-strand DNA) – dvouřetězcová DNA EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetate) – chelaton 3 EMBL (European Molecular Biology Laboratory) – evropská laboratoř molekulární biologie; označení databáze sekvencí nukleových kyselin ESR – estrogenový receptor, označení genu ETL (economic trait loci) – lokusy ekonomických vlastností FISH (fluorescent in situ hybridization) – fluorescenční hybridizace in situ GDF-8 (growth/differentiation factor-8) – růstový/diferenciační faktor-8, označení genu HAL (halothane) – halotan, starší označení genu RYR1 kb (kilo base) – tisíc bazí LEPR – leptinový receptor, označení genu LINE (long interspersed nuclear element) – dlouhý vmezeřený jaderný element MAS (marker assisted selection) – selekce podporovaná markery mRNA (messenger RNA) – mediátorová RNA
73
MSTN – myostatin, označení genu NGF (nerve growth factor) – nervový růstový faktor NGFB (nerve growth factor beta) – nervový růstový faktor, beta podjednotka, označení genu PCR (polymerase chain reaction) – polymerázová řetězová reakce PiGMaP (Pig Gene Mapping Project) – projekt mapování genomu prasete PPARγ – peroxisome proliferator activated receptor γ, označení genu PRE-1 (porcine repetitive element-1) – prasečí repetitivní element 1 PSE (pale, soft, exudative) – bledé, měkké, vodnaté, označení masa PSS (porcine stress syndrome) – stresový syndrom prasat QTL (quantitative trait loci) – lokusy kvantitativních znaků RNA (ribonucleic acid) – ribonukleová kyselina RFLP (restriction fragment length polymorphism) – polymorfismus délky restrikčních fragmentů S + číslo - mikrosatelit SINE (short interspersed nuclear element) – krátký vmezeřený jaderný element SSCP (single-strand conformation polymorphism) – konformační polymorfismus jednořetězcové DNA Tm (melting temperature) – teplota tání (DNA, primeru) TTGE (temporal temperature gradient electophoresis) – gelová elektroforéza při teplotním gradientu U (unit) – jednotka aktivity enzymu UTR (untranslated region) – nekódující oblast mRNA VNTR (variable number tandem repeats) – variabilní počet tandemových repetic Označení plemen:
M - meishan P – piétrain W – divoké prase
74
9. Seznam použité literatury Andersson, L., Haley, C.S., Ellegren, H., Knott, S.A., Johansson, M., Andersson, K., Andersson-Eklund, L., Edfors-Lilja, I., Fredholm, M., Hansson, I., Håkansson, J., Lundström, K. (1994). Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs. Science 263: 1771-1774. Archibald, A.L., Haley, C.S., Andersson, L., Gustavsson, I., Bosma, A., Davies, W., Fredholm, M., Geldermann, H., Gellin, J., Groenen, M., Ollivier, L., Tucker, E.M., Van de Weghe, A. (1991). PiGMaP: an European initiative to map the porcine genome. Anim Genet 22: 82-83. Archibald, A.L., Haley, C.S., Brown, J.F., Couperwhite, S., McQueen, H.A., Nicholson, D., Coppieters, W., Van de Weghe, A., Stratil, A., Wintero, A.K., Fredholm, M., Larsen, N.J., Nielsen, V.H., Milan, D., Woloszyn, N., Robic, A., Dalens, M., Riquet, J., Gellin, J., Caritez, J.-C., Hue, D., Burgaud, G., Ollivier, L., Bidanel, J.-P., Vaiman, M. Renard, C., Geldermann, H., Davoli, R., Ruyeter, D., Vestage, E.J.M., Groenen, M.A.M., Davies, W., Hoyheim, B., Keiserud, A., Andersson, L., Ellegeren H., Johansson, M., Marklund L., Miller, R.J., Anderson-Dear, D.V., Signer, E., Jeffreys, A.J. (1995). The PiGMaP consortium linkage map of the pig (Sus scrofa). Mamm Genome 6: 157-175. Blackburn, E. (1991). Structure and function of telomeres. Nature 350: 569-573. Borresen, A.L., Hovig, E., Smith-Sorensen, B., Malkin, D., Lystad, S., Andersen, T.I., Nesland, J.M., Isselbacher, K.J., Friend, S.H. (1991). Constant denaturant gel electrophoresis as a rapid screening technique for p53 mutations. Proc Natl Acad Sci 88: 8405-8409. Brascamp, E.W., Haley, C.S., Groenen, M.A.M., Janss, L.L.G. (1995) Pig News and Information 16: 41N-46N. Brisseau, G.F., Grinstein, S., Hackam, D.J., Nordstrom, T., Manolson, M.F., Khine, A.A., Rotstein, O.D. (1996) Interleukin-1 increases vacuolar-type H+ATPase activity in murine peritoneal macrophages. J Biol Chem 271: 20052011.
75
Buitkamp, J., Epplen, J.T. (1996). Modern genome research and DNA diagnostics in domestic animals in the light of classical breeding techniques. Electrophoresis 17: 1-11. Cytogenetic map of the pig: http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/cyto/cyto.htm Daneau, I., Silversides, D.W. (1998). Sus scrofa myostatin (GDF-8) promoter genomic sequence. Unpublished: EMBL AF093798. Ellegren, H. (1993). Variable SINE 3' poly(A) sequences: an abundant class of genetic markers in the pig genome. Mamm Genome 4: 429-434. Ellegren, H., Chowdhary, B.P., Johansson, M., Marklund, L., Fredholm, M., Gustavsson, I., Andersson, L. (1994). A primary linkage map of the porcine genome reveals a low rate of genetic recombination. Genetics 137: 1089-1100. EMBL (2000): http://www.embl-heidelberg.de/srs5/ Ernst, C.W., Kapke, P.A., Yerle, M. Rothschild, M.F. (1997). The leptin receptor gene (LEPR) maps to porcine chromosome 6. Mamm. Genome 8: 226. Fischer, S.G., Lerman, L.S. (1983). DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. Proc Natl Acad Sci 80: 1579-1583. Fujii, J., Otsu, K., Zorzato, F., de Leon, S., Khanna, V.K., Weiler, J.E., O'Brien, P.J., MacLennan, D.H. (1991). Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science 253: 448-451. Geldermann, H. (1975). Investigations on inheritance of quantitative characters in animals by gene markers. Theor Applied Genetics 46: 319-330. Geldermann, H., Moser, G., Müller, D., Beeckmann, P., Yue, G., Dragos, M., Bartenschlager, H., Čepica, S., Stratil, A., Schröffel, J. (1999). Status of genome and QTL mapping in pigs – Data of Hohenheim F2 families. Arch. Tierz., Dummerstorf 42: 67-81. Geldermann, H., Müller, E., Beeckmann, P., Knorr, C., Yue, G., Moser, G. (1996). Mapping of quantitative-trait loci by means of marker genes in F2 generations of Wild board, Pietrain and Meishan pigs. J. Anim. Breed. Genet. 113: 381-387. Gelfi, C., Righetti, P.G., Cremonesi, L., Ferrari, M. (1994). Detection of point mutations by capillary electrophoresis in liquid polymers in temporal thermal gradients. Electrophoresis 15: 1506-11
76
Georges, M., Massey, J.M. (1991). Velogenetics or the synergic use of marker assisted selection and germ line manipulation. Theriogenology 35: 151-159. Georges, M., Nielsen, D., Mackinnon, M., Mishra, A., Okimoto, R., Pasquino,A.T., Sargeant, L.S., Sorensen, A., Steele, M.R., Zhao, X., Womack, J.E., Hoeshele, I. (1995). Mapping quantitative trait loci controlling milk production in dairy cattle by exploiting progeny testing. Genetics 139: 907-920. Ghilardi, N., Ziegler, S., Wiestner, A., Stoffel, R., Heim, M.H., Skoda, R.C. (1996). Defective STAT signaling by the leptin receptor in diabetic mice. Proc. Nat. Acad. Sci. 93: 6231-6235. Gilad, S., Khosravi, R., Shkedy, D., Uziel, T., Ziv, Y., Savitsky, K., Rotman, G., Smith, S., Chessa, L., Jorgensen, T.J., Harnik, R., Frydman, M., Sanal, O., Portnoi, S., Goldwicz, Z., Jaspers, N.G., Gatti, R.A., Lenoir, G., Lavin, M.F., Tatsumi, K., Wegner, R.D., Shiloh, Y., Bar-Shira, A. (1996). Predominance of null mutations in ataxia-telangiectasia. Hum Mol Genet 5: 433-439. Glavac, D., Dean, M. (1995). Applications of heteroduplex analysis for mutation detection in disease genes. Hum Mutat 6: 281-287. Gonzalez-Cadavid, N. F., Taylor, W. E., Yarasheski, K., Sinha-Hikim, I., Ma, K., Ezzat, S., Shen, R., Lalani, R., Asa, S., Mamita, M., Nair, G., Arver, S., Bhasin, S. (1998). Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 14938-14943. Green, P., Falls, K., Crooks, S. (1990). Documentation for CRIMAP, version 2.4 (Washington University Schooů of Medicine, St. Louise, Mo). Greene, M.E., Blumberg, B., McBride, O.W., Yi, H.F., Kronquist, K., Kwan, K., Hsieh, L., Greene, G., Nimer, S.D. (1995). Isolation of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma cDNA: expression in hematopoietic cells and chromosomal mapping. Gene Expr 4: 281-299. Grindflek, E., Sundvold, H., Klungland, H., Lien, S. (1998). Characterisation of porcine peroxisome proliferator-activated receptors gamma 1 and gamma 2: detection of breed and age differences in gene expression. Biochem Biophys Res Commun. 249: 713-718.
77
Grobet, L., Martin, L.J.R., Poncelet, D., Pirottin, D., Brouwers, B., Riquet, J., Schoeberlein, A., Dunner, S., Menissier, F., Massabanda, J., Fries, R., Hanset, R., Georges, M. (1997). A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nature Genet 17: 71-74. Haley, C.S. (1995). Livestock QTLs - bringing home the bacon? Trends Genet 11: 488-492. Havenstein, G.B., Ferket, P.R., Scheideler, S.E., Larson, B.T. (1994).
Growth,
livability, and feed conversion of 1957 vs 1991 broilers when fed "typical" 1957 and 1991 broiler diets. Poult Sci 73: 1785-1794. Ho, M.N., Hirata, R., Umemoto, N., Ohya, Y., Takatsuki, A., Stevens, T.H., Anraku, Y. (1993). VMA13 encodes a 54-kDa vacuolar H(+)-ATPase subunit required for activity but not assembly of the enzyme complex in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 268: 18286-18292. Houseknecht, K.L., Bidwell, C.A., Portocarrero, C.P., Spurlock, M.E. (1998). Expression and cDNA cloning of porcine peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma). Gene 225: 89-96. Hui, D., Deppe, A., Wen, G., Leeb, T., Masabanda, J., Robic, A., Baumgartner, B.G., Fries, R., Brenig, B. (1999) Molecular cloning and chromosomal assignment of the porcine 54 and 56 kDa vacuolar H(+)-ATPase subunit gene (V-ATPase). Mamm Genome 10: 266-270. Chadwick, R.B., Conrad, M.P., McGinnis, M.D., Johnston-Dow, L., Spurgeon, S.L., Kronick, M.N. (1996). Heterozygote and mutation detection by direct automated fluorescent DNA sequencing using a mutant Taq DNA polymerase. Biotechniques 20: 676-683. Chen, H., Charlat, O., Tartaglia, L.A., Woolf, E.A., Weng, X., Ellis, S.J., Lakey, N.D., Culpepper, J., Moore, K.J., Breitbart, R.E., Duyk, G.M., Tepper, R.I., Morgenstern, J.P. (1996). Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell 84: 491-495 Chou, Q., Russell, M., Birch, D.E., Raymond, J., Bloch, W. (1992). Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Res 20: 1717-1723.
78
Chung, W.K., Power-Kehoe, L., Chua, M., Lee, R., Leibel, R.L. (1996). Genomic structures of the human OB receptor and identification of two novel intronic microsatellites. Genome Res. 6: 1192-1199. Innis, A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (1990). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, Inc., San Diego, USA. Innis, M.A., Myambo, K.B., Gelfand, D.H., Brow, M.A. (1988). DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9436-9440. Kopečný, M., Stratil, A., Čepica, S., Moser, G. (2000). Polymorphism in the porcine NGFB gene detected by DGGE and its linkage mapping. Czech J. Anim. Sci. 45: 189-192. Kukita, Y., Tahira, T., Sommer, S.S., Hayashi, K. (1997). SSCP analysis of long DNA fragments in low pH gel. Hum Mutat 10: 400-407. Lahbib-Mansais, Y., Mellink, C., Yerle, M., Gellin, J. (1994). A new marker (NGFB) on pig chromosome 4, isolated by using a consensus sequence conserved among species. Cytogenet Cell Genet 67(2): 120-125. Lahbib-Mansais, Y., Yerle, M., Dalens, M., Chevalet, C., Gellin, J. (1993). Localization of pig Na+,K(+)-ATPase alpha and beta subunit genes to chromosome 4 by radioactive in situ hybridization. Genomics 15: 91-97. Lane, L.K., Shull, M.M., Whitmer, K.R., Lingrel, J.B. (1989). Characterization of two genes for the human Na,K-ATPase beta subunit. Genomics 5: 445-453. Lawyer, F.C., Stoffel, S., Saiki, R.K., Myambo, K., Drummond, R., and Gelfand, D.H. (1989). Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 264: 6427-6437. Lee, G.-H., Proenca, R., Montez, J.M., Carroll. K.M. : Darvishzadeh, J.G., Lee, J.I., Friedman, J.M. (1996). Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature 379: 632-635. Levi-Montalcini, R. (1987). The nerve growth factor thirty-five years later. Science 237: 1154-1162. Liu, Q., Sommer, S.S. (1995). Restriction endonuclease fingerprinting (REF): a sensitive method for screening mutations in long, contiguous segments of DNA. Biotechniques 18: 470-477.
79
Makino, R., Yazyu, H., Kishimoto, Y., Sekiya, T., Hayashi, K. (1992). F-SSCP: fluorescence-based
polymerase
chain reaction-single-strand
conformation
polymorphism (PCR-SSCP) analysis. PCR Methods Appl 2: 10-13. Marklund, L., Johansson Moller, M., Hoyheim, B., Davies, W., Fredholm, M., Juneja, R.K., Mariani, P., Coppieters, W., Ellegren, H., Andersson, L. (1996). A comprehensive linkage map of the pig based on a wild pig-Large White intercross. Anim Genet 27: 255-269. Marklund, L., Wintero, A.K., Thomsen, P.D., Johansson, M., Fredholm, M., Gustafsson, U., Andersson, L. (1993). A linkage group on pig chromosome 4 comprising the loci for blood group L, GBA, ATP1B1 and three microsatellites. Anim Genet 24: 333-338. Matteri, R.L. and Carroll, J.A. (1996). Partial cDNA sequence of the porcine leptin receptor. Unpublished: EMBL U67739. Maxam, A.M., Gilbert, W. (1977). A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564. Men, T.Y., Lacroix, D.A., Ruiz-Cortes, Z.T., Song, J.H., Palin, M.-F., Murphy, B.D. (1998). Porcine leptin (Ob) receptor complete coding sequence. Unpublished, EMBL: AF092422 McPherron, A.C., Lawler, A.M., Lee, S.-J. (1997). Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 387: 83-90. McPherron, A.C., Lee, S.-J. (1996). The transforming growth factor beta superfamily. In: Growth Factors and Cytokines in Health and Disease, Vol. 1B (eds LeRoith, D. & Bondy, C.) 357-393 (JAI, Greenwich). McPherron, A.C., Lee, S.-J. (1997). Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc. Nat. Acad. Sci. 94: 12457-12461. Meirhaeghe, A., Fajas, L., Helbecque, N., Cottel, D., Lebel, P., Dallongeville, J., Deeb, S., Auwerx, J., Amouyel, P. (1998). A genetic polymorphism of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma gene influences plasma leptin levels in obese humans. Hum Mol Genet. 7: 435-440. Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A., Ebert, M.H. (1981). Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamide gels shows regional variation in cerebrospinal fluid proteins. Science 211: 1437-1438.
80
Mikawa, S., Akita, T., Hisamatsu, N., Inage, Y., Ito, Y., Kobayashi, E., Kusumoto, H., Matsumoto, T., Mikami, H., Minezawa, M., Miyake, M., Shimanuki, S., Sugiyama, C., Uchida, Y., Wada, Y., Yanai, S., Yasue, H. (1999). A linkage map of 243 DNA markers in an intercross of Gottingen miniature and Meishan pigs. Anim Genet 30: 407-417. Mullis, K.B., Faloona, F.A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase-catalysed chain reaction. Methods Enzymol. 155: 335-350. Myers, R.M., Maniatis, T., Lerman, L.S. (1987). Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis. Methods Enzymol 155: 501-527. Nagamine, C.M., Chan, K., Lau, Y.F. (1989). A PCR artifact: generation of heteroduplexes. Am J Hum Genet 1989 45: 337-339. Nakamura, Y., Leppert, M., O'Connell, P., Wolff, R., Holm, T., Culver, M., Martin, C., Fujimoto, E., Hoff, M., Kumlin, E., White, R. (1987). Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping. Science 235: 16161622. O'Brien, S.J., Womack, J.E., Lyons, L.A., Moore, K.J., Jenkins, N.A., Copeland, N.G. (1993). Anchored reference loci for comparative genome mapping in mammals. Nat Genet 3: 103-112. Ohta, T., Numata, M., Yagishita, H., Futagami, F., Tsukioka, Y., Kitagawa, H., Kayahara, M., Nagakawa, T., Miyazaki, I., Yamamoto, M., Iseki, S., Ohkuma, S. (1996). Expression of 16 kDa proteolipid of vacuolar-type H(+)-ATPase in human pancreatic cancer. Br J Cancer 73: 1511-1517. Orita, M., Suzuki, Y., Sekiya, T., Hayashi, K. (1989). Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5: 874-879. Ovchinnikov, Y.A., Modyanov, N.N., Broude, N.E., Petrukhin, K.E., Grishin, A.V., Arzamazova, N.M., Aldanova, N.A., Monastyrskaya, G.S., Sverdlov, E.D. (1986). Pig kidney Na+,K+-ATPase. Primary structure and spatial organization. FEBS Lett. 201: 237-245.
81
Pearson, R.E., Brinster, R.L., Hammer, R.E., Trumbauer, M.E., Rosenfeld, N.C., Birnberg, N.C., Evans, R.M. (1990). The potential for increasing productivity through selection for increased milk and component yields. Proceedings of the 4th World Congress in Genetics Applied to Livestock Production, July 23-27, 1990, Edinburgh, UK, 14: 104-113. Pfeiffer, I., Brenig, B. (1998). A highly polymorphic microsatellite within intron 5 of the porcine 54/56 kDa vacuolar H(+)-ATPase subunit gene (V-ATPase). Anim Genet 29: 464-465. Pig Genome Maping: http://www.ri.bbsrc.ac.uk/pigmap/pigmap.html Pomp, D., Medrano, J.F. (1991). Organic solvents as facilitators of polymerase chain reaction. Biotechniques 10: 58-59. Robic, A., Riquet, J., Yerle, M., Milan, D., Lahbib-Mansais, Y., Dubut-Fontana, C., Gellin, J. (1996). Porcine linkage and cytogenetic maps integrated by regional mapping of 100 microsatellites on somatic cell hybrid panel. Mamm Genome 7: 438-445. Rohrer, G.A., Alexander, L.J., Keele, J.W., Smith, T.P., Beattie, C.W. (1994). A microsatellite linkage map of the porcine genome. Genetics 136: 231-245. Rohrer, G.A., Alexander, L.J., Hu, Z., Smith, T.P., Keele, J.W., Beattie, C.W. (1996). A comprehensive map of the porcine genome. Genome Res 6: 371-391. Rothschild, M., Jacobson, C., Vaske, D., Tuggle, C., Wang, L., Short, T., Eckardt, G., Sasaki, S., Vincent, A., McLaren, D., Southwood, O., van der Steen, H., Mileham, A., Plastow, G. (1996). The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 201205. Rychlik, W., Rhoads, R.E. (1989). A computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res 17: 8543-8551. Saiki, R.K., Scharf, S.J., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A., Arnheim, N. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.
82
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491. Sambrook, J., Fritz, E.F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harb. Lab. Press, USA. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. Schmitz, A., Chaput, B., Fouchet, P., Guilly, M.N., Frelat, G., Vaiman, M. (1992). Swine chromosomal DNA quantification by bivariate flow karyotyping and karyotype interpretation. Cytometry 13: 703-710. Sheffield, V.C., Cox, D.R., Lerman, L.S., Myers, R.M. (1989). Attachment of a 40base-pair G + C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes. Proc Natl Acad Sci 86: 232-236. Shull, M.M., Pugh, D.G., Lane, L.K., Lingrel, J.B. (1990). MspI and PvuII polymorphisms in the Na,K-ATPase beta subunit gene ATP1B1. Nucleic Acids Res. 18: 1087. Singer, D.S., Parent, L.J., Ehrlich, R. (1987). Identification and DNA sequence of an interspersed repetitive DNA element in the genome of the miniature swine. Nucleic Acids Res 15: 2780. Smith, H.O., Wilcox, K.W. (1970). A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. J Mol Biol 51: 379-391. Sonstegard, T.S., Rohrer, G.A., Smith, T.P. (1998). Myostatin maps to porcine chromosome 15 by linkage and physical analyses. Anim Genet 29: 19-22. Southern, E.M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98: 503-517. Spiegelman, B.M. (1998). PPAR-gamma: adipogenic regulator and thiazolidinedione receptor. Diabetes 47: 507-514. Stratil, A., Kopečný, M., Moser, G., Schröffel, J.Jr., Čepica, S. (1998). HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping. Anim Genet 29: 405-406.
83
Stratil, A., Kopečný, M. (1999). Genomic organization, sequence and polymorphism of the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. Anim Genet 30: 468-470. Takahashi, H., Awata, T., Yasue, H. (1992). Characterization of swine short interspersed repetitive sequences. Anim Genet 23: 443-448. Tartaglia, L.A., Dembski, M., Weng, X., Deng, N., Culpepper, J., Devos, R., Richards, G.J., Campfield, L.A., Clark, F.T., Deeds, J., Muir, C., Sanker, S., Moriarty, A., Moore, K.J., Smutko, J.S., Mays, G.G., Woolf, E.A., Monroe, C.A., Tepper, R.I. (1995). Identification and expression cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell 83: 1263-1271. The DcodeTM Universal Mutation Detection System (manuál, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Thompson, D.B., Ossowski, V., Sutherland, J., Apel, W., Biesterfeldt,J. (1996). Human Leptin Receptor. Unpublished, EMBL: U59263. Vacková, I., Wolf, J., Čepica, S. (1998). Plemeno přeštické černostrakaté – genová rezerva. Náš chov, č.6, 1998, 19-20. Vaisse, C., Halaas, J.L., Horvath, C.M., Darnell, J.E.Jr., Stoffel, M., Friedman, J.M. (1996). Leptin activation of Stat3 in the hypothalamus of wildtype and ob/ob mice but not in db/db mice. Nature Genet. 14: 95-100. Vincent, A.L., Wang, L., Rothschild, M.F. (1997). Rapid communication: a restriction fragment length polymorphism in the porcine leptin receptor (LEPR) gene. J Anim Sci 75: 2287. Walling, G.A, Archibald, A.L., Cattermole J.A., Downing A.C., Finlayson, H.A., Nicholson D., Visscher, P.M., Walker, C.A., Haley, C.S. (1998). Mapping of quantitative trait loci on porcine chromosome 4. Anim Genet 29: 415-424. Webb, A.J., Simpson, S.D. (1986). Performance of British Landrace pigs selected for high and low incidence of halothane sensitivity. 2. Growth and carcass traits. Animal Production 43: 492-497. White, M.B., Carvalho, M., Derse, D., O'Brien, S.J., Dean, M. (1992). Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms. Genomics 12: 301306.
84
Wiese, U., Wulfert, M., Prusiner, S.B., Riesner, D. (1995). Scanning for mutations in the human prion protein open reading frame by temporal temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis 16: 1851-1860. Winick, J.D., Stoffel, M., Friedman, J.M. (1996). Identification of microsatellite markers linked to the human leptin receptor gene on chromosome 1. Genomics 36: 221-222. Yang-Feng, T.L., Schneider, J.W., Lindgren, V., Shull, M.M., Benz, E.J. Jr., Lingrel, J.B., Francke, U. (1988). Chromosomal localization of human Na+, K+-ATPase alpha- and beta-subunit genes. Genomics 2: 128-138. Yerle, M., Echard, G., Robic, A., Mairal, A., Dubut-Fontana, C., Riquet, J., Pinton, P., Milan, D., Lahbib-Mansais, Y., Gellin, J. (1996) A somatic cell hybrid panel for pig regional gene mapping characterized by molecular cytogenetics. Cytogenet Cell Genet 73: 194-202. Yerle, M., Lahbib-Mansais, Y., Mellink, C., Goureau, A., Pinton, P., Echard, G., Gellin, J., Zijlstra, C., De Haan, N., Bosma, A.A., Chowdhary, B., Gu, F., Gustavsson, I., Thomsen, P.D., Christensen, K., Rettenberger, G., Hameister, H., Schmitz, A., Chaput, B., Frelat, G. (1995). The PiGMaP consortium cytogenetic map of the domestic pig (Sus scrofa domestica). Mamm Genome 6: 176-186. Yerle, M., Lahbib-Mansais, Y., Pinton, P., Robic, A., Goureau, A., Milan, D., Gellin, J. (1997). The cytogenetic map of the domestic pig. Mamm Genome 8: 592-607. Zhu, Y., Qi, C., Korenberg, J.R., Chen, X.N., Noya, D., Rao, M.S., Reddy, J.K. (1995). Structural organization of mouse peroxisome proliferator-activated receptor gamma (mPPAR gamma) gene: alternative promoter use and different splicing yield two mPPAR gamma isoforms. Proc Natl Acad Sci 92: 7921-7925.
85
10. Životopisné údaje a seznam publikací 10.1. Životopisné údaje Jméno: Michal Kopečný Datum narození: 15. 4. 1971 Místo narození: Krnov Národnost: česká Státní příslušnost: Česká republika Bydliště: Sídl. pod Cvilínem S/69, 794 01 Krnov VZDĚLÁNÍ: Vysoká škola zemědělská, Agronomická fakulta, Brno, inženýrské studium studijní obor: zootechnika rok ukončení: 1994 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Agronomická fakulta, doktorandské studium obor: obecná zootechnika specializace: genetika živočichů od roku 1994 dosud V roce 1996 udělena Cena ministra školství, mládeže a tělovýchovy ″TALENT ´95″.
10.2. Původní práce uveřejněné v oponovaných časopisech Kopečný, M., Stratil, A., Čepica, S. (1997). Polymorphism at the porcine LEPR gene detected by PCR-DGGE. Anim Genet 28: 461. Kopečný, M., Stratil, A., Čepica, S., Moser, G. (2000). Polymorphism in the porcine NGFB gene detected by DGGE and its linkage mapping. Czech J. Anim. Sci. 45: 189-192.
86
Stratil, A., Knoll, A., Moser, G., Kopečný, M., Geldermann, H. (2000). The porcine adenosine monophosphate deaminase 1 (AMPD1) gene: polymorphism, linkage mapping and associations with carcass traits. Anim Genet 31: 147-148. Stratil, A., Kopečný, M. (1999). Genomic organization, sequence and polymorphism of the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. Anim Genet 30: 468-470. Stratil, A., Kopečný, M., Moser, G., Schröffel, J.Jr., Čepica, S. (1998). HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping. Anim Genet 29: 405-406.
10.3. Původní práce uveřejněné na konferencích Gajewczyk, P., Poznaňski, W., Jasek, S., Pawlik, J., Dvořák, J., Kopečný, M. (1996). Srovnání výsledků reprodukce a odchovu potomstva prasnic (WBP x PBZ) připouštěných čistokrevnými a hybridními kanci polských a českých plemen v podmínkách průmyslového chovu. In: Sb. XVII. Genetické dny, Brno, MZLU, 1996, 182. Kopečný, M. (1996). Detekce vybraných genetických markerů skotu pomocí metod molekulární
genetiky.
In:
Sb.
Seminář
posluchačů
postgraduálního
doktorandského studia MendelNET ´96, Brno, MZLU, 1996. Kopečný, M. (1996). Frequencies of genotypes of growth hormone gene in bulls. In: Sb. Miedzynarodowa konferecja studeckich kol naukowych, Wroclaw, AR, Poland, 1996, 112. Kopečný, M., Dvořák, J. (1996). Variabilita genu růstového hormonu skotu u býků českého strakatého plemene. In: Sb. XVII. Genetické dny, Brno, MZLU, 1996, 60-61. Kopečný, M., Dvořák, J., Nebola, M. (1996). Genotyping of growth hormone gene in bulls. In. Sb. Zborník z medzinárodnej vedeckej konferencie "Agronomická fakulta a vývoj poľnohospodárstva na Slovensku", Nitra, VŠP, Slovensko, 1996, 34-35. Kopečný, M., Havlíček, Z. (1997). Preliminary information on the use of milk protein genes and growth hormone gene polymorphism to characterize seven breeds of cattle. Prace i Materialy Zootechniczne, Zeszyt Specjalny 7: 61 - 62.
87
Kopečný, M., Nebola, M. (1996). Určení genotypu beta-laktoglobulinu skotu pomocí AS-PCR. In: Sb. XVII. Genetické dny, Brno, MZLU, 1996, 59. Kopečný, M., Nebola, M., Dvořák, J. (1997). Growth hormone and prolactin genes in gene reserves in Czech Republic and Poland. In: Sb. 48th EAAP, Vienna, 1997.
10.4. Další publikace Blažková, P., Kopečný, M., Stratil, A., Reiner, G., Geldermann, H. (2000). PCRRFLP and linkage assignments of the porcine ATP1B1 and V-ATPASE genes. Připraveno k publikování. Kopečný, M., Dvořák, J., Nebola, M. (1996). Detekce genomových variant betalaktoglobulinu skotu pomocí AS-PCR. Živoč. výr. 41: 423-424. Kopečný, M., Dvořák, J., Nebola, M. (1996). Molekulárně genetická variabilita genu růstového hormonu skotu. Živoč. výr. 41: 95.
88
11. Přílohy Příl. 1. Ukázka výsledku sekvenování – část genu MSTN Příl. 2. Sekvence prasečí DNA genu MSTN v databázi EMBL (AJ133580) Příl. 3. Sekvence prasečí DNA genu LEPR v databázi EMBL (AJ223162) Příl. 4. Sekvence prasečí DNA genu LEPR v databázi EMBL (AJ223163) Publikované práce: Kopečný, M., Stratil, A., Čepica, S. (1997). Polymorphism at the porcine LEPR gene detected by PCR-DGGE. Anim Genet 28: 453-461. Kopečný, M., Stratil, A., Čepica, S., Moser, G. (2000). Polymorphism in the porcine NGFB gene detected by DGGE and its linkage mapping. Czech J. Anim. Sci. 45: 189-192. Stratil, A., Kopečný, M. (1999). Genomic organization, sequence and polymorphism of the porcine myostatin (GDF8; MSTN) gene. Anim Genet 30: 468-470. Stratil, A., Kopečný, M., Moser, G., Schröffel, J.Jr., Čepica, S. (1998). HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping. Anim Genet 29: 405-406.
89
90
Příl. 2. Sekvence prasečí DNA genu MSTN v databázi EMBL (AJ133580), upraveno ID XX AC XX SV XX DT DT XX DE XX KW XX OS OC OC RN RP RA RL RL XX RN RA RT RL XX FH FH FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT
SSC133580
standard; DNA; MAM; 1027 BP.
AJ133580; AJ133580.1 23-MAR-1999 (Rel. 59, Created) 20-JAN-2000 (Rel. 62, Last updated, Version 2) Sus scrofa partial myostatin gene (GDF8:MSTN) promoter region and exon 1 GDF8:MSTN gene; myostatin; promoter. Sus scrofa (pig) Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Teleostomi; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus. [1] 1-1027 Stratil A.; Submitted (18-MAR-1999) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. Stratil A., Dept. of Genetics, Inst. Anim. Physiol. Genet., Acad. Sci. of the Czech Republ., Libechov, 277 21, CZECH REP. [2] Stratil A., Kopecny M.; "Genomic organization, sequence and polymorphism of porcine myostatin (GDF8:MSTN) gene"; Anim. Genet. 30:468-470(1999). Key
Location/Qualifiers
source
1..1027 /chromosome="15" /db_xref="taxon:9823" /organism="Sus scrofa" /map="15q2.3" <1..970 /gene="GDF8:MSTN" 163 /citation=[2] /replace="a" 406 /citation=[2] /replace="t" 607 /citation=[2] /note="allele" /replace="a" 633 /citation=[2] /replace="c" 664 /citation=[2] /replace="g"
promoter variation variation variation
variation variation
91
FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT XX SQ
mRNA CDS
mat_peptide exon
971..>1027 /product="myostatin" /gene="GDF8:MSTN" 971..>1027 /product="myostatin" /gene="GDF8:MSTN" /protein_id="CAB39561.1" /translation="MQKLQIYVYIYLFMLIVAG" 971..>1027 /product="myostatin" /gene="GDF8:MSTN" 971..1027 /number=1 /gene="GDF8:MSTN"
Sequence 1027 BP; 374 A; 141 C; 151 G; 361 T; 0 other;
tctgagggca taagcttatt cacatcttct gagcacgatt cagaataagt attatagctg atttaaatct attctttttt aaagacattt ttaaagtttc agattttaat tgaagtagtc tgacagacag gatcctgacg aaagattcac gcgttactca ttttaaaatc tgctggt
aactgcatta ctaagctcag gagcaatatt ttcacgtgaa atgattttca aatatatttt gtatttctct cctcaaatgt caacttttta actaataaag ttttcaaatg aaatgaatca ggttttaacc acacttgtct tggtgtggca aaagcaaaag atgcaaaaac
tcagtcataa atagctgaca aatctgcaac taaaagatat ttatgtacta actagtatca gattacacag ttgtctaaat agtatgaagt attaataata tcacatatat gctcaccctt tctgacagcg catcaagtgg agttgtctct taaaaggaag tgcaaatcta
aattcattat ttatcctctt tttaggatag tatttaaaaa gaaatttagt caatcttaaa gactaaaaat aatgtaaaat gtaaaagaat tttaagtgca ctttcattat gactgtaaca agattcattg aatataaaaa cagacagtgc aaataagaac tgtttatatt
92
ctttctattc ggtaataaac gagaaaatca taattccatg caggaaaaca ttttaattca aatttaaaac cattttattt tacttattta gtttatatta ttgtagattt aaatactgtt tggagcaaga gccacttgga aggcattaaa aaggagaaag tacctgttta
taagttattc aatgaaaaaa gttgaaaact tgtaatataa agtttctcaa ggtcttccta agcaaataaa ttttgaggaa aattacaatt ttgttaacat atttctttta tggtgacttg gccaatcata atacagtata attttgcttg attgtattga tgctgattgt
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1027
Příl. 3. Sekvence prasečí DNA genu LEPR v databázi EMBL (AJ223162) ID XX AC XX SV XX DT DT XX DE XX KW XX OS OC OC XX RN RP RA RL RL XX XX RN RA RT RL XX DR XX FH FH FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT XX SQ
SSAJ3162
standard; DNA; MAM; 340 BP.
AJ223162; AJ223162.1 03-MAR-1998 (Rel. 54, Created) 24-FEB-1999 (Rel. 59, Last updated, Version 3) Sus scrofa leptin receptor (LEPR] gene, exon 4, partial cds. LEPR gene; leptin receptor. Sus scrofa (pig) Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Teleostomi; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus. [1] 1-340 Stratil A.; Submitted (16-JAN-1998) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. Stratil A., Dept. of Genet., Inst. Anim. Physiol. Genet., Acad. Sci. of the Czech Republ., Libechov, 277 21, CZECH REPUBLIC. [2] Stratil A., Kopecny M., Moser G., Schroffel J., Cepica S.; "HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping"; Anim. Genet. 29:405-406(1998). SPTREMBL; Q95257; Q95257. Key
Location/Qualifiers
source
1..340 /chromosome="6" /db_xref="taxon:9823" /sequenced_mol="DNA" /organism="Sus scrofa" /map="q3.3-q3.5" 1..48 /number=4 <1..>48 /codon_start=3 /db_xref="SPTREMBL:Q95257" /gene="LEPR" /product="leptin receptor" /protein_id="CAA11142.1" /translation="KAFVSAVNSLVFQQT"
exon CDS
Sequence 340 BP; 120 A; 52 C; 49 G; 119 T; 0 other;
ggaaggcatt atattccaag cttttgtgaa actaataaaa ccataaaact tagtcttcta
tgtttcagca cattagctgt atagatgcct ttgagaatca aaaagaaaaa aattggcttt
gtaaattcct tacttaactg gtatggatat tcatgtgacc tgtcattaag aaagtagaaa
tagtttttca tattgaacaa gattctgagc aaactaatga ggacttttta aagtacacct
93
acaaacaggt aatgttttca acacatcatc gtccccagtt atcttagaaa
aagtatttta ttctctgaaa atttgatatt attttatatc acatttcttg
60 120 180 240 300 340
Příl. 4. Sekvence prasečí DNA genu LEPR v databázi EMBL (AJ223163) ID XX AC XX SV XX DT DT XX DE XX KW XX OS OC OC XX RN RP RA RL RL XX RN RA RT RL XX DR XX FH FH FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT FT XX SQ
SSAJ3163
standard; DNA; MAM; 441 BP.
AJ223163; AJ223163.1 03-MAR-1998 (Rel. 54, Created) 24-FEB-1999 (Rel. 59, Last updated, Version 3) Sus scrofa leptin receptor (LEPR] gene, exon 5, partial cds. LEPR gene; leptin receptor. Sus scrofa (pig) Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Teleostomi; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Cetartiodactyla; Suina; Suidae; Sus. [1] 1-441 Stratil A.; Submitted (16-JAN-1998) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases. Stratil A., Dept. of Genet., Inst. Anim. Physiol. Genet., Acad. Sci. of the Czech Republ., Libechov, 277 21, CZECH REPUBLIC. [2] Stratil A., Kopecny M., Moser G., Schroffel J., Cepica S.; "HpaII and RsaI PCR-RFLPs within an intron of the porcine leptin receptor gene (LEPR) and its linkage mapping"; Anim. Genet. 29:405-406(1998). SPTREMBL; Q95257; Q95257. Key
Location/Qualifiers
source
1..441 /chromosome="6" /db_xref="taxon:9823" /sequenced_mol="DNA" /organism="Sus scrofa" /map="q3.3-q3.5" 401..441 /number=5 <401..>441 /codon_start=3 /db_xref="SPTREMBL:Q95257" /gene="LEPR" /product="leptin receptor" /protein_id="CAA11143.1" /translation="ANWNIQCWMKEDL"
exon CDS
Sequence 441 BP; 136 A; 77 C; 85 G; 143 T; 0 other;
acgagattta agacacataa tcggaaagtg ttcaagatta aaatggaaac agcctgcatc
agacagcatc atattgcccc aggatgaact aaaaaaaaaa tgagggccaa agaacactga
ttagtccaat aaatttgctt gagccagtga aagtttgaga agggaatagc taaatttaat
atgaatcctc gtaccttggt gttttggggt aacaatcgta tgacttgggc ttagctcttc
94
atgcctttat atttcctgct cttttgctct tttattctct aaacacgcac tctttcactg
tatttaaagc ctctcagctc gtttaagtgg tactttccaa taccagttag agttgttcag
60 120 180 240 300 360
aatgtttttt tcagatttaa tttagtttat tttaattcag gtgcaaactg gaacatacag tgctggatga aagaggactt g
95
420 441
