Přímá analýza reálných vzorků hmotnostní spektrometrií s využitím nanodesorpčního elektrospreje (nano-DESI-MS) Teorie: Desorpční elektrosprej (DESI) byl popsán v roce 2004 Zoltánem Takátsem. Jedná se o ambientní měkkou ionizační techniku, která umožňuje přímo analyzovat nízkomolekulární látky povrchu často bez jakékoliv úpravy. DESI ionizuje a desorbuje molekuly povrchu pomocí elektrospreje. Elektrosprej vytváří jemné nabité kapičky rozpouštědla, které dopadají na povrch pod úhlem , desorbují molekuly na povrchu a pod úhlem (viz. Obr. 1) jsou transportovány do hmotnostního spektrometru (MS). DESI je složeno ze dvou v sobě vložených kapilár. Vnitřní sprejovací kapilárou protéká rozpouštědlo (sprejovací kapalina), na které je vkládáno vysoké napětí 3-5 kV. Okolo vnitřní kapiláry proudí dusík, který pomáhá fokusovat jemný sprej a desorbovat molekuly povrchu do MS. Princip ionizace a desorpce molekul povrchu pomocí DESI není zcela objasněn. Na základě počítačových simulací se předpokládá, že analyzovaný povrch je postupně zavlažen sprejovací kapalinou, molekuly povrchu jsou extrahovány z povrchu do kapaliny, ionizovány a desorbovány. Ionty a nabité mikrokapičky jsou z povrchu odprašovány (tzv. droplet pick-up mechanismus) a transportovány do MS. DESI si pro svou jednoduchost našlo široké uplatnění např. v analýze farmakokinetik, výbušnin, produktů pyrolýzy a metabolismu, ale i ve forenzní chemii i v zobrazovacím 2D módu, např. při analýze lipidů v mozkové tkáni.
Obr. 1 Schéma iontového zdroje DESI Pro toto cvičení byla navržena jednodušší alternativa desorpčního elektrosprej, desorpční nanoelektrosprej (nano-DESI), se kterým má katedra analytické chemie letité zkušenosti. Nano-DESI nevyžaduje pomocný plyn k tvorbě spreje. Vysoké napětí je vkládáno na kapiláru s vnitřním průměrem 1-2 nm. Jenmý sprej nabitých kapiček rozpouštědla je vytvářen pomocí kapilárních sil ve sprejovací špičce a průtok kapaliny je v jednotkách nl/min (viz. Obr. 2).
Obr. 2 Schéma iontového zdroje nano-DESI Nano-desorpční elektrosprej: Nano-DESI připevněný k hmotnostnímu spektrometru je zobrazen na Obrázku 3 a 4. Sprejer je pohyblivý v osách x, y, z a úhlu u. Barevně označené posuvné šrouby umožňují nastavit sprejer do správné geometrie. Žlutý šroub pohybuje sprejem v ose „y“, červený v ose „x“, zelený a šedý v ose „z“. Na pravé straně je červeně označeným drátem přiváděno vysoké napětí, proto buďte opatrní při manipulaci se zdrojem a vždy se ujistěte, že zdroj je vypnutý a v uživatelském okně svítí černý trojúhelník v zeleném pozadí (viz. níže). Pod sprejovací kapilárou je umístěno podložní sklíčko, na které je umístěn vzorek. Sprejer je snadno vyjmutelný k naplnění sprejovací kapiláry sprejovacím rozpouštědlem.
Obr. 3 DESI nasazené na hmotnostní spektrometr LCQ Finnigan
Obr. 4 Sprejovací kapilára směřuje před ústí vstupní kapiláry hmotnostního spektrometru. .
Analýza anthokyaninů ve víně metodou nano-DESI-MS Úvod: Anthokyaniny jsou součástí pigmentů plodů i květů. Bobule vinné révy, brusinky nebo borůvky jsou bohaté na anthokyaniny, které jsou významnými antioxidanty a mají blahodárný účinek na lidský organismus. Anthokyaniny přítomné ve vínu určují jeho barvu a každá odrůda má své typické zastoupení anthokyaninů, na základě kterého se dají jednotlivé odrůdy od sebe rozeznat. Úkol: Identifikujte odrůdu neznámého vína na základě porovnání zastoupení anthokyaninů ve skvrnách vín na látce. Chemikálie a pomůcky: Methanol, destilovaná voda, tkanina se skvrnami známých červených vín (Frankovka, Rubinet, Neronet), kádinka s neznámým červeným vínem, metanol, destilovaná voda, kyselina mravenčí, sprejovací kapilára, podložní sklíčko, čistá tkanina, nůžky, pipeta 5 ml, mikrostříkačka, nano-DESI, hmotnostní spektrometr Thermo LCQ Finnigan, tabulka s molekulovými hmotnostmi anthokyaninů (viz. Příloha II). Pracovní postup: 1) Připravte si sprejovací kapalinu, směs methanol:voda v poměru 3:1 a 0,2 % kyseliny mravenčí, a okyselující roztok 5 % kyselinu mravenčí. 2) Vytvořte na látce skvrny od vína pomocí pipety a nechte je zaschnout. 3) Připevněte DESI zdroj ke vstupu do hmotnostního spektrometru a upravte geometrii zdroje (viz. „Teorie“ a Obr. 2, 3 a 4). Otevřete si program LCQ tune, ikonu najdete na ploše. Otevřete si metodu C:\Xcalibur\methods\desi\cvicení_vino. Sprejovací špičku naplňte sprejovací kapalinou, upevněte ji do držáku, vložte čisté podložní sklíčko do zdroje a přisuňte k vyhřívané kapiláře. Spusťte ladění . Na displeji se objevují spektra pozadí (sprejovací kapaliny), píky o nízké intenzitě okolo 10E3 (viz. Příloha I). Nevidíte-li spektra, zastavte ladění
a upravte geometrii nano-DESI. Je-li signál stabilní, zastavte ladění
.
4) Z tkaniny vystřihněte část skvrny cca 10x10 mm, připevněte ji na podložní sklíčko oboustrannou lepicí páskou a tkaninu zvlhčete 5-10 l 5 % kyselinou mravenčí. Vložte do zdroje. 5) Spusťte ladění
. Vidíte-li ve spektru intenzivní píky anthokyaninů, tak zastavte ladění
. Jsou-li píky anthokyaninů málo intenzivní nebo nevidíte žádný signál, upravte geometrii.
6) Spusťte akvizici spekter po dobu jedné minuty. Spektra uložte do složky D:\Data\Desi_cvičení. Opakujte třikrát, přičemž mezi jednotlivými akvizicemi posuňte tkaninu o několik milimetru, abyste analyzovali novou pozici. Stejným způsobem pokračujte s ostatními skvrnami od vína. 7) Pomocí pipety vytvořte skvrnu neznámého vína na tkanině a po zaschnutí skvrnu analyzujte stejným způsobem jako v předchozím případě. Na základě hmot identifikujte anthokyaniny a přiřaďte odrůdu vína. 8) S protokolem odevzdejte vytištěná spektra s označenými píky anthokyaninů.
Příloha I. Spektrum pozadí DESI.
Příloha II. Seznam antokyaninů. č
m/z
název
vzorec OH OH
1
287
kyanidin
HO
O
+
OH OH
CH3
O
OH
2
301
peonidin
HO
O
+
OH OH
O
CH3 OH
3
317
petunidin
HO
O
+
OH OH OH
O
CH3 OH
4
331
malvidin
HO
O
+
O CH3
OH OH OH
OH HO
5
419
O
+
kyanidin-3-arabinosid
O OH O
OH
OH OH
OH OH HO
6
O
+
449a kyanidin-3-glukosid
O
OH
OH O
OH OH OH OH OH
HO
6
O
+
449b kyanidin-3-galaktosid
O
OH
OH O
OH OH OH
O
CH3 OH
HO
7
463
O
+
peonidin-3-glukosid
O
OH
OH O
OH OH OH
O
CH3 OH
HO
O
+
OH
8
479
petunidin-3-glukosid
O
OH
OH O
OH OH OH
CH3
O
OH HO
O
+
CH3
O
9
493
malvidin-3-glukosid
O
OH
OH O
OH OH OH CH3
O
OH HO
10
505
O
+
O
peonidin-3-acetylglukosid OH
OH
HO
O
HO
O H3C
O
O
CH3 OH
HO
O
+
O
11
535
CH3
O
malvidin-3-acetylglukosid OH
OH
HO
O
HO
O H3C
O
OH OH HO
O
+
OH O
12
581
kyanidin-3-sambubiosid
O
O OH
OH OH OH
O
OH OH
CH3
O
OH HO
O
+
O
OH
OH O
13
609
OH
peonidin-3-coumaroylglukosid OH O
O
OH
CH3
O
OH HO
O
+
OH O
OH
OH O
14
625
OH
petunidin-3-coumaroylglukosid OH O
O
OH
O
CH3 OH
HO
15
625
peonidin-3,5-diglukosid
O
+
OH
O O
OH
O O
HO
OH
OH OH
OH OH
CH3
O
OH HO
O
+
O O
CH3
OH
OH O
16
639
OH
malvidin-3-coumaroylglukosid OH O
O
OH
O
CH3 OH
HO
O
+
OH
17
641
petunidin-3,5-diglukosid
OH
O O
OH
O O
HO
OH
OH OH
OH OH
CH3
O
OH HO
O
+
O
18
655
malvidin-3,5-diglukosid
O
OH O
OH
O O
HO
CH3
OH
OH OH
OH OH
OH OH HO
O
+
OH O
19
743
kyanidin-3-sambubiosid-5-glukosid
O O HO
O OH
O OH OH
O HO
OH OH
OH OH
CH3
O
OH HO
O
+
OH
O O
20
771
peonidin-3-coumaroylglukosid-5glukosid
OH
O O
HO
OH
OH OH O
OH O
OH
O
CH3 OH
HO
O
+
O O
OH O
21
801
malvidin-3-coumaroylglukosid-5glukosid
OH
O O
HO
OH
OH OH O
OH
OH O
CH3
