PILOTNÍ DVOJITĚ SLEPÁ PLACEBEM KONTROLOVANÁ STUDIE S DOPLŇKEM STRAVY URINAL NA ZDRAVÝCH ŽENÁCH

© K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová, M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek

1

PILOTNÍ DVOJITĚ SLEPÁ PLACEBEM KONTROLOVANÁ STUDIE S DOPLŇKEM STRAVY URINAL NA ZDRAVÝCH ŽENÁCH Kateřina Valentová1, David Stejskal2, Petr Bednář3, Jitka Vostálová1, Čestmír Číhalík4, Renata Večeřová5, Dagmar Koukalová5, Milan Kolář5, Richard Reichenbach6, Lucyna Škňouřilová6, Jitka Ulrichová1, Vilím Šimánek1* 1

2 3 4 5 6

Ústav lékařské chemie a biochemie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého, Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc, [email protected], Nemocnice Šternberk, Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Klinika tělovýchovného lékařství, Fakultní nemocnice, Olomouc, Ústav mikrobiologie, Lékařská fakulta, Univerzita Palackého, WALMARK, a.s., Třinec – Oldřichovice

V pilotní klinické studii na mladých zdravých ženách (n = 65) byly testovány dvě dávky sušené šťávy brusinky (Vaccinium macrocarpon) v množství 400 mg, resp. 1200 mg/den po dobu 8 týdnů. Moč probandů užívajících vyšší dávku inhibovala adherenci uropatogenního kmene Escherichia coli. Ve srovnání s placebem byly v moči stanoveny metodou HPLC/ESI-MS významně zvýšené hladiny kyseliny hippurové, glukuronidu a methoxyderivátu kvercetinu (p < 0,05). Anthokyaniny ani proanthokyanidiny nebyly v moči nalezeny. Došlo ke statisticky významnému snížení hladiny produktů pokročilé oxidace bílkovin (AOPP) v krvi. Dosud u žádného z doplňků stravy, které obsahují přírodní antioxidanty, nebyl tento specifický ochranný účinek proti oxidačnímu poškození bílkovin popsán.

ÚVOD Plody brusinky (Vaccinium macrocarpon) a jejich šťáva jsou v tradiční medicíně používány v profylaxi a léčbě mikrobiální infekce vedoucí ke chronickému zánětu močových cest (Howell, 2002, Harkins 2000, Lynch 2004, Raz et al. 2004, Yarnell 2002). Šťáva plodů obsahuje vitaminy C, E a K, glukosu, fruktosu, polyfenolové glykosidy – anthokyaniny, proanthokyanidiny (kondenzované taniny), flavonoidy, kyseliny gallovou, benzoovou, citronovou a šťavelovou (Foo et al. 2000a, 2000b, Jensen et al. 2002, Kandil et al. 2002, Murphy et al. 2003, Prior et al. 2001, Rimando et al. 2004, Seeram et al. 2004, Vinson et al. 2001a, Vinson et al. 2001b, Vinson et al. 2001c, Vvedenskaya et al. 2004, Zhang a Zuo 2004, Zuo et al. 2002). O biologické aktivitě brusinky bylo v nedávné době publikováno několik přehledných článků (Anonymous 2005b, 2005c, 2005d, Berger 2005, Dreikorn 2005, Howell 2002). Některé z látek plodů V. macrocarpon mají farmakologicky ověřené účinky na složení plazmatických lipidů a zvyšují antioxidační kapacitu krve. Polyfenolové glykosidy mají protizánětlivý účinek chránící cévní epitel a spolu s dalšími látkami mají chemoprotektivní a antioxidační účinky (Chu a Liu 2005, Reed 2002, Ruel et al. 2005, Vattem et al. 2005, Vinson et al. 2001a, Vinson et al. 2001b, Vinson et al. 2001c, Wang a Stretch 2001, Yan et al. 2002, Zuo et al. 2002). Medicínsky zajímavým je účinek šťávy plodů na adherenci patogenních bakterií na epitel močových cest. Z hlediska profylaxe je významné zabránění adheze patogenů, především Escherichia coli, na epitel močové trubice a močového měchýře. Tato bakterie

je dominantní příčinou komunitních infekcí močových cest (Allison et al. 2000, Berger 2005, Di Martino et al. 2005, Foo et al. 2000a, 2000b, Howell et al. 2005, Turner et al. 2005). Metaanalýza klinických studií nepotvrdila terapeutický účinek šťávy u chronické infekce močových cest (Jepson et al. 2004). Ve třech klinických studiích z roku 2005 byl však potvrzen preventivní účinek šťávy plodů na močový trakt (Crews et al. 2005, McMurdo et al. 2005, Super et al. 2005). Brusinková šťáva inhibovala adherenci Helicobacter pylori na sliznici žaludku (Burger et al. 2002, Zhang et al. 2005), tvorbu zubního plaku (Anonymous 2005a, Koo et al. 2006, Steinberg et al. 2005) a snižovala virulenci virů chřipky (Weiss et al. 2005). Antiadherenční účinky jsou vesměs připisovány proanthokyanidinovým trimerům typu A (Foo et al. 2000a, 2000b, Howell et al. 2005), přičemž anthokyaninová frakce z brusinek neměla výraznou antibakteriální aktivitu (Leitao et al. 2005, Monroy-Torres a Macias 2005). V literatuře jsme nenalezli jediný důkaz o možné přítomnosti antiadherenčně působících proanthokyanidinových trimerů typu A v lidské moči (Ammon a Kaul 1994, Zhang a Zuo 2004, McGhie et al. 2003). Antiadherenční aktivita moče byla prokázána u myší po 30denním podávání (Howel et al. 2001) a v experimentech na dobrovolnících (n = 5, resp. n = 6) po jednorázovém požití 42,5 g sušených brusinek (Greenberg et al. 2005) nebo 240 ml brusinkového džusu (Howell et al. 2005). Fruktosa je další látkou, které je připisována antiadherenční aktivita brusinky (Zafriri et al. 1989). Fruktosa je obsažena ve všech druzích ovoce, avšak účinek na močový trakt byl prokázán výhradně u brusinek. Antiadherenční účinek na některé kmeny E. coli v pod-

2

K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová, M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek

mínkách in vitro měla také šťáva citrusových plodů, avšak na kmeny vybavené P-fimbriemi nebyla aktivní (Zafriri et al. 1989). U potravin se srovnatelným obsahem fruktosy – hroznová a jablečná šťáva, sušené hrozinky a čokoláda, nebyl antiadherenční účinek prokázán (Greenberg et al. 2005, Howell et al. 2005). Raz et al. (2004) předpokládají, že účinek látek z brusinky je vzhledem k velmi nízké biodostupnosti primárně lokalizován do spodní části trávicího traktu, kde působí selektivně na potenciálně patogenní bakterie. Z nežádoucích účinků brusinkové šťávy je uváděno riziko nefrolitiázy (Gettman et al. 2005, McHarg et al. 2003, Terris et al. 2001) a zvýšená hladina salicylátů v plazmě (Duthie et al. 2005). Možná léková interakce brusinky s antikoagulanciemi a/nebo antitrombotiky v důsledku inhibice CYP2C9 uváděná v pracích Sylvana a Justice (2005) a Walshe (2005) nebyla potvrzena (Greeblatt et al. 2006). Na světovém trhu je řada výrobků, které obsahují celé plody brusinky, jejich šťávu nebo koncentrovaný extrakt šťávy. Výrobci je doporučují jako funkční potraviny a/ nebo doplňky stravy k zabránění opakovaných infekcí močového traktu zejména u žen. Dosavadní studie o antiadherenční aktivitě látek obsažených v plodech a údaje o možných vedlejších účincích po dlouhodobém požívání brusinky nejsou úplné. Žádná z klinických studií o účincích plodů, brusinkové šťávy a/nebo jejího koncentrátu nebyla zaměřena na ověření bezpečnosti dlouhodobého pravidelného užívání této funkční potraviny. Cílem naší dvojitě slepé, placebem kontrolované studie, provedené na mladých zdravých ženách, bylo vyhodnocení vlivu 8 týdenního užívání dávek 400 mg/den a 1200 mg/den sušené brusinkové šťávy ve formě doplňku stravy. U žen byly sledovány základní parametry klinické biochemie a hematologie, hladina produktů lipoperoxidace, antioxidační kapacita krve, přítomnost metabolitů látek brusinky v moči a antiadherenční aktivita močí ex vivo. U aktivní složky použitého doplňku stravy bylo analyzováno jeho složení a testována antimikrobiální a antiadherenční aktivita in vitro. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Materiál Pro in vitro studie byla použita standardizovaná sušená šťáva z plodů brusinky Nutricran-90TM (Decas Botanical Synergies, Wareham, MA, USA). V klinické studii byl podáván doplněk stravy Urinal. Jedna želatinová tobolka přípravku obsahovala 200 mg Nutricranu-90TM, 290 mg sojového oleje, 15 mg lecithinu a 10 mg včelího vosku; tobolka placeba 443 mg sojového oleje. Přípravek a placebo byly poskytnuty firmou Walmark a.s. (Třinec, Česká republika). Analýza anthokyaninů a fenolových sloučenin Přístroj a metodika. Pro analýzy byl použit mikrokapalinový chromatograf (μLC/MS) CapLC (Waters Corporation, Milford, USA) spojený s hmotnostním spektrometrem na bázi iontové pasti (LCQ, Finnigan, USA)

nebo hybridním hmotnostním spektrometrem Q-TOF Premier (Waters Corporation). Pro chromatografickou separaci byla použita mikrokolona Gemini C-18 (150 × 0,3 mm, Phenomenex, USA). Dávkováno bylo 10 μl (přeplňování dávkovací smyčky) nebo 2 μl vzorku. Jako ionizační technika byl použit elektrosprej. Nastavení iontové optiky a parametrů ionizace bylo optimalizováno přímým zaváděním roztoků standardů malvidin-3-glukosidu, 3-hydroxybenzoové resp. hippurové kyseliny. Stanovení anthokyaninů. Vzorky (10 mg Nutricranu90TM nebo lyofilizátů močí) byly rozpuštěny v 1 ml 0,01 % HCl (v/v). Roztoky (0,5 ml) byly dávkovány na SPE kolonku na bázi polymerního sorbentu s vlastnostmi reverzní fáze (Strata SDB-L, 500 mg/3 ml, Phenomenex, USA). Kolonka byla následně promyta 3 ml 0,01 % HCl a anthokyaniny eluovány 3 ml okyseleného methanolu (0,01 % HCl v MeOH). Eluát byl odpařen v proudu dusíku při 40 °C. Odparek byl rozpuštěn v příslušné mobilní fázi A a analyzován μLC/MS za použití gradientové eluce: Mobilní fáze A – 0,12 % (v/v) trifluoroctová kyselina, 5 % acetonitril ve vodě (v/v); mobilní fáze B – 0,12 % trifluoroctová kyselina v acetonitrilu (v/v). Gradient: 0–30 min 10 %–90 % (v/v) B, 35–36 min 90 % (v/v) B. Stanovení fenolových kyselin a jejich metabolitů s předseparací. Vzorky (Nutricran-90TM nebo lyofilizáty močí) byly rozpuštěny ve fosfátovém pufru o pH 7,0 (44 mg vzorku v 1,5 ml pufru) a filtrovány přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45 μm). Filtrát byl nanesen na SPE kolonku (směsný sorbent reverzní fáze/anex Strata Screen A, Phenomenex, 200 mg/3 ml). Kolonka byla promyta 3 ml deionizované vody, 3 ml MeOH a eluována 3 ml 1 % HCl v MeOH. Eluát byl následně odpařen v proudu dusíku. Odparek byl rozpuštěn v odpovídající mobilní fázi A, pak analyzován μLC/MS za použití gradientové eluce: Mobilní fáze A – 0,1% octová kyselina, 5 % acetonitril ve vodě (v/v); mobilní fáze B – methanol:acetonitril (1 : 1, v/v); gradient: 0–10 min, 5–10 % (v/v) B, 10–30 min 10–50 % (v/v) B, 30– 40 min 50 – 80 (v/v) % B, 40–60 min 80–90 % (v/v) B. Stanovení fenolových kyselin a jejich metabolitů v moči bez předseparace. Lyofilizáty močí byly nadto analyzovány přímo po mikrofiltraci bez přečištění extrakcí tuhou fází. Tyto analýzy byly navrženy pro případné zachycení netypických metabolitů, které by selektivita použitých SPE kolonek nepokrývala. Postup není optimální z hlediska očekávané kontaminace chromatografické kolony a hmotnostního spektrometru a není uvažován jako rutinní analytická technika. S ohledem na identifikované metabolity se výsledky shodují s analýzami zahrnujícími v postupu přípravy vzorku extrakce. Vzorky (10 mg lyofilizátů moče) byly rozpuštěny v 1 ml roztoku odpovídající mobilní fáze A (viz dále). Takto připravené roztoky byly přefiltrovány přes teflonový membránový mikrofiltr (porozita 0,45 μm) a analyzovány μLC/MS za použití gradientové eluce. Mobilní fáze A – octová kyselina 5,7 mmol/l, 5% (v/v) acetonitril ve vodě, mobilní fáze B – acetonitril; gradient: 0–5 min 10 % (v/v) B, 5–25 min 90 % (v/v) B, 25–40 min 90 % (v/v) B, 40–45 min 10 % (v/v) B, 45–50 min 10 % (v/v) B.

Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách Antiadherenční aktivita Antiadherenční aktivita Nutricranu-90TM a lyofilizátů močí byla testována na 12 patogenních kmenech E. coli izolovaných z moči pacientů s uroinfekcí. Výběr kmenů spočíval v ověření jejich schopnosti aglutinovat červené krvinky skupiny A1, Rh+, dokumentující tvorbu faktorů adherence. Vybrané kmeny byly kultivovány v bujónu s obsahem tryptosy (HiMedia, Indie) při 37 °C, v aerobní atmosféře s 10 % CO2 po dobu 16 h. Poté byly v množství 300 μl inokulovány na celofánem pokrytou pevnou půdu (Colonisation Medium, HiMedia, Indie) a kultivovány za stejných podmínek do druhého dne. Získaná kultura byla spláchnuta fosfátovým pufrem (PBS) pH 7,0 a centrifugována. Po trojnásobném proprání sedimentu v PBS a změření hustoty bakterií byla jejich koncentrace upravena na 5×108 buněk/ml. K testování biologické aktivity bylo vždy použito 10 μl této suspenze. Čerstvé erytrocyty (A1, Rh+) byly třikrát proprány v PBS, naředěny na 3% koncentraci, k testování vždy použito po 10 μl. Vzorek Nutricranu-90™ byl rozpuštěn a po stanovení pH naředěn geometrickou řadou v PBS. Z testovaných koncentrací (0–1,20 mg/ml) bylo pipetováno 30 μl do jamek mikrotitrační destičky U (Gama, Česká republika), přidány vybrané kmeny E. coli a inkubovány na třepačce při pokojové teplotě po dobu 10 min. Poté byly přidány červené krvinky a následovala inkubace 20 min. Mikroskopické hodnocení sledovalo zábranu hemaglutinace proti kontrolám jednotlivých kmenů E. coli se samotnými krvinkami. Adheze vybraného patogenního kmene E. coli byla následně testována také stanovením vytvořeného mikrobiálního biofilmu na polystyrénových destičkách modifikovanou Christensenovou metodou (Christensen et al. 1985). Vzorky Nutricranu-90™, lyofilizovaných močí a manosy byly rozpuštěny v kultivačním mediu BHI (Brain Heart Infusion, Himedia, Indie) obohaceném o 0,25 % (m/v) glukosy. Koncentrace Nutricranu-90™ byla 0, 0,037, 0,075, 0,15, 0,30, 0,6, 1,2 a 2,4 mg/ml, manosa byla použita v koncentraci 0,5 % a 1 % (m/v) a lyofilizované moče byly rozpuštěny na původní koncentraci v kultivačním mediu. Do jamek sterilních mikrotitračních destiček bylo pipetováno 200 μl těchto roztoků. Poté byl pomocí aplikátoru inokulován do každé jamky 1 μl bakteriální suspenze o hustotě podle stupně 1 Mc Farlanda. Množství bakterií v jamce odpovídalo koncentraci 105-6 CFU (Colony-Forming Unit)/ml. Po inkubaci při 37 °C do druhého dne v aerobním prostředí byla destička šetrně promyta vodou a utvořený biofilm byl fixován 200 μl 99 % (v/v) methanolu po dobu 15 min. Po odsátí a vyschnutí byly jamky barveny 160 μl 1 % (m/v) krystalové violeti 10 min a důkladně promyty vodou. Fixované barvivo bylo rozpuštěno přidáním 160 μl 33 % (v/v) kyseliny octové. Intenzita zbarvení odpovídala množství adherovaných bakterií a byla hodnocena spektrofotometricky při vlnové délce 570 nm (fotometr MRX II, Dynex) (Christensen et al. 1985, Pratt a Kolter 1998, Ren et al. 2005, Wakimoto et al. 2004, Stepanovic et al. 2000, Marthur et al. 2006).

3

Antibakteriální aktivita Antimikrobiální účinnost Nutricranu-90™ byla testována pomocí standardní diluční mikrometody (National Committee for Clinical Laboratory Standards 2002, Urbášková 1998) určením minimální inhibiční koncentrace (MIC). Vzorky byly ředěny geometrickou řadou v Mueller-Hintonově bujónu (Difco, USA). Do jamek mikrotitračních destiček bylo očkováno standardní množství testovaného mikroba (hustota inokula odpovídala 105-6 CFU/ml). Po 24 h inkubaci při 37 °C byla odečtena MIC jako nejnižší koncentrace testované látky, která inhibovala viditelný růst testované bakterie. K testování byly použity standardní referenční kmeny Staphylococcus aureus CCM 3953, Enterococcus faecalis CCM 4224, E. coli CCM 3954 a Pseudomonas aeruginosa CCM 3955 (označení dle Sbírky kultur, Masarykova Univerzita, Brno) a dále kmeny izolované z klinického materiálu pacientů Fakultní nemocnice Olomouc: Staphylococcus epidermidis, methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA), vankomycin-rezistentní Enterococcus faecium (VRE) a Klebsiella pneumoniae (ESBL, producent širokospektré β-laktamasy AmpA). Typ účinku (bakteriostatický či baktericidní) byl stanoven vyočkováním jamek bez viditelného nárůstu na krevní agar. Testování bylo provedeno dvakrát. Schéma studie Studie se zúčastnilo 65 zdravých dobrovolnic ve věku 19–28 let (průměr 21,6 ± 1,6 let). Studie byly schválena etickou komisí Lékařské fakulty Univerzity Palackého a Fakultní nemocnice Olomouc. Evidence účastnic a prohlídky byly prováděny na Klinice tělovýchovného lékařství Fakultní nemocnice Olomouc. Všechny účastnice podepsaly informovaný souhlas, byly seznámeny s cíli studie a poučeny, že se mají v době 24 h před každým odběrem vyhýbat potravinám s vysokým obsahem fenolových látek, zejména barevnému ovoci, ale také kávě a čaji. Dobrovolnice byly náhodně rozděleny do tří skupin: Skupina I [n = 23, placebo (2 tobolky/den), 21,7 ± 2,0 let; BMI 21,2 ± 2,1; hmotnost 60,3 ± 7,1 kg], skupina II [n = 20, 400 mg Nutricranu-90TM (2 tobolky Urinal/den); 21,4 ± 2,0 let; BMI 21,2 ± 1,5; hmotnost 59,7 ± 6,1 kg] a skupina III [n = 22, 1200 mg Nutricranu-90TM (6 tobolek Urinal/den); 21,7 ± 2,0 let; BMI 21,2 ± 1,5; hmotnost 57,8 ± 6,1 kg]. Studie probíhala 8 týdnů se třemi kontrolními odběry krve a moči – v den 0 (1. odběr), den 28 (2. odběr) a den 56 (3. odběr). U 10 dobrovolnic ze skupiny III byl proveden ještě 4. odběr po 8 měsících od ukončení experimentu. U všech účastnic studie byl při každé návštěvě změřen tlak. V odebraných vzorcích byly stanoveny základní parametry klinické biochemie a hematologie – cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triacylglyceroly, ALT, AST, GMT, močovina, kreatinin, kyselina močová a hladina produktů pokročilé oxidace proteinů (AOPP) v séru, krevní obraz včetně diferenciálního rozpočtu leukocytů po ranním odběru krve nalačno; v moči změřeno pH a vyšetřen sediment. U probandů skupiny III bylo vyšetření rozšířeno o sběr moči po dobu 12 h před odběrem krve, stanovení celkových fenolů v moči Folin-Ciocalteu fenolo-

4


vým činidlem podle Zhenga a Wanga (2001), antioxidační kapacity krve a vybraných parametrů pro hodnocení oxidačního stresu (celková antioxidační kapacita a celkové SH-skupiny v plazmě, produkty peroxidace lipidů jako malondialdehyd (MDA) v plazmě a v erytrocytech, glutathion (GSH), superoxiddismutasa (SOD) a glutathionperoxidasa (GPX) v erytrocytech (Psotová et al. 2006). Sbíraná moč byla po celou dobu sběru udržována při 4 °C, po odevzdání byla ihned odpařena na objem 50 ml a lyofilizována. Parametry klinické biochemie, hematologie a hodnoty AOPP byly stanoveny na Oddělení klinické biochemie Nemocnice Šternberk na analyzátoru ADVIA 1650 (Bayer, SRN). Statistické vyhodnocení Všechny výsledky byly hodnoceny metodou ANOVA na hladině významnosti 95 %.

Tabulka 1. Anthokyaniny stanovené v Nutricranu-90™. Anthokyanin

% (m/m)

Pn-3,5-diGal Cy-3-Gal Cy-3-Glu Pn-3-Ara Cy-3-Pent Cy-3-Ara Pn-3-Gal Pn-3-Glu Dp Suma

0,106 0,031 0,054 0,025 0,013 0,024 0,045 0,135 0,008 0,44

Pn – peonidin, Cy – cyanidin, Dp – delphinidin, Gal – galaktosid, Glu – glykosid, Ara – arabinosid, Pent – blíže neidentifikovaný pentosid

VÝSLEDKY Analýza Nutricranu-90™ a biologická aktivita in vitro Nutricran-90™ obsahoval 10–11 % (m/m) organických kyselin. Mezi organickými kyselinami byly identifikovány kyselina benzoová, salicylová, ellagová, ferulová, kávová,

Tabulka 2. Parametry klinické biochemie žen skupiny I (2 tobolky placeba/den). Parametr

1. odběr

2. odběr

3. odběr

23

23

23

Tlak systolický

110 ± 10

110 ± 11

114 ± 10

Tlak diastolický

71 ± 10

73 ± 9

75 ± 8

Cholesterol (mmol/l)

4,8 ± 0,7

4,7 ± 0,7

Počet dobrovolnic

a

4,8 ± 0,8

HDL cholesterol (mmol/l)

2,01 ± 0,34

1,77 ± 0,26

1,71 ± 0,34a

LDL cholesterol (mmol/l)

2,64 ± 0,50

2,54 ± 0,53

2,45 ± 0,54

Triacylglyceroly (mmol/l)

1,11 ± 0,38

1,03 ± 0,65

1,06 ± 0,59

ALT (μkat/l)

0,33 ± 0,14

0,34 ± 0,19

0,30 ± 0,18

AST (μkat/l)

0,37 ± 0,07

0,33 ± 0,09

0,24 ± 0,11a,b

GMT (μkat/l)

0,25 ± 0,12

0,30 ± 0,20

0,24 ± 0,10

Urea (mmol/l)

2,97 ± 0,71

3,21 ± 0,73

3,24 ± 0,51

Kreatinin (μmol/l)

84,7 ± 5,5

81,0 ± 5,2

79,0 ± 4,6a,b

Kys. močová (μmol/l)

273,8 ± 57,1

247,8 ± 40,0

249,1 ± 50,6

AOPP (μmol/l)

55,6 ± 14,5

65,5 ± 39,9

51,2 ± 27,3

pH moči

6,18 ± 0,52

5,91 ± 0,69

5,98 ± 0,53

KO: Hemoglobin (g/l)

134,1 ± 9,2

137,7 ± 8,7

133,3 ± 8,0

Erytrocyty

4,63 ± 0,21

4,48 ± 0,23

4,54 ± 0,26

Leukocyty

7,6 ± 1,5

7,5 ± 1,6

7,7 ± 2,1

Trombocyty

276 ± 42

285 ± 55

277 ± 61

p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola

a

5

Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách Tabulka 3. Parametry klinické biochemie žen skupiny II (2 tobolky Urinal/den). Parametr

2. odběr

3. odběr

Počet dobrovolnic

20

19

18

Tlak systolický

114 ± 9

114 ± 13

116 ± 10

Tlak diastolický

76 ± 5

78 ± 9

77 ± 7


4,7 ± 0,7

4,7 ± 0,6

5,0 ± 0,8

HDL cholesterol (mmol/l) 1,91 ± 0,30

1,75 ± 0,22

1,69 ± 0,23a


2,50 ± 0,51

2,39 ± 0,51

2,30 ± 0,46


1,36 ± 0,45

1,22 ± 0,29

1,34 ± 0,58

ALT (μkat/l)

0,28 ± 0,09

0,30 ± 0,08

0,30 ± 0,08

a,c

0,25 ± 0,07a

AST (μkat/l)

0,36 ± 0,08

0,25 ± 0,07

GMT (μkat/l)

0,22 ± 0,09

0,21 ± 0,08

0,23 ± 0,07

Urea (mmol/l)

3,11 ± 0,91

3,37 ± 0,95

3,19 ± 1,14

Kreatinin (μmol/l)

77,3 ± 15,3c

75,2 ± 6,9c

81,4 ± 6,0

Kys. močová (μmol/l)

257,9 ± 52,4

249,9 ± 62,7 a

AOPP (μmol/l)

42,9 ± 10,1

57,5 ± 19,8

pH moči

6,13 ± 0,88

5,71 ± 0,51


a

1. odběr

242,3 ± 60,9 61,8 ± 21,3a 5,97 ± 0,70

c

129,5 ± 10,4

127,6 ± 11,0

129,2 ± 12,0

Erytrocyty

4,62 ± 0,30

4,58 ± 0,26

4,59 ± 0,28

Leukocyty

7,86 ± 1,83

7,89 ± 1,52

7,97 ± 1,25

Trombocyty

303 ± 92

296 ± 91

296 ± 97

p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola, c p < 0,05 vs. skupina I, d p < 0,05 vs. skupina II

p-kumarová, protokatechová, sinapová, vanilová a některé izomery kyseliny dihydroxybenzoové. Obsah polyfenolů byl 3 % (m/m). Byl nalezen kvercetin cca. 0,3 % (m/m) a anthokyaninová barviva v množství 0,44 % (m/m, tab. 1). Nutricran-90TM dále obsahoval 42 % (m/m) glukosy, 26 % (m/m) fruktosy a 10 % (m/m) MgO jako nosiče. Antiadherenční aktivita Nutricranu-90™ byla prokázána pro koncentrace 0,075–0,120 mg/ml; v testu hodnocení tvorby biofilmu byl pokles adherence změřen již u koncentrace 0,037 mg/ml. Statisticky významný pokles adherence nastal až u 2,40 mg/ml. Nutricran-90™ vykazoval slabou antimikrobiální aktivitu na testovaných kmenech bakterií (MIC 179 – 357 mg/ml). Nejvyšší účinnost byla zaznamenána u Pseudomonas aeruginosa s MIC 179 mg/ml. Biobezpečnost přípravku Z celkového počtu 65 dobrovolnic studii dokončilo 57. Ze skupiny I odstoupily 2 ženy (respirační onemocnění (1) a osobní důvody (1)), ze skupiny III 6 dobrovolnic (respirační onemocnění (2), nadměrné močení (1), překyselení žaludku (1) a osobní důvody (2)). Statisticky vyhodnocená data pro všechny skupiny jsou uvedena v tabulkách 2–4. Data byla hodnocena jednak mezi jednotlivými kontrolními odběry v každé skupině,

jednak mezi skupinami navzájem. U placeba (skupina I) byl pozorován statisticky významný pokles HDL cholesterolu při druhé a třetí kontrole ve srovnání s kontrolou v den 0. Při třetí kontrole došlo navíc k poklesu hladiny AST a kreatininu v séru (tab. 2). Ve skupině II (400 mg Nutricranu-90™/den) došlo k poklesu HDL cholesterolu při třetím odběru, k poklesu hladiny AST při druhém a třetím odběru. Hladina AST při druhém odběru byla nižší než ve skupině I, stejně jako hemoglobin (tab. 3). Ve skupině III (1200 mg Nutricranu-90™/den) byl při prvním odběru zaznamenán statisticky významně, avšak klinicky nevýznamně vyšší diastolický tlak ve srovnání se skupinou I. V dalších odběrech se však již tento jev nevyskytoval. Ve srovnání se skupinou I byly naměřeny také nižší hodnoty hladiny ALT v plazmě při prvním a druhém odběru, avšak vyšší hladinu AST při druhém a třetím odběru ve srovnání se skupinou II. Při třetím odběru byla hodnota AST významně vyšší než při odběru prvním. Významně poklesla také hladina kreatininu v séru při druhém odběru, a to ve srovnání s prvním a třetím odběrem i se skupinou II (tab. 4). Všechny tyto pozorované změny však byly v mezích fyziologických norem a nebyl pozorován žádný vedlejší účinek přípravku na dobrovolnice.

6

K. Valentová, D. Stejskal, P. Bednář, J. Vostálová, Č. Číhalík, R. Večeřová, D. Koukalová, M. Kolář, R. Reichenbach, L. Škňouřilová, J. Ulrichová, V. Šimánek Tabulka 4. Parametry klinické biochemie žen skupiny III (6 tobolek Urinal/den). Parametr

1. odběr

2. odběr

3. odběr

22

20

16

Tlak systolický

119 ± 11c

115 ± 11

116 ± 10

Tlak diastolický

80 ± 8

75 ± 9

78 ± 6

Počet dobrovolnic


4,7 ± 0,9

4,7 ± 1,0

HDL cholesterol (mmol/l)

c

1,79 ± 0,23

1,78 ± 0,27

1,72 ± 0,21


2,69 ± 0,67

2,67 ± 0,72

2,60 ± 0,74


1,26 ± 0,43

1,16 ± 0,62

1,23 ± 0,57

ALT (μkat/l)

0,25 ± 0,07c

0,25 ± 0,06c

0,25 ± 0,07

AST (μkat/l)

0,40 ± 0,05

0,39 ± 0,06

d

GMT (μkat/l)

0,26 ± 0,11

0,27 ± 0,10

0,25 ± 0,10

Urea (mmol/l)

3,41 ± 0,52

3,11 ± 0,59

3,35 ± 0,54

Kreatinin (μmol/l)

79,4 ± 5,0

73,8 ± 4,3a,c

82,6 ± 6,1b

265,8 ± 46,5

289,7 ± 61,0c

270,5 ± 51,6

Kys. močová (μmol/l) Antioxidační kapacitae

6,90 ± 1,11

7,32 ± 1,38

6,87 ± 1,25

f

SH-skupiny

5,99 ± 1,07

5,87 ± 0,79

4,93 ± 0,57a,b

SOD –ery (U/g proteinu)

2,59 ± 0,51

2,73 ± 0,42

2,68 ± 0,33

MDA-eryf

0,46 ± 0,10

0,57 ± 0,13a

0,59 ± 0,13a

GSH-eryf

116,3 ± 24,5

119,6 ± 23,4

124,3 ± 24,1

GPX-ery (μU/ g proteinu)

10,60 ± 2,28

11,06 ± 2,25

11,74 ± 3,01

MDA

0,16 ± 0,041

0,16 ± 0,031

0,15 ± 0,036

pH moči

5,79 ± 0,49

5,89 ± 0,54

5,75 ± 0,58

Celkové fenoly moč (mg/mol kreatininu)

37,7 ± 14,9

54,2 ± 20,5a

37,8 ± 12,7b

132,3 ± 10,63

132,0 ± 6,94

131,1 ± 8,96

Erytrocyty

4,54 ± 0,35

4,53 ± 0,27

4,47 ± 0,37

Leukocyty

7,31 ± 1,75

7,36 ± 1,54

7,41 ± 1,84

276 ± 52

301 ± 54

277 ± 54

Trombocyty

9,53 ± 16,8

11,4 ± 12,1a,c,d

47,4 ± 25,0


f

a,c,d

0,43 ± 0,07c,d

AOPP (μmol/l)

f

a

4,6 ± 0,8

p < 0,05 vs. 1. kontrola, b p < 0,05 vs. 2. kontrola, c p < 0,05 vs. skupina I, d p < 0,05 vs. skupina II, e μA/ml plazmy; μmol/g proteinu

Antioxidační status U dobrovolnic všech tří skupin byla stanovena hladina produktů pokročilé oxidace proteinů (Advanced Oxidation Protein Products, AOPP). Zatímco ve skupině II došlo při druhém a třetím odběru ke statisticky významnému zvýšení tohoto parametru pozdního oxidačního stresu, ve skupině III došlo již po čtyřech týdnech užívání doplňku stravy ke statisticky významnému poklesu AOPP, a to na hodnoty, které běžně v populaci nenacházíme. U některých dobrovolnic byla naměřena hodnota 5,0 μmol/l (tab. 4). Citlivost použité metody neumožňovala stanovit nižší množství AOPP. Vzhledem k tomuto neočekávanému pozitivnímu výsledku jsme se rozhodli u skupiny III provést ještě stanovení dalších pa-

rametrů pro hodnocení oxidačního stresu. Byl naměřen pokles celkové hladiny celkových SH-skupin v plazmě u třetího odběru a nárůst hladiny produktů lipoperoxidace (MDA) v erytrocytech při druhém a třetím odběru ve srovnání s odběrem prvním. Nebyla změněna antioxidační kapacita plazmy ani hladina produktů lipoperoxidace v plazmě. U erytrocytů nebyla ovlivněna hladina SOD, GSH a GPX. Po 8 měsících od ukončení studie bylo u 10 dobrovolnic ze skupiny III provedeno kontrolní měření hladiny AOPP. Hladina AOPP při tomto čtvrtém odběru krve (průměrná hodnota byla 27,65 ± 6,54 μmol/l) byla statisticky významně vyšší ve srovnání s druhou a třetí kontrolou, nedosáhla však hladiny změřené při prvním odběru (obr. 1).

7

Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách

AOPP

µmol.l-1

1. odběr 2. odběr 3. odběr

80

4. odběr

70 60

47,36

50 40

27,65

30 20

11,41

9,53

10 0

Obr. 1. Hladina AOPP v séru dobrovolnic skupiny III při užívání 6 tobolek Urinalu/den) 1. Odběr v den 0, 2. odběr v den 28, třetí odběr v den 56 užívání přípravku; 4. odběr 8 měsíců po ukončení studie.

E. coli 3,5 3 A 570 nm

2,5 2 1,5 1 0,5 22 an os N a 23 ut ric Ma 0 ,5 N ra n- no s % a ut ric 9 0™ 1 % ra n- 2,4 90 ™ mg 3 K 7 µg on tr o la M

19

18

16

15

14

13

12

9

5

4

3

2

0

Obr. 2. Vliv močí, Nutricranu-90™ a manosy na adherenci uropatogenní E. coli. Vzorky 2-22 odpovídají dobrovolnicím skupiny III, vzorek 23 je moč ze skupiny I (placebo). Identifikace a stanovení fenolových látek v moči Během studie nedošlo u žádné účastnice ze skupin I až III ke statisticky významné změně hodnoty pH moče. Celková hladina fenolových látek v moči dobrovolnic skupiny III, vztažená na kreatinin, se statisticky významně zvýšila při druhém odběru, při třetím odběru však jejich koncentrace zase poklesla (p < 0,05, tab. 4). U skupiny III byly v moči sbírané poslední den studie analyzovány organické kyseliny a fenolové sloučeniny. Vedle kyseliny citrónové byly identifikovány kyseliny hippurová a salicylurová, glukuronid a methoxyderivát kvercetinu

a apigenin. Anthokyaniny ani proanthokyanidiny nebyly nalezeny (analýzy byly prováděny při pozitivní i negativní ionizaci elektrosprejem). Koncentrace těchto látek v moči mohou být ovlivněny stravováním. Proto byly porovnány vzorky vykazující vysokou inhibici adherence (lyofilizovaná moč probandů skupiny III) se vzorkem kontrolním (skupina I). U močí s antiadherenční aktivitou byly stanoveny zvýšené hladiny kyseliny hippurové, glukuronidu a methoxyderivátu kvercetinu (p < 0,05).

8


Antiadherenční aktivita moče Účinek močí na adhezi E. coli byl testován u skupiny III metodou tvorby biofilmu. Bakterie uropatogenního kmene E. coli vytvořily biofilm s početnou populací pouze v prostředí moče bez metabolických produktů brusinky (vzorek 23, skupina I) (obr. 2). Vzorky ze skupiny III snižovaly adhezi E. coli ve srovnání se vzorkem skupiny I (p < 0,01). Manosa v koncentraci 0,5 % a 1 % snížila množství adherovaných bakterií E. coli výrazněji než vzorky ze skupiny III (p < 0,05).

DISKUSE Srovnání hodnot parametrů klinické biochemie mezi skupinou I (placebo) a skupinou II (400 mg/den Nutricranu-90TM) neprokázalo statisticky významný účinek přípravku Urinal na žádný z nich (tab. 2 a 3). Rozdíly mezi některými parametry uvnitř obou skupin, resp. mezi oběma skupinami byly vždy v rozmezí normálních hodnot a lze je připsat změnám ve složení diety během studie. Ve skupině III (1200 mg/den Nutricranu-90TM) vedlo 8 týdenní podávání přípravku Urinal ke statisticky významnému snížení hladiny produktů pokročilé oxidace proteinů (Advaced Oxidation Protein Products, AOPP) na hodnoty, které běžně v populaci nenacházíme (tab. 4, obr. 1). V provedeném kontrolním odběru 8 měsíců po ukončení experimentu došlo k opětovnému zvýšení hladiny AOPP v séru (obr. 1). Tento účinek na hladinu produktů AOPP nebyl u rostlinných antioxidantů, s výjimkou kyseliny askorbové, dosud popsán (Griffiths et al. 2002). Nenalezli jsme vztah mezi AOPP a ostatními parametry oxidačního poškození (tab. 4). AOPP vznikají reakcí volných radikálů s bílkovinami. Aktivují prozánětlivé cytokiny, které spouštějí oxidační „vzplanutí“ u neutrofilů, monocytů a T-lymfocytů (Kalousová et al. 2005). Bylo zjištěno, že nemocní s ischemickou chorobou srdeční a uremickým syndromem měli zvýšené hodnoty AOPP. U obou skupin nemocných byly hladiny AOPP statisticky významně vyšší než u zdravých dobrovolníků (Kaneda et al. 2002; WitkoSarsat et al. 1996). Naše studie prokázala, že extrakt šťávy plodů V. macrocarpon může mít mimo antiadherenčního, také antiaterogenní účinek. Ruel et al. (2005) popsali, že po pití brusinkové šťávy (muži, n = 21, věk 38 ± 8 roků, 7 ml/kg hmotnosti, 2 týdny) došlo ke snížení hladiny produktů lipoperoxidačního poškození. Obsahové látky šťávy nebyly charakterizovány. Námi nalezené rozdíly v hodnotách parametrů oxidačního poškození (celkové SH-skupiny, MDA, GSH a TBARS) uvnitř skupiny III se pohybovaly v rozmezí normálních hodnot (tab. 4). Ex vivo antiadherenční aktivita moče byla dosud u lidí studována jen po jednorázové konzumaci brusinky. Aktivitu na uropatogenní E. coli měly moče šesti dobrovolníků po vypití 240 ml brusinkové šťávy (Howel et al. 2005), stejně jako moče tří z pěti dobrovolnic po požití 42,5 g sušených plodů brusinky (Greenberg et al. 2005). Zhang a Zuo (2004) nalezli v plazmě dobrovolníka, po jednorázovém vypití 1800 ml brusinkového nápoje obsahujícího 25 % ovocného podílu, kyseliny benzoovou, o-hydroxybenzoovou, p-hydroxybenzoovou, 2,3- a 2,4-di-

hydroxybenzoovou, ferulovou a sinapovou. McGhie et al. (2003) popsali, že proanthokyanidiny z různých druhů ovoce, ne však z brusinky, jsou absorbovány a vylučovány močí u lidí a potkanů. Nicméně v moči bylo detekováno jen 0,1 % podaného množství proanthokyanidinů. Jediná zmínka o možné přítomnosti proanthokyanidinových trimerů a oligomerů v moči byla nalezena v práci Ammona a Kaula (1994). Tito autoři citují disertační práci HeckerNiedieka (1983), kdy myším byly podávány 14C-značené anthokyaniny izolované z hlohu. Podle autora byly nalezeny v moči trimery a oligomery proanthokyanidinů. Vzhledem k tomu, že byla měřena pouze radioaktivita moče, je pravděpodobné, že byly takto detekovány pouze metabolity značených látek. Naše studie prokázala, že moč člověka, který dlouhodobě užívá extrakt z plodů brusinky, má inhibiční účinek na adherenci bakterií vyvolávajících akutní a/nebo chronickou infekci močových cest (obr. 2). V močích probandů skupiny III byly ze skupiny fenolových kyselin nalezeny vysoké hladiny kyseliny hippurové, konjugáty některých dalších fenolových kyselin, z flavonoidů glukuronid a methoxyderivát kvercetinu a apigenin. Kyselina hippurová je pravděpodobně aktivní látkou v moči, která brání adhezi bakterií na epitel močových cest. V moči nebyly nalezeny anthokyaniny, resp. proanthokyanidiny, které jsou uváděny jako klíčové faktory v inhibici adherence E. coli. Nepřítomnost těchto polyfenolů v moči potvrdila výsledky Olthofa et al. (2003), že zdraví lidé metabolizují polyfenolové látky na fenolové kyseliny již v trávícím traktu.

ZÁVĚR Denní dávka doplňku stravy Urinal obsahující 400 mg Nutricranu-90TM podávaná osm týdnů zdravým ženám neovlivnila žádný ze sledovaných parametrů klinické biochemie a krevní obraz. U skupiny, která užívala dávku 1200 mg Nutricranu-90TM/den došlo ke statisticky významnému snížení hladiny produktů pokročilé oxidace bílkovin v krvi (AOPP). Dosud u žádného z doplňků stravy, které obsahují přírodní antioxidanty, nebyl tento specifický ochranný účinek proti oxidačnímu poškození bílkovin popsán. Moč žen této skupiny měla inhibiční účinek na adherenci uropatogenních kmenů E. coli, nebyl však prokázán vliv vyšší dávky přípravku na zvýšení její acidity. Plody brusinky, buď jako funkční potravina a/nebo jako komponenta doplňků stravy, jsou nejen účinné v ochraně močových cest před infekcí, ale také mohou být prospěšné rizikovým skupinám populace ohrožené metabolickým syndromem a dialyzovaným pacientům v ochraně jejich organismu před oxidačním stresem.

PODĚKOVÁNÍ Autoři prohlašují, že získané výsledky byly interpretovány nezávisle a nevyjadřují žádný obchodní zájem firmy Walmark, a.s., která poskytla doplněk stravy Urinal a placebo. Za finanční podporu děkujeme projektům MŠMT ČR (grant MSM 6198959216) a MPO ČR (grant FT-TA3/ 024).

Pilotní dvojitě slepá placebem kontrolovaná studie s doplňkem stravy Urinal na zdravých ženách LITERATURA Allison DG, Cronin MA, Hawker J, Freeman S (2000) Influence of cranberry juice on attachment of Escherichia coli to glass. J Basic Microbiol 40:3–6 Ammon HPT, Kaul R (1994) Crataegus. Herz-kreislauf-wirkunen von Crataegusextrakten, flavonoiden und procyanidinen. Deutsch Apothek Zeit 134:2631–2636, německy Anonymous (2005a) Cranberries fight bacteria. Br Dent J 199:698 Anonymous (2005b) Cranberries. Full of potential health benefits. Mayo Clin Womens Healthsource 9:9 Anonymous (2005c) Cranberry and urinary tract infection. Drug Ther Bull 43:17–19 Anonymous (2005d) Cranberry juice and urinary tract infections. Harv Health Lett 30:7 Berger RE (2005) Cranberries for preventing urinary tract infections. J Urol 173:1988 Burger O, Weiss E, Sharon N, Tabak M, Neeman I, Ofek I (2002) Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus by a high-molecular-weight constituent of cranberry juice. Crit Rev Food Sci Nutr 42:279–284 Crews WD, Jr., Harrison DW, Griffin ML, Addison K, Yount AM, Giovenco MA, Hazell J (2005) A double-blinded, placebo-controlled, randomized trial of the neuropsychologic efficacy of cranberry juice in a sample of cognitively intact older adults: pilot study findings. J Altern Complement Med 11:305–309 Di Martino P, Agniel R, Gaillard JL, Denys P (2005) Effects of cranberry juice on uropathogenic Escherichia coli in vitro biofilm formation. J Chemother 17:563–565 Dreikorn K (2005) Complementary and alternative medicine in urology. BJU Int 96:1177–1184 Duthie GG, Kyle JA, Jenkinson AM, Duthie SJ, Baxter GJ, Paterson JR (2005) Increased salicylate concentrations in urine of human volunteers after consumption of cranberry juice. J Agric Food Chem 53:2897–2900 Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N (2000a) The structure of cranberry proanthocyanidins which inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia coli in vitro. Phytochemistry 54:173–181 Foo LY, Lu YR, Howell AB, Vorsa N (2000b) A-type proanthocyanidin trimers from cranberry that inhibit adherence of uropathogenic P-fimbriated Escherichia coli. J Nat Prod 63:1225–1228 Gettman MT, Ogan K, Brinkley LJ, Adams-Huet B, Pak CY, Pearle MS (2005) Effect of cranberry juice consumption on urinary stone risk factors. J Urol 174:590–594; quiz 801 Greenberg JA, Newmann SJ, Howell AB (2002) Consumption of sweetened dried cranberries versus unsweetened raisins for inhibition of uropathogenic Escherichia coli adhesion in human urine: a pilot study. J Altern Compl Med 11: 875–878 Greenblatt DJ, von Moltke LL, Perloff ES, Luo Y, Harmatz JS, Zinny MA (2006) Interaction of flurbiprofen with cranberry juice, grape juice, tea, and fluconazole: in vitro and clinical studies. Clin Pharmacol Ther 79: 125–133 Griffiths HR, Moller L, Bartosz G, Bast A, Bertoni-Freddari C, Collins A, Cooke M, Coolen S, Haenen G, Hoberg AM, Loft S, Lunec J, Olinski R, Parry J, Pompella A, Poulsen H, Verhagen H, Astley SB (2002) Biomarkers. Mol Aspects Med 23: 101–208 Harkins KJ (2000) What‘s the use of cranberry juice? Age Ageing 29(1):9–12. Hecker-Niediek AE (1983) Untersuchung zur Biogenese, markierung und pharmakokinetik der procyanidine aus Crataegus-species. Disertační práce Marburg, str. 33–38. Hollman OMR, Buijsman MN, van Amelsvoort JM, Katan MB (2003) Chlorogenic acid, quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are extensively metabolized in humans. J Nutr 133: 1806–1814. Howell AB (2002) Cranberry proanthocyanidins and the maintenance of urinary tract health. Crit Rev Food Sci Nutr 42:273–8. Howell AB, Leahy M, Kurowska E., Guthrie N (2001) In vivo evidence that cranberry proanthocyanidins inhibit adherence of P-fimbriated E. coli bacteria to uroepithelial cells. Fed Amer Soc Exp Biol J 15:A284.

9

Howell AB, Reed JD, Krueger CG, Winterbottom R, Cunningham DG, Leahy M (2005) A-type cranberry proanthocyanidins and uropathogenic bacterial anti-adhesion activity. Phytochemistry 66:2281–2291 Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, Baddour LM, Barrett FF, Melton DM (1985) Adherence of Coagulase-Negative Staphylococci to Plastic Tissue-Culture Plates – a Quantitative Model for the Adherence of Staphylococci to Medical Devices. J Clin Microbiol, 22: 996–1006. Chu YF, Liu RH (2005) Cranberries inhibit LDL oxidation and induce LDL receptor expression in hepatocytes. Life Sci 77:1892–1901 Jensen HD, Krogfelt KA, Cornett C, Hansen SH, Christensen SB (2002) Hydrophilic carboxylic acids and iridoid glycosides in the juice of American and European cranberries (Vaccinium macrocarpon and V-oxycoccos), lingonberries (V-vitis-idaea), and blueberries (V-myrtillus). J Agric Food Chem 50:6871–6874 Jepson RG, Mihaljevic L, Craig J (2004) Cranberries for treating urinary tract infections. Cochrane Database Syst Rev CD001322 Kalousová M, Zima T, Tesař V, Dusilová-Sulková S, Škrha J (2005) Advanced glycoxidation end products in chronic diseases – clinical chemistry and genetic background. Mutat Res 579: 37–46 Kandil FE, Smith MAL, Rogers RB, Pepin MF, Song LL, Pezzuto JM, Seigler DS (2002) Composition of a chemopreventive proanthocyanidin-rich fraction from cranberry fruits responsible for the inhibition of 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA)induced ornithine, decarboxylase (ODC) activity. J Agric Food Chem 50:1063–1069 Kaneda H, Taguchi J, Ogasawara K, Aizawa T, Ohno M (2002) Increased level of advanced oxidation protein products in patients with coronary artery disease. Atherosclerosis 162: 221–225 Koo H, Nino de Guzman P, Schobel BD, Vacca Smith AV, Bowen WH (2006) Influence of cranberry juice on glucan-mediated processes involved in Streptococcus mutans biofilm development. Caries Res 40:20–27 Leitao DP, Polizello AC, Ito IY, Spadaro AC (2005) Antibacterial screening of anthocyanic and proanthocyanic fractions from cranberry juice. J Med Food 8:36–40 Lynch DM (2004) Cranberry for prevention of urinary tract infections. Am Fam Physician 70:2175–2177 Mathur T, Singhal S, Khan S, Upadhyay DJ, Fatma T, Rattan A (2006) Detection of biofilm formation among the clinical isolates of Staphylococci: an evaluation of three different screening methods. Indian J Med Microbiol, 24:25–29 McGhie TK, Ainge GD, Barnett LE, Cooney JM, Jensen DJ (2003) Anthocyanin glycosides from berry fruit are absorbed and excreted unmetabolized by both humans and rats. J Agric Food Chem 51:4539–4548 McMurdo ME, Bissett LY, Price RJ, Phillips G, Crombie IK (2005) Does ingestion of cranberry juice reduce symptomatic urinary tract infections in older people in hospital? A double-blind, placebo-controlled trial. Age Ageing 34:256–261 McHarg T, Rodgers A, Charlton K (2003) Influence of cranberry juice on the urinary risk factors for calcium oxalate kidney stone formation. BJU International 92:765–768 Monroy-Torres R, Macias AE (2005) Does cranberry juice have bacteriostatic activity? Rev Invest Clin 57:442–446 Murphy BT, MacKinnon SL, Yan XJ, Hammond GB, Vaisberg AJ, Neto CC (2003) Identification of triterpene hydroxycinnamates with in vitro antitumor activity from whole cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon). J Agric Food Chem 51:3541–3545 National Committee for Clinical Laboratory Standards (2002) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Twelfth informational supplement. NCCLS document M100-S12. NCCLS, Wayne, Pennsylvania Olthof MR, Hollmam PC, Buijsman MN, van Amelsvoort JM, Katan MB (2003) Chlorogenic acid, quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are extensively metabolized in humans. J Nutr 133: 1806–1814 Pratt LA, Kolter R (1998) Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Molecular Microbiology, 30: 285–293

10


Prior RL, Lazarus SA, Cao GH, Muccitelli H, Hammerstone JF (2001) Identification of procyanidins and anthocyanins in blueberries and cranberries (Vaccinium spp.) using high-performance liquid chromatography/mass spectrometry. J Agric Food Chem 49:1270–1276 Psotová J, Večeřa R, Zdařilová A, Anzenbacherová E, Kosina P, Svobodová A., Hrbáč J, Jirovský D, Stiborová M, Lichnovský V, Vičar J, Šimánek V, Ulrichová J (2006) Safety assesment of sanguiritrin, alkaloid fraction of Macleaya cordata, in rats. Vet MedCzech 51:145–155 Raz R, Chazan B, Dan M (2004) Cranberry juice and urinary tract infection. Clin Infect Dis. 38:1413–9 Reed J (2002) Cranberry flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health. Crit Rev Food Sci Nutr 42:301–316 Ren DC, Zuo RJ, Barrios AFG, Bedzyk LA, Eldridge GR, Pasmore ME (2005) Differential gene expression for investigation of Escherichia coli biofilm inhibition by plant extract ursolic acid. Applied and Environmental Microbiology, 71: 4022–4034 Rimando AM, Kalt W, Magee JB, Dewey J, Ballington JR (2004) Resveratrol, pterostilbene, and piceatannol in Vaccinium berries. J Agric Food Chem 52:4713–4719 Ruel G, Pomerleau S, Couture P, Lamarche B, Couillard C (2005) Changes in plasma antioxidant capacity and oxidized low-density lipoprotein levels in men after short-term cranberry juice consumption. Metab Clin Exper 54:856–861 Seeram NP, Adams LS, Hardy ML, Heber D (2004) Total cranberry extract versus its phytochemical constituents: Antiproliferative and synergistic effects against human tumor cell lines. J Agric Food Chem 52:2512–2517 Steinberg D, Feldman M, Ofek I, Weiss EI (2005) Cranberry high molecular weight constituents promote Streptococcus sobrinus desorption from artificial biofilm. Int J Antimicrob Agents 25:247–251 Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, Savic B, Svabic-Vlahovic M (2000) A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal of Microbiological Methods, 40: 175–179 Super EA, Kemper KJ, Woods C, Nagaraj S (2005) Cranberry use among pediatric nephrology patients. Ambul Pediatr 5:249–252 Sylvan L, Justice NP (2005) Possible interaction between warfarin and cranberry juice. Am Fam Physician 72:1000. Terris MK, Issa MM, Tacker JR (2001) Dietary supplementation with cranberry concentrate tablets may increase the risk of nephrolithiasis. Urology 57:26–29 Turner A, Chen SN, Joike MK, Pendland SL, Pauli GF, Farnsworth NR (2005) Inhibition of uropathogenic Escherichia coli by cranberry juice: a new antiadherence assay. J Agric Food Chem 53:8940– 8947 Urbášková P (1998) Rezistence bakterií k antibiotikům – vybrané metody. Trios, Praha

Vattem DA, Ghaedian R, Shetty K (2005) Enhancing health benefits of berries through phenolic antioxidant enrichment: focus on cranberry. Asia Pac J Clin Nutr 14:120–130 Vinson JA, Bose P, Su M (2001a) Cranberry: A fruit unusually rich in antioxidants. Faseb Journal 15:A287–a287 Vinson JA, Proch J, Bose P, Taffera P, Dick L, Su M (2001b) Cranberries: Powerful in vitro and in vivo source of antioxidants. Abstracts of Papers of the American Chemical Society 221:U34–U34 Vinson JA, Su XH, Zubik L, Bose P (2001c) Phenol antioxidant quantity and quality in foods: Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49:5315–5321 Vvedenskaya IO, Rosen RT, Guido JE, Russell DJ, Mills KA, Vorsa N (2004) Characterization of flavonols in cranberry (Vaccinium macrocarpon) powder. J Agric Food Chem 52:188–195 Wakimoto N, Nishi J, Sheikh J, Nataro JP, Sarantuya J, Iwashita M (2004) Quantitative biofilm assay using a microtiter plate to screen for enteroaggregative Escherichia coli. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 71: 687–690 Walsh KM (2005) Getting to yes. J Am Geriatr Soc 53:1072 Wang SY, Stretch AW (2001) Antioxidant capacity in cranberry is influenced by cultivar and storage temperature. J Agric Food Chem 49:969–974 Weiss EI, Houri-Haddad Y, Greenbaum E, Hochman N, Ofek I, ZakayRones Z (2005) Cranberry juice constituents affect influenza virus adhesion and infectivity. Antiviral Res 66:9–12 Witko-Sarsat V, Friedlander M, Capeiller-Blandin C, Nguyen-Khoa T, Nguyen AT, Zingraff J, Jungers P, Descamps-Latscha B (1996) Advanced oxidation products as a novel marker of oxidative stress in uremia. Kidney Int 49:1304–1313 Yan XJ, Murphy BT, Hammond GB, Vinson JA, Neto CC (2002) Antioxidant activities and antitumor screening of extracts from cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon). J Agric Food Chem 50:5844–5849 Yarnell E (2002) Botanical medicines for the urinary tract. World J Urol. 20285-93. Zafriri, D., Ofek, I., Adar, R., Pocino, M., Sharon, N. (1989). Inhibitory activity of cranberry juice on adherence of type 1 and type P fimbriated Escherichia coli to eucaryotic cells. Antimicrob Agents Chemother, 33(1), 92–98 Zhang K, Zuo YG (2004) GC-MS determination of flavonoids and phenolic and benzoic acids in human plasma after consumption of cranberry juice. J Agric Food Chem 52:222–227 Zhang L, Ma J, Pan K, Go VL, Chen J, You WC (2005) Efficacy of cranberry juice on Helicobacter pylori infection: a double-blind, randomized placebo-controlled trial. Helicobacter 10:139–145 Zheng W, Wang SY (2001) Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. J Agric Food Chem 49:5165–5170. Zuo YG, Wang CX, Zhan J (2002) Separation, characterization, and quantitation of benzoic and phenolic antioxidants in American cranberry fruit by GC-MS. J Agric Food Chem 50:3789–3794

PILOTNÍ DVOJITĚ SLEPÁ PLACEBEM KONTROLOVANÁ STUDIE S DOPLŇKEM STRAVY URINAL NA ZDRAVÝCH ŽENÁCH

Recommend Documents