ÁLLATTANI KÖZLEMÉNYEK (2009) 94(2): 159–166.
Pikkely-morfometriai vizsgálatok halfajok, illetve populációk elkülönítésére STASZNY ÁDÁM1,5, FERINCZ ÁRPÁD2, WEIPERTH ANDRÁS3, HAVAS ENIKİ4, PAULOVITS GÁBOR5 és URBÁNYI BÉLA1 1
SZIE, MKK, KTI, Halgazdálkodási Tanszék, H–2103 Gödöllı, Páter K. u. 1. E-mail:
[email protected] 2 ELTE, TTK, Állatrendszertani és Ökológiai Tanszék, H–1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. 3 MTA-ÖBKI, Magyar Dunakutató Állomás, H–2131 Göd, Jávorka Sándor u. 14. 4 SZIE, MKK, Állattani és Állatökológiai Tanszék, H–2103 Gödöllı, Páter K. u. 1. 5 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézete, H–8237 Tihany, Klebelsberg Kuno út 3.
Összefoglalás: Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy a Cyprinidae családba tartozó halak pikkelyeinek alakja alkalmas-e fajok, illetve populációk elkülönítésére. Ehhez a geometriai morfometria eszköztárát vettük igénybe. A módszerrel a ponty (Cyprinus carpio LINNAEUS) és az ezüstkárász (Carassius gibelio BLOCH) pikkelyeit 99,6%-os megbízhatósággal különítettük el egymástól. A négy mintavételi helyrıl származó ezüstkárászokat 3 jól elkülönülı csoportba tudtuk sorolni, ami – figyelembe véve a vizsgált élıhelyek földrajzi elkülönülésének mértékét – a várakozásnak megfelelı. A leírt módszerrel egy könnyen, gyorsan, olcsón és a vizsgált halra nézve kíméletesen elvégezhetı vizsgálatot kívánunk bevezetni. Kulcsszavak: geometriai morfometria, mérıpontok, Cyprinus carpio, Carassius gibelio.
Bevezetés Régóta foglalkoznak kutatások a halfajok minél pontosabb elkülönítésével – ami a rokon fajok gyakori természetes hibridizálása (HUBBS 1955, ARNOLD et al. 1999) miatt nem minden esetben könnyő feladat –, illetve az egyes fajok populációinak szétválasztásával, azok közti különbségek feltárásával. Ezen vizsgálatok többféle módszert alkalmaznak a kérdések megválaszolására. Az 1960-as évektıl napjainkig alkalmazott módszer a hagyományos morfometria, melyet BERINKEY LÁSZLÓ vezetett be a hazai kutatásba, és mind a mai napig széles körben alkalmazzák (BERECZKI & TAKÁCS 2007, BÍRÓ et al. 2008, SPECZIÁR et al. 2009). A módszer alapja, hogy a hal testén fellelhetı minél több (napjainkban ez legalább 20) testparamétert vesznek fel, így jellemezve a test formáját. A halak allometrikus növekedése folytán a felvett adatokat standardizálni kell. A kezdeti idıkben ez a standardizálás annyit jelentett, hogy az egyes testparamétereket elosztották a standard testhosszal (BERINKEY 1973), ami az egyes egyedek testhosszbeli különbségeit ugyan kiküszöbölte, azonban a növekedés során fellépı testarányváltozásokat nem. A statisztikai módszerek fejlıdésével ezt a problémát is megoldották, mára bonyolult matematikai képletek állnak rendelkezésre a megoldáshoz (LLEONART et al. 2000). A hagyományos morfo-
159
STASZNY Á. et al.
metriai módszer hátránya, hogy valamennyi esetben a vizsgált egyedek pusztulásával jár, valamint hogy nem kapunk igazi képet a különbségek mibenlétérıl, mivel nem a formát, hanem annak egy közvetett tulajdonságát (a hosszméreteket) vizsgálja. A másik módszer a genetikai markerek alkalmazása, melyet egyre szélesebb körben használnak fel, akár az egyes populációk eredetének felkutatására is (IMSIRIDOU et al. 1997, BERNATCHEZ & WILSON 1998). Ezen módszerek gyakorlatilag mindegyike kellıképpen pontos, azonban drága és hosszadalmas, emellett a környezeti hatások csupán azon részét képes észlelni, amelyek már oly régóta fennállnak, hogy a hozzájuk való alkalmazkodás tulajdonságai már genetikailag is rögzültek. A harmadik módszer az ebben a munkában is használt geometriai morfometria, mely a 70-es évek végén, 80-as évek elején alakult ki a statisztikai módszerek, illetve a digitális technikák fejlıdésével. Az elmúlt 30 évben a nemzetközi szakirodalomban egyre több olyan publikáció jelenik meg, mely ezt a módszercsoportot használja fel az alakban észlelhetı eltérések leírására (ADAMS et al. 2004). Két nagy irányzata alakult ki. Az egyik csoport a körvonal-analízisen alapuló módszereket tartalmazza, alkalmasságát azonban sokan vitatják (CADRIN 2000). A másik nagy irányzat a mérıpontok alapján történı vizsgálat, melyet a legkülönbözıbb állatcsoportokkal kapcsolatban használnak, sıt olyan publikáció is született, melyben a skizofrénia által kiváltott arctorzulást írják le (HENRIKSSON et al. 2006). Itt bizonyos számú mérıpontot vesznek fel a vizsgált egyed digitalizált képén. A késıbbiekben ezen mérıpontok koordinátái jelentik a vizsgált változókat, az egyedek közti különbségeket többváltozós statisztikai módszerekkel elemzik. Jelen vizsgálatban arra voltunk kíváncsiak, hogy a módszer alkalmas-e halfajok, illetve populációk elkülönítésére pikkelyeik morfológiája alapján. Így egy gyorsan, könnyen és mindenekelıtt a vizsgált egyedekre nézve kíméletesen elvégezhetı módszert szeretnénk bevezetni.
Anyag és módszer A vizsgálat során elıször a ponty (Cyprinus carpio LINNAEUS) és az ezüstkárász (Carassius gibelio BLOCH) pikkelyeit, majd az ezüstkárász különbözı populációit különítettük el. A mintavételek 2008 nyarán történtek, elektromos halászati módszerrel (AGKtípusú halászgéppel). Az elsı vizsgálat során 83 ponty és 139 ezüstkárász egyed pikkelyeit vizsgáltuk. Valamennyi egyed a Kis-Balaton Vízvédelmi Rendszer I-es és II-es ütemérıl származott. A második vizsgálatban 4 mintavételi területrıl származó 233 ezüstkárász egyed pikkelyeit vizsgáltuk. A mintavételi területek a következık: Isaszegi tórendszer I-es tava (43 egyed), Kis-Balaton I-es ütem (87 egyed), Kis-Balaton II-es ütem (62 egyed), Nagyberek (41 egyed). A pikkelyeket az elsı kemény úszósugárról az oldalvonalra vetített függıleges által kijelölt területrıl, az oldalvonal és a hátvonal közti felezı környékérıl vettük. Valamennyi egyedrıl 5–5 db jól fejlett, nem regenerálódott pikkelyt vettünk le. A feldolgozásig saját nyálkájával papírlapok közé ragasztottuk ıket. Feldolgozáskor csapvízzel lemostuk a pikkelyeket, majd tárgylemez közé ragasztottuk ıket. Ezután felsı megvilágítású szkennerrel 2400 dpi felbontással digitalizáltuk a pikkelyeket. Ezzel az eljárással igen jó minıségő digitalizált képet kaptunk. Hét könnyen meghatározható mérıpontot vettünk fel valamennyi pikkelyen a tpsDig2 nevő szoftverrel (ROHLF 2008). Fontos a mérıpontok ugyanolyan sorrendben történı felvétele. A további elemzést a MorphoJ nevő szoftvercsomaggal végeztük (KLINGENBERG 2008). A nyers adatokon teljes Prokrusztész-illesztést vé-
160
PIKKELYMORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK FELHASZNÁLÁSI LEHETİSÉGEI
geztünk a fıtengelyek alapján. Így a mérıpontokat beméreteztük, beforgattuk és beigazítottuk. Ahogy a hal testénél megfigyelhetjük, úgy a pikkelyek növekedésénél is allometrikus növekedést tapasztalhatunk. Ez annyit jelent, hogy amennyiben a mintánkban szereplı csoportok nem mutatnak tökéletesen átfedı korosztályi szerkezetet, illetve azonos méretet (ami gyakorlati munkák során kivitelezhetetlen, már csak azért is, mivel különbözı területeken különbözı életkorban más és más méretet érnek el a halak), úgy az eltérı méretekbıl adódó alakkülönbséget ki kell küszöbölnünk. Ennek módja a következı: Regressziót illesztettünk a Prokrusztész-koordinátákra (alakváltozók) és a centroidok logaritmusára (méretváltozók), majd a statisztikai elemzést a regresszió reziduálisával végeztük. Kanonikus varianciaanalízist (CVA) valamint funkcionális diszkriminancia-elemzést (DFA, Discriminant function analysis) végeztünk annak kiderítésére, hogy – elsı esetben – a két faj –, második esetben – a mintavételi helyeken élı ezüstkárász-populációk elkülönülnek-e egymástól. Permutációs tesztet végeztünk az eredmények megbízhatóságának érdekében.
Eredmények Az elsı vizsgálat során sikeresen különítettük el a ponty és az ezüstkárász egyedeit pikkelyeik morfometriai vizsgálata alapján (1. ábra). A csoportok közötti Mahalanobistávolság 5,93, a T2 érték 1824,65, mindkettı igen magas érték.
1. ábra. Ponty és ezüstkárász elkülönítése kanonikus varianciaanalízissel. Figure 1. Discrimination of Carp and Prussian carp with Canonical Variate Analysis.
161
STASZNY Á. et al.
A permutációs teszt eredménye alapján az értékek magas szinten megbízhatóak (p<0,0001). A DFA eredményeként kapott validációs és keresztvalidációs (validation/crossvalidation) eredmények (1. táblázat) szerint a változók alapján történı csoportba sorolás átlagosan 99,64%-ban egyezett a valós csoportokkal.
1. táblázat. Ponty és ezüstkárász DFA-val történı elkülönítésébıl származó validációs/keresztvalidációs táblázat. Table 1. Validation/Cross-validation table of the discrimination of Carp and Prussian carp with DFA.
fajok egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
ezüstkárász
Validáció besorolt ponty
összeg
Kereszt-validáció besorolt ezüstkárász ponty összeg
138 0
1 83
139 83
138 0
1 83
139 83
99,28 0
0,72 100
100 100
99,28 0
0,72 100
100 100
A második vizsgálat során a 4 elıre meghatározott csoportból 3-at sikerült elkülöníteni (2. ábra). A Kis-Balaton két ütemén élı ezüstkárászok pikkelyeik alapján egy csoportot alkottak. A csoportok közötti Mahalanobis-távolságok és T2 értékek a 2. táblázatban láthatók.
2. táblázat. Ezüstkárász-populációk közötti Mahalanobis-távolságok és T2-értékek. Table 2. Mahalanobis distances and T2 statistic of Prussian carp populations.
Mahalanobistávolságok
Isaszeg Kis-Balaton-I. Kis-Balaton II. Nagyberek
Isaszeg ––– 3,8199 3,6701 5,5309
T2-értékek Kis-Balaton-I. Kis-Balaton II. 534,4407 337,5777 ––– 60,4817 1,1745 ––– 7,2678
7,3503
Nagyberek 675,7496 2116,6513 1079,1647 –––
A permutációs teszt eredménye alapján (p<0,0001) valamennyi érték magas szinten megbízható. A DFA által adott validációs és keresztvalidációs (validation/cross-validation) eredmények (3. táblázat) alapján a legrosszabbul elkülönülı két csoport a Kis-Balaton I-es és II-es üteme (átlagos validációs érték: 74%, átlagos kereszt-validációs érték: 68%), azon csoportok melyeket elkülönülınek tekintettünk, átlagos validációs értéke: 98,62%, átlagos keresztvalidációs értéke: 97,63%.
162
PIKKELYMORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK FELHASZNÁLÁSI LEHETİSÉGEI
3. táblázat. Ezüstkárász-populációk DFA-val történı elkülönítésébıl származó validációs/keresztvalidációs táblázatok. Table 3. Validation/Cross-validation tables of the discrimination of Prussian carp populations with DFA.
Validáció besorolt
Kereszt-validáció besorolt
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Isaszeg
Kis-Balaton-I.
összeg
Isaszeg
Kis-Balaton-I.
összeg
43 3
0 84
43 87
42 4
1 83
43 87
100 3,45
0 96,55
100 100
97,67 4,60
2,33 95,40
100 100
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Isaszeg
összeg
Isaszeg
Kis-Balaton-II.
Kis-Balaton-II.
összeg
41 1
2 61
43 62
41 5
2 57
43 62
95 1,61
4,65 98,39
100 100
95,35 8,06
4,65 91,94
100 100
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Isaszeg
Nagyberek
összeg
Isaszeg
Nagyberek
összeg
43 1
0 40
43 41
43 1
0 40
43 41
100 2,44
0 97,56
100 100
100 2,44
0 97,56
100 100
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Kis-Balaton-I.
összeg
Kis-Balaton-I.
Kis-Balaton-II.
Kis-Balaton-II.
összeg
69 19
18 43
87 62
64 23
23 39
87 62
79 30,65
20,69 69,35
100 100
73,56 37,10
26,44 62,90
100 100
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Kis-Balaton-I.
Nagyberek
összeg
Kis-Balaton-I.
Nagyberek
összeg
87 0
0 41
87 41
87 0
0 41
87 41
100 0
0 100
100 100
100 0
0 100
100 100
területek egyedszám ezüstkárász ponty százalék ezüstkárász ponty
Kis-Balaton-II.
Nagyberek
összeg
Nagyberek
összeg
61 0
1 41
62 41
61 0
1 41
62 41
98 0
1,61 100
100 100
98,39 0
1,61 100
100 100
Kis-Balaton-II.
163
STASZNY Á. et al.
2. ábra. Ezüstkárász populációk elkülönítése kanonikus varianciaanalízissel. Figure 2. Discirimination of Prussian carp populations with Canonical Variate Analysis.
Értékelés Az eredmények alapján kijelenthetı, hogy az általunk használt módszer alkalmas halfajok, illetve populációk elkülönítésére. A ponty és az ezüstkárász pikkelyének egyszerő vizuális elkülönítése szakembernek természetesen nem jelent problémát, éppen ezért alkalmas a módszer megbízhatóságának vizsgálatára. Az, hogy a mérıpontok alapján több mint 99%-os biztonsággal sikerült a pikkelyeket a megfelelı fajba sorolni, a módszer erejét mutatja. Mivel a keresztvalidációs értékek pontosan megegyeztek a validációs értékekkel, az eredmény maximálisan megbízható. Az ezüstkárász populációinak elkülönítése során is megbízható eredményeket kaptunk, amit a permutációs tesztek magasan szignifikáns értékei mutatnak, valamint az, hogy a validációs értékek egyik esetben sem térnek el számottevıen a keresztvalidációs értékektıl. Az, hogy a két kis-balatoni csoport nem tért el egymástól, nem meglepı. A két víztest nemcsak hogy összeköttetésben áll egymással, hanem az Ies ütembıl a víz kizárólag a II-es ütemen keresztül haladhat a Balaton irányába, ami óhatatlanul az egyedek egymás közti keveredését, közös populáció alkotását eredményezi. A kapott eredmény ennek a feltételezésnek a megerısítése, valamint a módszer alkalmasságának újabb bizonyítéka. Az azonban, hogy még ezt a két csoportot is 70% körüli megbízhatóság mellett sikerült a módszerrel elkülöníteni, azt mutatja, hogy az eredményeket szigorúan kell értékelni, valamint, hogy nem szabad csupán egyes értékeket figyelembe venni.
164
PIKKELYMORFOLÓGIAI VIZSGÁLATOK FELHASZNÁLÁSI LEHETİSÉGEI
Köszönetnyilvánítás. Köszönettel tartozunk a Balaton-felvidéki Nemzeti Park Igazgatóságának az engedélyek megadásáért, valamint dr. HEGYI ÁRPÁDnak az isaszegi mintavételekben nyújtott segítségéért. A pikkelyek digitalizációjában nyújtott segítségéért köszönet illeti BALÁZS BOLDIZSÁRt.
Irodalomjegyzék ADAMS, D. C., ROHLF, F. J. & SLICE, D. E. (2004): Geometric morphometrics: ten years of progress following the ‚revolution‘. Italian Journal of Zoology 71: 5–16. ARNOLD, M. L., BULGER, M. R., BURKE, J. M., HEMPEL, A. L. & WILLIAMS, J. H. (1999): Natural hybridization: how long can you go and still be important? Ecology 80(2): 371–381. BERECZKI Cs. & TAKÁCS P. (2007): Balatoni befolyók jellegzetes halfajainak morfometriai vizsgálata. Hidrológiai Közlöny 87(6): 22–24. BERINKEY L. (1973): A sujtásos küsz (Alburnoides bipunctatus BLOCH) két populációjának összehasonlító analízise testméretek alapján. Vertebrata Hungarica 14(1): 3–8. BERNATCHEZ, L. & WILSON, C. C. (1998): Comparative phylogeography of Nearctic and Palearctic fishes. Molecular Ecology 7: 431–452. BÍRÓ P., TAKÁCS P. & SPECZIÁR A. (2008): A küsz (Alburnus alburnus L.) növekedése és morfometriája a Balaton két szélsı medencéjében. Hidrológiai Közlöny 88(6): 28–30. CADRIN, S. X. (2000): Advances in morphometric identification of fishery stocks. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10: 91–112. HENRIKSSON, K. M., WICKSTROM, K., MALTESSON, N., ERCSSON, A., KARLSSON, J., LINDGREN, F., ASTROM, K., MCNEIL, T. F. & AGARTZ, I. (2006): A pilot study of facial, cranial and brain MRI morphometry in men with schizophrenia: Part 2. Psychiatry Research: Neuroimaging 147: 187–195. HUBBS, C. L. (1955): Hybridization between Fish Species in Nature. Systematic Zoology 4: 1–20. IMSIRIDOU, A., KARAKOUSIS, Y. & TRIANTAPHYLLIDIS, C. (1997): Genetic polymorphism and differentiation among Chub Leuciscus cephalus L. (Pisces, Cyprinidae) populations in Greece. Biochemical Systematics and Ecology 25(6): 537–546. KLINGENBERG, C. P. (2008): MorphoJ. Faculty of Life Sciences, University of Manchester, UK. http://www.flywings.org.uk/MorphoJ_page.htm LLEONART, J., SALAT, J. & TORRES, G. J. (2000): Removing allometric effects of body size in morphological analysis. Journal of Theoretical Biology 205: 85–93. ROHLF, F. J. (2008): tpsDig, digitize landmarks and outlines, version 2.11. Department of Ecology and Evolution, State University of New York at Stony Brook. SPECZIÁR A., BERCSÉNYI M. & MÜLLER T. (2009): Morphological characteristics of hybrid pikeperch (Sander lucioperca ♀ x Sander volgensis ♂) (Osteichtyes, Percidae). Acta Zoologica Academiae Scientiarum Hungaricae 55(1): 39–54.
165
STASZNY Á. et al.
Scale-morphometry studies to discriminate fish species and populations ÁDÁM STASZNY1,5, ÁRPÁD FERINCZ2, ANDRÁS WEIPERTH3, ENIKİ HAVAS4, GÁBOR PAULOVITS5 & BÉLA URBÁNYI1 1 Szent István University, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences; Institute of Environmental & Landscape Management; Department of Fish Culture, Páter K. út 1. H–2103 Gödöllı, Hungary E-mail:
[email protected] 2 Eötvös Loránd University, Department of Systematic Zoology and Ecology, Pázmány Péter sétány 1/c. H–1117 Budapest 3 Hungarian Academy of Sciences, Institute of Ecology and Botany, Hungarian Danube Research Station, H–Jávorka u. 14. 2131, Göd 4 Szent István University, Department of Zoology and Animal Ecology, Páter K. út 1. H–2103 Gödöllı 5 Hungarian Academy of Sciences, Balaton Limnological Research Institute, Klebelsberg Kunó út 3. H–8237 Tihany
ÁLLATTANI KÖZLEMÉNYEK (2009) 94(2): 159–166.
Abstract. During this work we examined whether the shape of the scales are suitable to discriminate species and populations. This involved the use of tools of geometric morphometry. We could discriminate the common carp (Cyprinus carpio LINNAEUS) and the prussian carp (Carassius gibelio BLOCH) scales from each other with 99.6% reliability. We classified the prussian carps from the four sampling locations to 3 distinct groups, in line with the expectations, according to the geographical distinction between the two stages of KBVR. With this method, we would like to introduce a cheap, fast and an animal-friendly method. Keywords: geometric morphometry, landmark, Cyprinus carpio, Carassius gibelio.
166
