DEBRECENI EGYETEM ORVOS- ÉS EGÉSZSÉGTUDOMÁNYI CENTRUM ÉLETTANI INTÉZET
Sejt- és Molekuláris Élettani Laboratórium Molekuláris Medicina Kutatóközpont (EU Center of Excellence)
DE-MTA „Lendület” Sejtélettani Kutatócsoport 4032 Debrecen, Nagyerdei krt 98. Vezető: Dr. Bíró Tamás egyetemi docens
UNIVERSITY OF DEBRECEN MEDICAL AND HEALTH SCIENCE CENTER DEPARTMENT OF PHYSIOLOGY
Laboratory for Cellular and Molecular Physiology Research Center for Molecular Medicine (EU Center of Excellence)
DE-MTA „Lendület” Cellular Physiology Research Group Nagyerdei krt 98, Debrecen, H-4032 Hungary-EU Chief: Dr. Tamás Bíró, M.D., Ph.D., D.Sc. Associate Professor
Phone: +36-52-255-575. FAX: +36-52-255-116. Cellular: +36-209-816-326 or +36-20-583-7074 Email:
[email protected],
[email protected]
Robert Lyons részére
Tisztelt Lyons úr, Csatolva küldjük a Kaqun víz daganatnövekedésre gyakorolt hatásával kapcsolatban végzett állatkísérletek első részének eredményeit. A kísérleteket a DE OEC Bőrklinika SCID laboratóriumában, Prof. Dr. Hunyadi János vezetése mellett végezték. Debrecen, 2012-01-16 Tisztelettel,
Bíró Tamás
JELENTÉS 2012-01-16 Bevezetés Az Iscador a Viscum album gyomnövény kivonata, amelyet évtizedek óta alkalmaznak tumoros betegek kezelésére. Egérkísérletben igazolták, hogy az Iscador (1 mg/adag) hetente kétszer 15 héten át alkalmazva teljes mértékben gátolta a 20- methylcholanthren által indukált sarcoma kifejlődését, és megelőzte ezen állatoknál a tumor által kifejlődő halál létrejöttét. Az Iscador hatása dózisfüggő volt, a 0.166, 0.0166 és 0.00166 mg/dózis mellett az 67, 50 and 17% volt az állatok sarcoma által előidézett pusztulása (Carcinogenesls vol.17 no.5 pp.1107 1109, 1996). A KAQUN víz az MTA Izotópkutató Intézet vizsgálata szerint (Ikt.sz.: IKI/Igazg/306/2010) 18-21g oxigént tartalmaz dm3-ként, ami a normál víz átlagos oxigéntartalmának 6-8-szorosa. A KAQUN oxigén dús vízben 10 másodperc alatt maximumot mutató reaktív oxigéngyök koncentráció érhető el, míg a kontroll vízben ez a folyamat lassú és jóval rövidebb élettartamú. Feltételezések szerint a KAQUN víz fokozza a granulocyták és az NK sejtek aktivitását. Ha a KAQUN víz jelenléte, valamint a Iscador stimuláció egyaránt fokozza az NK sejt aktivitást, szinergiás hatás tételezhető fel, amit xenotranszplantált immunhiányos egereken végzett kísérletekkel igazolni lehet. Súlyos immunhiány szindrómás (SCID) egerekre humán tumorok ültethetők át. Az így létrehozott tumoros állatok daganatai humán jellegűek. A modell jól összehasonlítható, reprodukálható kísérleti lehetőséget biztosít, a tumor növekedése mérhető. Sejttenyésztés Kísérleteink során két permanens sejtvonalat alkalmaztunk.
Human ovarium carcinoma sejtvonal (A2780) : Tenyésztéséhez Dulbecco’s modified Eagle’s médiumot használtunk 10%-os fötális borjú szérum (FBS), 5U/ml penicillin, 50µg/ml streptomycin, 1,25µg/ml fungizone kiegészítés mellett. Cervix carcinoma sejtvonal (KB31) : Tenyésztéséhez Dulbecco’s modified Eagle’s médiumot használtunk 10%-os fötális borjú szérum (FBS), 5U/ml penicillin, 50µg/ml streptomycin, 1,25µg/ml fungizone kiegészítés mellett.
Állattartási körülmények A megbízó kísérleteihez szükséges immunhiányos (SCID) egereket a DEOEC Bőrgyógyászati Klinika engedéllyel rendelkező állatháza biztosította. Az egerek egerekben nincs sem T sem B sejtes immunitás, azonban normál NK-sejttel, makrofágokkal és granulocitákkal rendelkeznek. A vizsgálatokhoz egy éves egereket használtunk, amelyek csíramentes körülmények között sterilizált, konvencionális rágcsálótápot, illetve sterilizált vizet kaptak és állandó hőmérsékleten (24oC) és páratartalmon (55%) tartottunk.
2
Humán daganatok indukálása SCID egerekben A vizsgálatok során 16 immunhiányos (SCID - Severe Combined Immunodeficiency) egér bőre alá humán eredetű daganatos sejteket injektáltunk. Az állatok bal oldalába A2780 (humán, ovarium carcinoma), jobb oldalába KB-3-1 (humán, cervix carcinoma) sejteket injektáltunk különböző koncentrációban, oldalanként két különböző helyre: bal láb – 4x106 sejt/150 µl fiziológiás sóoldat, bal hát – 2x106 sejt/150 µl fiziológiás sóoldat. A tumorok indukciója után az injektált állatokat négy csoportba osztottuk, minden csoport 4 egeret tartalmazott. Kezelések 1. csoport (n=4): kontroll 2. csoport (n=4): sterilre szűrt Kaqun víz ad libitum 3. csoport (n=4): Iscador injekció intraperitoneálisan 4. csoport (n=4): sterilre szűrt Kaqun víz ad libitum + Iscador injekció intraperitoneálisan A kísérleti állatok megfelelő csoportjai (2. és 4. csoport) a sterilre szűrt Kaqun vizet ad libitum kapták a tumor indukálásával azonos naptól a kísérlet befejezéséig. A Kaqun vizet 0,22 µm pórusméretű steril szűrő segítségével sterilre szűrtük. A megfelelő csoportok (3. és 4. csoport) az intraperitoneális Iscador M injekciót (törzsoldata 300 ng/ml lektint tartalmaz) három nappal a daganatos sejtek injektálása után kapták először 1 ng lektin/kg dózisban (optimális adag), majd heti két alkalommal a kísérlet lezárásáig. Az Iscador injekciót mindig közvetlenül az injektálás előtt készítettük el az alábbiak szerint:
Iscador M spec 5 mg 1004/0318 (bis 05.2012). 300 ng/ml lektint tartalmaz. Optimális adagja: 1 ng/kg Javasolt suboptimális adagja: 0,25 ng/kg Hígítás
Iscador
PBS
Koncentráció
–
1,0ml Amp.
–
300ng/ml
1:99
50 ml
4950 ml
3 ng/ml
1:14*
150 ml
2100 ml
0,2 ng/ml
1:3**
500 ml
1500 ml
0,05 ng/ml
* Ebből 0,1 ml egy 0,02 kg-os egérnek 1ng/kg dózisnak felel meg ** Ebből 0,1 ml egy 0,02 kg-os egérnek 0,25 ng/kg dózisnak felel meg Tumorok térfogatának mérése A tumorok nagyságát ugyanazon kutató digitális tolómérő segítségével mérte meg heti két alkalommal. A daganatok térfogatát irodalmi adatok alapján a következő képlet alapján határoztuk meg: V (mm2) = legnagyobb átmérő x legkisebb átmérő2 x 0,5. Eredmények A vizsgálatok során megállapítható, hogy a kísérleti állatokba injektált daganatos sejtek növekedésnek indultak, azonban a különböző daganatok eltérő mértékben reagáltak az alkalmazott kezelésekre.
3
Az A2780 humán ovárium carcinoma – amelyet a kísérleti állatok bal oldalába injektáltunk - esetén a vártnak megfelelően a kontroll állatok (n=4) tumora exponenciális növekedést mutatott és a beültetést követően 5 hét alatt közel 3000 mm3 méretűre fejlődött (1. ábra). A kontrollhoz képest az alkalmazott kezelések (Kaqun, Iscador, Kaqun+Iscador) hatásosnak mutatkoztak, azonban eltérő mértékben gátolták a tumorok progresszióját. Abban a kísérleti csoportban, amelyben az egerek csak intraperitoneális Iscador kezelést kaptak heti két alkalommal optimális dózisban (1 ng lektin/kg), a daganatok mérete nem sokkal maradt el a kontroll állatok tumorainak méretétől. Az állatok túlélése ebben a csoportban volt a legrosszabb. A kísérlet lezárásakor a legkisebb méretű daganatok a Kaqun vízzel (1400 mm3), illetve a Kaqun+Iscador-al kezelt állatoknál (800 mm3) voltak megfigyelhetőek. A tumorok növekedési kinetikájában is különbségek figyelhetőek meg a különböző kezelések hatására. Azokban a kísérleti állatokban, amelyek csak Iscadort kaptak, a daganat már a beültetést követő 2. héten jól tapinthatóvá fejlődött. Ezzel szemben azokban az csoportokban, amelyek kezelésének részét képezte a Kaqun víz (önmagában vagy Iscador-al kombinálva), a sejtek beültetését követő két hét elteltével még nem figyelhető meg tumor. A növekedési kinetika szempontjából a legjobb eredményt az önmagában alkalmazott Kaqun vizes kezelés mutatta, hiszen ebben a csoportban indultak legkésőbb növekedésnek az ovárium carcinoma tumorok (beültetést követő
3
Tumor térfogata (mm ) A2780
18. nap után).
Iscador Kaqun+ Iscador Kontroll Kaqun
3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
n=1
n=1
n=3
n=4 n=4
n=4 n=4 n=4 n=4 0
11
n=3
n=2
n=4 n=3
n=4 n=4 n=4 13
n=4 n=4 17
n=2
n=3
n=2
25
34
n=1
39
Napok száma 1. ábra Különböző kezelések hatása A2780 ovárium carcinoma daganatokra SCID egerekben
4
A KB-3-1 humán cervix carcinoma – amelyet a kísérleti állatok jobb oldalába injektáltunk - esetén a kontroll állatok (n=4) tumora exponenciális növekedést mutatott a beültetést követő 17. napig és átlagosan 3500 mm3 méretűre fejlődött (2. ábra). A csak Iscador kezelést kapott csoportban a cervix carcinoma tumorok mérete exponenciális növekedést mutatott és elérte a 4500 mm3-t, ami a megfelelő kontroll tumor méreteit azonos időpontban meghaladta és a kísérleti állatok pusztulását okozta. Ezen tumorok esetén is a Kaqun vízzel kezelt csoportok (2. és 4. csoport) tumorainál lassabb növekedési kinetika volt megfigyelhető.
Iscador Kaqun + Iscador Kontroll Kaqun
5000
n=3
n=4
3
Tumor térfogata (mm ) KB-3-1
4000
n=3
3000
n=2
n=1 n=2
n=4 n=3
n=4
2000 n=4
1000
n=4
n=4
n=4
n=4
n=4
n=4
n=1
n=3
n=2
25
34
n=1
n=4
n=4
0 0
11
13
17
39
Napok száma 2. ábra Különböző kezelések hatása KB-3-1 cervix carcinoma daganatokra SCID egerekben
Megjegyzések, következtetések A kísérletek során nyert, „szigorúan” előzetes adatok azt sugallják, hogy a Kaqun víz folyamatos itatása lecsökkentette a daganatok kialakulásának ütemét. Hangsúlyozandó ugyanakkor, hogy az alacsony állatszám (n) miatt statisztikai analízisre nem nyílt mód. A továbbiakban az alábbi kísérletek kivitelezése javasolt: A Kaqun víz hatásának vizsgálata sejtkultúrákban (in vitro kísérletek) – A kísérletek során a fenti 2 daganatos sejttípus mellett malignus melanoma sejtvonalakon, valamint egészséges humán bőr eredetű sejteken (epidermális keratinocytákon és dermáli fibroblastokon) végzünk kísérleteket.
5
A Kaqun víz további vizsgálata SCID egérmodellben (in vivo kísérletek) – A kísérletek során a Kaqun vizet csak a daganatok kialakulása után kezdjük el adagolni; azaz azt elemezzük, hogy csökkenthető-e a daganatok mérete a víz itatásával.
6
