Ph.D. értekezés. Készítette: Dr. Bán Zoltán Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár

A magzat számbeli chromosoma-rendellenességeinek kimutatása magzatvíz- és chorionboholymintákból quantitatív fluoreszcens polimeráz láncreakció módszerrel

Ph.D. értekezés

Készítette: Dr. Bán Zoltán Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok (vezető: Dr. Tulassay Zsolt) 2/2. Magzati és Újszülöttkori Orvostudomány (programvezető: Dr. Papp Zoltán) Téma: I. Prenatális genetika Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Budapest, 2005. Szigorlati bizottság:

Hivatalos bírálók:

Dr. Fekete György egyetemi tanár

Dr. Dobos Matild egyetemi docens

Dr. Tóth Zoltán egyetemi tanár

Dr. Gundy Sarolta osztályvezető

Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés………………………………………………………......... 1. oldal 1.1. A prenatális cytogenetikai vizsgálat indikációi…………............ 2. oldal 1.1.1. „Idősebb” anyai életkor………………………………..… 2. oldal 1.1.2. Kiegyensúlyozott strukturális chromosoma-rendellenesség valamelyik szülőnél……………………………………….... 3. oldal 1.1.3. Előző gyermek chromosoma-rendellenessége………….... 3. oldal 1.1.4. Anyai szérum marker vizsgálat………………………..…. 4. oldal 1.1.4.1. Anyai szérum marker szűrés a második trimeszterben. 5. oldal 1.1.4.2. Anyai szérum marker szűrés az első trimeszterben…. 6. oldal 1.1.5. Ultrahang vizsgálat………………………………………. 7. oldal 1.2. Invazív mintavételi módszerek………………………………….. 8. oldal 1.2.1. Chorionboholy-mintavétel……………………………….. 9. oldal 1.2.2. Genetikai amniocentézis…………………………………. 9. oldal 1.3. A chromosoma-rendellenességek prenatális diagnosztikájának laboratóriumi módszerei…………………………………………. 10. oldal 1.3.1. Cytogenetikai vizsgálat…………………………………… 10. oldal 1.3.2. Molekuláris genetikai módszerek………………………… 11. oldal 1.3.2.1.FISH………………………………………………….. 11. oldal 1.3.2.2.QF-PCR………………………………………………. 13. oldal 1.3.2.3.Comparatív genomiális hybridizáció……………........ 17. oldal 1.3.2.4.Real-time PCR……………………………………….. 18. oldal 2. Célkitűzések…………………………………………………………. 20. oldal 3. Anyag és módszer………………………………………………….... 21. oldal 3.1. Chorionboholyminták …………………………………………... 21. oldal 3.2. Magzatvízminták ……….………………………………………. 21. oldal 3.3. Műszerek………………………………………………………… 21. oldal 3.4. Reagensek……………………………………………………….. 22. oldal 3.5. Fluoreszcens jelöléssel ellátott oligonukleotid primerek………... 23. oldal 3.6. Felhasznált számítógépes programok…………………………… 23. oldal 3.7. Módszerek………………………………………………………. 24. oldal

I

3.7.1. Cytogenetikai vizsgálat…………………………………... 24. oldal 3.7.2. QF-PCR vizsgálat………………………………………... 24. oldal 3.7.2.1. DNS izolálás chorionboholymintából ………………. 25. oldal 3.7.2.2. DNS izolálás magzatvízmintából ……….…………... 26. oldal 3.7.2.3. Polimeráz láncreakció……………………………….. 26. oldal 3.7.2.4. A PCR termékek detektálása………………………... 27. oldal 3.7.3. Statisztikai kiértékelés…………………………………... 27. oldal 4. Eredmények…………………………………………………………. 28. oldal 4.1. A QF-PCR módszer és a cytogenetikai vizsgálat eredményeinek összehasonlítása…………………………………………………. 28. oldal 4.1.1. Normál minták értékelése………………………………... 32. oldal 4.1.2. Aneuploidiák kimutatása chorionboholymintákból…….... 33. oldal 4.1.3. Aneuploidiák kimutatása magzatvízmintákból .…............. 33. oldal 4.1.4. Magzati nemmeghatározás chorionboholymintákból …… 35. oldal 4.1.5. Magzati nemmeghatározás magzatvízmintákból ………... 35. oldal 4.1.6. Mozaikosság kimutatása…………………………………. 36. oldal 4.1.7. A magzatvízminta kontaminációja anyai vérrel….………. 37. oldal 4.2. Az STR markerek alléleloszlásának vizsgálata ……………….. 38. oldal 4.3. A chorionboholy-mintavétel indikációjának vizsgálata a kórosnak talált esetekben………………………………………………….. 39. oldal 4.4. A magzatvíz-mintavétel indikációjának elemzése a kórosnak talált esetekben…………………………………………………... 40. oldal 4.5. A QF-PCR vizsgálat egyéb alkalmazási lehetőségei……………. 40. oldal 4.5.1. Triploidia kimutatása és a számfeletti chromosomaszerelvény szülői eredetének meghatározása……….…… 40. oldal 4.5.2. Uniparentalis disomia kimutatása és az UPD-t mutató chromosoma eredetének vizsgálata……………………… 43. oldal 4.6. Az allélvesztés csökkentésének lehetőségei ………………….... 44. oldal 5. Megbeszélés…………………………………………………………. 49. oldal 6. Következtetések …………………………………………………….. 54. oldal 7. Összefoglalás………………………………………………………… 56. oldal 8. Rövidítések…………………………………………………………... 58. oldal

II

9. Köszönetnyilvánítás………………………………………………… 60. oldal 10. Irodalomjegyzék…………………………………………………….. 61. oldal 11. Saját irodalom jegyzéke…………………………………………….. 74. oldal 11.1.

Az értekezés készítése során felhasznált saját irodalom……… 74. oldal

11.1.1. Lektorált közlemények…………………………………… 74. oldal 11.1.2. Idézhető absztraktok……………………………………… 76. oldal 11.2.

Egyéb, nem az értekezés témájában megjelent saját

közlemények……………………………………………………... 77. oldal 11.2.1. Lektorált közlemények…………………………………… 77. oldal 11.2.2. Könyvfejezetek…………………………………………… 78. oldal 11.2.3. Idézhető absztraktok……………………………………… 79. oldal

III

1. BEVEZETÉS

1. Bevezetés A prenatális diagnosztika a klinikai genetika azon területe, amely magába foglalja mindazokat a módszereket és eljárásokat, amelyek segítségével az embryo, illetve a magzat genetikai állományáról információt nyerhetünk. A módszerek segítségével felismerhetjük azokat a magzati rendellenességeket, amelyek méhen belüli, esetleg korai újszülöttkori kezelést tesznek szükségessé, vagy gyógyíthatatlan esetekben a terhesség befejezését indokolhatják. A prenatális diagnosztika egyrészt lehetővé teszi, hogy magas genetikai kockázattal bíró szülők számára is megelőzhető legyen a beteg utód születése, másrészt negatív diagnosztikus eredmény esetén elősegíti az utód vállalását ezekben a családokban. A prenatális genetikai diagnosztika kezdete az 1950-es évekre vezethető vissza. Elsőként Fuchs és munkatársai az X-chromatin vizsgálatával magzatvízből történő nemmeghatározást végeztek haemophilia A emelkedett magzati kockázata miatt [44], majd 1966-ban Steele és Bregg [114], valamint Lussier és mtsai [70] nevéhez fűződik az első magzati karyotypus-meghatározás. Magyarországon az első prenatális nemmeghatározást Papp és munkatársai végezték 1970-ben [91], majd az első magzatvízsejt-vizsgálatokról 1972-ben számoltak be [92]. A prenatális genetikai diagnosztika egyik legfontosabb területe a magzati chromosomarendellenességek vizsgálata. A petesejtek 18-19%-ában, a spermiumok 3-4%-ában figyelhető meg a chromosomák számbeli rendellenessége, aneuploidia [78,79,113]. Becslések szerint 13 megfogant embryóból egy chromosoma-rendellenességet hordoz [14], és az első trimeszterben történő vetélések mintegy 50%-ának hátterében áll aneuploidia [83]. Az összes szülés 0,65%-ában fordul elő klinikailag jelentős chromosoma-rendellenesség, valamint 0,2%-ban olyan kiegyensúlyozott chromosoma transzlokáció, amelynek a későbbi reproduktivitásban lehet következménye [58]. A perinatalis mortalitás 30%-ában van szerepe veleszületett rendellenességeknek, és összességében ezeknek 5,6-11,5%-ának hátterében áll chromosoma-rendellenesség [4]. A fenti adatok alátámasztják a prenatális chromosoma-vizsgálatok fontosságát. A vizsgálat elvégzésének előfeltétele a terhességgondozás során végzett genetikai tanácsadás. A genetikai tanácsadás feladata, hogy kiszűrje azon terheseket, akiknél a

1

1. BEVEZETÉS

magzati chromosoma-rendellenességek fokozott kockázata áll fenn. A magzati chromosoma-rendellenességek definitív diagnózisa jelenleg csak invazív beavatkozások útján lehetséges, amelyek magzati kockázatot jelentenek. A genetikai tanácsadás legfőbb célja, hogy a terhesség alatt végzett nem-invazív vizsgálatok eredményei, illetve az anamnesztikus adatok alapján felmérjék a házaspár kockázatát, és a házaspár tájékoztatása után a kockázatok és az előnyök ismeretében a házaspárral közösen szülessék döntés az invazív beavatkozás esetleges elvégzéséről [2]. A terhesgondozás során a chromosoma-rendellenességek kockázatának becslésénél a következő szempontokat kell figyelembe venni: •

Anyai életkor [34,38,50,54,61]

•

Kiegyensúlyozott strukturális chromosoma-rendellenesség valamelyik szülőnél [131,132,137]

•

Előző gyermek chromosoma-rendellenessége [84,115,131]

•

Anyai szérum marker szűrővizsgálat pozitív eredménye [19,28,54,128]

•

Ultrahang gyanújelek [7,8,9,72,112]

•

Habituális

vetélés,

subfertilitás,

vagy

tisztázatlan

perinatális

halálozás

a

kórelőzményben [4,12] •

Egyéb (pl. szülői aggodalom, apai életkor [79], a családban észlelt UPD [16], stb.)

A házaspár tájékoztatása a WHO ajánlása alapján nem-direktív módon történik [71]. A genetikai tanácsadás során a házaspár az objektív felvilágosítást követően maga hozza meg a döntést a cytogenetikai vizsgálat elvégzéséről, illetve kóros esetben a terhesség továbbviseléséről, vagy megszakításáról [126,139].

1.1. A prenatális cytogenetikai vizsgálat indikációi 1.1.1. „Idősebb” anyai életkor Az autosomalis trisomiák és a nemi chromosomák aneuploidiáinak előfordulásának gyakorisága az anyai életkorral párhuzamosan növekszik. (ld. 1. ábra)

2

1. BEVEZETÉS

Chromosoma-rendellenességek gyakorisága az anyai életkor függvényében 12

10

Előfordulás (%)

8 21-es trisomia 18-as trisomia 13-as trisomia Nemi chr. Összesen

6

4

2

0 35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

Anyai életkor

1. ábra: Chromosoma-rendellenességek gyakorisága az anyai életkor függvényében Forrás: Ferguson-Smith és mtsa 1985 [38]

Amennyiben az anyai életkor ≥35 év, javasolt a prenatális cytogenetikai vizsgálat elvégzése. Jelenleg ez a magzati cytogenetikai vizsgálatok leggyakoribb indikációja. A 35 éves határ megállapítása abból adódik, hogy ennél a korcsoportnál éri el a chromosoma-rendellenességek

előfordulásának

kockázata

az

invazív

magzati

mintavételi technikák szövődményeinek kockázatát (0,5-1%) [34,38,50,54,61,94]. 1.1.2.

Kiegyensúlyozott

strukturális

chromosoma-rendellenesség

valamelyik

szülőnél Ebbe a csoportba lényegesen kevesebb eset (általában <5%) tartozik, az utód kockázata azonban igen magas arra, hogy kiegyensúlyozatlan chromosoma-rendellenessége legyen [131,132]. A kockázat változó (10-50%) attól függően, hogy az apa, vagy az anya a hordozó, illetve, hogy melyik chromosomáról és milyen típusú rendellenességről van szó [137]. 1.1.3. Előző gyermek chromosoma-rendellenessége 1979-ben Milunsky 32.443 amniocentesis adatait gyűjtötte össze világméretű tanulmányában, és megállapította, hogy az előző gyermek aneuploidiája nem okoz

3

1. BEVEZETÉS

szignifikáns kockázatnövekedést a következő terhesség során [80]. Ennek ellentmond az 1984-es európai kollaboratív tanulmány, amely 2353 Down-syndromás eset adatai alapján megállapította, hogy a 30 évnél fiatalabb terhesek esetén a magzati chromosoma-rendellenesség kockázata mintegy 20-szorosára emelkedik abban az esetben, amennyiben az előző gyermek chromosoma-rendellenességben szenved. [115]. Az emelkedett kockázat feltételezhető okai a szülők gonadális mozaikossága, vagy strukturális chromosoma-rendellenessége, bizonyos exogén faktorok, vagy valamilyen jelenleg ismeretlen, monogénesen öröklődő, non-disjunctióra hajlamosító gén [84]. 1.1.4. Anyai szérum marker vizsgálat A 35 év feletti anyai életkor a magzati chromosoma-rendellenességek ismert rizikófaktora, azonban a terhespopuláció nagyságából adódóan a chromosomarendellenességben szenvedő gyermekek többsége 35 évnél fiatalabb anyáktól születik. Az USA-ban, Nagy-Britanniában és Kanadában a Down-syndromás gyermekek 7580%-a az 1970-es évek végén olyan 35 évnél fiatalabb anyától született, akiknél a negatív kórelőzmény miatt nem történt genetikai tanácsadás [2,129]. Ezen esetek egy részének megelőzésére alkalmasak a terhespopuláción végzett neminvazív szűrések, például az anyai szérum marker- és az ultrahang-szűrővizsgálatok [54,100,130]. A szűrővizsgálat nevében is benne van, hogy nem diagnosztikus célt szolgál, azaz egy átlagpopulációból kiszűri azokat az eseteket, amelyekben diagnosztikus vizsgálatra van szükség egy adott betegség szempontjából. A magzati chromosoma-rendellenességek, elsősorban a Down-syndroma szűrésére a következő szérum markerek alkalmasak: •

alfa-fetoprotein (AFP)

•

humán chorion gonadotropin (első trimeszterben a szabad β-hCG, második trimeszterben az össz β-hCG)

•

konjugálatlan oestriol (uE3)

•

inhibin-A (inhA)

•

pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A)

4

1. BEVEZETÉS

1.1.4.1. Anyai szérum marker szűrés a második trimeszterben Az AFP, a β-hCG és az uE3 markerek együttes vizsgálatát („triple teszt”) 1988-ban fejlesztették ki [129], majd 1996-ban egészítették ki az inhA vizsgálatával („quadteszt”) [28]. Tanulmányok tapasztalata szerint a „triple-teszt” a Down-syndromás terhességek 65%-ában [129], a „quad-teszt” 75%-ában pozitív [28] amellett, hogy egy átlagos terhespopuláció 5%-ában indikál amniocentesist. Megfelelő kockázatbecslési programmal a módszer alkalmasnak bizonyult az Edwards syndroma (18-as trisomia) szűrésére is, valamint a vizsgálat során levett vérminta alkalmas a velőcsőzáródási rendellenességek AFP általi szűrésére is [19]. Az AFP-t a második trimeszterben döntően a magzati máj termeli. Indirekt adatok arra utalnak, hogy Down-syndromában a magzati máj éretlensége miatt kevesebb AFP termelődik, valamint a lepényben észlelhető csökkent vascularisatio miatt kevesebb jut az anyai keringésbe. A magzati máj, a mellékvese, valamint a lepény termeli a fetoplacentalis uE3-t, amelynek szintje szintén alacsonyabb Down-syndroma esetén. A hCG biológiailag aktív formája a non-kovalens módon kötött alfa és béta alegységből felépülő heterodimer. A második trimeszterben az összes, tehát a dimer és a szabad βhCG szintje Down-syndroma esetén magasabbnak bizonyult az anyai szérumban. Az inhA-t a terhesség során szintén a méhlepény termeli nagy mennyiségben, biológiailag aktív, heterodimer formájának szintje emelkedett Down-syndromás esetekben. A négy marker együttes vizsgálata biztosítja jelenleg a leghatásosabb biokémiai Downsyndroma szűrést a 2. trimeszterben [129]. A normális terhességeknél a 15-20. hét között az AFP és az uE3 szintje erősen emelkedik, a β-hCG szintje csökken, az inhA viszonylag változatlan marad [129]. Mivel ezen szűk időszakban relatíve nagy változás történik a szérum markerek szintjében, az adott terhességi napra specifikus értékeket kell használni a kockázatbecslés során (MoM). A MoM érték alkalmazása függetleníti a vizsgálatot a pontos terhességi kortól. Az MoM értékek felhasználásával, statisztikai módszerrel (multivariábilis Gauss eloszlás analízis), validált számítógépes programmal végezhető el a kockázatbecslés [129]. A teszt során a következő fő szempontokat kell betartani: •

A mintát a terhesség 16. hetében kell levenni.

5

1. BEVEZETÉS

•

A pontos terhességi kort lehetőleg ultrahangos BPD, vagy CRL méréssel kell megállapítani, mivel a magzati femur és humerus Down-syndroma esetén rövidebb az átlagosnál [72].

•

Az anyai életkort és esetleges chromosoma-rendellenességben szenvedő gyermeket figyelembe kell venni a kockázatbecslésnél [130].

•

Anyai inzulin dependens diabetes mellitus, dohányzás és többes terhesség befolyásolhatja a biokémiai marker-szinteket [129].

A „triple/quad teszt” interpretációja genetikai tanácsadásonként változó lehet. Néhányan az 1/250 kockázatot veszik határértéknek [19,129], amely megfelel egy 37 éves terhes kockázatának. Mások az 1/380 határértéket alkalmazzák, amely egy 35 éves terhes Down-syndroma

kockázatának

felel

meg

[28].

Amennyiben

a

határérték

meghatározásában megegyezés születik, és a terhes kockázata azt meghaladja („pozitív szűrővizsgálat”), a genetikai tanácsadás során felmerül a magzat cytogenetikai vizsgálatának szükségessége. A „triple/quad teszt” irodalmi adatok szerint alkalmas a 18-as trisomia szűrésére is. Az AFP, a β-hCG és az uE3 MoM értékei alacsonyabbak a normál értékeknél. Mivel 18-as trisomia esetén a β-hCG MoM értéke a 21-es trisomiával ellentétben alacsonyabb a normál értéknél, az inhA szintje pedig nem mutat eltérést, a Down-syndroma szűrésére tervezett protokollok nem alkalmasak a 18-as trisomia szűrésére, ehhez külön kockázatbecslő programot kell használni [28]. 1.1.4.2. Anyai szérum marker szűrés az első trimeszterben A második trimeszterben történő szűrés elterjedése után kezdték vizsgálni a biokémiai marker-szűrés alkalmazási lehetőségét az első trimeszterben. Ennek előnye, hogy egy esetleges korai terhességmegszakítás a terhes szempontjából mind psychésen, mind a kockázatok szempontjából kedvezőbb. Az első trimeszterben végzett Down-syndroma szűrésre két biokémiai marker bizonyult alkalmasnak, a szabad β-hCG és a PAPP-A [49,130]. A szabad β-hCG szintje az első trimeszterben Down-syndroma esetén emelkedett, azonban önmagában alkalmazva szenzitivitása maximum 33%, 5%-os álpozitivitás mellett [49]. A PAPP-A a 8-13. terhességi hét között mérve Down-syndroma esetén alacsonyabbnak bizonyult (0,4

6

1. BEVEZETÉS

MoM) a normál értéknél. Önmagában alkalmazva szenzitivitása 45%, 5%-os álpozitivitás mellett [130]. A két szérum marker együttes vizsgálata mintegy 60%-os szenzitivitást teszt lehetővé [130]. Egy harmadik faktorral, a magzati tarkóredő (nuchal translucency=NT) vastagságának ultrahanggal történő mérésével kiegészített szabad βhCG és PAPP-A vizsgálat („kombinált teszt”) szenzitivitása eléri a 85%-ot úgy, hogy a vizsgált terhességek 5%-ában indikál invazív vizsgálatot [13]. Az első trimeszterbeli „kombinált teszt” hatékonysága így meghaladja a második trimeszterbeli „quad-teszt” hatékonyságát, azonban az NT pontos és standardizált mérése kulcsfontosságú a módszer megbízhatósága szempontjából, ezért a klinikai alkalmazás során fontos a folyamatos minőségellenőrzés és minőségbiztosítás [112]. 1.1.5. Ultrahangvizsgálat A legtöbb klinikailag jelentős magzati chromosoma-rendellenesség részletes ultrahangvizsgálat során észlelhető rendellenességgel jár. Ezek jelentős része már az első, illetve a második trimeszterben kimutatható. Az ebben a témában megjelent legtöbb publikáció azonban progresszív betegellátást végző intézetekből származik, így válogatott beteganyagra és nem az átlagpopulációra vonatkozik. Ezért nem vonható le következtetés arról, hogy egy adott eltérés milyen gyakorisággal jár valójában chromosoma-rendellenességgel. Lényeges a vizsgálatot végző szakember tapasztalata is; több tanulmány utal az ultrahang-vizsgálatok szubjektív értékelésére [112]. Az első trimeszterben a leggyakrabban előforduló chromosoma-rendellenességet jelző elváltozás a megvastagodott magzati tarkóredő (NT). Tanulmányok szerint a terhesség 11-14. hetében mérve megbízható jele az autosomalis trisomiáknak, a Turner és Klinefelter syndromának, valamint a triploidiának. 21-es trisomia esetén 75-80%-os szűrési hatékonyságot írnak le a módszer alkalmazásával [72] , bár az egészséges magzatok 5-10%-ánál is megvastagodott tarkóredő figyelhető meg [13]. Az álpozitív esetek aránya Spencer és mtsai 200-ben végzett összefoglaló tanulmányban 6%-nak bizonyult, és megállapították, hogy 3 mm-nél vastagabb tarkó redő esetén a 21-es trisomia előfordulásának kockázata 13-szorosa az átlagosnak. [112]. A jelenleg ajánlott protokoll szerint a genetikai tanácsadás 3 mm-nél vastagabb NT esetén indokolt [72]. Az NT mérésének azonban szigorú kritériumok szerint kell történnie, amelyek

7

1. BEVEZETÉS

alkalmazásáról és eredményeiről a multicentrikus FASTER (First and Second Trimester Evaluation of Risk) tanulmány számol be [130]. Az elmúlt években jelentek meg közlemények egy másik, első trimeszterben észlelhető gyanújelről, a magzati orrcsont hiányáról 21-es trisomia esetén. Az orrcsont a terhesség 11-14.

hete

között

a

chromosomálisan

egészséges

magzatok

99,5%-ában

ultrahangvizsgálat során látható. 21-es trisomia esetén az orrcsont hypoplasiás, és ezért a 21-es trisomiás magzatok 60-73%-ában az első trimeszterben nem látható. Egészséges magzatok esetén az orrcsont hiányának valószínűsége 0,3-0,6% [81]. Előrehaladottabb terhesség során a különböző chromosoma-rendellenességekhez egyéb, változatos eltérések társulhatnak [54]. A második trimeszterben észlelhető jelek közül leggyakrabban a ventriculomegalia (21es, 18-as, 13-as trisomia és triploidia), holoprosencephalia (18-as, és 13-as trisomia), plexus choroideus cysta (21-es és18-as trisomia), corpus callosum hiány (18-as, és 13-as trisomia), rövid frontális lebeny (21-es trisomia), fossa posterior rendellenességek (18as trisomia), eper alakú koponya (18-as trisomia), brachycephalia (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), súlyos micrognathia (18-as trisomia), szem- és orr rendellenességek (13-as trisomia), cysticus hygroma és non-immun hydrops (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), hernia diaphragmatica (18-as trisomia), szív rendellenességek (trisomiák és Turner syndroma), hyperechogén papilláris izom, oesophagus atresia (18-as trisomia), duodenum atresia (21-es trisomia), echogen belek (21-es trisomia), omphalocele (18-as és 13-as trisomia), rövidebb femur és a végtagok egyéb rendellenességei (21-es, 18-as, 13-as trisomia, Turner syndroma és triploidia), és intrauterin retardatio (18-as trisomia és triploidia) figyelhető meg [7,8]. A magzati symphysis-szög mérése a 21-es trisomia szűrésében 20% feletti álpozitivitása miatt jelenleg nem alkalmas önálló markerként [46], több markerrel kombinálva azonban értékes információt nyújthat [9].

1.2. Invazív mintavételi módszerek A genetikai diagnosztikus vizsgálatra alkalmas magzati mintavétel módjai a chorionboholy-mintavétel (CVS), a genetikai amniocentézis (GAC), és a vérvétel a magzati köldökzsinórból (percutan umbilical blood sampling=PUBS) [20,32].

8

1. BEVEZETÉS

1.2.1. Chorionboholy-mintavétel A CVS a terhesség mindhárom trimeszterében, legkorábban a 10-12. hét között alkalmazható magzati mintavételi technika. A behatolás 20 G-s spinál tűvel a hasfalon keresztül történik ultrahang-ellenőrzés mellett. 10-20 mg szövetminta nyerhető a méhlepényből, amely cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNSvizsgálatokra alkalmas [86,111]. Elsőként Kazy és mtsai alkalmazták az 1980-as évek elején [59]. A módszer alkalmazása az 1990-es évek elején átmenetileg visszaesett, mivel feltételezték, hogy összefüggésben állhat végtag-redukciós defektussal, illetve oromandibularis hypogenesissel [21,43]. A 10. terhességi hét után végzett CVS esetén a fenti rendellenességeket nem figyelték meg [21], ezért klinikánkon CVS vizsgálatot kizárólag a 10. terhességi hét után végzünk [88,89,90]. A transcervicalis és transabdominális behatolási lehetőségek közül napjainkban szinte kizárólag a transabdominális mintavételt alkalmazzák biztonságosabb volta miatt [6,89,90]. A módszer előnye, hogy az első trimeszterben is elvégezhető és a nyert minta direkt cytogenetikai vizsgálatával az eredmény a mintavételt követő 24 órán belül elkészül, így kóros esetben a terhesség megszakítása már az első trimeszterben elvégezhető. A módszer hátránya, hogy alkalmazása során a magzati veszteség mintegy kétszerese az amniocentesis során észleltnek (≈2%), valamint sem a direkt, sem a tenyésztéses módszer során vizsgálható mitózisok minősége és sávozhatósága nem éri el a magzatvíz preparátumokét [68]. A pseudo-mozaikosság kérdése, amely lényegesen gyakoribb, mint a magzatvízvizsgálatnál, nehezítheti a kiértékelést [51]. A magzati veszteség a módszer

alkalmazásával

beteganyagában

a

nemzetközi

tapasztalatokhoz

1,7%-nak

bizonyult,

végtag-redukciós

hasonlóan defektust,

klinikánk illetve

oromandibularis hypogenesist nem figyeltünk meg [88]. 1.2.2. Genetikai amniocentesis Az első magzatvízből végzett cytogenetikai vizsgálatokat az 1960-as években írták le [70,114,123]. A „klasszikus” (a terhesség 16-18 hete között végzett) genetikai amniocentesis azóta a magzati chromosoma vizsgálatok standard módszerévé vált [85], és mivel az 1980-as évek végén történt kísérletek a korai (10-14. hét közötti) amniocentesissel kevésbé váltak be [57], a középidős amniocentesis azóta is alapvető

9

1. BEVEZETÉS

fontosságú módszer a prenatális diagnosztikában [6]. Az eljárás során ultrahangellenőrzés mellett az amnionűrből egy 22G-s tűvel mintegy 10-20 ml magzatvizet veszünk, amely magzati eredetű sejteket tartalmaz. A minta cytogenetikai vizsgálatra, enzimaktivitás mérésére, illetve DNS-vizsgálatokra alkalmas. Mivel a magzatvízsejtek tenyésztése és cytogenetikai vizsgálata igen megbízható [105], valamint a beavatkozás szövődményeinek kockázata is alacsony (<1%), cytogenetikai vizsgálathoz elsősorban ezt a módszert alkalmazzuk [102]. Hátránya, hogy az eredményre a sejtek tenyésztése miatt mintegy két hetet kell várni, így kóros esetben a vetélésindukcióra -amennyiben azt a házaspár kéri- legkorábban a 18. héten kerülhet sor [6].

1. 3. A chromosoma-rendellenességek prenatális diagnosztikájának laboratóriumi módszerei 1.3.1. Cytogenetikai vizsgálat A chromosoma analízis hagyományos módszere a cytogenetikai vizsgálat során történő karyotypizálás, amely a metafázisban gátolt osztódó sejtek Giemsa (G-) sávozását követően fénymikroszkópos vizsgálattal történik [52,53] (2. ábra). a.

2. ábra:

b.

c.

a. tenyésztett magzatvízsejtek colchicinnel történt blokkolást és hypotonizálást követően b. egy sejthez tartozó metafázis c. 46, XX karyotypus (karyogram)

A magztavíz-minta nem tartalmaz osztódó sejteket, ezért minden esetben szükséges a sejtek tenyésztése. A prenatális karyotypizálás fejlődése során kevésbé kondenzált, jobban sávozható chromosomák nyerése vált lehetővé, valamint a sejttenyésztés ideje lerövidült. A számbeli chromosoma-rendellenességeken kívül jelenleg az 5 Mb méretnél

10

1. BEVEZETÉS

nagyobb deléciók, duplikációk és transzlokációk felismerésre lehetséges a rutin cytogenetikai vizsgálatok során [134]. 1.3.2. Molekuláris genetikai módszerek Az utóbbi évtizedekben a társadalmi igények változása és az idősebb életkorban gyermeket vállaló nők számának emelkedése miatt ugrásszerűen megnőtt az igény a prenatális diagnosztika iránt [77]. A vizsgálatok számának megemelkedése nagy megterhelést ró a cytogenetikai laboratóriumokra, amely igényt teremtett olyan automatizálható diagnosztikai módszer iránt, amely bizonyos esetekben helyettesítheti a hagyományos cytogenetikai vizsgálatot [134]. A cytogenetikai vizsgálat időigénye a másik oka azon molekuláris módszerek bevezetésének, amelyek nem igényelnek sejttenyésztést és ez által a vizsgálat rutinszerűen 1-2 napon belül elvégezhető. A két leggyakrabban alkalmazott molekuláris módszer a chromosoma-rendellenességek prenatalis kimutatására a fluorescens in situ hybridisatio (FISH) és a quantitativ fluoreszcens polimeráz láncreakció (QF-PCR). Mind a FISH, mind a QF-PCR alkalmazható a 21-es, a 18-as és a 13-as trisomia, valamint a nemi chromosomák rendellenességeinek (47,XXY, 47,XYY, 47,XXX, stb.) kimutatására [55]. Ezek a chromosoma-rendellenességek alkotják a chromosoma-rendellenességek 99%-át olyan terhességekben, amelyekben a magzati chromosoma-vizsgálat anyai életkor, gyanús ultrahang lelet, vagy az első és második trimeszterben észlelt szérum marker eltérés miatt történik. További újabb módszerek a comparatív genomiális hybridizáció (CGH) és a real-time PCR, amelyek azonban jelenleg még nem terjedtek el a magzati chromosoma-rendellenességek diagnosztikájában. 1.3.2.1. FISH A FISH módszer során fluoreszcens jelöléssel ellátott oligonukleotid probe-okat hybridizálunk a tárgylemezre korábban speciálisan rögzített interfázis- vagy metafázispreparátumokra. A probe-ok kötődnek a chromosomákon található komplementer DNSszakaszhoz és ezáltal fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálhatóak. Az aneuploidiák vizsgálata során interfázisban lévő sejteket használnak [125]. Normális esetben két fluoreszcens jel utal a chromosoma-párra, trisomia esetén három jel látható a sejtmagokban [55]. A 3. ábrán a 21-es trisomia FISH képe látható.

11

1. BEVEZETÉS

3. ábra: 21-es trisomia kimutatása interfázis FISH módszerrel. A DAPI magfestés kék színe előtt megfigyelhetőek a 21-es chromosomára

specifikus

vörös

„SpectrumOrange”

jelek,

amelyekből három ábrázolódik.

A módszer első leírása 1969-ben Pardue és Gall nevéhez fűződik, ők még radioaktív jelöléssel ellátott probe-okat alkalmaztak [93]. Napjainkban, kereskedelmi forgalomban kapható kitek (pl. Vysis AneuVysion® Assay Kit) segítségével fluoreszcens jelölésű probe-okkal lehetséges a 21-es, 18-as, 13-as és az X/Y chromosomák aneuploidiáinak a vizsgálata [124]. A vizsgálat során 1-2 ml magzatvízminta üledékéből származó sejteket speciális tárgylemezekre kell fixálni, majd a hybridizációt elvégezni. Az aneuploidiavizsgálathoz két lemezt szokás használni, az egyiken a 21-es és 13-as, a másikon a 18-as és az X/Y chromosomák vizsgálata történik [18,55]. Mind az előkészítés, mind a kiértékelés idő- és munkaigényes, de a mintavételt követő két-három napon belül általában rendelkezésre áll az eredmény. Az utóbbi években megjelentek az automatizált kiértékelést szolgáló software-ek (Applied Imaging, stb.), azonban ezek megbízhatóságáról és hatékonyságáról még nem áll rendelkezésre elegendő adat [104,116]. Az irodalomban összesen publikált FISH vizsgálatok száma jelenleg több mint 60.000, ennek alapján az álpozitivitás 1/30000-nek, az álnegativitás 1/4000-nek bizonyult [17,18,35,37,65,133,136]. A viszonylag nagy arányú álnegativitás oka elsősorban abban keresendő, hogy az anyai sejtekkel történő kontamináció során a magzati és az anyai sejtek nem különíthetőek el egymástól [36,116,135]. A másik probléma a magzati mozaicizmus [116]. Mivel a probe-ok nem 100%-os specificitásúak, normál minta esetén is a sejtmagok egy részében három szignál figyelhető meg. Emiatt több (25-50) sejtmag vizsgálata alapján kell egy mintát kiértékelni és az eredmény akkor tekinthető normálisnak, ha a hármas-szignált adó magok száma nem ér el egy küszöbértéket [17,18]. Mindez azonban gyakorlatilag lehetetlenné teszi az alacsony arányú mozaikosság kimutatását [119].

12

1. BEVEZETÉS

1.3.2.2. QF-PCR A PCR módszert 1985-ben Saiki és munkatársai írták le [107], majd 1987-ben Mullis és Faloona [82] fejlesztette tovább. 1989-ben a hőstabil DNS polymeráz (Taq) enzim bevezetésével [108] a módszer automatizálhatóvá vált, és forradalmasította a molekuláris biológiát. A módszer lényege a genomiális DNS-nek egy -a primerek által közrefogott szakaszának- in vitro megsokszorosítása. A reakció három lépés ismétlődéséből áll: •

Denaturáció: ≈95 °C-on a DNS kettős hélix komplementer szálai közötti hidrogénkötés felbomlik, a DNS egy szálúvá válik (ssDNS)

•

Primer hybridizáció (annealing): a primerek a komplementer DNS szakaszokhoz kötődnek. Ennek ideális hőmérséklete a primerek olvadási hőmérsékleténél (Tm) néhány fokkal alacsonyabb, általában 52-72 °C között van, a primer C-G tartalmától függően. A magasabb annealing hőmérséklet alkalmazása javítja a reakció specifikusságát, de csökkentheti a hatékonyságát.

•

Extenzió: a Taq enzim a bekötött primerek folytatásában, a reakcióelegyben található dNTP felhasználásával szintetizálja az adott DNS szakasz komplementer párját. A Taq enzim hőmérsékleti optimuma 72 °C körül van. Ezen a hőmérsékleten az enzim percenként 2 kb hosszúságú DNS-t szintetizál.

A reakcióelegy összetétele is befolyásolja a reakció működését. -

A reakciópuffer pontos összetétele gyártónként változik.

-

A Taq enzim optimális koncentrációja 1,0-1,25 U között van 100 µl elegyben. Túl magas enzimkoncentráció a reakció specificitását rontja, ami zavaró „háttér” termékek képződéséhez vezet. A reakció specificitását rontja az is, ha az enzim szobahőmérsékleten kerül a reakcióelegybe. Ekkor primer dimerek és egyéb aspecifikus termékek képződnek. Ezt küszöbölte ki régebben a „hot start”, amely során a Taq enzimet csak az annealing hőmérséklet elérése után adták a reakcióelegyhez. Napjainkban olyan blokkolt Taq enzimet (pl. AmpliTaq Gold®) használnak a nagy specificitást igénylő PCR-ekhez, amely csak 95 °C-on aktiválódik, és így a „hot start”-ot szimulálja, azonban lényegesen egyszerűbb az alkalmazása.

-

A dNTP-k koncentrációja általában 20-200 µM között van. Koncentrációjának csökkentése a specificitást növelheti.

13

1. BEVEZETÉS

-

A MgCl2 koncentrációja általában 0,5–2,5 mM között van, amelyet minden PCR reakcióhoz optimalizálni kell.

-

Az optimális primerkoncentráció 0,1–0,5 µM között van. A magasabb koncentráció csökkenti a specificitást. A primerek megtervezését a célszekvencia ismeretében számítógépes programok segítik. Az optimális primerhossz 18-28 bp, C-G tartalma 40-60% között van és legalább az egyik végén C/G-re végződik. A hossz és C-G tartalom alapján kiszámítható az olvadási hőmérséklet, amely az annealing hőmérséklet megválasztásában ad támpontot.

A QF-PCR módszer a PCR továbbfejlesztett változata. Előnye, hogy érzékenysége mintegy 1000-szerese a hagyományos PCR vizsgálatnak, a PCR termékek méretének pontos meghatározására alkalmas, valamint multiplex vizsgálat esetén könnyebben kiértékelhető, mint a hagyományos PCR [69]. 1993-ban Du és munkatársai írták le a PCR termékek szekvenálóval történő gyors és pontos meghatározását [31]. Mansfield és munkatársa 1993-ban ehhez fluoreszcensen jelölt primereket használt, amely az érzékenységet lényegesen megnövelte [74], ugyanabban az évben beszámoltak az első automatizált mikroszatellita tesztről [75]. Adinolfi és Mansfield munkacsoportja 1995-ben számolt be a módszer alkalmazásáról a 21-es trisomia kimutatása céljára [3]. 1994-ben Pertl és mtsai a 21-es trisomia 24 órán belüli meghatározását írták le magzatvízből, magzati szövetből és magzati vérből QF-PCR módszerrel [98]. Adinolfi és mtsai 1995-ben már 2-2 primer párt használtak a 18-as és 21-es trisomiák kimutatására, a módszer megbízhatóságának növelését érték így el [95]. Findlay és mtsai 1995-ben blastomerákból a nemi chromosomák és a cystás fibrosis deltaF508 mutáció QF-PCR módszerrel való meghatározásáról számoltak be [40], majd 1998-ban az allélvesztés (ADO) problémáját elemezték munkájukban [39]. 1998-ban klinikánkon Tóth és mtsai a 13-as trisomia magzatvízből történő QF-PCR módszerrel való meghatározását írták le [121], ezt követte a 21-es trisomia és a 18-as trisomia hasonló módszerrel való maghatározása [120]. Findlay és mtsai 1998-ban a leggyakoribb trisomiák, a 21-es, 18-as és 13-as meghatározásának lehetőségét a prenatalis diagnosztikában és preimplantatios diagnosztikában elemezték [41]. 1999-ben Pertl és mtsai 247 chorionboholyminta vizsgálata során sem téves pozitív, sem téves negatív eredményt nem kaptak a QF-PCR vizsgálatok során. A FISH módszernél megbízhatóbb

14

1. BEVEZETÉS

eljárásnak tekintik, sürgős esetben a cytogenetikai vizsgálat kiváltására is alkalmas módszernek javasolják [96]. 2001-ben Ogilvie munkacsoportja vezette be kifejezetten diagnosztikus célra a QF-PCR módszert a 21-es, 18-as és 13-as trisomia prenatalis kimutatására. Tanulmányukban 1148 magzatvíz- és 188 chorionboholy vizsgálatáról számolnak be. A vizsgálatok 98%-a volt informatív, 22 esetben (2%) a vizsgálat nem informatív eredménnyel járt. Álnegatív és álpozitív vizsgálatról nem számoltak be. A QF-PCR vizsgálatot önállóan javasolják az anyai életkor miatt végzett prenatalis diagnosztika során [73]. 2003-ban Leung és mtsai elemezték 235 magzatvízminta párhuzamos QF-PCR és cytogenetikai vizsgálata, valamint 1526 cytogenetikai vizsgálat indikációjának és eredményeinek retrospektív feldolgozásával azt, hogy milyen indikációk esetén pótolhatja a QF-PCR vizsgálat a cytogenetikai vizsgálatot. Eredményeik alapján a QF-PCR vizsgálatot alkalmasnak találták arra, hogy az anyai szérum marker szűrés pozitív eredménye esetén helyettesítse a cytogenetikai vizsgálatot [63]. Érzékenysége miatt a QF-PCR vizsgálat alkalmas egyetlen sejt vizsgálatára (single-cell PCR), amelynek a preimplantatiós genetikai diagnosztikában [48], valamint az anyai vérből dúsított, majd mikromanipulált magzati sejtek vizsgálatában van jelentőssége [10]. 2002-ben beszámoltunk a preimplantatiós genetika diagnosztika területén klinikánkon elért sikereinkről. A QF-PCR módszerrel chromosoma-specifikus ismétlődő úgynevezett „short tandem repeat” (STR) DNS szekvenciákat vizsgálunk. Az STR-eket az irodalom microsatellita néven is említi. Az STR-ek polimorfizmust mutatnak, tehát egyénenként változó hosszúságúak attól függően, hogy hányszor ismétlődik egy adott tri-, tetra-, vagy pentanukleotid egység [15,122]. A mendeli szabályok szerint öröklődnek, tehát az egyik allél anyai, a másik pedig apai eredetű. Az STR-ek első leírása Edwards és munkatársai nevéhez fűződik 1991-ben [33]. A DNS mintából a PCR amplifikációt fluoreszcens jelöléssel ellátott primerekkel végezzük, és a keletkezett PCR termékeket automata szekvenálóval mutatjuk ki. Az automata szekvenáló lehetővé teszi a PCR termékek méretének pontos meghatározását és mennyiségének összehasonlítását. Normál heterozygota (két különböző hosszúságú STR allélt hordozó) egyének esetében a vizsgálat során két eltérő méretű terméknek megfelelő csúcs látható, amelyek közel azonos magasságúak. Az STR-ek PCR amplifikációjának szemléltetése a 4. ábrán látható.

15

1. BEVEZETÉS

AATG

7 ismétlődő egység

8 ismétlődő egység 4. ábra: Az STR-ek ismétlődő tetranukleotid egységek. A piros és kék négyszögek a példaként vett AATG ismétlődő szekvenciákat jelzik. A kék nyilak a primereket jelzik, a zöld csillag a forward primer fluoreszcens jelölésére utal.

A trisomiás egyénektől származó minta vizsgálata során három azonos méretű csúcs látható (triallélikus), vagy csak két csúcs, amelyek közül azonban az egyik kétszer akkora, mint a másik (diallélikus). Ezt a 5. ábra szemlélteti. a.

5. ábra:

b.

c.

a: normál mintázat esetén két csúcs 1:1 aránya figyelhető meg b: triallélikus mintázat esetén három csúcs 1:1:1 aránya figyelhető meg c: diallélikus mintázat esetén két csúcs 2:1 aránya figyelhető meg

Az STR markerek homozygotasága esetén csak egy csúcs figyelhető meg, ekkor neminformatív vizsgálati eredményről beszélünk. Ha egyszerre több marker vizsgálatát végezzük el, a nem-informatív eredmények aránya csökken. A markerek vizsgálata szimultán módon történhet multiplex PCR vizsgálat során. A QF-PCR módszer alkalmazása során figyelték meg az allélvesztés (allele drop-out ADO) jelenségét [39,47]. Az allélvesztés kis kiindulási mennyiségű DNS-ből történő heterozygota locusok PCR amplifikációja során figyelhető meg. A preferenciális amplifikáció során a primerek jobban kötődnek a heterozygota allélpár egyik tagjához,

16

1. BEVEZETÉS

és emiatt ezen allél PCR terméke lényegesen nagyobb mennyiségben szaporodik fel, mint az allélpárjáé. Amennyiben a preferenciális amplifikáció során a két termék mennyisége közötti különbség oly nagy mértékű, hogy az egyik termék nem detektálható, allélvesztésről beszélünk [39]. Az allélvesztés jelensége monogénes betegségek PCR diagnosztikája esetén a téves diagnózishoz vezethet, az STR markerek vizsgálata esetén pedig a nem informatív esetek számát emelheti. Az allélvesztés előfordulása függ a kiindulási DNS kópiaszámtól, illetve az izolált DNS mintában található szennyezőanyagoktól, amelyek gátolhatják a PCR-t [39,47]. A QF-PCR vizsgálathoz minimális mennyiségű minta szükséges, 1 ml magzatvízből, vagy 1-2 chorionboholyból izolált DNS elegendő. Lényegesen gyorsabb, mint a FISH vizsgálat, eredménye akár 4 órával a mintavétel után készen lehet, és mivel a módszer automatizálható, nagy mennyiségű minta gyors vizsgálatára alkalmas [55]. Klinikánk genetikai laboratóriumában a világon az elsők között alkalmaztuk rutinszerűen a módszert chromosoma-rendellenességek kimutatására. Az elmúlt években a QF-PCR módszer a cytogenetikai vizsgálat fontos kiegészítőjévé vált, és értekezésemben a módszer alkalmazása során nyert tapasztalataimat dolgozom fel. 1.3.2.3. Comparatív genomiális hybridizáció (CGH) A CGH módszert 1992 óta alkalmazzák chromosoma-rendellenességek kimutatására, különösen a tumorgenetika területén [60]. Az eljárás során DNS-t izolálnak a vizsgálandó mintából, valamint egy egészséges kontroll mintából. A két mintát ezt követően zöld és piros (FITC és Texas Red) fluorochrommal jelölik és egy tárgylemezre fixált referencia chromosoma-preparátumhoz hybridizálják egyenlő mennyiségben összekeverve. A hybridizáció után a mikroszkópos kép számítógépes kiértékelése történik, amely során az adott chromosoma hiánya/deléciója esetén a kontroll minta színének irányába történő eltolódás, többlet/duplikáció esetén a vizsgálandó minta színének irányába történő eltolódás jelez (6. ábra). A deléciók, illetve duplikációk kimutathatóságának mérete 1 Mb, és a vizsgált szövet sejtjeinek legalább 50%-ában jelen kell lennie az eltérésnek ahhoz, hogy a CGH módszerrel kimutatható legyen.

17

1. BEVEZETÉS

6. ábra: 13-as trisomiára jellemző kép CGH vizsgálat során. A vizsgálandó minta zöld jelölésének irányába történő színeltolódás chromosoma többletre utal. Forrás: Marton T. és mtsai 2001.

A microarray technológiával kombinált CGH vizsgálat előnye, hogy a cytogenetikai vizsgálathoz hasonlóan valamennyi chromosoma szimultán vizsgálatára alkalmazható és nem igényel élő, osztódó sejteket, tehát akár archivált anyag vizsgálatára is alkalmas. Hátránya a költségessége és munkaigényessége. Főként ezen utóbbi okok miatt a prenatális diagnosztikában eddig nem terjedt el és kevés közlemény jelent meg a módszer prenatális alkalmazásával kapcsolatban [29,67]. 1.3.2.4. Real-time PCR A real-time PCR módszer segítségével a keletkezett PCR termékek mennyisége minden ciklusban folyamatosan vizsgálható. A hagyományos PCR módszerrel szembeni előnye a gyorsasága, teljes automatizálhatósága és az, hogy a keletkezett termékek abszolút quantitatív vizsgálata végezhető el általa. Az utóbbi években a módszer széles körben elterjedt a génexpressziós vizsgálatokban, illetve pontmutációk kimutatásában [5]. 2002-ben jelent meg az első közlemény a real-time PCR alkalmazásáról 21-es trisomia kimutatása céljára [138]. A módszer alapja a 21 chromosoma Down syndroma kritikus régiójában (DSCR) lévő amyloid gén quantitatív amplifikációja egy referencia génnel, a 12. chromosomán lokalizált glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenáz (GADPH) génnel párhuzamosan. A vizsgálat során a küszöb-ciklusszám változásával 10 esetből 9 esetben mutatták ki a 21-es trisomiát és 11 euploid kontrollból 9 esetben mutatták ki az euploidiát. Egy másik vizsgálat során 6 különböző, a 21-es chromosomán található pontmutáció (SNP) olvadáspont analízisét végezték el 52 esetben 21-es trisomiás, és 59 negatív kontroll mintán. A quantitatív analízis során 52 pozitív esetből 50-ben volt kimutatható a 21-es trisomia, míg az 59 negatív kontrollból 49 volt egyértelműen negatív. Bár a módszer még további vizsgálatokat igényel, adaptálható egyéb chromosomák vizsgálatára is, és egy teljesen automatizálható, egyszerű diagnosztikus módszer lehetőségét hordozza magában. A módszer érzékenysége miatt alkalmazható a

18

1. BEVEZETÉS

preimplantatiós genetikai diagnosztikában, illetve alkalmas az anyai szérumból izolált magzati DNS vizsgálatára is, amely a nem-invazív prenatális genetikai diagnosztika legígéretesebb területe.

19

2. CÉLKITŰZÉSEK

2. Célkitűzések 1. Az QF-PCR módszer megbízhatóságának vizsgálata a gyakori chromosomarendellenességek

magzatvízsejtekből

és

chorionboholymintákból

történő

kimutatásában. a. A normál minták vizsgálati eredményeinek értékelése. b. A 21-es, 18-as és 13-as trisomia kimutatásának elemzése. c. A magzati nemmeghatározás eredményeinek áttekintése. d. A mozaikosságnak a QF-PCR vizsgálat eredményeire gyakorolt hatása. e. Az anyai vérrel történő kontaminációnak a QF-PCR vizsgálat eredményeire gyakorolt hatása. 2. Az

alkalmazott

STR

markerek

alléleloszlásának

vizsgálata

klinikánk

beteganyagában. 3. Azon indikációs területek meghatározása, amelyben a magzatvíz/chorionboholy minták QF-PCR vizsgálata biztonságosan alkalmazható, mint önálló vizsgálat. 4. A QF-PCR vizsgálat egyéb alkalmazási lehetőségeinek vizsgálata. a. A QF-PCR módszer alkalmazhatóságának vizsgálata a számfeletti chromosomaszerelvény eredetének meghatározására triploidiában. b. A QF-PCR módszer alkalmazhatóságának vizsgálata uniparentalis disomia eseteiben. 5. A allélvesztés (ADO) csökkentésére alkalmas lehetőségek vizsgálata

20

3. ANYAG ÉS MÓDSZER

3. Anyag és módszer 3.1. Chorionboholyminták A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Genetikai Tanácsadásán 2001. januártól 2004. júliusig 146 terhesnél végzett chorionboholymintavétel során nyert magzati mintán végeztünk párhuzamos cytogenetikai és QF-PCR vizsgálatot. Az összesen 20-40 µg mintából 1-2 chorionbolyhot DNS izolálás céljára, a többit cytogenetikai vizsgálatra használtunk fel. A két módszert egymástól függetlenül értékeltük ki, majd az eredményeket összehasonlítottuk. A terhesek átlagéletkora a chorionboholy mintavétel időpontjában 32,1 ± 2,5 év, az átlagos gestatiós kor 11,3 ± 1,1 hét volt. A terhesek a beavatkozás és a vizsgálat előtt részletes tájékoztatást követően a beavatkozásra vonatkozó “Kérelem és beleegyező nyilatkozat”-ot írtak alá.

3.2. Magzatvízminták A Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Genetikai Tanácsadásán 1999. januártól 2004. júliusig 4850 terhesnél végzett 4875 amniocentesis során nyert magzatvízmintán (25 ikerterhesség) végeztünk cytogenetikai vizsgálatot és QF-PCR vizsgálatot. Az összesen 10-12 ml magzatvízből 1,5 ml-t DNS izolálás céljára, a többit cytogenetikai vizsgálatra használtunk fel. A két módszert egymástól függetlenül értékeltük ki, majd az eredményeket összehasonlítottuk. A terhesek átlagéletkora az amniocentesis időpontjában 36,1 ± 2,5 év, az átlagos gestatiós kor 18,2 ± 2,7 hét volt. A terhesek a beavatkozás és a vizsgálat előtt részletes tájékoztatást követően a beavatkozásra vonatkozó “Kérelem és beleegyező nyilatkozat”-ot írtak alá.

3.3. Műszerek Molekuláris genetikai vizsgálat: ABI 310 Genetic Analyzer

Applied Biosystems, Foster City, CA. USA

GeneAmp 9700 PCR System


Genetic Analyzer kapilláris 47cm X 50µm Applied Biosystems, Foster City, CA. USA Laminar Airflow Series 3

Nuaire Plymouth, MN. USA

Mikrocentrifuga Microfuge E

Beckman Instruments, Providence, RI. USA

21


Mikrocentrifuga Z 160 M

Hermle, Gosheim, Germany

Pipetták Proline 10, 50, 200, 1000

Biohit, Helsinki, Finland

Rázógép REAX 2000

Heidolph, Schwabach, Germany

Vízfürdő Dri-Block DD-2A

Techne, Cambridge, UK

Cytogenetikai vizsgálat: IG150 CO2 Inkubátor

Jouan, Winchester, VA. USA

MSC 9 Laminar Airflow

Jouan, Winchester, VA. USA

4-15 Centrifuga

Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA

Wilovert S invert mikroszkóp

Hund Wetzlar, Wetzlar, Germany

Leica DMLB mikroszkóp

Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany

Chantal Chromosome Karyotype Software Leica Imaging AG, Wetzlar, Germany

3. 4. Reagensek Molekuláris genetikai vizsgálat: ABI Prism puffer (EDTÁ-val)


AmpliTaq Gold DNS polimeráz


dNTP

Promega, Madison, WI. USA

Formamid

Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA

GeneScan 500-TAMRA méretmarker


POP4 gél


ReadyAmp Genomic Purification System

Promega, Madison, WI. USA

High Pure PCR Template Isolation Kit

Roche, Mannheim, Germany

Cytogenetikai vizsgálat: Chang Medium

Irvine Scientific, Santa Ana, CA. USA

KCl (0,075 M, GIBCO)

Invitrogene, Carlsbad, CA, USA

Colchicin


Methanol (analítikai tisztaságú)

Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Ecetsav (99-100%)

Acidum-2 Kft, Debrecen, Hungary

Tripszin

Difco Laboratories, Detroit, Mi. USA

22


Giemsa festék


Entellan

Merck KGaA, Darmstadt, Germany

3. 5. Fluoreszcens jelöléssel ellátott “forward” és jelöletlen “reverse” oligonukleotid primerek (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA. USA) Amel A, oligo 24-mer

5’-TET-ccc tgg gct ctg taa aga ata gtg-3’

Amel B, oligo, 24-mer

5’atc aga gct taa act ggg aag ctg-3’

D21S11/F1 oligo, 22-mer

5’-TET-tgt att agt caa tgt tct cca g-3’

D21S11/R1 oligo, 22-mer

5’-ata tgt gag tca att ccc caa g-3’

D21S1411/F oligo, 22-mer

5'-TET-tga tga atg cat aga tgg atg g-

D21S1411/R oligo, 21-mer

5'-cta tgg gcc cag aaa aca act-3'


5’-TET-cgg agg ttg cag tga gtt g-3’


5’-ggg aag gct atg gag gag a-3’


5’-FAM-caa acc cga cta cca gca ac-3’

D18S51/R1 oligo 20-mer

5’-gag cca tgt tca tgc cac tg-3’

D18S851F oligo-24-mer

5'-FAM-cac aca caa aca tct ctt tct atc-3'

D18S851 R oligo-20-mer

5'-tta tga agc agt gat gcc aa-3'

D13 S631/F1 oligo, 20-mer

5’-HEX-ggc-aac-aag-agc-aaa-act-ct-3’

D13 S631/R1 oligo, 19-mer

5’-tag-ccc-tca-cca-tga-ttg-g-3’


5’-HEX-acc tgc caa att tta cca gg-3’


5’-gac-aga-gag-agg-gaa-taa-acc-3’

3. 6. Felhasznált számítógépes programok Excel 2002 Software – Microsoft Corporation, Seattle, WA, USA

23


SPSS for Windows v. 11.0.0. – SPSS Corporation, USA GeneScan Analysis Software version 2.1 - Applied Biosystems, Foster City, CA. USA

3. 7. Módszerek 3.7.1. Cytogenetikai vizsgálat Klinikánk

cytogenetikai

laboratóriumában

a

cytogenetikai

vizsgálatokat

a

magzatvízsejtek in situ eljárással történő tenyésztését követően végezzük el. Az eljárás során 10 ml magzatvízmintát 1000 G fordulatszámon 10 percig centrifugálunk, majd az üledéket

Chang

B+C

tápfolyadékban

reszuszpendáljuk.

A

sejtszuszpenziót

petricsészékbe pipettáztuk, amelyek alján 22X22 mm-es fedőlemezek vannak. A petricsészéket 37°C-on 5%-os CO2 koncentráció mellett inkubáljuk 6 napig, majd a tápfolyadék cseréje következik. Ezt követően a tápfolyadék kétnaponta történő cseréjével további inkubálás következik mindaddig, amíg invert-mikroszkóppal vizsgálva megfelelő mitózisokat nem látunk. A metafázisokra 0,1 mg/ml colchicint cseppentve, majd 37°C-on 1,5 óráig inkubálva a sejtosztódást metafázisban blokkoljuk. A sejteket 0,075 mmol-os KCl-oldattal 37°C-on 12-20 percig inkubálva hypotonizáljuk, majd methanol-ecetsav 3:1 arányú keverékével fixáljuk. 24 órás száradást követően ASG sávozást végzünk 5%-os tripszines emésztést követő Giemsa festéssel. A fedőlemezeket entellánnal tárgylemezre montírozzuk, majd fénymikroszkóppal 100X-os nagyítással értékeljük. A kiértékelés során 15-20, más-más kolóniából származó metafázis vizsgálatát végezzük el. 3.7.2. QF-PCR vizsgálat A QF-PCR módszerrel a 3.5. pontban felsorolt STR markereket vizsgáltuk. A Genomic Database-ből [125,126] kiválasztott markerek alkalmazása 1997 óta történik klinikánk genetikai laboratóriumában. A nemmeghatározás az amelogenin gén amplifikációjával történt. A gén az X és az Y chromosomán helyezkedik el (Xp22.31-p22.1 és Yp11.2), de az Y chromosomán 6 bázispárral hosszabb formában, azaz amikor csak egy 103 bp hosszúságú terméket mutatunk ki, a magzat neme leány, amennyiben a 109 bp hosszúságú termék is kimutatható, a magzat neme fiú.

24


Három, a 21-es chromosomán, valamint két-két, a 18-as és 13-as chromosomán elhelyezkedő STR-t vizsgáltunk. A markerek chromosomalis lokalizációját az 1. táblázatban foglalom össze. 1. táblázat: A vizsgált markerek chromosomalis lokalizációja Marker

Chromosomalis lokalizáció

D21S11

21q21-21q21

D21S1411

21pter-21qter

D21S1412

21pter-21qter

D18S51

18q21.33-18q21.33

D18S851

18pter-18qter

D13S258

13q21.2-13q31

D13S631

13q31-13q32

3.7.2.1. DNS izolálás chorionboholymintából A DNS izolálását két különböző módszerrel végeztük. 1998-2004 között a DNS izolálást ReadyAmp kit-tel, a használati útmutató szerint, módosításokkal végeztük. A natív chorionboholymintából egy-két bolyhot eltávolítottunk, majd 1 ml desztillált vízzel átmostuk és lecentrifugáltuk. Ezt követően 500 µl desztillált vízzel szobahőmérsékleten 10 percig forgattuk, majd újabb centrifugálás következett 5 percig 8000 rpm-mel. A felülúszó eltávolítása után az üledéket 100 µl resinben szuszpendáltuk, majd 20 percig 56 °C-on, majd keverés után 8 percig 95 °C-on inkubáltuk. Ezt 2 perces centrifugálás követte 8000 rpm-en. Az izolált DNS a felülúszóban található. Későbbi felhasználás esetén a minta 4 °C-on tárolható és felhasználás előtt lecentrifugálandó. 2004-től a High Pure PCR Template Isolation Kit-et alkalmaztuk a használati útmutató szerint, módosításokkal. Az amniocentesis során nyert 10-12 ml minta 1,5 ml-es alliquotját Eppendorf csőbe pipettáztuk, majd éjszakára 200 µl lízis puffer és 40 µl proteináz K oldattal 55 °C-on inkubáltuk. A további lépések a használati útmutató szerint történtek, a DNS-t 60 µl pufferben oldottuk fel.

25


3.7.2.2. DNS izolálás magzatvízmintából A

DNS

izolálás

a

magzatvízmintákból

ReadyAmp

kit

felhasználásával

a

chorionboholymintából történő izoláláshoz hasonlóan történt. Az amniocentesis során nyert 10-12 ml minta 1,5 ml-es alliquotját Eppendorf csőbe pipettáztuk, majd ezt közvetlenül, vagy fagyasztva tárolást (-24 °C) követően 8000 rpm fordulatszámon centrifugáltuk. Az üledéket 1 ml desztillált vízzel mostuk és ismételten centrifugáltuk. Ezt követően 500 µl desztillált vízzel szobahőmérsékleten 10 percig forgattuk, és innentől a chorionboholyból történő DNS izolálással megegyezően jártunk el. A DNS izolálás a magzatvízmintákból a High Pure PCR Template Isolation Kit felhasználásával

a

chorionboholyból

történő

izoláláshoz

hasonlóan,

1

ml

magzatvízminta felhasználásával történt. 3.7.2.3. Polimeráz láncreakció A 3.5. pontban felsorolt fluoreszcens jelöléssel ellátott primereket használtuk fel. A 21es és a nemi chromosomákon elhelyezkedő STR markerek primerjei TET (zöld) jelöléssel, a 18-as chromosomán elhelyezkedő STR markerek primerjei FAM (kék) jelöléssel és a 13-as chromosomán elhelyezkedő STR markerek primerjei HEX (sárga) jelöléssel lettek ellátva. A multiplex PCR-t két külön PCR csőben (4-4 primer pár) 25 µl térfogatban végeztük. A reakcióelegy a következő összetételű volt: 2,5 µl izolált DNS, 200 µM minden egyes dNTP-ből, 5 pmol minden egyes primerből, l,5 mM MgCl2, és 0,6 U AmpliTaq Gold. A reakcióelegyen a következő PCR ciklusokat hajtottuk végre: 95 °C

10 perc

Kezdeti denaturáció

95 °C

30 mp

Denaturáció

56 °C

45 mp

Annealing

72 °C

60 mp

Extenzió

60 °C

30 perc

Végső extenzió

4 °C

kivételig

Tárolás

26

32X


3.7.2.4. A PCR termékek detektálása Az egy mintához tartozó 2-2 PCR termékből 2-2 µl-t 20 µl formamiddal és 1,0 µl TAMRA jelöléssel ellátott méretmarkerrel mértünk össze, majd 95 °C-on denaturáltuk és 4 °C-ra hűtöttük. Az elektroforézist ABI 310 kapilláris szekvenálóval 25 percig végeztük POP4 gél felhasználásával, 15 kV feszültségen és 62 oC hőmérsékleten. Az adatgyűjtést ABI PRISM 310 Collection software-rel végeztük. 3.7.2.5. A PCR termékek kiértékelése A termékek méretének és relatív mennyiségének analízise GeneScan Analysis 3.7 software-rel történt. A trisomiás esetek megállapítása az adott chromosomán elhelyezkedő STR markerek csúcsainak száma, és a csúcsok alatti területek hányadosának kiszámításával történt. 3.7.3. Statisztikai értékelés A termékek méretének és mennyiségi arányainak kiértékelését Microsoft® Excel programmal a statisztikai számítást SPSS for Windows v. 11.0.0 programmal végeztük. A specificitás és szenzitivitás számítása az alábbi képlet alapján történt: A keresett rendellenesség fennáll

nem áll fenn

A vizsgálat

+

a

b

eredménye

-

c

d

Szenzitivitás = a/(a+c) Specificitás = d/(b+d)

27

4. EREDMÉNYEK

4. Eredmények 4.1. A QF-PCR módszer és a cytogenetikai vizsgálat eredményeinek összehasonlítása A 4875 magzatvízmintán és 146 chorionboholymintán elvégezett QF-PCR vizsgálat és cytogenetikai

vizsgálat

egymástól

függetlenül

került

kiértékelésre,

majd

az

eredményeket összehasonlítottuk. A 7. ábrán egy egészséges fiú magzat karyogramja (46,XY) látható, a 8. ábrán ugyanezen minta QF-PCR vizsgálat során kapott elektroforetogramja látható.

7. ábra: Normál 46,XY karyogram

Amelogenin

D21S11 D18S51

D18S851 D21S1411 D13S631

D13S258

D21S1412

8. ábra: Normál 46,XY karyotypusú magzatvízminta QF-PCR elektroforetogramja. Feliratok

jelölik, hogy melyik csúcs melyik markernek felel meg. Az egy markerhez tartozó 1:1 arányú két csúcs az adott chromosoma euploidiáját jelzi.

28

4. EREDMÉNYEK

A 9. ábrán egy 21-es trisomiás leánymagzat karyogramja látható (47,XX+21), a 10. ábrán egy 21-es trisomiás magzatvízminta elektroforetogramja van, amely esetén az első STR marker diallélikus, a második és harmadik STR marker triallélikus mintázatot mutat.

9. ábra: 47,XX+21 karyogram

D21S11

D21S1411 D21S1412

10. ábra: 47,XX+21 karyotypusú magzat mintájának elektroforetogramja. A D21S11 marker diallélikus mintázatot mutat 1:2 aránnyal, a D21S1411 és D21S1412 markerek triallélikus mintázatot mutatnak (1:1:1 arány).

29

4. EREDMÉNYEK

A 11. ábrán egy 47,XY+18 karyotypusú magzat karyogramja látható, a 12. ábrán az ennek megfelelő QF-PCR elektroforetogram, amely az egyik STR diallélikus, a második triallélikus mintázatot mutat.

11. ábra: 47,XY+18 karyogram

D18S51

D18S851

12. ábra: 47,XY+18 karyotypusú magzat QF-PCR elektroforetogramja. A D18S51 marker diallélikus mintázatot (2:1 arány), a D18S851 marker triallélikus mintázatot (1:1:1 arány) mutat.

30

4. EREDMÉNYEK

A 13. ábrán egy 47,XX+13 karyotypusú magzat karyogramja látható, a 14. ábrán az ennek megfelelő QF-PCR elektroforetogram, amely az egyik STR diallélikus, a második triallélikus mintázatot mutat.

13. ábra: 47, XX+13 karyogram

D13S258

D13S631

14. ábra: 47,XX+13 karyotypusú magzat mintájának elektroforetogramja. A D13S258 marker diallélikus mintázatot mutat 2:1 aránnyal, a D13S632 marker triallélikus mintázatot (1:1:1 aránnyal) mutat.

31

4. EREDMÉNYEK

A 15. ábrán a triploid (69,XXX) magzattól származó metafázis látható, a 16. ábrán ugyanezen magzati minta elektroforetogramja látható.

15. ábra: 69,XXX karyotypus

16. ábra: Triploid (69,XXX) karyotypusú magzat mintájának elektroforetogramja. A 21-es, 18as és 13-as chromosoma STR markerei mindhárom chromosoma esetén aneuploidiára utalnak.

4.1.1. Normál minták értékelése A QF-PCR módszer alkalmazása során 4791 magzatvízmintán (98,3%) és 142 chorionboholymintán (97,3%) bizonyultak a vizsgált STR markerek valamennyi vizsgált chromosoma esetén informatívnak. A cytogenetikai vizsgálat eredményeivel összehasonlítva álpozitív eredményt nem figyeltünk meg. A vizsgált STR markerek 84 magzatvízminta (1,7%) és 4 chorionboholyminta (2,7%) esetében homozygota formában voltak jelen valamelyik vizsgált chromosomán, tehát az adott chromosomára

32

4. EREDMÉNYEK

vonatkozóan nem informatív eredményt adtak. A cytogenetikai vizsgálat során ezen minták egyike sem bizonyult az adott chromosomára nézve rendellenesnek. 4.1.2. Aneuploidiák kimutatása chorionboholymintákból A 146 chorionboholymintán elvégzett cytogenetikai és QF-PCR vizsgálat kilenc chromosoma-rendellenességet mutatott ki. Mindkét vizsgálat során 4 esetben 21-es, 3 esetben 18-as és 1 esetben 13-as trisomiát, valamint 1 esetben 47,XXY karyotypusú magzatot mutattunk ki. A 21-es, 18-as és 13-as trisomiák kimutatásában a QF-PCR vizsgálat 100%-os szenzitivitást és specificitást mutatott. Ebben a vizsgálati anyagban nem észleltem a QF-PCR vizsgálattal nem kimutatható chromosoma-rendellenességet. Az eredményeket a 2. táblázatban foglalom össze. 2. táblázat: Chromosoma-rendellenességek előfordulása a 146 chorionboholyminta vizsgálata során Cytogenetikai vizsgálat

QF-PCR

A QF-PCR

n=146

n=146

hatékonysága

21-es trisomia

4

4

100%

18-as trisomia

3

3

100%

13-as trisomia

1

1

100%

47, XXY

1

1

100%

Összesen

9

9

100%

4.1.3. Aneuploidiák kimutatása magzatvízmintákból A 4875 magzatvízmintán elvégzett cytogenetikai és QF-PCR vizsgálat 92 esetben 21-es, 26 esetben 18-as és 12 esetben 13-as trisomiás magzatot mutatott ki. Ezen kívül 3 esetben triploidiát, 9 esetben 47,XXY és 6 esetben 47,XYY karyotypusú magzatot találtunk. Egy mozaik 21-es trisomiás és két mozaik 18-as trisomiás esetben a QF-PCR vizsgálat eredménye álnegatívnak bizonyult. A nem-mozaik 21-es, 18-as és 13-as trisomiák kimutatásában a QF-PCR vizsgálat 100%-os szenzitivitást és specificitást mutatott. Két esetben találtunk a QF-PCR vizsgálattal a cytogenetikai vizsgálat során transzlokációs típusúnak bizonyuló 21-es trisomiát. Az egyik esetben a 46,XX,t(11;21), karyotypus a más intézetben CVS mintából végzett direkt cytogenetikai vizsgálat során

33

4. EREDMÉNYEK

nem került felismerésre. A cytogenetikai vizsgálat 46 esetben mutatott ki olyan chromosoma-eltérést, amely kimutatására a QF-PCR módszer a vizsgált markerekkel nem alkalmas. A QF-PCR vizsgálattal nem kimutatható chromosoma-eltérések közül a kiegyensúlyozott transzlokációk esetében a fenotípusban nem várható eltérés. A 47,XXX és a 48,XXXX karyotypus szintén enyhe fenotípus eltérésekkel jár [1,48,66], így a QF-PCR vizsgálattal fel nem ismert, klinikailag jelentős chromosomarendellenességek száma 28. A 28 eset között 10 esetben szerepel 45,X0, 6 esetben egyéb aneuploidia (mozaik 20-as és mozaik 16-os trisomia), 3 esetben mozaik trisomia és 8 kiegyensúlyozatlan transzlokációs eset. A kimutatott rendellenességeket és a két módszer eredményeit a 3. táblázatban hasonlítom össze. 3. táblázat: A magzatvízmintákon végzett cytogenetikai vizsgálatok és a QF-PCR vizsgálatok eredményeinek összehasonlítása Cytogenetikai

QF-PCR

A QF-PCR

vizsgálat (n=4875)

(n=4875)

hatékonysága

21-es trisomia

92

92

100%

18-as trisomia

26

26

100%

13-as trisomia

12

12

100%

Triploidia

3

3

100%

47, XXY

9

9

100%

47, XYY

6

6

100%

45, X0

10

-

0%

47, XXX* / 48,XXXX*

6

-

0%

Egyéb aneuploidia

6

-

0%

Mozaik (21-es és 18-as trisomia)

8

5

62,5%

12

-

0%

-

0%

Transzlokáció

Kiegyensúlyozott*

Kiegyensúlyozatlan 8

Összesen

198

153

77,3%

Klinikailag jelentős eltérések

184

153

83,2%

* Klinikailag nem jelentős chromosoma-rendellenességek

34

4. EREDMÉNYEK

A trisomiák triallélikus mintázata esetén a QF-PCR vizsgálat eredménye egyértelmű. Normál minták esetén a két csúcs aránya elméletileg 1:1, a diallélikus trisomiás mintázat esetén a trisomiára a két csúcs elméleti 1:2 aránya utal. A normál minták elemzése során ez az arány a gyakorlatban 1:1-1:1,6 között változott. 1:1,5 „cut off” érték használatával álnegatív eredmény nem volt és 5 álpozitív eredményünk volt. 1:1,7 „cut off” értéket alkalmazva nem fordult elő álpozitív eset, azonban egy álnegatív esetet (mozaik 47,XX+21) észleltünk. A normál és trisomiás minták esetén a diallélikus minták esetén megfigyelhető területi arányokat a 4. táblázatban foglalom össze. 4. táblázat: Az STR marker-csúcsok területeinek arányai normál és diallélikus trisomiás minták esetén Marker

A csúcsok területeinek arányai

A csúcsok területeinek arányai

normál mintákban (±SD)

diallélikus trisomiás mintákban (±SD)

D21S11

1,114 ± 0,122

1,922 ± 0,191

D21S1411

1,132 ± 0,151

1,961 ± 0,211

D21S1412

1,146 ± 0,161

1,895 ± 0,182

D18S51

1,125 ± 0,132

1,974 ± 0,213

D18S851

1,163 ± 0,150

1,923 ± 0,202

D13S258

1,122 ± 0,149

1,974 ± 0,153

D13S631

1,164 ± 0,157

1,913 ± 0,125

4.1.4. Magzati nemmeghatározás chorionboholymintákból A

146

chorionboholyminta

cytogenetikai

és

QF-PCR

vizsgálata

során

a

nemmeghatározás eredményei megegyeztek. A nemi chromosomák aneuploidiái közül egy esetben 47,XXY karyotypust találtunk mindkét módszerrel. 4.1.5. Magzati nemmeghatározás magzatvízmintákból A magzati nemet és az X és Y chromosomák kópiaszámának meghatározását az amelogenin gén nem-polimorf szekvenciájának meghatározásával végeztem. A 4875 magzatvízminta cytogenetikai és QF-PCR vizsgálata során a nemmeghatározás eredményei megegyeztek. A nemi chromosomák aneuploidiái közül kilenc esetben

35

4. EREDMÉNYEK

47,XXY és hat esetben 47,XYY karyotypust találtam mindkét módszerrel. Mivel az amelogenin gén nem mutat polimorfizmust, azok a nemi chromosoma rendellenességek, amelyekben csak X chromosoma van jelen, a QF-PCR módszerrel nem voltak kimutathatóak. A cytogenetikai vizsgálat tíz 45,X, öt 47,XXX és egy 48,XXXX esetet mutatott ki a vizsgált 4875 magzatvízmintából, amelyet a QF-PCR módszer nem mutatott ki. Az 17. ábrán egy 47,XXY karyotypusú magzattól származó magzatvízminta elekroforetogramja látható.

17. ábra: 47,XXY karyotypusú magzattól származó magzatvízminta elekroforetogramja. Az X chromosomára jellemző 103 bp és az Y chromosomára jellemző 109 bp méretű csúcsok alatti területek hányadosa 2/1 (41789/20230=2,066).

4.1.6. Mozaikosság kimutatása magzatvízmintákból A magzatvízminták vizsgálata során a cytogenetikai vizsgálat 5 esetben talált mozaikosságot. A QF-PCR módszerrel két esetben találtunk 21-es mozaik trisomiára utaló, a határérték közelében lévő diallélikus arányokat mutató eredményt. A cytogenetikai vizsgálat mindkét esetben 40-60% közötti mozaikosságot állapított meg. Három esetet nem észleltünk a QF-PCR vizsgálat során, amelynél a cytogenetikai vizsgálat 10-20%-os mozaik 21-es, vagy 18-as trisomiát diagnosztizált. A vizsgált 146 chorionboholyminta esetén nem találtunk mozaikosságot mutató esetet.

36

4. EREDMÉNYEK

4.1.7. A magzatvízminta anyai vérrel történő kontaminációjának hatása a QF-PCR vizsgálatra Mind a cytogenetikai, mind a QF-PCR módszer számára problémát jelenthet a magzatvízminta anyai vérrel történő szennyezettsége. Makroszkópos mennyiségű vérrel történő szennyeződést 162 minta esetén figyeltünk meg. A cytogenetikai vizsgálat számára ez 14 esetben jelentett akadályt, a QF-PCR vizsgálatot 17 esetben befolyásolta. Amennyiben a magzatvízminta makroszkóposan vérrel kontaminált volt, a minta dokumentációjában ezt feltüntettük. Nagyfokú kontamináció esetén a QF-PCR vizsgálat elektroforetogramja a triploidiához hasonló képet adott. A kontamináló vér mennyiségétől függően azonban az anyai eredetű csúcsok a magzati eredetű csúcsoknál általában kisebbek voltak. A fiúmagzatoktól származó minták esetén az amelogenin gén X és Y specifikus csúcsainak összehasonlításával a kontamináció mértékére is következtetni lehet, így a kontamináció tényét egyértelműen el lehet különíteni a trisomiás esetektől, valamint az esetek nagy részében a triploid esetektől is. Ennek ellenére kifejezett anyai kontamináció esetén a mintát QF-PCR vizsgálattal értékelhetetlennek tekintettük. A cytogenetikai és QF-PCR-rel értékelhetetlennek bizonyuló eseteket az 5. táblázatban foglalom össze. 5. táblázat: Eredménytelen cytogenetikai és QF-PCR vizsgálatok előfordulása magzatvízmintákban Cytogenetikai vizsgálat (n=4875)

QF-PCR (n=4875)

Nem informatív

-

84 (1,72%)

Technikai hiba

75 sikertelen sejttenyésztés

17 anyai vérrel kontaminált

14 anyai vérrel erősen kontaminált

(0,35%)

89 (1,83%)

101 (2,07%)

Összesen

A chorionboholyminták értékelése során a cytogenetikai vizsgálat minden esetben kivitelezhető volt. A QF-PCR vizsgálattal 4 minta nem volt informatív, tehát ezen minták esetén homozygotaságot figyeltünk meg valamelyik vizsgált chromosoma valamennyi STR markere esetében. A cytogenetikai vizsgálat egyik nem informatív minta esetén sem állapított meg chromosoma-rendellenességet. Az anyai kontamináció chorionboholyminták esetén nem volt megfigyelhető a QF-PCR vizsgálatok során.

37

4. EREDMÉNYEK

4.2. Az STR markerek alléleloszlásának vizsgálata Az STR markerek alléleloszlásának vizsgálata során a magzatvízmintákat és a chorionboholymintákat összevontuk, így összesen 5021 minta eredményét elemeztük. A 21-es, 18-as és 13-as chromosomák vizsgálatára használt markerek nagyfokú polymorphismust mutattak beteganyagunkban, a vizsgált minták 81-88%-ban bizonyultak heterozygotáknak. A nem informatív vizsgálatok száma az alkalmazott markerekkel 21-es chromosoma esetén 0,13%, 18-as chromosoma esetén 1,8%, 13-as chromosoma esetén 2,9% volt. Összességében az esetek 4%-ában volt valamelyik chromosomán elhelyezkedő markerek nem informatív volta (homozygotasága) miatt a vizsgálat nem tökéletesen értékelhető. A nem informatív esetek egyikében sem igazolódott trisomia a cytogenetikai vizsgálat során, mégis a nem informatív vizsgálati eredmény esetén a QF-PCR vizsgálat korlátozottan értékelhetőnek tekintendő. Az 6. táblázatban markerenként elemezem az STR vizsgálatok informativitását. 6. táblázat: Az informatív és nem informatív esettek előfordulása markerenkénti lebontásban Marker

Nem informatív

Informatív

D21S11

703 (14%)

4318 (86%)

D21S1411

653 (13%)

4368 (87%)

D21S1412

854 (17%)

4167 (83%)

Valamennyi 21-es marker

15 (0,3%)

5006 (99,7%)

D18S51

603 (12%)

4418 (88%)

D18S851

954 (19%)

4067 (81%)

Valamennyi 18-as marker

29 (0,6%)

4992 (99,4%)

D13S258

703 (14%)

4318 (86%)

D13S631

653 (13%)

4368 (87%)

Valamennyi 13-as marker

40 (0,8%)

4981 (99,2%)

n= 5021 A 7. táblázatban összefoglalom a 7 analizált STR markerének a fő jellemzőit.

38

4. EREDMÉNYEK

7. táblázat: A vizsgált STR markerek alléleloszlása magyar populációban Marker

Chromosomalis

Termékek mérete

Heterozygotaság

lokalizáció

(bp)*

aránya (n=5021)

D21S11

21q21-21q21

208-286

0,86

D21S1411

21pter-21qter

273-328

0,87

D21S1412

21pter-21qter

368-429

0,83

D18S51

18q21.33-18q21.33

120-169

0,88

D18S851

18pter-18qter

270-326

0,81

D13S258

13q21.2-13q31

116-140

0,86

D13S631

13q31-13q32

220-292

0,87

* A mérési eredményeket egész számokra kerekítettük.

4.3. A chorionboholy-mintavétel indikációjának vizsgálata a kórosnak talált esetetekben A 146 chorionboholyminta vizsgálata során mind a kilenc kóros eset a QF-PCR vizsgálattal kimutatható volt. Az indikációkat és a kimutathatóságot a 8. táblázatban foglalom össze. 8. táblázat. A chorionboholy-mintavétel indikációjának és a talált chromosomarendellenességek QF-PCR vizsgálattal való kimutathatóságának összefüggése Összesen

QF-PCR-rel

QF-PCR-rel nem

kimutatható

kimutatható

Ultrahang: NT>3mm

4

4

-

35 év feletti anyai életkor*

4

4

-

Monogénesen öröklődő betegség

1

1

-

9

9

-

prenatalis diagnosztikája Összesen * Ultrahang eltérés nélkül

n=146

39

4. EREDMÉNYEK

4.4. A magzatvíz-mintavétel indikációjának vizsgálata a kórosnak talált esetetekben Az 9. táblázatban összefoglalom a cytogenetikai és QF-PCR vizsgálat során kórosnak bizonyult minták esetén a magzatvízvizsgálatok indikációját. Amennyiben a rendellenes ultrahang lelet mellett egyéb indikáció is fenn állt, az esetet a „rendellenes UH lelet” csoportba soroltam. 9. táblázat: A mintavétel indikációja a klinikailag jelentős eltérést mutató magzatvízminták esetén Összesen

QF-PCR-rel

QF-PCR-rel nem

kimutatható

kimutatható

Rendellenes UH lelet

98

76 (77,6%)

22 (22,4%)

35 év feletti anyai életkor*

46

45 (98%)

1 (2%)

Pozitív serum marker vizsgálat*

29

29 (100%)

- (0%)

Előző gyermek Down-syndromája

3

3 (100%)

- (0%)

Valamelyik szülő kiegyensúlyozott

8

-

8 (100%)

184

153 (83,2%)

31 (16,8%)

transzlokáció hordozó Összesen * Ultrahang eltérés nélkül

n=4875

4.5. A QF-PCR vizsgálat egyéb alkalmazási lehetőségeinek vizsgálata 4.5.1. Triploidia kimutatása és a számfeletti chromosomaszerelvény szülői eredetének meghatározása A triploidia eseteiben a QF-PCR módszer a szülői minták összehasonlító vizsgálata során alkalmasnak bizonyult a számfeletti chromosomaszerelvény szülői eredetének meghatározására is. Két triploidia esetben elvégeztük a magzatvízből és a szülői peripheriás vérből izolált DNS minták összehasonlító vizsgálatát. A mintákon végzett QF-PCR

során

kapott

DNS

fragmentumok

méretének

meghatározásával

megállapítottuk, hogy a számfeletti haploid chromosomakészlet anyai eredetű. A 18. ábrán az egyik vizsgálat eredménye látható. Az 10. táblázatban összehasonlítom a

40

4. EREDMÉNYEK

magzati és a szülői eredetű microsatelliták (STR markerek) méreteit, amely a számfeletti haploid chromosomatöbblet anyai eredetét bizonyítja.

18. ábra: Triploid magzati minta, valamint az anyai és apai minta STR markereinek összehasonlítása

41

4. EREDMÉNYEK

10. táblázat: A microsatellita (STR) markerek méreteloszlása a magzati és szülői mintákbana Microsatellita marker Magzati minta (bp) D21S11

Anyai minta (bp)

217

Apai minta (bp) 217

229

229

241

241 245

D21S1211

278

278

282

282

302

302

D21S1214

385 389

389

389

389

397

397

D18S51

141 149

149

156

156

156 D18S251

282

156

292

292

292

292

328

328 312

D13S251

120

120 124

132

132

132 D13S631

132

234

234

238

238 238

274 a

274

Az anyai eredetű allélok aláhúzással jelöltem

42

4. EREDMÉNYEK

4.5.2. Uniparentalis disomia kimutatása és az UDP-t mutató chromosoma eredetének vizsgálata A QF-PCR módszert alkalmaztuk a családban előforduló 21-es trisomia és uniparentalis

disomia

esetén

a

számfeletti

21-es

chromosoma

eredetének

megállapításában, valamint az uniparentalis disomiás családtagok kimutatása által az egyes családtagok kockázatbecslésére a genetikai tanácsadás során. Az uniparentalis disomiát mutató 21-es chromosoma (UPD21) kimutatásának menetét a 19. ábrán és a 11. táblázatban mutatom be.

43

4. EREDMÉNYEK

19. ábra: A 21-es chromosomán elhelyezkedő microsatelliták quantitativ amplifikációja során a csúcsok diallélikus 1:2 aránya utal a magzati 21-es trisomiára (III/1). Az apai minta (46,XY) ezen markerekre nézve normális, diallelikus 1:1 arányokat mutat (II/2). Az anyai minta (46,XX) a vizsgált allélokra nézve homozygota (II/3), amely a 21-es chromosoma isodisomiájára utal. Ugyanez a mintázat figyelhető meg a gravida édesapjánál (I/2) és az édesapa leánytestvérénél (I/1), ami a vizsgált családtagoknál a 21-es chromosoma uniparentalis disomiájával magyarázható. A Down-syndromában szenvedő unokatestvérnél (47,XY+21) a magzathoz hasonlóan a csúcsok diallelikus 1:2 aránya figyelhető meg (II/1). A 11. táblázatban összehasonlítjuk a vizsgált családtagok STR amplikonjainak méreteit. Aláhúzással emeljük ki az isodisomiát mutató 21-es chromosomán elhelyezkedő markereket. 11. táblázat: A családtagok 21 chromosomán elhelyezkedő STR markereinek eloszlása D21S11

D21S1411

D21S1412

D21S1413

Magzat (III/1)

225, 233

334, 346

406, 414

196, 208

Apa (II/2)

217, 233

342, 346

406, 422

196, 188

Anya (II/3)

225

334

414

208

Az anya édesapja (I/2)

225

334

414

208

Az anya nagynénje (I/1)

225

334

414

208

334, 342

414, 426

196, 208

Az anya unokatestvére (II/1) 225, 237

Diamniális ikerterhességekben végzett amniocentesis során a QF-PCR módszerrel nagy biztonsággal megállapítható az ikrek zygozitása, ugyanis az egypetéjű ikrek megegyező STR profilt mutatnak. 4.6. Az allélvesztés (ADO) csökkentésének lehetőségei A PCR módszer érzékenységére alapvető hatással van az izolált DNS mennyisége és minősége []. A ReadyAmp kit felhasználása során a 4875 magzatvízminta 97,2%-a, a 146 chorionboholyminta 96,6%-a bizonyult informatívnak valamennyi vizsgált chromosoma esetén. Feltételezésünk szerint a nem informatív esetek hátterében a

44

4. EREDMÉNYEK

vizsgált STR markerek homozygotaságán kívül számos esetben az allélvesztés (allele drop-out = ADO) állt. Az ADO előfordulásának vizsgálata céljából 20 magzatvízmintában összehasonlítottuk a három különböző módszerrel izolált DNS minták QFPCR eredményeit. A vizsgált izolálási módszerek a következők voltak: •

„A” módszer: ReadyAmp kit-tel friss magzatvízmintából izolált DNS

•

„B” módszer: ReadyAmp kit-tel előzetesen min. 24 órán át -24 oC-ra fagyasztott magzatvízmintából izolált DNS

•

„C” módszer: High Pure PCR Template Isolation Kit-tel friss magzatvízmintából izolált DNS

A 20. ábrán szemléltetem a három módszerrel izolált DNS mintából végzett QF-PCR vizsgálat egy jellemző elektroforetogramját.

21. ábra: A három különböző módszerrel izolált DNS mintán végzett QF-PCR vizsgálatok elektroforetogramjai A 12. táblázatban összehasonlítom a különböző módszerekkel izolált DNS felhasználásával végzett QF-PCR vizsgálatok során kapott csúcsok méreteit, amely a PCR termék mennyiségére utal.

45

12. táblázat: A QF-PCR vizsgálat eredményeinek összehasonlítása különböző DNS izolálási módszerek alkalmazásával

A DNS izolálási módszerrel kapott QF-PCR csúcsok területeinek méretei STR marker

„A” módszer (±SD)

„B” módszer (±SD)

„C” módszer (±SD)

A csúcsok méreteinek statisztikai összehasonlítása, szignifikancia (p)

„A” és „B” módszer összehasonlítása 43954±31939 57980±39380 82151±34351 0.101 Amel X 31422±16068 34560±12829 58416±27202 0.249 AmelY 5028±8062 4722±4386 7746±3662 0.6 D13S631 A 3194±2461 3920±3265 7048±2092 0.781 D13S631 B 6586±3118 10552±6736 19660±9945 D13S258 A 0.029 5936±3057 7470±4288 16141±7323 0,32 D13S258 B 12413±5725 16403±10669 17785±7737 0.063 D18S851 A 8228±5396 8870±5919 14159±4465 0.842 D18S851 B 1993±1037 3767±1970 6078±3558 D18S51 A 0.039 2163±1192 3289±1890 4250±2152 0.168 D18S51 B 18532±12306 18925±11735 34409±15182 0.906 D21S11 A 12984±7192 17339±10525 26955±13201 0.131 D21S11 B 1426±1677 7626±6657 10489±11549 D21S1411 A 0.013 3590±1666 6457±5305 80850±34783 0.058 D21S1411 B 2753±1761 5798±5279 11271±5957 0.202 D21S1412 A 2843±1703 2949±2083 15207±7245 0.571 D21S1412 B Kétmintás t-próba: a szignifikanciát mutató különbségek (p< 0,05, CI 95%) pirossal kiemelve.

„A” és „C” módszer összehasonlítása 0.001 0.016 0.078 0.029 0.001 0,002 0.065 0.003 0.009 0.148 0.004 0.001 0.047 0.001 0.049 0.035

„B” és „C” módszer összehasonlítása 0,026 0.017 0.412 0.027 0.006 0,005 0.681 0.003 0.061 0.254 0.001 0.007 0.342 0.001 0.574 0.005

4. EREDMÉNYEK

A három izolálási módszer összehasonlítása során megállapítható, hogy a ReadyAmp kit-tel a fagyasztott magzatvízmintából izolált DNS („B” módszer) több PCR termék keletkezését tette lehetővé, mint a friss magzatvízmintából izolált DNS („A” módszer). A legjobb eredményt a High Pure PCR Template Isolation Kit-tel friss magzatvízmintából izolált DNS („C” módszer) adta. Amennyiben

a különböző

módszerekkel izolált DNS-ből QF-PCR vizsgálat során kimutatható allélek számát elemezzük, a legtöbb allélt a „C” módszerrel izolált DNS-ből, a legkevesebb allélt az „A” módszerrel tudtuk kimutatni. (13. táblázat) 13. táblázat: A DNS izolálás módjának és a QF-PCR vizsgálat során kapott allélek száma közötti összefüggés A magzatvízmintákból kimutatható allélek száma STR marker

különböző DNS izolálási módszeres alkalmazásával „A” módszer

„B” módszer

„C” módszer

Amel X

20

20

20

Amel Y

10

11

11

D13S631 A

11

15

19

D13S631 B

7

12

13

D13S258 A

13

15

19

D13S258 B

10

13

16

D18S851 A

16

17

20

D18S851 B

13

13

15

D18S51 A

10

15

19

D18S51 B

5

13

15

D21S11 A

18

19

20

D21S11 B

15

14

16

D21S1411 A

13

19

20

D21S1411 B

13

18

20

D21S1412 A

5

8

13

D21S1412 B

3

7

10

47

4. EREDMÉNYEK

Az eredmények arra utalnak, hogy a magzatvízminták fagyasztása a DNS izolálás eredményességét javítja, illetve a korszerűbb szilika membrán módszeren alapuló DNS izoláló módszerrel [80] nagyobb tisztaságú, jobb minőségű DNS izolálható, mint a régebbi, műgyanta alapú DNS izoláló módszerrel. A tisztább, kevesebb PCR inhibitort és genomiális DNS-t nagyobb koncentrációban tartalmazó minták felhasználása során az ADO jelensége ritkábban figyelhető meg.

48

5. MEGBESZÉLÉS

5. Megbeszélés Az újszülötteknél megfigyelhető leggyakoribb chromosoma rendellenességek a 21-es, a 18-as és a 13-as, valamint a nemi chromosomákat érintik [34,37,58]. A magzati chromosoma-rendellenességek diagnosztikájának legelterjedtebb és legmegbízhatóbb módszere a magzatvízsejtek cytogenetikai vizsgálata [34,55]. A sejttenyésztés szükségessége miatt azonban a módszer idő- és munkaigénye nagy, amely a chromosoma-rendellenességek

molekuláris

genetikai

módszerekkel

történő

kimutatásának kifejlesztését indította el. A molekuláris genetikai módszerek közül a FISH és a QF-PCR vizsgálat terjedt el a legszélesebb körben a magzati chromosomarendellenességek kimutatásában. A QF-PCR és FISH módszer előnyei a cytogenetikai vizsgálattal szemben lényegében azonosak, azonban a QF-PCR módszer gyorsabb és hatékonyabb [55]. A nemzetközi irodalomban megjelent közlemények alapján a QFPCR megbízhatóan alkalmazható a gyakori magzati aneuploidiák kimutatására mind chorionboholy-, mind magzatvízmintákból [3,11,25,27,64,73,87,96]. Ezt a megfigyelést nagy esetszámú vizsgálat során alátámasztottam a klinikánkon alkalmazott, egyéni marker-kombináció felhasználásával. A cytogenetikai és a QF-PCR módszert tapasztalataink alapján a 14. táblázatban hasonlítom össze. 14. táblázat: A magzatvízmintákon végzett cytogenetikai vizsgálat, valamint az QFPCR módszer előnyeinek és hátrányainak összehasonlítása Előny

Cytogenetikai vizsgálat

QF-PCR

Komplex információt ad.

Eredmény

a

mintavétel

napján

lehetséges. El lehet végezni befertőződött, valamint kismennyiségű és fixált mintán is. Alkalmazható

a

preimplantatiós

diagnosztikában. Hátrány

Közel két hét az eredmény kiadásáig.

Csak a vizsgált markerekről szolgál

Élő, tenyészthető sejteket és viszonylag információval. nagyobb mennyiségű mintát igényel.

49

5. MEGBESZÉLÉS

A QF-PCR vizsgálat előnyeit a klinikai alkalmazás során saját, és a nemzetközi irodalomban közölt tapasztalatok szerint a következőkben lehet összefoglalni: •

Gyorsaság: o A gyors eredmény csökkenti a várandósok szorongását és psychés terhelését a mintavétel és az eredmény kiadása közötti időszakban [62]. o Előrehaladott terhesség esetén is elvégezhető a magzatvíz vizsgálata, amikor a hagyományos cytogenetikai vizsgálat alkalmazásával túllépnénk a terhességmegszakítás törvényileg engedélyezett határát (24. hét) [42].

•

Nem igényel élő sejteket: o Fertőzött magzatvízből (amely tenyésztése nem lehetséges) is elvégezhető [55]. o Lefagyasztott magzatvízminták későbbi vizsgálatára alkalmas. o A 16. terhességi hét előtt és a 20. hét után levett magzatvízminták gyakran kevés osztódásra képes sejtet tartalmaznak. A QF-PCR módszer ezekben az esetekben is alkalmazható [57,134]. o A fetopathológiai feldolgozás során nyert post-mortem anyagok vizsgálatára is alkalmas.

•

Kis mennyiségű mintát igényel: o Alkalmas coelocentesis útján nyert minta vizsgálatára [57] o Alkalmas single-cell PCR vizsgálatra, amely a preimplantatiós genetikai diagnosztikában és az anyai vérből izolált magzati sejtek vizsgálatában szükséges [10].

A QF-PCR módszer kiválóan alkalmas a cytogenetikai vizsgálat kiegészítésére. Amennyiben az amniocentesis során levett magzatvízből a karyotypizálással párhuzamosan 1-1,5 ml mintát QF-PCR módszerrel vizsgálunk, a gyors vizsgálatnak köszönhetően negatív eredmény esetén a házaspár megnyugtatható. A párhuzamosan vizsgált minta a cytogenetikai vizsgálat számára kontrollt jelent, illetve a tenyésztés problémái és a cytogenetikai vizsgálat kiértékelésének gondjai esetén elkerülhető az ismételt amniocentesis. Ebből a célból a cytogenetikai vizsgálat céljára levett magzatvízmintákból 1 ml minta lefagyasztása javasolt esetleges későbbi QF-PCR vizsgálat céljából.

50

5. MEGBESZÉLÉS

Az STR markerek vizsgálatán alapuló QF-PCR módszer során alapvető kérdés a vizsgált marker heterozygótaságának aránya az adott populációban. Az STR markerek heterozygotaságáról információ nyerhető a The Human Genome Database (GDB) adatbázisból [118]. Pertl és munkatársai osztrák, Quaife és munkatársai délkelet-ázsiai populáción végezték el az STR allélok eloszlásának a vizsgálatát [95]. Vizsgálatuk, valamint a GDB adatainak saját eredményeimmel történő összehasonlítását a 15. táblázat tartalmazza. Ennek alapján megállapítható, hogy az általunk alkalmazott STR markerek az irodalomban tanulmányozott populációkhoz hasonlóan nagyfokú polymorphismust mutatnak a magyar populációban is, és ezáltal alkalmasak a magyar terhespopuláción végzett vizsgálatokra. 15. táblázat: A tanulmányozott STR markerek heterozygotaságának összehasonlítása más populációkon végzett vizsgálatokkal Marker

Heterozygotaság

Heterozygotaság

Heterozygotaság

Heterozygotaság

(magyar

(Pertl és mtsai,

(GDB adatok)

(Quaife és mtsai,

populációban)

osztrák

[118]

délkelet-ázsiai

n = 5021

populációban)

populációban) [103]

[95]

n=1115

n = 85

D21S11

0,86

0,93

0,900

0,81

D21S1411

0,87

0,93

0.933

0,78

D21S1412

0,83

0,80

0.800

0,82

D18S51

0,88

0,92

0.930

0,75

D18S851

0,81

nincs adat

nincs adat

nincs adat

D13S258

0,86

nincs adat

0,875

nincs adat

D13S631

0,87

0,94

0,938

0,84

Amennyiben egy adott chromosomán valamennyi vizsgált STR marker homozygota formában van jelen, a minta QF-PCR vizsgálata nem informatív. Az allél drop-out (ADO) során egy heterozygota minta egyik allélja a PCR során nem amplifikálódik, és a QF-PCR vizsgálata a homozygota eredményhez hasonló nem informatív képet mutat [39]. Az ADO hátterében az izolált DNS-ben található kontamináló anyagok állnak [47]. A korszerűbb, szilika-adszorbciós DNS izolálási módszer alkalmazásával az ADO csökkenthető és ezáltal növelhető az informatív esetek

51

5. MEGBESZÉLÉS

aránya, illetve csökkenthető az ismétlések száma. Vizsgálatunk során igazoltuk, hogy a szilika adszorpciós elven működő korszerűbb DNS izolálási módszer a régebbi, műgyanta alapú módszernél jobb minőségű DNS izolálására alkalmas, és csökkenthető általa az ADO előfordulása. Az utóbbi években merült fel a kérdés, hogy alkalmazhatóak-e a molekuláris genetikai vizsgálatok a cytogenetikai vizsgálat helyett, azaz alkalmas-e a QF-PCR módszer önállóan alkalmazva a prenatalis aneuploidiák kimutatására [63]. A nemzetközi irodalomban a vélemények megoszlanak ebben a tekintetben. A klinikailag jelentős chromosoma-rendellenességek 99%-át a 21-es, 18-as, 13-as és a nemi chromosomák aneuploidiái okozzák. A nemzetközi irodalomban megjelent közlések szerint a QF-PCR módszerrel nem kimutatható chromosoma-rendellenességek a vizsgált esetek 18-30%-ában voltak megfigyelhetőek [27,63]. Saját megfigyeléseink szerint a QF-PCR vizsgálattal nem kimutatható magzati chromosoma-rendellenességek aránya 18,8%, de ezek előfordulása a különböző indikációk esetén igen eltérő. Az irodalmi adatokhoz hasonlóan, vizsgálataink során az anyai életkor, illetve a serum marker szűrővizsgálat pozitív eredménye esetén a QF-PCR módszer hatásosan alkalmazható,

azonban

ultrahang-vizsgálattal

észlelt

magzati

strukturális

rendellenességek esetén a QF-PCR vizsgálattal nem kimutatható chromosoma-eltérések kockázata magas [63]. Tanulmányomban a „rendellenes ultrahanglelet” csoport magába foglalta a strukturális elváltozásokat és az ú.n. „soft markereket” is. További vizsgálatot igényel, hogy melyek azok az ultrahanggal észlelhető elváltozások, amelyek a QF-PCR módszerrel kimutatható chromosoma-rendellenességekre utalnak, és melyek azok, amelyek kimutatásához a cytogenetikai vizsgálat elvégzése szükséges. Amennyiben a szülők kiegyensúlyozott transzlokáció hordozók, a QF-PCR módszer szintén nem alkalmazható. Ilyenkor karyotypizálás, vagy specifikus molekuláris vizsgálat végzendő. A QF-PCR módszerrel történő vizsgálatok során polymorph STR markereket vizsgálunk, amely számos olyan lehetőséget nyújt, amelyet a hagyományos karyotypizálás nem. A módszer alkalmasnak bizonyult a számfeletti chromosomaszerelvény anyai/apai eredetének bizonyítására triploidiában, valamint az uniparentalis disomia kimutatására. Hasonló elven alkalmas apasági vizsgálat elvégzésére, valamint ikertehességben a

52

5. MEGBESZÉLÉS

zygozitás megállapítására is. Az igazságügyi alkalmazási lehetőségek közül érdekes az archivált cytogenetikai készítményekről leoldott magzati sejtek vizsgálata, amely lehetővé teszi egy kérdéses lemez utólagos azonosítását, és így esetleges mintacsere kizárását, vagy bizonyítását. A fetopathológiai vizsgálatot segítheti azáltal, hogy a gyakori chromosoma-rendellenességek a post-mortem mintákból is kimutathatóak. A QF-PCR módszer alkalmas egyetlen sejt vizsgálatára (single cell-PCR), amely lehetőséget nyújt az anyai vérből izolált magzati sejtek vizsgálatára, valamint alkalmazására a preimplantatiós genetikai diagnosztikában. Tanulmányom összegzéseként megállapítom, hogy a QF-PCR módszer gyors, egyszerű és

megbízható

módja

a

leggyakoribb

magzati

chromosoma-rendellenességek

diagnosztikájának. A módszer alkalmas az invazív módszerekkel (CVS és amniocentesis) nyert minták vizsgálatára, elsősorban mint a cytogenetikai vizsgálat kiegészítője, de bizonyos indikációk esetén akár önállóan is. Az indikációs területek közül a 35 év feletti anyai életkor, az anyai szérum marker szűrés pozitív eredménye és a családban előforduló 21-es, 18-as, vagy 13-as trisomia esetén megbízhatóan alkalmazható önálló módszerként, míg az ultrahang vizsgálat során észlelt strukturális eltérés

esetén

alkalmazása

fokozott

körültekintést

igényel.

Kiegyensúlyozott

chromosoma transzlokáció hordozó szülők esetén cytogenetikai vizsgálat javasolt.

53

6. KÖVETKEZTETÉSEK

6. Következtetések 1. 4875 magzatvíz- és 146 chorionboholyminta (összesen 5021 magzati minta) vizsgálata alapján megállapítom, hogy a QF-PCR módszer megbízhatóan alkalmazható a 21-es, 18-as és 13-as chromosomákat érintő aneuploidiák kimutatására magzatvíz- és chorionboholymintákból. a. A normál minták kimutatása során a magzatvízminták 97,2%-ban, a chorionboholyminták

96,6%-ában

volt

a

vizsgálat

informatív.

Az

eredmények megfeleltek a cytogenetikai vizsgálat eredményének, álpozitív eredményt nem figyeltem meg, tehát a QF-PCR módszer specificitása 100%-nak bizonyult. b. A 21-es, 18-as és 13-as trisomiát mutató minták vizsgálata során egy mozaik 21-es és két mozaik 18-as trisomiás minta kivételével a vizsgálati eredmény minden esetben megfelelt a cytogenetikai vizsgálat eredményének. A nem mozaik 21-es, 18-as, 13-as chromosomákat érintő aneuploidiák esetén a QFPCR vizsgálat szenzitivitása 100%. c. Az 5021 esetben elvégzett magzati nemmeghatározás során a QF-PCR és a cytogenetikai vizsgálat eredményei megegyeztek. A QF-PCR módszerrel az amelogenin gén vizsgálatával nem lehet kimutatni azokat a nemi chromosomákat érintő aneuploidiákat, amelyekben csak X chromosoma van jelen (45,X0, 47,XXX, 48,XXXX, stb.). d. A 4875 magzatvízminta vizsgálata során a cytogenetikai vizsgálat két esetben mutatott ki 40-60% közötti mozaik 21-es trisomiát és három esetben 10-20% közötti mozaik 21-es, vagy 18-as trisomiát. A 40-60%-os mozaik trisomiát mutató esetekben a határértékhez közeli aránnyal a QF-PCR vizsgálat felhívja a figyelmet a rendellenességre, azonban alacsony fokú mozaikosság kimutatására a QF-PCR vizsgálat nem alkalmas. e. A 4875 magzatvízminta QF-PCR vizsgálata során az értékelést akadályozó anyai vérrel történő kontaminációt 17 esetben (0,35%) figyeltem meg. A chorionboholyminták esetén az értékelést akadályozó anyai kontaminációt nem figyeltem meg.

54

6. KÖVETKEZTETÉSEK

2. 5021 magzati mintán meghatároztam 7 STR marker heterozygotaságának arányát a magyar populációban. A heterozygotaság valamennyi marker esetében 80% felettinek bizonyult (81-88%). A nagyfokú heterozygotaság alapján megállapítható, hogy az alkalmazott 7 marker vizsgálata alkalmas a magyar terhespopulációban a 21-es, 18-as és 13-as trisomia prenatális kimutatására. 3. A magzati minták cytogenetikai és QF-PCR vizsgálati eredményei alapján megállapítom, hogy a QF-PCR vizsgálat biztonságosan alkalmazható önálló vizsgálatként, amennyiben a magzati mintavétel indikációja a magzati Downsyndroma szűrésének keretében végzett anyai szérum marker vizsgálat pozitív eredménye és a 35 év feletti anyai életkor. Magzati ultrahang-eltérés esetén a QFPCR módszerrel nem kimutatható chromosoma-rendellenességek aránya 22,4%-nak (22/98) bizonyult, ezért ebben az esetben cytogenetikai vizsgálatot javaslom. Amennyiben a magzati vizsgálat indikációja valamelyik szülő kiegyensúlyozott transzlokáció hordozósága, cytogenetikai vizsgálat javasolt. 4. Megállapítom, hogy a QF-PCR vizsgálat alkalmas a számfeletti chromosomaszerelvény eredetének meghatározására triploidia esetén, valamint az uniparentális disomia 21-es, 18-as és 13-as chromosomákat érintő eseteiben. A számfeletti chromosomaszerelvény / chromosoma eredetének meghatározása segíti a genetikai tanácsadást az érintett házaspár és családtagjaik esetén. 5. 20 magzatvízmintán összehasonlítottam a különböző DNS izolálási módszerek hatását az allélvesztés jelenségére. A korszerűbb, szilika membrán elven működő eljárással izolált DNS szignifikánsan jobb eredményeket adott a QF-PCR során, és csökkentette az allélvesztés (ADO) előfordulását. Ilyen módon csökkenthető a neminformatív vizsgálati eredmények száma, amelynek köszönhetően a QF-PCR módszer hatékonyabban alkalmazható önállóan, párhuzamos cytogenetikai vizsgálat elvégzése nélkül.

55

7. ÖSSZEFOGLALÁS

7. Összefoglalás A magzat számbeli chromosoma-rendellenességeinek kimutatása magzatvíz- és chorionboholymintákból fluoreszcens polimeráz láncreakció módszerrel A magzati chromosoma-rendellenességek kimutatásának megbízható módszere a cytogenetikai vizsgálat, azonban idő- és munkaigényes, valamint érzékeny a környezeti hatásokra.

A

quantitatív

fluoreszcens-PCR

(QF-PCR)

módszer

gyors

és

automatizálható, viszonylag alacsony költségvonzattal. A QF-PCR módszer hátránya, hogy

alkalmazása

során

csak

a

célzottan

vizsgált

chromosomák

számbeli

rendellenességei mutathatók ki. A szerző 4875 magzatvíz- és 146 chorionboholymintán végzett QF-PCR módszerrel vizsgálatot a 21-es, 18-as, 13-as és a nemi chromosomák számbeli rendellenességeinek kimutatására. Eredményeit összevetette a párhuzamosan elvégzett cytogenetikai vizsgálatok eredményeivel. Feldolgozta az invazív beavatkozások indikációit és elemezte összefüggéseit a chromosomavizsgálatok eredményeivel, valamint vizsgálta az allélvesztés (ADO) csökkentésének lehetőségeit. A QF-PCR vizsgálatok során a minták 98,2%-a volt informatív. A 21-es, 18-as, 13-as és nemi chromosomák aneuploidiáinak vizsgálata során álpozitív és álnegatív eset nem fordult elő. Az alkalmazott STR markerek heterozygotaságának aránya 80% felettinek bizonyult, így a vizsgált rendszer alkalmas prenatális diagnosztika céljára a magyar populációban. A korszerű szilika-adszorpciós DNS izolálási módszer alkalmazásával az ADO gyakorisága szignifikánsan csökkenthetőnek bizonyult, ezáltal az informatív esetek száma emelhető. Az eredmények alapján a szerző megállapítja, hogy a QF-PCR vizsgálat a tanulmányban felhasznált markerekkel megbízhatóan alkalmazható a 21-es, 18-as, 13-as és a nemi chromosomák aneuploidiáinak kimutatására. A vizsgálat lehetőséget ad bizonyos chromosomákat érintő uniparentalis disomia kimutatására, valamint a számfeletti chromosoma/chromosomaszerelvény eredetének megállapítására. A 35 év feletti anyai életkor, az anyai szérum marker szűrés pozitív eredménye és a családban előforduló 21-es, 18-as, vagy 13-as trisomia miatt végzett magzati vizsgálat során a QFPCR módszer megbízhatóan alkalmazható, azonban az ultrahang vizsgálattal észlelt strukturális eltérés esetén alkalmazása fokozott körültekintést igényel. Kiegyensúlyozott chromosoma transzlokációt hordozó szülők esetén cytogenetikai vizsgálat javasolt.

56

7. ÖSSZEFOGLALÁS

Detection of fetal aneuploidies from amniotic fluid and chorionic villus samples by quantitative fluorescent polymerase reaction Traditional cytogenetic analysis is the ’gold standard’ in the detection of fetal chromosome abnormalities. Because of the long term culture of the fetal cells the average reporting time is minimum two weeks. The multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF-PCR) has been shown to be a useful tool in the detection of fetal aneuploidies. It has several advantages over cytogenetic analysis. It is fast and does not require viable cells. QF-PCR has its limitations as it can not detect some fetal chromosome disorders of clinical importance. The aims of the study were to test the reliability of QF-PCR for the prenatal diagnosis of the common aneuploidies, to obtain data on the allele distribution of 7 different short tandem repeats (STR) in Hungarian population, to determine the indications in which QF-PCR can be applied safely in prenatal diagnosis and to analyze the possibilities for decreasing the rate of allele dropout. In a prospective study of 4875 amniocenteses and 146 chorionic villus samplings, both QF-PCR and karyotyping of the prenatal samples were performed. The results of QF-PCR were compared with those of the conventional cytogenetic study. Allele distribution of the applied STR markers was analyzed. The occurrences of chromosome disorders which can not be detected by QF-PCR were compared in cases with different indications of amniocentesis. 98.2% of the QF-PCR results were informative without false-negative and false-positive results. The rate of homozygousity was over 80% in all investigated STR markers in the Hungarian population. With the use of silica adsorption column based method a significant decrease in the frequency of ADO was observed. In conclusion: We applied a reliable, simple and cost-effective protocol using 7 STRs for the prenatal diagnosis of the common aneuploidies. In our study on almost 5021 prenatal samples, all chromosome disorders of clinical significance were detected in case of advanced maternal age and positive serum screening results. The highest number of chromosome disorders that are not detectable by QF-PCR were in case of structural abnormalities detected by ultrasound. Prenatal QF-PCR diagnosis of the trisomies 21, 18, 13 and sex chromosome anomalies is a reliable alternative to cytogenetic analysis of fetal samples, but the indication of the prenatal diagnosis should be considered prior to its application.

57

8. RÖVIDÍTÉSEK

Rövidítések

ADO

allélvesztés (allele drop-out)

AFP

alfa-fetoprotein

bp

bázispár

BPD

biparietális átmérő (biparietal diameter)

CVS

chorionboholy-mintavétel (chorionic villus sampling)

CGH

comparatív genomialis hybridizáció

CRL

ülőmagasság (crown-rump lenght)

DNS

dezoxiribonukleinsav

dNTP

dezoxiribonukleotid-triphosphate

uE3

konjugálatlan ösztriol (unconjugated estriol)

EDTA

ethylenediaminetetraacetic acid

6-FAM

6-carboxyfluorescein

FISH

fluoreszcens in situ hybridizáció

FITC

fluorescein isothiocyanate

GAC

genetikai amniocentesis

HEX

4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein

hCG

humán chorion gonadotropin

inhA

inhibin A

M

molár

MoM

multiples of the median

NT

magzati tarkóredő (nuchal translucency)

PCR

polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction)

PGD

praeimplantatiós genetikai diagnosztika

POP-4

performance optimized polymer-4

PUBS

magzati köldökzsinór mintavétel (percutaneous umbilical blood sampling)

QF-PCR

quantitatív fluoreszcens polimeráz láncreakció

rpm

fordulat/perc (round per minute)

SD

standard deviáció

58

8. RÖVIDÍTÉSEK

SNP

single-nucleotide polymorphism

ss

egy szálú (single stranded)

STR

short tandem repeat

TAMRA

N,N,N,N-tetramethyl-6-carboxyrhodamine

TET

4,7,2’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein

U

egység (unit)

59

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetnyilvánítás Munkámat teljes egészében a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján végeztem 1999-2004 között. Hálás köszönetemet fejezem ki Dr. Papp Zoltán professzor úrnak, a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika igazgatójának, program- és témavezetőmnek, aki mind klinikai, mind tudományos munkámat maximálisan támogatta és segítette. Elhivatottságával és emberi hozzáállásával példaképül szolgál számomra és a Klinika valamennyi orvosa számára. Köszönöm Dr. Nagy Bálint tudományos főmunkatárs úrnak, hogy a molekuláris genetikai módszerekbe bevezetett és munkámat barátilag, önzetlenül segítette. Köszönöm a genetikai tanácsadás dolgozóinak, elsősorban Dr. Papp Csaba egyetemi docens úrnak, Dr. Tóth-Pál Ernő egyetemi docens úrnak és Dr. Beke Artúr egyetemi adjunktus úrnak a klinikai genetikai tevékenység során nyújtott segítséget és baráti támogatást. Köszönet illeti a Genetikai Laboratórium minden jelenlegi és volt munkatársát, elsősorban Oroszné Nagy Judit vezető asszisztenst, Tóth Anikó, Gnotek Edit és Kamasz Jánosné asszisztenseket, akik odaadóan segítettek és támogattak munkám során. Végül köszönöm a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika valamennyi dolgozójának az elmúlt hat évben nyújtott segítségét.

60

10. IRODALOMJEGYZÉK

10. Irodalomjegyzék 1. Abramsky L, Hall S, Levitan J, Marteau TM. What parents are told after prenatal diagnosis of a sex chromosome abnormality: interview and questionnaire study. BMJ 2001; 322: 463-466. 2. Abramsky L, Rodeck CH. Women's choices for fetal chromosome analysis. Prenat Diagn 1991; 11: 23-28. 3. Adinolfi M, Sherlock J, Pertl B. Rapid detection of selected aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. Bioessays 1995; 17: 661-664. 4. Alberman ED, Creasy MR. Frequency of chromosomal abnormalities in miscarriages and perinatal deaths. J Med Genet 1977; 14: 313-315. 5. Alexander A, Subramanian N, Buxbaum JN, Jacobson DR. Drop-in, drop-out allelespecific PCR: a highly sensitive, single-tube method. Mol Biotechnol 2004; 28: 171174. 6. Alfirevic Z, Sundberg K, Brigham S. Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis. Cochrane Database Syst Rev 2003; (3): CD003252. 7. Al-Kouatly HB, Chasen ST, Gilbert F, Ahner R, Alonso LM, Chervenak FA. Correlation between rare chromosomal abnormalities and prenatal ultrasound findings. Am J Med Genet. 2002; 107: 197-200. 8. Beke A, Papp C, Tóth-Pál E, Mezei G, Oroszné Nagy J, Joó JG, Csaba Á, Papp Z. Cytogenetic exploration of fetal ultrasound anomalies. Orv Hetil 2004; 145: 21232133. 9. Belics Z, Beke A, Csabay L, Szabó I, Papp Z. Sonographic measurement of the fetal iliac angle in trisomy 21, 18 and 13. Fetal Diagn Ther 2003; 18: 47-50. 10. Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, Elias S, Holzgreve W, Evans MI, Dukes KA, Sullivan LM, Klinger KW, Bischoff FZ, Hahn S, Johnson KL, Lewis D, Wapner RJ, de la Cruz F. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn 2002; 22: 609-615. 11. Bili C, Divane A, Apessos A, Konstantinos T, Apostolos A, Ioannis B, Periklis T, Florentin L. Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR. Prenat Diagn 2002; 22: 360-365.

61


12. Bonduelle M, Van Assche E, Joris H, Keymolen K, Devroey P, Van Steirteghem A, Liebaers I. Prenatal testing in ICSI pregnancies: incidence of chromosomal anomalies in 1586 karyotypes and relation to sperm parameters. Hum Reprod 2002; 17: 2600-2614. 13. Borell A, Casals E, Fortuny A, Farre TM, Gonce A, Sanchez A, Soler A, Cararach V, Vanrell JA. First trimester screening for trisomy 21 combining biochemistry and ultrasound at individually optimal gestational ages. An interventional study. Prenat Diagn 2004; 24: 541-545. 14. Boué J, Boué A, Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions. Teratology 1975; 12: 11-26. 15. Brinkmann B, Meyer E, Junge A. Complex mutational events at the HumD21S11 locus. Hum Genet 1996; 98: 60-64. 16. Bruyère H, Rupps R, Kuchinka BD, Friedman JM, Robinson WP. Recurrent trisomy 21 in a couple with a child presenting trisomy 21 mosaicism and maternal uniparental disomy for chromosome 21 in the euploid cell line. Am J Med Genet 2000; 94: 35-41. 17. Bryndorf T, Christensen B, Vad M, Parner J, Brocks V, Philip J. Prenatal detection of chromosome aneuploidies by fluorescence in situ hybridization: experience with 2000 uncultured amniotic fluid samples in a prospective preclinical trial. Prenat Diagn 1997; 17: 333-341. 18. Bryndorf T, Christensen B, Vad M, Parner J, Carelli MP, Ward BE, Klinger KW, Bang J, Philip J. Prenatal detection of chromosome aneuploidies in uncultured chorionic villus samples by FISH. Am J Hum Genet 1996; 59: 918-926. 19. Burton BK, Prins GS, Verp MS. A prospective trial of prenatal screening for Down syndrome by means of maternal serum alpha-fetoprotein, human chorionic gonadotropin, and unconjugated estriol. Am J Obstet Gynecol 1993; 169: 526-530. 20. Buscaglia M, Ghisoni L, Bellotti M, Ferrazzi E, Levi-Setti P, Marconi AM, Taglioretti A, Zamperini P, Pardi G. Percutaneous umbilical blood sampling: indication changes and procedure loss rate in a nine years' experience. Fetal Diagn Ther 1996; 11: 106-113.

62


21. Chen CP, Liu FF, Jan SW, Lin SP, Lan CC. CVS-exposed limb deficiency defects with or without other birth defects: presentation of six cases born during a period of nine years. Am J Med Genet 1996; 63: 447-453. 22. Chen CP, Chern SR, Wang W. Rapid determination of zygosity and common aneuploidies from amniotic fluid cells using quantitative fluorescent polymerase chain reaction following genetic amniocentesis in multiple pregnancies. Hum Reprod 2000; 15: 929-934. 23. Chen CP, Shih JC, Chern SR, Lee CC, Wang W. Prenatal diagnosis of mosaic trisomy 16 associated with congenital diaphragmatic hernia and elevated maternal serum alpha-fetoprotein and human chorionic gonadotrophin. Prenat Diagn 2004; 24: 63-66. 24. Cirigliano V, Ejarque M, Fuster C, Adinolfi M. X chromosome dosage by quantitative fluorescent PCR and rapid prenatal diagnosis of sex chromosome aneuploidies. Mol Hum Reprod 2002; 8: 1042-1045. 25. Cirigliano V, Lewin P, Szpiro-Tapies S, Fuster C, Adinolfi M. Assessment of new markers for the rapid detection of aneuploidies by quantitative fluorescent PCR (QF–PCR) Ann Hum Genet 2001; 65: 421-427. 26. Cirigliano V, Sherlock J, Conway G, Quilter C, Rodeck C, Adinolfi M. Rapid detection of chromosomes X and Y aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. Prenat Diagn 1999; 19: 1099-1103. 27. Cirigliano V, Voglino G, Canadas MP, Marongiu A, Ejarque M, Ordonez E, Plaja A, Massobrio M, Todros T, Fuster C, Campogrande M, Egozcue, J Adinolfi M. Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR. Assessment on 18 000 consecutive clinical samples. Mol Hum Reprod 2004; 10: 839-846. 28. Cuckle HS, Holding S, Jones R, Groome NP, Wallace EM. Combining inhibin A with existing second-trimester markers in maternal serum screening for Down's syndrome. Prenat Diagn 1996; 16: 1095-1100. 29. de Pater JM, Govaerts LC, de Man SA, van der Sijs-Bos CJ, Christiaens GC, van Dam WM, Loneus WH, Engelen JJ. Prenatal detection of complex chromosomal aberrations using advanced molecular cytogenetic techniques. Prenat Diagn 2003; 23: 747-751.

63


30. Donaghue C, Roberts A, Mann K, Ogilvie CM. Development and targeted application of a rapid QF–PCR test for sex chromosome imbalance. Prenat Diagn 2003; 23: 201-210. 31. Du Z, Hood L, Wilson RK. Automated fluorescent DNA sequencing of polymerase chain reaction products. Methods in Enzymol 1993; 218: 104-121. 32. Dugoff L, Hobbins JC. Invasive procedures to evaluate the fetus. Clin Obstet Gynecol 2002; 45: 1039-1053. 33. Edwards A, Civitello A, Hammond HA, Caskez CT. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am J Hum Genet 1991; 49: 746-756. 34. Egan JF, Benn PA, Zelop CM, Bolnick A, Gianferrari E, Borgida AF. Down syndrome births in the United States from 1989 to 2001. Am J Obstet Gynecol 2004; 191: 1044-1048. 35. Eiben B, Trawicki W, Hammans W, Goebel R, Epplen JT. A prospective comparative study on fluorescence in situ hybridization (FISH) of uncultured amniocytes and standard karyotype analysis. Prenat Diagn 1998; 18: 901-906. 36. Estabrooks LL, Hanna JS, Lamb AN. Overwhelming maternal cell contamination in amniotic fluid samples from patients with oligohydramnios can lead to false prenatal interphase FISH results. Prenat Diagn 1999; 19: 179-181. 37. Evans MI, Henry GP, Miller WA et al. International, collaborative assessment of 146 000 prenatal karyotypes: expected limitations if only chromosome-specific probes and fluorescent in situ hybridization are used. Hum Reprod 1999; 14: 12131216. 38. Ferguson-Smith MA, Jates JRW. Maternal age specific rates for chromosome aberrations and factors influencing them: Report of a collaborative European study on 52,965 amniocenteses. Prenat Diagn 1985; 4: 5-12. 39. Findlay I, Matthews P, Quirke P. Multiple genetic diagnoses from single cells using multiplex PCR: reliability and allele dropout. Prenat Diagn 1998; 18: 1413-1421. 40. Findlay I, Quirke P, Hall J, Rutherford A. Fluorescent PCR: a new technique for PGD of sex and single-gene defects. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 96-103. 41. Findlay I, Tóth T, Matthews P, Marton T, Quirke P, Papp Z. Rapid trisomy diagnosis (21, 18 and 13) using fluorescent PCR and short tandem repeats:

64


applications for prenatal diagnosis and preimplantation genetic diagnosis. J Assist Reprod Genet 1998; 15: 266-275. 42. Fisk NM, Fordham K, Abramsky L. Elective late fetal karyotyping. Br J Obstet Gynaecol 1996; 103: 468-470. 43. Firth HV, Boyd PA, Chamberlain P, MacKenzie IZ, Lindenbaum RH, Huson SM. Severe limb abnormalities after chorion villus sampling at 56-66 days' gestation. Lancet 1991; 337: 762-763. 44. Fuchs F, Riis R. Antenatal sex determination. Nature 1956; 177: 330. 45. Geraedts J, Handyside A, Harper J, Liebaers I, Sermon K, Staessen C, Thornhill A, Vanderfaeillie A, Viville S. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Consortium: preliminary assessment of data from January 1997 to September 1998. ESHRE PGD Consortium Steering Committee. Hum Reprod 1999; 14: 3138-3148. 46. Grange G, Thoury A, Dupont J, Pannier E, LeRhun F, Goussot Souchet M, Goffinet F, Cabrol D. Sonographic measurement of the fetal iliac angle cannot be used alone as a marker for trisomy 21. Fetal Diagn Ther 2000; 15: 41-45. 47. Hahn S, Garvin AM, Di Naro E, Holzgreve W. Allele drop-out can occur in alleles differing by a single nucleotide and is not alleviated by preamplification or minor template increments. Genet Test 1998; 2: 351-355. 48. Hall S, Abramsky L, Marteau TM. Health professionals' reports of information given to parents following the prenatal diagnosis of sex chromosome anomalies and outcomes of pregnancies: a pilot study. Prenat Diagn 2003; 23: 535-538. 49. Hallahan T, Krantz D, Orlandi F, et al. First trimester biochemical testing for Down syndrome: free beta hCG versus intact hCG. Prenat Diagn 2000; 20: 785-789. 50. Halliday JL, Warren R, McDonald G, Rice PL, Bell RJ, Watson LF. Prenatal diagnosis for women aged 37 years and over: to have or not to have. Prenat Diagn 2001; 21: 842-847. 51. Heckerling PS, Verp MS. Amniocentesis or chorionic villus sampling for prenatal genetic testing: a decision analysis. J Clin Epidemiol 1991; 44: 657-670. 52. Hoehn H, Bryant EM, Karp LE, Martin GM. Cultivated cells from diagnostic amniocentesis in second trimester pregnancies. I. Clonal morphology and growth potential. Pediatr Res 1974; 8: 746-754.

65


53. Hoehn H, Bryant EM, Karp LE, Martin GM. Cultivated cells from diagnostic amniocentesis in second trimester pregnancies. II. Cytogenetic parameters as functions of clonal type and preparative technique. Clin Genet 1975; 7: 29-36. 54. Holzgreve W, Tercanli S, Schneider HP, Miny P. Prenatal karyotyping: when, how and whom? Ultrasound Obstet Gynecol 1992; 2: 64-69. 55. Hulten MA, Dhanjal S, Pertl B. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction 2003; 126: 279-297. 56. Jauniaux E, Brown R, Rodeck C, Nicolaides KH. Prenatal diagnosis of triploidy during second trimester of pregnancy. Obstet Gynecol 1996; 88: 983-989. 57. Jauniaux E, Cirigliano V, Adinolfi M. Very early prenatal diagnosis on coelomic cells using quantitative fluorescent polymerase chain reaction Reprod Biomed Online 2003; 6: 494-498. 58. Kalter H. Five-decade international trends in the relation of perinatal mortality and congenital malformations: stillbirth and neonatal death compared. Int J Epidemiol 1991; 20: 173-179. 59. Kazy Z, Rozovsky IS, Bacharev VA. Chorion biopsy in early pregnancy: A method of early prenatal diagnosis for inherited disorders. Prenat Diagn 1982; 2: 39-41. 60. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman FM, Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular genetic analysis of solid tumors. Science 1992; 258: 818-821. 61. Knott PD, Penketh RJA, Lucas MK. Uptake of amniocentesis in women aged 38 years or more by the time of the expected date of delivery: A two-year retrospective study. Br J Obstet Gynecol 1986; 93: 1246-1250. 62. Leung WC, Lam YH, Wong Y, Lau ET, Tang MH. The effect of fast reporting by amnio-PCR on anxiety levels in women with positive biochemical screening for Down syndrome--a randomized controlled trial. Prenat Diagn 2002; 22: 256-259. 63. Leung WC, Lau ET, Lao TT, Tang MH. Can amnio-polymerase chain reaction alone replace conventional cytogenetic study for women with positive biochemical screening for fetal Down syndrome? Obstet Gynecol 2003; 101: 856-861.

66


64. Levett LJ, Liddle S, Meredith R. A large-scale evaluation of amnio–PCR for the rapid prenatal diagnosis of fetal trisomy. Ultrasound Obstet Gynecol 2001; 17: 115118. 65. Lewin P, Kleinfinger P, Bazin A, Mossafa H, Szpiro-Tapia S. Defining the efficiency of fluorescence in situ hybridization on uncultured amniocytes on a retrospective cohort of 27 407 prenatal diagnoses. Prenat Diagn 2000; 20: 1-6. 66. Linden MG, Bender BG, Robinson A. Intrauterine diagnosis of sex chromosome aneuploidy. Obstet Gynecol 1996; 87: 468-475. 67. Lirrabee PB, Johnson KL, Pestova E, Lucas M, Wilber K, LeShane ES, Tantravahi U, Cowan JM, Bianchi DW. Microarray analysis of cell-free fetal DNA in amniotic fluid: a prenatal molecular karyotype. Am J Hum Genet 2004; 75: 485-491. 68. Los FJ, van Den Berg C, Wildschut HI, Brandenburg H, den Hollander NS, Schoonderwaldt EM, Pijpers L, Jan H, Galjaard R, Van Opstal D. The diagnostic performance of cytogenetic investigation in amniotic fluid cells and chorionic villi. Prenat Diagn 2001; 21: 1150-1158. 69. Lubin MB, Elashoff JD, Wang SJ, Rotter JI, Toyoda H. Precise gene dosage determination by polymerase chain reaction: theory, methodology, and statistical approach. Mol Cell Probes 1991; 5: 307-317. 70. Lussier G, Chagnon A, Pavilanis V. Study of the karyotype of a fetal human cell strain. Rev Can Biol 1966; 25: 57-61. 71. Mahowald MB, Verp MS, Anderson RR. Genetic counseling: clinical and ethical challenges. Ann Rev Genet 1998; 32: 547-559. 72. Malone FD, D’Alton ME. First-trimester sonographic screening for Down syndrome. Obstet Gynecol 2003; 5: 1066-1079. 73. Mann K, Fox SP, Abbs SJ, Yau SC, Scriven PN, Doherty Z, Ogilvie CM. Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis. Lancet 2001; 358: 1057-1061. 74. Mansfield ES, Kronick MN. Alternative labeling techniques for automated fluorescence based analysis of PCR products. Biotechniques 1993; 15: 274-279.

67


75. Mansfield ES. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Hum Mol Genet 1993; 2: 43-50. 76. Marko MA, Chipperfield R, Birnboim CH. A procedure for the large scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. Anal Biochem 1982; 121: 382-387. 77. Marteau TM, Nippert I, Hall S, Limbert C, Reid M, Bobrow M, Cameron A, Cornel M, van Diem M, Eiben B, Garcia-Minaur S, Goujard J, Kirwan D, McIntosh K, Soothill P, Verschuuren-Bernelmans C, de Vigan C, Walkinshaw S, Abramsky L, Louwen F, Miny P, Horst J; DADA Study Group. Decision-making after diagnosis of fetal abnormality. Outcomes of pregnancies diagnosed with Klinefelter syndrome: the possible influence of health professionals. Prenat Diagn 2002; 22: 562-566. 78. Martin RH, Ko E, Rademaker A. Distribution of aneuploidy in human gametes: comparison between human sperm and oocytes. Am J Med Genet 1991; 39: 321331. 79. Martin RH, Spriggs E, Ko E, Rademaker AW. The relationship between paternal age, sex ratios, and aneuploidy frequencies in human sperm, as assessed by multicolor FISH. Am J Hum Genet 1995; 57: 1395-1399. 80. Milunsky A. The prenatal diagnosis of chromosomal disorders. In: Genetic Disorders and the Fetus. 1979; Ed. A. Milunsky. Plenum Press, New York 81. Monni G, Zoppi MA, Ibba RM. Absence of nasal bone and detection of trisomy 21. Lancet 2002; 359: 1343. 82. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987; 155: 335-350. 83. Munne S, Bahce M, Sandalinas M, Escudero T, Marquez C, Velilla E, Colls P, Oter M, Alikani M, Cohen J. Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy and survival to first trimester. Reprod Biomed Online 2004; 8: 81-90. 84. Munne S, Sandalinas M, Magli C, Gianaroli L, Cohen J, Warburton D. Increased rate of aneuploid embryos in young women with previous aneuploid conceptions. Prenat Diagn 2004; 24: 638-643.

68


85. Nadler HL, Gerbie AB. Role of amniocentesis in the intrauterine detection of genetic disorders. N Engl J Med 1970; 282: 596-599. 86. Niazi M, Coleman DV, Loeffler FE. Trophoblast sampling in early pregnancy. Culture of rapidly dividing cells from immature placental villi. Br J Obstet Gynaecol 1981; 88: 1081-1085. 87. Nicolini U, Lalatta F, Natacci F, Curcio C, Bui TH. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration. Hum Reprod Update 2004; 10: 541-548. 88. Papp C, Beke A, Mezei G, Tóth-Pál E, Papp Z. Chorionic villus sampling: a 15-year experience. Fetal Diagn Ther 2002; 17: 218-227. 89. Papp C, Papp Z. Chorionic villus sampling and amniocentesis: what are the risks in current practice? Curr Opin Obstet Gynecol 2003; 15: 159-165. 90. Papp C. Chorionic villus sampling. Ultrasound Rev Obstet Gynecol 2003; 3: 279284. 91. Papp Z, Gardó S, Herpay G, Árvai A. Prenatal sex determination by amniocentesis. Obstet Gynecol 1970; 36: 429-431. 92. Papp Z, Gardó S, Herpay G, Méhes K. G-G translocatio méhen belüli kimutatása. Orv Hetil 1972; 113: 68-70. 93. Pardue ML, Gall JG. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proc Natl Acad Sci USA 1969; 64: 600-604. 94. Penrose LS. Maternal age in familial mongolism. J Ment Sci 1951; 97: 738-747. 95. Pertl B, Kopp S, Kroisel PM, Hausler M, Sherlock J, Winter R, Adinolfi M. Quantitative fluorescence polymerase chain reaction for the rapid prenatal detection of common aneuploidies and fetal sex. Am J Obstet Gynecol. 1997; 177: 899-906. 96. Pertl B, Kopp S, Kroisel PM, Tului L, Brambati B, Adinolfi M. Rapid detection of chromosome aneuploidies by quantitative fluorescence PCR: first application on 247 chorionic villus samples. J Med Genet 1999; 36: 300-303. 97. Pertl B, Weitgasser U, Kopp S, Kroisel PM, Sherlock J, Adinolfi M. Rapid detection of trisomies 21 and 18 and sexing by quantitative fluorescent multiplex PCR. Hum Genet 1996; 98: 55-59. 98. Pertl B, Yau SC, Sherlock J, Davies AF, Mathew CG, Adinolfi M. Rapid molecular method for prenatal detection of Down’s syndrome. Lancet 1994; 343: 1197–1198.

69


99. Petersen MB, Schinzel AA, Binkert F, Tranebjaerg L, Mikkelsen M, Collins FA. Use of short sequence DNA polymorhisms after PCR amplification to detect the parental origin of the additional chromosome 21 in Down sysndrome. Am J Hum Genet 1991; 48: 65-71. 100.

Platt LD, Greene N, Johnson A, Zachary J, Thom E, Krantz D, Simpson JL,

Silver RK, Snijders RJ, Goetzl L, Pergament E, Filkins K, Mahoney MJ, Hogge WA, Wilson RD, Mohide P, Hershey D, MacGregor S, Bahado-Singh R, Jackson LG, Wapner R. Sequential pathways of testing after first-trimester screening for trisomy 21. Obstet Gynecol 2004; 104: 661-666. 101.

Poon LL, Leung TN, Lau TK, Lo YM. Prenatal detection of fetal Down’s

syndrome from maternal plasma. Lancet 2000; 356: 1819-1820. 102.

Poutamo J, Keski-Nisula L, Kuopio T, Heinonen S. Amniocentesis--a routine

procedure, but invasive. Prenat Diagn 2003; 23: 767-769. 103.

Quaife R, Wong LF, Tan SY, Chua WY, Lim SS, Hammersley CJ, Yeo HL. QF-

PCR based prenatal detection of aneuploidy in a southeast Asian population. Prenat Diagn 2004; 24: 407-413. 104.

Quilter CR, Holman S, AL-Hammadi RM, Theodorides D, Hastings RJ,

Delhanty JD. Aneuploidy screening in direct chorionic villus samples by fluorescence in situ hybridisation: the use of commercial probes in a clinical setting. BJOG 2001; 108: 215-218. 105.

Robinson WP, McFadden DE, Barrett IJ, Kuchinka B, Penaherrera MS, Bruyere

H, Best RG, Pedreira DA, Langlois S, Kalousek DK. Origin of amnion and implications for evaluation of the fetal genotype in cases of mosaicism. Prenat Diagn 2002; 22: 1076-1085. 106.

Rogan PK, Sabol DW, Punnett HH. Maternal uniparental disomy of

chromosome 21 in a normal child. Am J Med Genet 1999; 83: 69-71. 107.

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N.

Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985; 230: 1350-1354. 108.

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB,

Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 1988; 239: 487-491.

70


109.

Schmidt W, Jenderny J, Hecher K, Hackeloer BJ, Kerber S, Kochhan L, Held

KR. Detection of aneuploidy in chromosomes X, Y, 13, 18 and 21 by QF-PCR in 662 selected pregnancies at risk. Mol Hum Reprod 2000; 6: 855-860. 110.

Sherlock J, Cirigliano V, Petrou M, Tutschek B, Adinolfi M. Assessment of

diagnostic quantitative fluorescent multiplex polymerase chain reaction assays performed on single cells. Ann Hum Genet 1998; 62: 9-23. 111.

Simoni G, Brambati B, Danesino C, Terzoli GL, Romitti L, Rossella F, Fraccaro

M. Diagnostic application of first trimester trophoblast sampling in 100 pregnancies. Hum Genet 1984; 66: 252-259. 112.

Spencer K, Spencer CE, Power M, Moakes A, Nicolaides KH. One stop clinic

for assessment of risk for fetal anomalies: a report of the first year of prospective screening for chromosomal anomalies in the first trimester. Br J Obstet Gynecol 2000; 107: 1271-1275. 113.

Spriggs EL, Rademaker AW, Martin RH. Aneuploidy in human sperm: the use

of multicolor FISH to test various theories of nondisjunction. Am J Hum Genet 1996; 58: 356-362. 114.

Steele MW, Breg WR. Chromosome analysis of human amniotic fluid cells.

Lancet 1966; 1: 383. 115.

Stene J, Stene E, Mikkelsen M. Risk for chromosome abnormality at

amniocentesis following a child with a non-inherited chromosome aberration. Prenat Diagn 1984; 4: 81. 116.

Tepperberg J, Pettenati MJ, Rao PN, Lese CM, Rita D, Wyandt H, Gersen S,

White B, Schoonmaker MM. Prenatal diagnosis using interphase fluorescence in situ hybridization (FISH): 2-year multi-center retrospective study and review of the literature. Prenat Diagn 2001; 21: 293-301. 117.

The Human Genome Database: http://www.gdb.org

118.

The Utah Marker Development Group: A collection of ordered tetranucleotide-

repeat markers from the human genome. Am J Hum Genet 1995; 57: 619-628. 119.

Thein AT, Abdel-Fattah SA, Kyle PM, Soothill PW. An assessment of the use of

interphase FISH with chromosome specific probes as an alternative to cytogenetics in prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2000; 20: 275-280.

71


120.

Tóth T, Findlay I, Papp C, Tóth-Pál E, Marton T, Nagy B, Quirke P, Papp Z.

Prenatal detection of trisomy 13 from amniotic fluid by quantitative fluorescent polymerase chain reaction. Prenat Diagn 1998; 18: 669-674. 121.

Tóth T, Findlay I, Papp C, Tóth-Pál E, Marton T, Nagy B, Quirke P, Papp Z.

Prenatal detection of trisomy 21 and 18 from amniotic fluid by quantitative fluorescent polymerase chain reaction. J Med Genet 1998; 35: 126-129. 122.

Urquhart A, Kimpton CP, Downes TJ, Gill P. Variation in short tandem repeat

sequences--a survey of twelve microsatellite loci for use as forensic identification markers. Int J Legal Med 1994; 107: 13-20. 123.

Van Leeuwen L, Jacoby H, Charles D. Exfoliative cytology of amniotic fluid.

Acta Cytol 1965; 9: 442-445. 124.

Verma L, Macdonald F, Leedham P, McConachie M, Dhanjal S, Hulten M.

Rapid and simple prenatal DNA diagnosis of Down’s syndrome Lancet 1998; 352: 9-12. 125.

Verma RS, Luke S. Variations in alphoid DNA sequences escape detection of

aneuploidy at interphase by FISH technique. Genomics 1992; 14: 113-116. 126.

Verp MS, Bombard AT, Simpson JL, Elias S. Parental decision following

prenatal diagnosis of fetal chromosome abnormality. Am J Med Genet 1988; 29: 613-622. 127.

Voglino G, Marongiu A, Massobrio M, Campogrande M, Todros T. Rapid

prenatal diagnosis of aneuploidies. Lancet 2002; 359: 442. 128.

Wald NJ, Cuckle HS, Densem JW, Nanchahal K, Royston P, Chard T, Haddow

JE, Knight GJ, Palomaki GE, Canick JA. Maternal serum screening for Down's syndrome in early pregnancy. BMJ 1988; 297: 883-887. 129.

Wald NJ, Rodeck C, Hackshaw AK, Walters J, Chitty L. Mackinson AM. First

and second trimester antenatal screening for Down’s syndrome: the result of the serum, urine and ultrasound screening study (SURUSS). Health Technol Assess 2003; 7(II): 1-49. 130.

Wapner R, Thom E, Simpson JL. First trimester screening for trisomies 21 and

18. N Engl J Med 2003; 349: 1405-1403.

72


131.

Warburton D, Dallaire L, Thangavelu M, Ross L, Levin B, Kline J. Trisomy

recurrence: a reconsideration based on North American data. Am J Hum Genet 2004; 75: 376-385. 132.

Warburton D. De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker

chromosomes identified at prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of breakpoints. Am J Hum Genet 1991; 49: 995-1013. 133.

Ward BE, Gersen SL, Carelli MP, McGuire NM, Dackowski WR, Weinstein M,

Sandlin C, Warren R, Klinger KW. Rapid prenatal diagnosis of chromosomal aneuploidies by fluorescence in situ hybridization: clinical experience with 4500 specimens. Am J Hum Genet 1993; 52: 854-865. 134.

Waters JJ, Waters KS. Trends in cytogenetic prenatal diagnosis in the UK:

results from UKNEQAS external audit, 1987–1998. Prenat Diagn 1999; 19: 10231026. 135.

Winsor EJ, Silver MP, Theve R, Wright M, Ward BE. Maternal cell

contamination in uncultured amniotic fluid. Prenat Diagn 1996; 16: 49-54. 136.

Witters I, Devriendt K, Legius E, Matthijs G, Van Schoubroeck D, Van Assche

FA, Fryns JP. Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 in 5049 consecutive uncultured amniotic fluid samples by fluorescence in situ hybridisation (FISH). Prenat Diagn 2002; 22: 29-33. 137.

Yaegashi N, Uehara S, Maeda T, Fujimori K, Okamura K, Yajima A. Observed

versus expected rates of unbalanced fetal karyotype at second trimester amniocentesis when one parent carries a balanced translocation. Gynecol Obstet Invest 2001; 51: 85-91. 138.

Zimmermann B, Holzgreve W, Wenzel F, Hahn S. Novel real-time quantitative

PCR test for trisomy 21. Clin Chem 2002; 48: 362-363. 139.

Zlotogora J. Parental decisions to abort or continue a pregnancy with an

abnormal finding after an invasive prenatal test. Prenat Diagn 2002; 22: 1102-1106.

73

11. SAJÁT IRODALOM JEGYZÉKE

11. Saját irodalom jegyzéke 11. 1. Az értekezés készítése során felhasznált saját irodalom 11. 1. 1. Lektorált közlemények: I. Nagy B., Tóth-Pál E., Papp Cs., Bán Z., Papp Z. Prenatal detection of the ∆F-508 mutation using fluorescent PCR and comparison of the results with conventional PCR. Ped Pathol Molec Med 1999; 18: 213-219. II. Nagy B., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Beke A., Papp Z. Az apolipoprotein E allélok előfordulási gyakorisága számbeli chromosoma rendellenességet mutató magzatok csoportjában. Magyar Nőorvosok Lapja 1999; 62: 433-436. III. Nagy B., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Beke A., Papp Z. A cysticus fibrosist okozó ∆F-508 mutatio kimutatása fluorescens polimeráz láncreakcióval. Magyar Nőorvosok Lapja 2000; 63: 25-28. IV. Nagy B., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Fintor L., Papp Z. Apolipoprotein E allele distribution in trisomy 13, 18 and 21 conceptuses. Am J Clin Pathol 2000; 113: 572575. V. Nagy B., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Oroszné Nagy J., Beke A., Csaba Á., Papp Z. A leggyakoribb számbeli chromosomaaberratiók kimutatása fluorescens PCR és DNS fragmens analysis segítségével. Magyar Nőorvosok Lapja 2000; 63: 227-232. VI. Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Oroszné Nagy J., Lotz T., Nagy B., Papp Z. A számfeletti kromoszómaszerelvény eredetének molekuláris genetikai bizonyítása triploidiában. Magyar Nőorvosok Lapja 2001; 64: 41-44. VII. Bán Z., Papp Z. A magzati diagnosztika korszerű lehetőségei. Gyermekgyógyászat 2001; 52: 35-42. VIII. Beke A., Bán Z., Nagy B., Papp Cs., Tóth-Pál E. A perinatalis morbiditás és mortalitás genetikai összetevői. Gyermekgyógyászat 2001; 52: 179-184. IX. Fancsovits P., Bán Z., Tóthné Gilán Zs., Urbancsek J., Papp Z. Első lépéseink praeimplantatios genetikai diagnosztikában: blastomerabiopsia. Orv Hetil 2001; 142: 2427-2430.

74


X. Bán Z., Fancsovits P., Nagy B., Kamaszné Haim M., Urbancsek J., Papp Z. Első lépéseink a praeimplantatios genetikai diagnosztikában: genetikai vizsgálatok. Orv Hetil 2001; 142: 27-32. XI. Bán Z., Nagy B., Papp Cs., Tóth-Pál E., Papp Z. Rapid diagnosis of triploidy of maternal origin using fluorescent-PCR and DNA fragment analysis in the third trimester of pregnancy. Prenat Diagn 2002; 22: 984-987. XII. Bán Z., Nagy B., Papp Cs., Beke A., Oroszné Nagy J., Papp Z. Családban ismétlődő 21-es trisomia és uniparentalis disomia. Magyar Nőorvosok Lapja 2003; 66: 109-112. XIII. Papp Z., Fancsovits P., Bán Z., Urbancsek J. Előébrény diagnosztikát követően fogant sikeres terhesség első hazai esete. Orv Hetil 2002; 143: 2881-2883. XIV. Beke A., Bán Z., Nagy B., Tóth-Pál E., Papp Cs., Csaba Á., Papp Z. Prae- and perinatal relations of haemophilia A and B. Fetal Diagn Ther 2003; 18: 17-25. XV. Bán Z., Papp Z. Prenatális és preimplantációs diagnosztika. Focus Medicinae 2003; 5: 3-7. XVI. Bán Z., Nagy B., Papp Cs., Beke A., Papp Z. Recurrent trisomy 21 and uniparental disomy 21 in a family. Fetal Diagn Ther 2003; 18: 454-458. XVII. Tóth-Pál E., Papp Cs., Beke A., Bán Z., Papp Z. Genetic amniocentesis in multiple pregnancy. Fetal Diagn Ther 2004; 19: 138-144. XVIII. Szigeti Zs., Tóth-Pál E., Papp C., Beke A., Joó J.G., Bán Z., Mezei G., Papp Z. Cytogenetic investigation of fetuses conceived by ICSI. Prenat Diagn 2004; 24: 579580. XIX. Lázár L., Bán Z., Szakács O., Nagy B., Beke A., Oroszné Nagy J., Rigó J., Papp Z. Szabad magzati DNS kimutatása a magzati Y-kromoszóma igazolásával anyai vérplazmából. Magyar Nőorvosok Lapja 2003; 144: 2405-2409. XX. Nagy GyR., Bán Z., Sipos F., Beke A., Papp Cs., Papp Z. Isolation of epsilonhaemoglobin chain positive fetal cells with micromanipulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2005. (közlésre elfogadva) XXI. Nagy B., Bán Z., Lázár L., Tóth-Pál E., Papp Cs., Papp Z. Rapid determination of trisomy 21 from amniocytes using single nucleotide polymorphic loci. 2005. Prenat Diagn 2005. (elküldve)

75


XXII. Nagy B., Bán Z., Papp Z. The DNA isolation method has effect on allele drop out and on the results of fluorescent PCR and DNA fragment analysis. 2005. Clin Chim Acta 2005. (közlésre elfogadva) 11. 1. 2. Idézhető absztraktok I. Bán Z., Nagy B., Tóth-Pál E., Papp Cs., Papp Z. Prenatal sex determination and detection of trisomy 21, 18 and 13 by quantitative F-PCR. 31st Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Geneva, 29th May - 1st June 1999. Eur J Hum Gen 1999; 7(S1): 40. II. Dickman A., Nagy B., Bán Z., Kelecsényi A., Papp Cs., Tóth-Pál E., Papp Z. Comparison of F-PCR and conventional PCR for the detection of cystic fibrosis. 31st Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Geneva, 29th May - 1st June 1999. Eur J Hum Gen 1999; 7(S1): 98. III. Bán Z., Papp Cs., Tóth-Pál E., Oroszné Nagy J., Papp Z. Detection of triploidy by FPCR: Case report. 32nd Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Amsterdam, 27th May – 30th May 2000. Eur J Hum Gen 2000; 8(S1): 96. IV. Bán Z., Nagy B., Fancsovits P., Urbancsek J., Papp Z. Sex determination and detection of delta F508 mutation in human blastomeres by F-PCR. 10th International Congress on Human Genetics 2001, Vienna, May 15- 19, 2001. Eur J Hum Gen 2001; 9(S1): 102. V. Bán Z., Nagy B., Fancsovits P., Urbancsek J., Papp Z.. Single cell DNA analysis using F-PCR. 29th Conference of the European Teratology Society, Balatonfüred, 2-5 September 2001. Reprod Toxicol 2001; 15(4): 451. VI. Bán Z., Papp Cs., Nagy B., Tóth-Pál E., Lázár L., Papp Z. Further experiences for the reliability of F-PCR STR analysis for the detection of the most common aneuploidies. 33nd Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Strasbourg, 25th May – 28th May 2002. Eur J Hum Gen 2002; 10(S1): 96. VII. Fancsovits P., Bán Z., Tóthné G. Zs., Urbancsek J., Papp Z. Blastomere biopsy as the first step in preimplantation diagnosis. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 31.

76


VIII. Bán Z., Fancsovits P., Nagy B., Kamaszné H. M., Urbancsek J., Papp Z. First attempts in Hungary in sex determination and detection of delta-F508 mutation in human blastomeres for preimplantation diagnosis. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 31. IX. Tóth-Pál E., Csaba Á., Papp Cs., Bán Z., Beke A., Papp Z. Genetic amniocentesis in multiple pregnancies. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 41. X. Lázár L., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Cs., Oroszné Nagy J., Nagy B., Papp Z. Detection of triploidy by a molecular genetic method. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 54. XI. Bán Z., Lázár L., Papp Cs., Tóth-Pál E., Beke A., Papp Z. Detection of recurrent trisomy 21 and uniparental disomy 21 in a family by STR analysis. 33nd Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Birmingham, 3rd May – 6th May 2003. Eur J Hum Gen 2003; 11(S1): 142. XII. Lázár L., Bán Z., Papp Cs., Tóth-Pál E., Beke A., Papp Z. Fetal sex determination with real time PCR from fetal DNA in maternal plasma. 33nd Annual Meeting of the European Society of Human Genetics. Birmingham, 3rd May – 6th May 2003. Eur J Hum Gen 2003; 11(S1): 143.

11. 2. A szerző egyéb, nem az értekezés témájában megjelent

közleményei 11. 2. 1. Lektorált közlemények I. Bauknecht T., Randelzhofer B., Schmitt B., Bán Z., Hernando J., Bauknecht Th. Response to IL-6 of HPV-18 cervical carcinoma cell lines. Virology 1999; 258: 344354. II. Bán Z., Rigó J., Nagy B. Unusual cases of severe thrombotic episodes during peripartum. Am J Obstet Gynecol 1999; 181: 1040-1041. III. Bán Z., Nagy B., Papp Z. A vese örökletes cysticus elváltozásai. Genetikai tanácsadás és magzati diagnosztika. Lege Artis Medicinae 1999; 9: 516-522.

77


IV. Beke A., Nagy B., Bán Z., Tóth-Pál E., Csaba Á., Papp Z. A haemophilia A és B prae- és perinatalis vonatkozásai. Orv Hetil 2000; 141: 721-727. V. Marton T., Thein A., Bán Z., Soothill P., Oroszné Nagy J., Papp Z. 13-as trisomia prenatalis diagnózisának megerősítése Comparativ Genomialis Hybridisatio (CGH) módszerrel. Orv Hetil 2001; 142: 997-1000. VI. Tanyi J., Páy A., Rigó J., Nagy B., Bán Z. A human plakoglobin gén mutatioanalízise epithelialis ovariumcarcinomában. Magyar Nőorvosok Lapja 2001; 64: 241245. VII. Gávai M., Csákány Gy., Bán Z. Magyarország szülészeti statisztikai mutatói az ezredfordulón. Magyar Nőorvosok Lapja 2001; 64: 401-411. VIII. Beke A., Bán Z., Nagy B., Papp Cs., Tóth-Pál E. A perinatalis morbiditás és mortalitás genetikai összetevői. Gyermekgyógyászat 2001; 52: 179-184. IX. Beke A., Bán Z., Nagy B., Tóth-Pál E., Papp Cs., Csaba Á., Papp Z. Prae- and perinatal relations of haemophilia A and B. Fetal Diagn Ther 2003; 18: 17-25. X. Nagy B., Laitinen T., Bán Z., Andrásofszky K., Papp Gy., Lázár L., Nékám K., Papp Z., Réthy LA. Molekuláris genetikai vizsgálatokra alkalmas „szabad” DNS izolálása archivált vérsavó mintákból. Orv Hetil 2005; 47: 2375-2378. XI. Glasz T., Hortoványi E., Mózes G., Kiss A., Lotz G., Nagy PK., Szik A., Kardos M., Sziller I., Nagy B., Bán Z., Tóth A., Kassai I., Horkay F., Dudás G., Kádár A. Chlamydia pneumoniae in coronary bypass grafts of redo patients. The concept of the 'adventitial baseline infection'. Pathol Res Pract 2004; 200: 609-618. XII. Nagy B., Tarja L., Bán Z., Andrásofszky Z., Papp G., Lázár L., Nékám K., Papp Z., Réthy LA. Molekuláris vizsgálatokra alkalmas szabad DNS izolálása archivált szérum mintákból. Orv Hetil 2004; 145: 2375-2378. 11. 2. 2. Könyvfejezetek I. Papp Cs., Beke A., Bán Z., Tóth-Pál E., Papp Z. (1999) Organization of prenatal genetic services In: Perinatal Medicine. Ed. L.S. Voto, M. Margulies, E.V. Cosmi. Monduzzi Editore, Bologna, 76-83. II. Papp Z., Bán Z., Nagy B. (1999) Genetic components of perinatal outcome In: Perinatal Medicine. Ed: L.S. Voto, M. Margulies, E.V. Cosmi. Monduzzi Editore, Bologna, 587-592.

78


III. Bán Z., Papp Z. (2003) Prenatális és preimplantációs diagnosztika In: A genom. Ed. Hidvégi E. Széphalom Kiadó, Budapest IV. Marton T., Bán Z., Papp Z. (2003) Post-termination fetopathology In: Donald School Textbook of Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. Eds: A. Kurjak, F. A Chervenak. Jaypee Brothers Medical Publishers Ltd., New Delhi, 386-394. 11. 2. 3. Idézhető absztraktok I. Sipos B., Bán Z., Török V., Corradi Gy., Kádár A. Detection of C. trachomatis in prostates and epididymises. 21st International Congress of the International Academy of Pathology. Budapest, 20th - 25th October 1996. Pathol Int 1996; 46(S1): 850. II. Rigó J., Nagy B., Bán Z., Papp Z. The prevalence of the factor V Leiden mutation in preeclampsia and superimposed preeclampsia: implications for clinical outcomes. XVI. FIGO World Congress. Washington D.C., September 3-8, 2000. Int J Gynecol Obstet 2000; 70(S1): 74. III. Papp Cs., Bán Z. Expression of plasminogen activators in human stromal cells during implantation. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 35. IV. Jenei K., Beke A., Csabay L., Sipos Zs., Barakonyi E., Bán Z., Sziller I., Mezei G., Papp Cs., Tóth-Pál E. Incidence of toxoplasma and CMV infections in cases with positive ultrasound findings. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 47. V. Marton T., Bőze T., Thein A., Hajdú J., Cesko I., Bán Z., Soothill P., Papp Z.. 12q34+ chromosome gain in a fetus with herterotaxy. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 54. VI. Tótth Á., Csabay L., Bán Z., Csapó Zs. Megalocystis/megaloureter syndrome – demonstration of a rare urogenital malformation. XVIII International Congress ’The Fetus as a Patient’, Budapest, April 25-28, 2002. Fetal Diagn Ther 2002; 17(S1): 57.

79

Ph.D. értekezés. Készítette: Dr. Bán Zoltán Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár

Recommend Documents