PETUNJUK PRAKTIKUM FISIOLOGI REPRODUKSI
Penyusun: Dr. Hj. Bayyinatul Muchtarromah, drh. M.Si
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM MALANG MALANG 2014
KATA PENGANTAR Segala puji bagi Allah tuhan sekalian alam yang telah memberikan rahmat dan hidayahNya sehingga kami dapat menyusun buku petunjuk praktikum Fisiologi Reproduksi Praktikum Fisiologi Reproduksi merupakan mata kuliah pilihan bagi mahasiwa juruisan Biologi sebagai upaya memberikan ketrampilan bekerja di laboratorium bagi mahasiswa dan memberikan pengalaman empiris dari teori-teori yang diberikan. Diharapkan dengan segala bentuk persiapan dan pelaksanaan praktikum yang melibatkan dosen pembimbing dan mahasiswa secara aktif memberikan kontribusi live skill bagi mahsiswa dan memacu kreatifitas dalam pelaksanaan praktikum dan penggalian ilmu pada umumnya. Meskipun telah dikerahkan usaha sebaik-baiknya untuk pembuatan buku petunjuk praktikum ini tentunya masih banyak kekurangan disana-sini, seiring dengan semakin bervariasinya peralatan yang akan disediakan, buku petunjuk ini akan semakin disempurnakan. Akhirnya kami mengucapkan selamat bekerja semoga buku ini bermanfaat, Amin. Malang, Agustus 2014
Penyusun
1
DAFTAR ISI
Kata pengantar Daftar isi Tata tertib praktikum Praktikum 1: 1. Uji kehamilan Praktikum 2 : 2. Penampungan semen domba Praktikum 3 : 3. Menghitung motilitas spermatozoa Praktikum 4 : 4. Menghitung prosentase hidup dan mati spermatozoa Praktikum 5 : 5. Penghitungan konsentrasi spermatozoa Praktikum 6 : 6. Koleksi spermatozoa epididimis kambing Praktikum 7 : 7. Peran pengencer pada motilitas dan daya hidup sperma Praktikum 8 : 8. Hypoosmotic swelling test (hos) Praktikum 9 : 9. Kajian aglutinasi spermatozoa dari epididimis Praktikum 10 : 10. Pengamatan sel kelamin betina
2
TATA TERTIB PRAKTIKUM 1. Praktikan harus datang 10 menit sebelum praktikum dimulai dan jika terlambat tanpa alasan yang dapt dipertanggungjawabkan, tidak diperkenankan mengikuti praktikum. 2. Praktikan wajib menggunakan jas praktikum selama melaksanakan kegiatan di laboratorium. 3. Peralatan praktikum yang digunakan harap diteliti terlebih dahulu jenis, jumlah, dan keadaannya, kerusakan atau kehilangan peralatan selama praktikum menjadi tanggung jawab peserta praktikum dan harus mengganti alat tersebut sesuai spesifikasi 4. Baca dan pelajari buku ini dengan teliti sebelum mengikuti praktikum. Jika menemukan kesulitan dalam menjalankan praktikum, bertanyalah kepada asisten praktikum. 5. Dalam menjalankan kegiatan praktikum, hendaklah bersikap profesional dan hati-hati dalam menggunakan semua peralatan. 6. Praktikan harus membersihkan semua peralatan yang telah dipakai dalam praktikum dan mengembalikan kepada petugas sesuai dengan jenis dan jumlahnya serta dalam keadaan baik. 7. Praktikan wajib menjaga ketertiban dan kebersihan laboratorium selama praktikum. 8. Pelanggaran atas tata tertib ini diberikan sangsi dikeluarkan dari pelaksanaan praktikum dan atau tidak diperkenankan mengikuti acara praktikum selanjutnya. 9. Hal-hal yang belum tercantum dalam tata tertib ini akan diatur kemudian.
3
PRAKTIKUM I UJI KEHAMILAN I. TUJUAN Mendeteksi kehamilan secara biologik yaitu menggunakan makhluk hidup lain Mendeteksi kehamilan menggunakan test pack II. DASAR TEORI Fertilisasi atau pembuahan merupakan pusat kejadian dari seluruh proses reproduksi seksual. Fertilisasi merupakan penyatuan atau fusi dua sel, gamet-gamet jantan dan betina, untuk membentuk satu sel, zygot. Fertilisasi adalah satu proses ganda meliputi pengaktifan ovum oleh spermatozoa dan pemasukan faktor-faktor hereditas pejantan ke dalam ovum sesudah proses ovulasi, dimulailah masa kebuntingan yang diakhiri pada waktu kelahiran. Diagnosa kebuntingan dapat dilakukan dengan berbagai cara. Pada ternak besar seperti sapi, kerbau, kuda, cara yang paling praktis dan dapat diandalkan adalah diagnosa melalui palpasi rektal. Pada manusia, cara yang mudah, praktis dan dapat dilakukan sendiri adalah dengan menggunakan test pack. Test pack di dalamnya memiliki zat yang bereaksi dengan hormon kehamilan, Human Chorionic Gonadotropin (HCG). HCG dihasilkan oleh chorion pada plasenta wanita hamil kira-kira 30 sampai 60 hari sesudah menstruasi terakhir dan diekskresikan melalui urine. Selain test pack, penentuan kehamilan dengan menggunakan urine dapat dilakukan dengan cara biologik yaitu cara Ascheim zondek, Friedman dan Galli Mainini; masingmasing cara biologik menggunakan binatang percobaan yaitu tikus putih, kelinci dan katak jantan. III. ALAT DAN BAHAN Mikroskop Obyek glass 4
Cover glass Alat suntik Beker glass Cawan petri Pipet tetes Pinset Sarung tangan Test pack Urine pertama setelah bangun pagi dari wanita hamil sekitar 1-3 bulan Urine pertama setelah bangun pagi dari wanita tidak hamil Aquades 2 ekor katak jantan (Bufo vulgaris ) IV. CARA KERJA Pipet cairan di lubang pengeluaran katak Amati di bawah mikroskop, jika ada sperma. Maka katak tidak boleh dipakai Suntikkan 4-5ml air seni wanita hamil di perut kira-kira 11/2 cm didepan kloaka dengan cara mencubit / menarik kulit katak dengan pinset. Pegang katak selama beberapa saat dengan posisi sama seperti waktu penyuntikan. Kembalikan katak ke tempat yang telah diberi sedikit air Tunggu selama 1 jam Ambil katak dari tempatnya Pakai sarung tangan dan beri rangsangan pada daerah kloka Tempatkan cawan petri di bawah kloaka, untuk menampung cairan yang keluar dari kloaka Ambil cairan tersebut dengan pipet tetes. Teteskan diatas obyek glass Amati di bawah mikroskop Apabila pada pengamatan ditemukan sperma, berarti positif.
5
Selama waktu menunggu, lakukan uji kehamilan dengan test pack pada urin wanita hamil dan tidak. Catat hasilnya dan bandingkan dengan hasil uji pada katak. V. PERTANYAAN Mengapa dalam uji kehamilan digunakan katak jantan bukan katak betina? Apa sebabnya uji kehamilan menggunakan urin sebagai sampel? Mengapa lubang pengeluaran atau kloaka katak perlu diperiksa dulu sebelum digunakan untuk uji kehamilan? Apa fungsi pemberian rangsang pada kloaka setelah perlakuan? Apakah daerah penyuntikan dan lama reaksi (1jam) mempengaruhi hasil ? jelaskan jawabanmu! Apa makna positif dan negatif hasil pemeriksaan baik dengan katak dan test pack!
6
PRAKTIKUM 2 PENAMPUNGAN SEMEN DOMBA I. TUJUAN Mengetahui cara dan mempraktekkan penampungan semen II. DASAR TEORI Semen adalah cairan yang diproduksi saat ejakulasi, terdiri atas bagian sel, yaitu spermatozoa dan cairan tempat hidup spermatozoa, yaitu plasma semen. Spermatozoa dihasilkan di dalam testis sedangkan plasma semen adalah campuran sekresi yang dibuat oleh epididimis dan kelenjarkelenjar kelamin pelengkap yaitu kelenjar-kelenjar veskularis dan prostate. Sperma atau sel-sel kelamin jantan merupakan suatu sel kecil, kompak dan sangat khas, yang tidak tumbuh atau membagi diri. Secara esensial ia terdiri dari kepala yang membawa materi herider paternal, dan ekor yang menggandung sarana penggerak. Ia tidak memegang peranan apapun dalam fisiologi hewan yang menghasilkannya dan hanya melibatkan diri dalam pembuahan untuk membentuk individu baru sejenis darimana ia berasal. III. ALAT DAN BAHAN Satu unit vagina buatan Tabung penampung semen berskala Termos (penampung air hangat) Thermometer Vaselin Air hangat IV. CARA KERJA Penampungan Semen
7
• Sterilkan tabung penampung dan tutup sisi luar tabung penampungan dengan aluminium foil agar semen hasil penampungan tidak terkena langsung sinar matahari. • Persiapkan seluruh bahan dan alat untuk keperluan penampungan, diantaranya dengan merebus air sampai mendidih agar pencapaian suhu ketika air tersebut dimasukkan ke dalam vagina buatan bisa maksimal. • Bersihkan alat penampungan dengan air bersih, juga bersihkan sisa-sisa dari penampungan yang sebelumnya • Ikatkan tabung penampungan pada sisi kanan dari vagina buatan dengan karet atau yang lain dengan tujuan, diharapkan agar tidak terlepas pada waktu penampungan. • Masukkan air yang panas/hangat yang telah dipersiapkan tadi kedalam vagina buatan sampai ± 41ºC didalam vagina buatan. • Tak kalah pentingnya juga oleskan vaselin pada sepertiga sebelah dalam dari vagina buatan tersebut, hal ini bertujuan agar diharapkan penis dari domba ketika memasuki vagina buatan tidak terluka dan terjadi infeksi. • Persiapkan domba jantan dan sebagai pancingan taruh domba betina seakan-akan siap untuk dikawin. • Pejantan dibiarkan menaiki pemancing dan berejakulasi sewaktu penis diarahkan dan memasuki vagina buatan. • dan lakukan pengamatan lagi. V. PERTANYAAN 1. Apa fungsi vagina buatan dalam praktikum ini? 2. Apa tujuan dari dimasukkan air hangat kedalam vagina buatan? 3. Jelaskan peranan domba betina pada praktikum ini?
PRAKTIKUM 3 8
MENGHITUNG MOTILITAS SPERMATOZOA I. TUJUAN 1. Mengetahui penampungan semen 2. Memeriksa dan menghitung motilitas spermatozoa. II. DASAR TEORI a) Morfologi Spermatozoa Domba Satu spermatozoa terdiri dari; kepala, leher dan ekor. Kepala spermatozoa berbentuk oval memanjang, lebar dan datar satu pandangan dan sempit pada pandangan lain dengan bagian tebal pada pangkal kepala yang melangsing ke apex yang tipis. Kepala sperma terisi sepenuhnya dengan materi inti, kromosom, terdiri dari DNA yang bersenyawa dengan protein. Panjang 4-5µm lebar 2,5-3,5µm, sebagian besar kepala berisis inti. Leher hanya 1-1,5µm panjangnya. Bagian ini adalah tempat persambungan ekor dengan kepala. Persambungan ini membentuk semacam sendi peluru pada rangka. Dalam leher pulalah terletak sentriol. Ekor dibedakan atas 3 bagian: bagian tengah (Mid Piece) bagian utama (Principle Piece), dan bagian ujung (End Piece). Panjang ekor seluruhnya sekitar 55µm, dengan diameter yang makin keujung makin kecil. b) Motilitas Spermatozoa Domba Spermatozoa mempunyai kecenderungan untuk bergerak bersama-sama dalam kelompok (gerakan massa) sehingga akan membentuk gelombang tebal dan tipis. Gerakan massa yang cepat dan gelombang tebal merupakan indikasi tingginya presentase motilitas dan konsentrasi spermatozoa yang terkandung di dalam semen. III.
ALAT DAN BAHAN Peralatan penampungan : satu unit vagina buatan, tabung penampung semen, thermometer
9
Peralatan perlakuan : tabung reaksi, beaker glass, mikropipet volumerik, rak tabung Pemeriksaan kwalitas spermatozoa: mikroskop cahaya binokuler, objek glass, cover glass, kertas tissue. Bahan penampung semen : vaselin dan air hangat IV.
CARA KERJA a). Pemeriksaan Motilitas Spermatozoa 1. Setelah selesai penampungan, lepaslah aluminium foil yang menutupi tabung penampungan. 2. Semen yang berada di dalam tabung penampungan lihat dan perhatikan volume jumlah semen yang terkumpul. Penghitungan volume semen ini bisa dilakukan dengan melihat langsung pada tabung penampung berskala. 3. Hisaplah semen dari tabung penampungan dengan mikropipet. 4. Teteskan semen pada objek glass. 5. Amatilah motilitas individu sperma pada objek glass yang telah ditretesi semen tersebut langsung dibawah mikroskop dengan tanpa cover glass dengan pembesaran 400 kali. 6. Untuk pengamatan motilitas massa, dengan melihat obyek glass yang telah ditetesi semen dengan menutup bagian atas dengan cover glass, dibawah mikroskop dengan pembesaran 100kali. 7. Tentukan kriteria penilaian gerak massa spermatozoa sebagai berikut : a). Sangat baik (+++), sehingga terlihat gelombang besar, banyak gelap dan tebal, dan aktif seperti gumpalan awan hitam menjelang hujan bergerak cepat berpindah-pindah tempat. b). Baik (++), bila terdapat gelombang-gelombang kecil, tipis, jarang, kurang jelas dan bergerak lamban. c). Kurang (+), jika tidak terlihat gelombang melainkan gerakan-gerakan individual aktif progresif. 10
8. Klasifikasikan juga gerak individu spermatozoa dengan kriteria sebagai berikut : a). Gerakan progresif atau gerakan maju dari spermatozoa merupakan gerak terbaik. b). Gerak mundur dan gerak melingkar sering merupakan tanda-tanda cold shock sedangkan untuk spermatozoa yang gerakannya berayun atau berputar-putar adalah spermatozoa yang tua. c). Spermatozoa yang berhenti bergerak adalah spermatozoa yang mati. V. PERTANYAAN 1. Bagimana motilitas spermatozoa pada praktikum ini? 2. Ada berapa macam gerak spermatozoa yang kalian temukan dalam praktikum ini? 3. Bagimanakah gerak massa spermatozoa pada praktikum ini? 4. Apakah ada kaitan antara gerak individu spermatozoa dengan gerak massa spermatozoa?
11
PRAKTIKUM 4 MENGHITUNG PROSENTASE HIDUP DAN MATI SPERMATOZOA I. TUJUAN a. Mengetahui penampungan semen b. Mengetahui dan menghitung prosentase motilitas sperma c. Mengetahui dan menghitung prosentase hidup dan mati spermatozoa. II. DASAR TEORI Untuk mengetahui jumlah spermatozoa yang hidup dan yang mati adalah dengan pewarnaan deferensial. Dasar penggunan metode ini adalah perbedaan afinitas zat warna antara sel-sel spermatozoa yang mati dan yang hidup. Zat warna yang sering dipakai adalah eosin-negrosin. Pada waktu semen segar dicampur dengan zat warna karena permiabilitas dinding sel meninggi sewaktu mati. Eosin akan mewarnai spermatozoa menjadi merah atau merah muda, sedangkan spermatozoa yang hidup tetap tidak terwarnai. Zat-zat warna ini akan tetap stabil memberikan latar belakang biru hitam. III.
ALAT DAN BAHAN Alat untuk pengambilan semen : vagina buatan, selongsong hitam, tabung penampungan Pemeriksaan semen : mikroskop, obyek glass, cover glass, 2 counter. Bahan untuk penampungan semen : vaselin dan air hangat Bahan pewarna semen : eosin-negrosin
IV.
CARA KERJA a) Penampungan semen Lihat cara kerjanya pada praktikum penampungan semen domba b)Memeriksa motilitas spermatozoa 12
Lihat cara kerjanya pada praktikum penampungan semen domba c) Memeriksa dan menghitung presentase hidup dan mati spermatozoa Setelah penampungan segera lakukan pemeriksaan baik motilitas atau yang lain sebab dengan kerja seperti ini bisa diharapkan hasil dari semen penampungan baik Teteskan semen dengan mikropipet pada objek glass. Teteskan eosin-negrosin pada sperma yang telah diteteskan pada objek glass. Ambil objek glass yang lain dan apuslah objek glass yang sudah ditetesi dengan sperma dan eosin-negrosin tersebut. Mengapusan kedua objek glass tersebut yakni dengan menempelkan ujung objek glass yang lain pada campuran tadi tarik kearah sepanjang gelas objek sehingga membentuk 1 lapisan yang tipis. Fiksasikan preparat tersebut atau kering anginkan dan amati dibawah mikroskop dengan pembesaran 400kali. Spermatozoa yang hidup tidak akan menyerap warna Spermatozoa yang mati akan menyerap warna sehingga berwarna gelap. Hitunglah sel sperma yang ada sebanyak 200 sel Hitunglah sel yang hidup dan mati dengan persamaan : Persentase hidup : h x 100% h+m Keterangan : h = sperma yang hidup m = sperma yang mati V. PERTANYAAN 1. Bagaimanakah cara mengetahui sperma hidup dan mati? 2. Mengapa sperma yang hidup tidak menyerap warna sedangkan sperma yang mati menyerap warna? 3. Apa fungsi eosin-negrosin disini?
13
4. Bagaimanakah cara menghitung prosentase hidup dan mati spermatozoa?
14
PRAKTIKUM 5 PENGHITUNGAN KONSENTRASI SPERMATOZOA I. TUJUAN 1. Mengetahui cara penampungan semen domba 2. Mengetahui dan menghitung prosentase motilitas sperma 3. Mengetahui dan menghitung konsentrasi spermatozoa II. DASAR TEORI Penilaian konsentrasi dan jumlah per-milimeter semen segar penting, karena faktor inilah yang menggambarkan sifat-sifat semen dan dipakai sebagai salah satu kriteria penetuan kualitas semen. Konsentrasi digabung dengan volume dan prosentase sperma motil memberikan jumlah sperma motil per ejakulat, yaitu kuantitas yang menentukan berapa betina yang dapat diinseminasi dengan ejakulat tersebut. Berbagai metode dapat dipergunakan untuk menentukan konsentrasi spermatozoa, metode mana yang dipakai tergantung situasi, kebutuhan kebiasaan dan tersedia tidaknya alat yang dipergunakan. Untuk pemeriksaan rutin dilapangan perlu digunakan metode yang praktis dan sederhana, sedangkan pemeriksaan incidental terhadap satu contoh semen, terutama untuk diagnosa atau tujuan sebaiknya cara-cara yang lebih akurat. III. ALAT DAN BAHAN Alat untuk pengambilan semen domba : vagina buatan, selongsong hitam, tabung penampungan Pemeriksaan semen segar : mikropipet, mikroskop, obyek glass, cover glass, haemocytometer, counter Sperma uji : sperma domba yang telah birahi diambil dengan vagina buatan. Bahan pemekrisaan sperma hasil sexing : pewarna eosinnegrosin dan NaCl 0,3%.
IV. CARA KERJA 15
a) Penampungan semen Lihat cara kerjanya pada praktikum penampungan semen Domba b) Pemeriksaan motilitas spermatozoa Lihat cara kerjanya pada praktikum penampungan semen domba c) Pemeriksaan konsentrasi spermatozoa 1) Mikrometer objektif diperlakukan sama seperti objek glass dan dicari bayangan skalanya. 2) Bila telah terlihat, mikrometer okuler diletakkan didalam perangkat wadah lensa okuler, kemudian dipasang lagi. 3) Skala-skala pada kedua mikrometer tersebut di sejajarkan, dimana salah satu anak skala diatur sedemikian rupa sehingga saling lurus. jadi posisi kedua baris skala tersebut saling berhimpit. 4) Dicari satu anak skalanya pada kedua baris skala tersebut yang saling lurus berhimpit. 5) Pada masing-masing mikrometer tersebut di hitung banyaknya anak skala mulai yang paling lurus pertama kali sampai yang kedua. 6) Dari sini dapat di hitung. 7) 1 skala mikroometer okuler = ………… skala mikrometer obyektif. 8) Tutup cover glass d) Penghitungan konsentrasi spermatozoa 1) Hisaplah semen dengan pipet thoma sampai angka 0,5 atau 0,1 2) Hisaplah dengan pipet thoma larutan NaCl fisiologis 3% sehingga pada akhirnya terjadi pengenceran 1/200 (atau 1/100). 3) Tutuplah kedua ujung pipet menggunakan ibu jari dan jari tengah lakukan pengocokan dengan cara membolak balik. 4) Keluarkan 1-2 tetes cairan dalam pipet thoma dan buang, kemudian pada tetesan selanjutnya ujung pipet 16
mikro ditempelkan salah satu sisi bilik hitung yang telah diberi glass penutup/cover glass dan kertas tissue pada sisi lainnya. 5) Cairan dalam pipet thoma akan mengalir memenuhi bilik hitung dan selanjutnya bilik hitung ditaruh di bawah mikroskop. 6) Hitunglah spermatozoa yang ada di dalam 5 bilik hitung dengan langkah diagonal dan menyerupai huruf R. perhitungan dimulai dari sebelah kiri secara zigzag. Untuk menghindari perhitungan yang kurang tepat spermatozoa yang ada digaris batas sebelah kiri dan atas suatu bilik dihitung sebagai spermatozoa yang ada dalam bilik kecil tersebut. 7) Jumlah spermatozoa sesungguhnya dapat dihitung dengan perhitungan sebagai berikut : Panjang sisi 1 bilik R = 0,2mm Dalamnya bilik hitung = 0,1mm Pengenceran semen (p) = 100 atau 200 Volume dari 5 bilik hitung = V mm3 Jumlah spermatozoa dari 5 bilik hitung = N Jumlah spermatozoa per mm3 = N p/V V. PERTANYAAN 1. Bagaimanakah cara menghitung konsentrasi spermatozoa? 2. Mengapa 1-2 tetes cairan pertama dalam tabung thoma dibuang terlebih dahulu sebelum diteteskan pada bilik hitung? 3. Apa manfaat penghitungan konsentrasi spermatozoa?
17
PRAKTIKUM 6 KOLEKSI SPERMATOZOA EPIDIDIMIS KAMBING I. TUJUAN 1. Mengetahui sumber spermatozoa bisa berasal dari makhluk hidup yang telah mati. 2. Mengetahui motilitas spermatozoa epididimis. II. DASAR TEORI Epidimis adalah suatu struktur memanjang yang bertaut rapat dengan testis. Epididimis mempunyai 4 fungsi utama: transport, konsentrasi, maturasi dan penyimpanan sperma. Pemanfaatan epididimis sebagai sumber spermatozoa memberikan harapan baru untuk mengumpulkan material genetik hewan jantan meskipun hewan yang bersangkutan telah mati. III.
ALAT DAN BAHAN Mikroskop Obyek glass Botol steril Gunting steril Sentrifus Tabung Spuit 10 cc dan jarum 20G Alimunium foil Epididimis kambing dari Rumah Pemotongan Hewan (RPH) 0.9% NaCl Eosin antibiotik: penisilin dan sterptomycin sulfate air kelapa muda sari buah melon aquabides kertas saring
IV.
CARA KERJA 18
1) Epididimis dikoleksi dari rumah pemotongan hewan 2) Bersihkan epididimis dan masukkan ke dalam botol steril yang didalamnya berisi NaCl fisiologis dan telah ditambah dengan antibiotik; penisilin dan sterptomycin sulfate. Tutup rapat. 3) Bawa ke laboratorium dalam kondisi suhu lingkungan. 4) di laboratorium: Pisahkan epididimis dari testis. Buatlah sayatan-sayatan pada epididimis kemudian bilas tekan. Pembilasan epididimis dilakukan dengan cara menyemprotkan larutan larutan NaCl fisiologis (0,9% NaCl) ke epididimis menggunakan spuit 10 cc dan jarum berukuran 20G sambil ditekan. Tampung dalam tabung sentrifus cairan yang telah mengandung spermatozoa Sentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit pada suhu kamar. Buang supernatan Sedimen (endapan di dalam tabung setelah disentrifugasi, yakni spermatozoa) diencerkan. Masing-masing dengan pengencer air kelapa muda antibiotik-kuning telur, sari buah melon antibiotik-kuning telur, aquabides antibiotik-kuning telur. Sebelum tabung reaksi ditutup dengan aluminium foil. Ambil sedikit cairan dengan pipet tetes. Teteskan di atas obyek glass. Kemudian tutup dengan gelas penutup. Amati motilitas spermatozoa di bawah mikroskop cahaya pembesaran 400X pada delapan lapang pandang yang berbeda secara subyektif. Amati spermatozoa yang hidup, dengan cara teteskan satu tetes cairan yang diambil dari tabung reaksi, kemudian tambahkan satu tetes larutan 1% eosin dalam aquabides campur hingga homogen, buat preparat ulas tipis pada kaca obyek.
19
Amati di bawah mikroskop cahaya pembesaran 400X, dengan minimum 200 spermatozoa yang diamati. Spermatozoa yang hidup ditandai dengan kepala berwarna putih, sedangkan yang mati ditandai dengan kepala berwarna merah. Tabung reaksi kemudian disimpan dalam refrigerator dengan suhu 3-5ºC selama 3 hari. V. PERTANYAAN 1. Mengapa epididimis hewan yang telah mati dapat digunakan sebagai sumber spermatozoa? 2. Sebutkan bagian-bagian epididimis! 3. Apa fungsi penekanan jaringan epididimis pada waktu pengkoleksian spermatozoa dari epididimis? 4. Bagaimana morfologi spermatozoa epididimis? Macam-macam pengencer semen 1. bahan pengencer airkelapamuda antibiotik-kuning telur air kelapa antibiotik : 80%, kuning telur : 20% 2. bahan pengencer sari buah melon antibiotik-kuning telur, sari buahmelon-antibiotik : 80%, kuning telur : 20% 3. bahan pengencer aquabides antibiotikkuningtelur, aquabidesantibiotik : 80 %, kuning telur : 20% 4. cara membuat air kelapamuda-antibiotik 991 ml air kelapa muda + 4 ml streptomycin + 5 ml pensisilin. Campur sampai homogen 5. cara membuat sari buah melon-antibiotik 991 ml sari buah melon + 4 ml streptomycin + 5 ml penisilin. Campur sampai homogen. 6. kuning telur pilih telur ayam yang segar ditandai dengan kulit telur yang bersih, halus dan tidak retak. Kuning telur dipisahkan dari putih telur. Setelah itu disaring de ngan kertas saring. 7. air kelapa muda air kelapa muda disaring dengan kertas saring 8. cara membuat antibiotik (untuk 100ml) 20
1. streptomycin 5 gr dilarutkan dengan aquabides hingga 20 ml 2. penisilin 3.000.000 IU dilarutkan dengan aquabides sampai volumenya 15 ml 3. 1 dan 2 dicampur kemudian ditambahkan aquabides sampai volume mencapai 100ml
21
PRAKTIKUM 7 PERAN PENGENCER PADA MOTILITAS DAN DAYA HIDUP SPERMA I. TUJUAN 1. Mengetahui peran pengencer pada motilitas sperma 2. Mengetahui peran pengencer pada daya tahan hidup sperma II. DASAR TEORI Selama proses penyimpana spermatozoa memerlukan perlindungan dan nutrisi untuk kelangsungan hidupnya. Maka diperlukan bahan pengencer yang dapat menjalankan fungsi tersebut. Syarat bahan pengencer adalah harus dapat menyediakan nutrisi bagi kebutuhan spermatozoa selama penyimpanan, harus memubgkinkan sperma dapat bergerak secara progresif, tidak bersifat racun bagi sperma, menjadi penyanggah bagi sperma, dapat melindugi sperma dari kejutan dingin (cold shock) baik untuk semen beku maupun semen yang tidak dibekukan (semen cair). Daya tahan hidup sperma adalah kemampuan sperma untuk bertahan hidup selama penyimpanan yang diperlihatkan melalui sanggupnya bergerak sampai tidak adanya pergerakan lagi. III. ALAT DAN BAHAN Mikroskop Pipet tetes Obyek glass Spermatozoa epidimis yang telah disimpan selama 3 hari IV. CARA KERJA 1. Ambil spermatozoa dari refrigerator 2. Diamkan beberapa saat 3. Pipet dengan pipet tetes 4. Teteskan diatas obyek glass 5. Amati dibawah mikroskop; motilitas dan viabilitasnya (spermatozoa yang hidup dan mati). 22
V. PERTANYAAN 1. Apa peran pengencer selama proses penyimpanan? 2. Bagaimana motilitas dan daya hidup spermatozoa dalam pengencer air kelapa muda-kuning telur ayam setelah mengalami proses penyimpanan? 3. Bagaimana motilitas dan daya hidup spermatozoa dalam pengencer sari buah melon-kuning telur setelah mengalami proses penyimpanan? 4. Bagaimana motilitas dan daya hidup spermatozoa dalam pengencer aquabides-kuning telur selama mengalami proses penyimpanan? 5. Bagaimana motilitas dan daya hidup spermatozoa dalam pengencer aquabides setelah mengalami proses penyimpanan? 6. dari ke-3 jenis pengencer, manakah yang menghasilkan hasil yang paling baik?
23
PRAKTIKUM 8 OSMOTIC RESISTANCE TEST (ORT) ATAU HYPOOSMOTIC SWELLING (HOS) TEST I. TUJUAN 1. Mengetahui cara mengevaluasi keutuhan membran spermatozoa yaitu dengan metode hypoosmotic swelling (HOS) test 2. Mengetahui pengaruh lama penyimpanan pada keutuhan membran plasma spermatozoa. II. DASAR TEORI Untuk melakukan fertilisasi, spermatozoa harus bergerak mencapai tempat pembuahan dengan menggunakan energi yang diperoleh dari pengencer, sehingga motilitas seringkali dijadikan indikator fertilitasspermatozoa. Namun demikian pergerakan spermatozoa dipengaruhi juga oleh integritas struktur morfologi spermatozoa. Evaluasi terhadap keutuhan membran plasma spermatozoa (presentase MPU) dilakukan dengan metode hypoosmotic swelling test (HOS test). III. ALAT DAN BAHAN 1. Mikroskop 2. Obyek glass 3. Sperma epididimis yang telah diencerkan dengan pengencer 4. Sperma epididimis yang telah disimpan selama 3 hari 5. Fruktosa 6. Na Citrat 7. aquabides IV. CARA KERJA Buat larutan hipoosmotik dengan cara melarutkan 0,3 g fruktosa dan 0,7 g Na Citrat ke dalam 100 ml aquabides.
24
Sebanyak 0,1ml semen dicampur dengan 9,9 ml medium hipoosmotik Setelah dicampurkan sediaan diinkubasi dalam inkubator CO2 bersuhu 37C selam 45 menit. Semen kemudian dibuat preparat ulas tipis pada gelas obyek dan diamati dengan mikroskop cahaya pembesaran 400X terhadap minimum 200 spermatozoa. Spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh ditandai oleh ekor yang melingkar atau menggelembung, sedangkan yang rusak ditandai oleh ekor yang lurus. Lakukan langkah diatas pada spermatozoa yang telah disimpan selama 3 hari. I. V.PERTANYAAN 1. Apa gunanya metode Hypoosmotic swelling test (HOS test) pada spermatozoa? 2. Bagaimana kalian mengetahui keutuhan dan kerusakan membran spermatozoa? 3. Apakah lama penyimpanan juga memperngaruhi keutuhan membran spermatozoa? Jelaskan!
25
PRAKTIKUM 9 KAJIAN AGLUTINASI SPERMATOZOA DARI EPIDIDIMIS I. TUJUAN 1. Mengetahui aglutinasi spermatozoa 2. Mengetahui manfaat antiaglutinin bagi spermatozoa. II. DASAR TEORI Pengambilan spermatozoa dari epididimis seringkali mengabaikan cairan plasmanya yang berperan amat penting yaitu sebagai media untuk menjaga kehidupan sperma. Secara alami spermatozoa yang dibiarkan dalam media tertentu akan mengalami proses aglutinasi atau pengumpalan. Proses aglutinasi terjadi antarkepala spermatozoa, sehingga secara tidak langsung akan menurunkan tingkat efisiensi spermatozoa dalam membuahi sel telur. Penghambatan aglutinasi tampaknya dapat dilakukan dengan antiaglutinin. Dan salah satu sumber aantiglutinin adalah plasma epididimis. Tingkat aglutinasi spermatozoa dapat digunakan untuk menentukan keberadaan antiaglutinin. III.
IV.
ALAT DAN BAHAN Sentrifus Tabung reaksi Inkubator Mikropipet Spuit Gelas obyek Mikroskop cahaya Epididimis kambing dari rumah pemotongan hewan Medium Krebs Ringer-HEPES (KR-HEPES) 1:50 Giemsa 10% (Merck, Darmstadt Germany) Glutaraldehid NaCl Fisiologis CARA KERJA 26
1. Ambil cairan dari bagian kaput, korpus dan kauda epididimis dengan cara membuat sayatan-sayatan pada bagian tersebut kemudian semprotkan larutan NaCl fisiologis menggunakan spuit 10 cc dan jarum berukuran 20G. 2. Larutan yang mengandung spermatozoa tersebut ditampung dalam tabung reaksi 3. kemudian disentrifus pada kecepatan 700 g selama 5 menit pada suhu ruang. 4. Selanjutnya untuk memperoleh plasma, supernatan yang diperoleh disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4ºC. 5. Plasma dicampur dengan medium Krebs Ringer-HEPES (KR-HEPES) 1:50 . 6. Tabung reaksi diinkubasi dalam inkubatoer CO2 5% pada suhu 38,5ºC selama 1, 2, 3 jam. 7. Setelah 1, 2, 3 jam campuran tersebut diambil 10 µl dengan mikropipet untuk dibuat preparat ulas pada gelas obyek. 8. Selanjutnya preparat difiksasi dengan glutaraldehid 0,25% dalam NaCl fisiologis (1:1) 9. Kemudian dikeringanginkan dan diwarnai dengan Giemsa 10%. 10. Dilakukan penghitungan semua aglutinasi (perlekatan) antarkepala spermatozoa pada 10 lapang pandang di bawah mikroskop cahaya pembesaran 400kali. V. PERTANYAAN 1. Dari bagian epididmis yang manakah diperoleh hasil aglutinasi tertinggi? 2. Dari bagian epididimis yang manakah diperoleh hasil aglutinasi terendah? 3. Dari waktu 1,2, 3 jam manakah yang menghasilkan aglutinasi tertinggi dan manakah yang menghasil;kan aglutinasi terendah? 4. Apa akibatnya jika spermatozoa mengalami aglutinasi? 27
5. Apa fungsi antiaglutinin bagi spermatozoa?
28
PRAKTIKUM 10 PENGAMATAN SEL KELAMIN BETINA I. TUJUAN 1. Mengenal struktur morfologi ovarium domba 2. 2. Mengenal struktur morfologi oosit II. DASAR TEORI Sel kelamin atau gamet merupakan komponen sistem reproduksi yang penting, karena dari persatuan antara sel kelamin jantan dan betina terbentuklah zigot yang akan berkembang menjadi individu baru. Pengenalan dan pemahaman mengenai ciri-ciri morfologi sel kelamin hewan vertebrata pada lokasi yang berbeda-beda dari sistem reproduksi merupakan dasar untuk penelitian reproduksi dan embriologi yang berkaitan dengan sel kelamin. Dalam praktikum ini akan diamati struktur morfologi sel telur dan ovarium. III.
ALAT DAN BAHAN 1 .Alat untuk pengambilan oosit domba: spuit 5 atau 10 cc 2. Alat pemeriksaan oosit : mikropipet, bisecting mikroskop, cawan petri 3. Ovarium uji : ovarium domba yang diambil dari rumah pemotongan hewan 4. Bahan pemeriksaan ovarium : NaCl fisiologis
IV.
CARA KERJA • Ovarium yang ada folikelnya diaspirasi menggunakan spuit • Kemudian dikumpulkan dalam tabung reaksi • NaCl fisiologis disemprotkan agar oosit tercuci • Diamati di cawan petri dengan bisecting mikroskop
V. PERTANYAA 1. Bagaiman struktur morfologi ovarium? 29
2. Bagaimana struktur morfologi oosit? 3. Apa perbedaan antar ovarium dan oosit? 4. Bagaimanakah cara pengambilan oosit dari ovarium?
30
