PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN G SUBUNIT α DARI KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK RIAN PRATIWI. Perakitan Vektor Ekspresi Protein G subunit α dari Kedelai (Glycine max) Kultivar Slamet. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SUHARSONO. Protein heterotrimerik G terdiri atas tiga subunit yaitu α, β, dan γ. Protein Gα teraktivasi oleh adanya cekaman biotik atau abiotik di luar sel. Protein Gα di duga berperan penting dalam ketahanan tanaman kedelai kultivar Slamet terhadap cekaman aluminium (Al). Untuk mempelajari peran Gα dalam ketahanan tanaman terhadap cekaman Al, gen Gα harus diekspresikan di dalam tanaman transgenik. Untuk itu vektor ekspresi gen Gα harus dikonstruksi. Tujuan penelitian ini adalah untuk merakit vektor ekspresi untuk protein G subunit α dari kedelai kultivar Slamet. Vektor eskpresi pMSH1-Gα telah berhasil dirakit dengan menyisipkan gen Gα yang berukuran 1380 pb ke dalam plasmid pMSH1 yang berukuran 14000 pb dibawah kendali promotor 35S CaMV sehingga, plasmid rekombinan pMSH1-Gα berukuran 15380 pb. Plasmid rekombinan telah berhasil diintroduksikan ke dalam bakteri Escherichia coli galur DH5α. Kata kunci: Gen Gα, pMSH1, konstruksi, plasmid rekombinan, transformasi ABSTRACT RIAN PRATIWI. Construction of expression vector of G protein subunit α of soybean (Glycine maxI) cultivar Slamet. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and SUHARSONO. Heterotrimeric G protein consists of three subunits α, β, and γ. Activation of Gα protein is induced by biotic or abiotic stress. It is supposed that Gα protein has an important role in the Al tolerance in soybean cv. Slamet. To study the role of Gα in the tolerance to Al stress in the plant, the gene encoding for Gα had to be expressed in the transgenic plant. For this reason, the expression vector of this Gα gene has to constructed. So, this research had an objective to construct the expression vector of Gα gene of soybean cv Slamet. The expression vector pMSH1Gα was succesfully constructed by inserting 1380 bp Gα gene into pMSH1 plasmid under 35S CaMV promoter, so this size of recombinant plasmid is 15380 bp. This recombinant plasmid was succesfully introduce into Escherichia coli DH5α strains. Keyword: Gα gene, pMSH1, construction, recombinant plasmid, transformation
PERAKITAN VEKTOR EKSPRESI PROTEIN SUBUNIT α DARI KEDELAI (Glycine max) KULTIVAR SLAMET
RIAN PRATIWI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul : Perakitan Vektor Ekspresi Protein G Subunit α dari Kedelai (Glycine max) Kultivar Slamet Nama : Rian Pratiwi NIM : G34070045
Disetujui
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si Pembimbing I
Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA Pembimbing II
Diketahui
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si Ketua Departemen Biologi
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan rasa syukur penulis sampaikan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya yang telah diberikan sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2011 ini ialah Perakitan Vektor Ekspresi Protein G Subunit α dari Kedelai (Glycine max) Kultivar Slamet . Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Bapak Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran selama penelitian dan penulisan laporan karya ilmiah ini. Disamping itu, ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. R. R. Dyah Perwitasari, M.Sc sebagai dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan dalam penulisan karya ilmiah. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Kepala Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB Darmaga berserta seluruh staf dan karyawan atas sarana dan prasarananya selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium BIORIN (Biotechnology Research Indonesia-The Netherland). Penulis mengucapkan terima kasih kepada hibah bersaing XII dengan nomor 317/SP3/PP/DP2M/II/2006 dan proyek KKP3T dengan nomor 635/LB. 620/1.1/2/2009/ atas nama Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si dan Prof. Dr. Ir Suharsono, DEA. Penulis juga sampaikan terima kasih kepada Ratna, Pepi, Fajri, Ulung, Muchdar, Mulya, keluarga besar Lab Biorin, dan teman-teman biologi angkatan 44 yang telah membantu selama berlangsungnya kegiatan karya ilmiah. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada orang tua, serta keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Februari 2012
Rian Pratiwi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Baru Rambang, Muara Enim pada tanggal 15 Maret 1989 dari ayah Fahrudin dan ibu Nurlina. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 3 Prabumulih dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru IPB. Penulis terpilih masuk Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Dasar pada semester ganjil 2010/2011, semester genap 2010/2011, mata kuliah Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2010/2011 dan mata kuliah Genetika Dasar pada tahun ajaran 2011/2012. Penulis aktif sebagai staf Infokom Himpunan Mahasiswa Biologi pada tahun 20102011. Penulis pada saat mengikuti perkuliahan melakukan praktik lapang di Balai Pengujian Mutu Pakan Ternak Bekasi Jawa Barat. Kegiatan dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2011 dengan judul makalah “Analisis Mutu Pakan Ternak Di Balai Pengujian Mutu Pakan Ternak Bekasi Jawa Barat.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................
ix
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................
ix
PENDAHULUAN Latar Belakang Penelitian...................................................................................................
1
Tujuan Penelitian ................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat ..............................................................................................................
1
Bahan...................................................................................................................................
1
Metode Penelitian ...............................................................................................................
2
Isolasi DNA Plasmid pSL 16......................................................................................
2
Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16…........................................................................
2
Persiapan Vektor Ekspresi..........................................................................................
2
Ligasi Sisipan dan Vektor Ekspresi............................................................................
3
Introduksi Hasil Ligasi ke dalam Bakteri E.coli.........................................................
3
Isolasi Plasmid pSL16 dan Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16.........................................
3
Persiapan Vektor Ekspresi ..................................................................................................
4
Ligasi Sisipan dan Vektor Ekspresi ....................................................................................
4
Introduksi Hasil Ligasi ke dalam bakteri E.coli..................................................................
4
PEMBAHASAN ........................................................................................................................
5
SIMPULAN ...............................................................................................................................
6
SARAN ......................................................................................................................................
6
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................
6
HASIL
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil isolasi plasmid pSL16 dan gen Gα ................................................................................ 4 2 pMSH1 hasil isolasi dan pemotongan dengan enzim restriksi SpeI & XbaI...........................
4
3 PCR dari hasil ligasi pMSH1 dan Gα .....................................................................................
4
4 Bakteri yang dibiakan di media LB ........................................................................................
4
5 Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid rekombinan pMSH1-Gα .........................................
5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media LB cair ditambah antibiotik ........................................................................ 8 2 Komposisi larutan solution 1.....................................................................................................
9
3 Komposisi larutan solution 2.....................................................................................................
10
4 Komposisi larutan solution 3.....................................................................................................
11
5 Komposisi larutan buffer TAE 1x ............................................................................................
12
6 Komposisi larutan TFB ............................................................................................................
13
7 Komposisi larutan media 2YT .................................................................................................
14
8 Komposisi media LB padat ditambah antibiotik ......................................................................
15
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Penelitian Protein G subunit α merupakan komponen dari protein heterotrimerik G yang mengandung 3 subunit (α, β, γ) yang diaktivasi oleh sinyal ekstrakseluler (Albert et al. 2002). Pada keadaan tidak aktif protein protein heterotrimerik berada dalam bentuk ikatan GDP (guanosin difosfat) dan akan aktif dengan mengubah GDP ke bentuk GTP (guanosin trifosfat) yang berikatan pada subunit α. GTP subunit α akan terpisah dari subunit βγ dan keduanya akan berinteraksi dengan efektor yang berada di down stream. Penurunan aktivitas GTP-subunit α menjadi GDP-subunit α melalui aktivitas GTPase menyebabkan pembentukan kembali bentuk heterotrimerik tidak aktif (Kolle 1997). Kedelai kultivar Slamet diketahui merupakan kedelai toleran terhadap cekaman aluminium (Al) (Anwar 1999). Protein G subunit α pada tanaman kedelai kultivar Slamet telah berhasil diisolasi dan diklon ke dalam plasmid pGEMT dengan nama pSL16 (Suharsono & Suharsono 2004). Kedelai varietas Slamet memiliki satu kopi gen Gα pada genomnya (Suharsono & Suharsono 2004), sehingga untuk mempelajari fungsi gen ini salah satunya dapat dilakukan dengan men-knockout gen tersebut. Ion Al3+ merupakan bentuk paling toksik pada tanaman. Cekaman Al pada tanaman dapat menurunkan integritas membran, menginduksi pembentukan peroksidasi lipid dan kalosa sehingga menghambat pertumbuhan perpanjangan akar primer tumbuhan (Yamamoto et al. 2001). Cekaman Al juga dapat menginduksi ekspresi sejumlah gen yang berperan dalam sistem pertahanan tumbuhan. Salah satu gen yang diduga terlibat adalah gen penyandi protein G subunit α. Keterlibatan protein Gα terhadap toleransi Al telah diketahui dari hasil analisis ekspresi gen pada kultivar Lumut dan Slamet melalui pemberian cekman Al 1,6 mM. Kedelai kultivar Slamet mengalami peningkatan ekspresi gen Gα setelah diberikan perlakuan tersebut dibandingkan dengan kultivar Lumut yang merupakan tanaman peka terhadap Al yang tidak mengalami peningkatan ekspresi gen Gα (Suharsono & Suharsono 2006). Penambahan mastoparan yang merupakan aktivator protein Gα dapat meningkatkan sistem pertahanan tanaman kedelai terhadap cekaman Al melalui pertambahan perpanjangan akar, penurunan kandungan Al,
peroksidasi lipid, dan kalosa serta peningkatan integritas membran (Srimulyati 2007). Hartini (2008) melakukan pendekatan reverse genetic dengan menonaktifkan gen Gα melalui irradiasi sinar gamma dan berhasil mendapatkan 10 kandidat mutan. Ciri morfologi mutan gen Gα yaitu tanaman pendek (Fujisawa et al. 1999) dan dengan stomata menutup. Analisis keterlibatan protein Gα pada mekanisme toleransi cekaman Al dilakukan pada mutan kedelai kultivar Slamet yaitu Slm 103 dan Slm 338. Hasil analisis menunjukkan adanya keterlibatan protein Gα pada tanaman yang diberi cekaman Al 1,6 mM, dengan gejala akar pendek dan kerusakan sel di bagian epidermis sampai korteks mutan gen Gα (Giok 2010). Oleh karena itu untuk mempelajari fungsi gen ini lebih lanjut penelitian tanaman transgenik yang mengekspresikan gen ini harus dilakukan. Vektor ekspresi yang membawa gen Gα sangat diperlukan untuk perakitan tanaman transgenik sehingga penelitian untuk mengkonstruksi vektor ekspresi perlu dilakukan. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan melakukan perakitan vektor ekspresi untuk protein G subunit α dari kedelai kultivar Slamet. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari - Desember 2011 di Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, LPPM IPB. Bahan Bahan yang digunakan adalah bakteri Escherichia coli yang membawa gen Gα pada plasmid pSL16 (Suharsono & Suharsono 2004). Primer SL-F sebagai primer forward dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut (5’TCTAGAGCTTCACACTTCACACTTA A3’) dan SL-R bertindak sebagai primer reverse dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut (5’ACTAGTATATTGTTG TATA CCTGACCTC3’) yang digunakan untuk mengamplifikasi gen Gα. Plasmid pMSH1 (koleksi Prof. Yokota, NAIST, Japan), digunakan untuk perakitan vektor ekspresi. Primer 35S dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut (5’AAACCTCCTCGGATTC CATT3’) bertindak sebagai primer forward dan L4 bertindak sebagai primer reverse dengan sekuen nukleotidanya sebagai berikut
2 (5’CTTAGGACCCACTCAAAAACGTTCC3 ’) digunakan untuk melakukan verifikasi hasil ligasi dan transformasi genetik DH5α. Enzim XbaI (TCTAGA) dan SpeI (ACTAGT) yang digunakan untuk memotong plasmid pMSH1. E. coli DH5α digunakan sebagai sel inang bagi vektor ekspresi. Metode Penelitian Isolasi DNA Plasmid pSL16 Metode isolasi DNA plasmid mengikuti metode Suharsono et al. (2002). Sebanyak 100 μl biakan bakteri E. coli yang mengandung gen Gα pada plasmidnya dengan kode SL16 disubkultur di dalam 5 ml media Luria Bertani (LB) cair yang mengandung 50 mg/L ampisilin (Lampiran 1). Bakteri ditumbuhkan selama satu malam pada suhu 37ºC pada kecepatan 250 rpm didalam inkubator bergoyang. Biakan bakteri dipindahkan ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Endapan hasil sentrifugasi ditambahkan 150 μl larutan solution 1 (Lampiran 2) dan dilarutkan kembali. Campuran kemudian ditambahkan 250 μl larutan solution 2 (Lampiran 3) untuk melisis sel dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Campuran tersebut ditambahkan 200 μl larutan solution 3 (Lampiran 4) dan diinkubasi di dalam es selama 10 menit. Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC sehingga diperoleh supernatan. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung mikro, kemudian ditambahkan larutan 1x volume fenol-klorofrom-isoamilalkohol(PCI) (25:24:1). Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC. Supernatan yang diperoleh ditambahi dengan 1 ml alkohol absolut, kemudian diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC. Endapan yang merupakan DNA ditambahkan dengan 1 ml alkohol 70 %. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit pada suhu 4ºC. Endapan DNA yang dihasilkan kemudian dikeringkan dengan pengering kedap udara. DNA plasmid yang berupa endapan dilarutkan kembali dengan menambahkan 10-20 µl ddH2O. DNA plasmid yang sudah larut ditambahkan 0,2 x volume RNAse (1 mg/ml) untuk mendegradasi RNA kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 10 menit dilanjutkan inaktif RNAse selama 10 menit.
Hasil isolasi diketahui dengan elektroforesis agarosa 1% (b/v) menggunakan buffer TAE 1x (Lampiran 5). Langkahlangkah elektroforesis yaitu sebanyak 5 µl dicampur dengan 1 µl 6x loading dye, dimasukan ke dalam gel agarosa 1 % (b/v) dan dimigrasikan menggunakan buffer TAE 1x selama 30 menit dengan tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam dalam larutan ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10 menit, dibilas dengan akuades, kemudian pita DNA dilihat menggunakan UV transluminator dan dikuantifikasi dengan spektrofotometer UVVIS pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Isolasi Gen Gα dari Plasmid pSL16 Isolasi gen Gα dari plasmid pSL16 dilakukan dengan PCR. PCR dilakukan dengan mencampur 100 ng plasmid sebanyak 1 μl sebagai cetakan, 1 μl buffer Taq 10x, 0,2 μl dNTP 10 mM, 10 pmol primer SL-F , 10 pmol primer SL-R, 1 unit enzim Taq Polymerase dan ddH2O sampai volume akhir 10 μl. Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR 95ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 30 detik, penempelan primer 54 ºC selama 45 detik, pemanjangan 72ºC selama 1 menit dengan 34 siklus, pasca PCR 72 ºC selama 5 menit, dan pendinginan pada suhu 20 ºC selama 15 menit. Hasil PCR diperiksa dengan elektroforesis untuk itu sebanyak 5 µl hasil PCR dicampur dengan 1 µl 6x loading dye, dimasukkan ke dalam gel agarosa 1 % (b/v) dan dimigrasikan menggunakan buffer TAE 1x selama 30 menit dengan tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam dalam larutan ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10 menit, dibilas dengan akuades, kemudian pita dilihat menggunakan UV transluminator dan dielusi menggunakan Gel/PCR DNA fragment Extraction kit (Geneaid). Persiapan Vektor Ekspresi Tahapan isolasi DNA vektor ekspresi pMSH1 sama seperti isolasi plasmid pSL16. Plasmid yang sudah berhasil diisolasi kemudian diverifikasi dengan elektroforesis dan dikuantifikasi dengan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm seperti pada plasmid pSL16. DNA plasmid pMSH1 hasil isolasi kemudian dipotong menggunakan enzim restriksi XbaI dan SpeI. Sebanyak 5 μl (33,5 ng) plasmid pMSH1 ditambahkan 12 μl ddH2O, 2 μl buffer restriksi, enzim restriksi XbaI 0,5 μl (7,5 U) sebanyak, dan SpeI 0,5 μl (7,5 U) dan
3 diinkubasi pada suhu 37 ºC selama satu malam (Sambrook 1989). Ligasi Sisipan dan Vektor Ekpresi DNA gen Gα hasil PCR diligasikan pada vektor ekspresi pMSH1. Proses ligasi menggunakan enzim ligase yaitu T4 DNA ligase. Proses ligasi dilakukan selama satu malam pada suhu 4 ºC mengikuti metode Promega 1999 (Frackman & Kephart 1999) untuk itu sebanyak 2 μl (11, 866 ng) gen Gα dicampur dengan 5 μl (33, 565 ng) vektor pMSH1, 1,5 μl ddH2O, 5 μl buffer ligasi (5x) dan 0,5 μl (1,5 U) enzim ligasi T4 DNA ligase. Hasil ligasi diverifikasi keberhasilannya dengan PCR mengunakan primer spesifik 35S dan L4. PCR dilakukan dengan mencampur 1μl plasmid rekombinan sebagai cetakan, 1 μl buffer Taq 10x, 0,2 μl dNTP 10 mM, 0,25 μl primer 35S 10 pmol, 0,25 μl primer L4 10 pmol, 1 unit enzim Taq Polymerase dan 7,2 μl ddH2O dengan volume akhir mencapai 10 μl. Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR 95ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 30 detik, penempelan primer 54 ºC selama 45 detik, pemanjangan 72ºC selama 1 menit dengan 34 siklus, pasca PCR 72 ºC selama 5 menit, dan pendinginan pada suhu 20 ºC selama 15 menit. Hasil PCR sebanyak 5 µl dicampur dengan1 µl 6x loading dye, dimasukan ke dalam gel agarosa 1 % (b/v) dan dimigrasikan menggunakan buffer TAE selama 30 menit dengan tegangan 100 volt. Selanjutnya gel direndam dalam larutan ethidium bromida 0,5 μg/ml selama 10 menit, dibilas dengan akuades, kemudian pita DNA dilihat menggunakan UV transluminator Introduksi Hasil Ligasi ke dalam Bakteri E.coli Hasil ligasi antara plasmid pMSH1 dan gen Gα diintroduksikan ke dalam bakteri E.coli galur DH5α. Bakteri tersebut terlebih dahulu dibuat kompeten mengikuti metode Suharsono et al. (2002). Bakteri DH5α diambil dari koloni tunggal, dibiakkan di dalam media LB cair sebanyak 2 ml selama satu malam pada suhu 37 ºC dengan kecepatan 250 rpm dalam inkubator bergoyang. Sebanyak100 μl bakteri disubkultur di dalam media LB cair 10 ml selama 2,5 jam sampai OD 0,4-0,6 yang diukur pada panjang gelombang 660 nm. Selanjutnya bakteri diinkubasi dalam es selama 5 menit, kemudian dipindahkan ke tabung mikro dan disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4 ºC. Endapan ditambah dengan 495 μl larutan TFB (Lampiran 6) dan dilarutkan kembali. Suspensi bakteri diinkubasi di dalam es selama 10 menit kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ºC. Endapan ditambah dengan 125 μl larutan buffer transformasi (TFB) dan 8,8 μl DMSO (dimetil sulfoksida) kemudian diinkubasi di dalam es dan sel kompeten siap digunakan. Bakteri kompeten sebanyak 50 μl ditambah dengan 10 μl hasil ligasi kemudian diinkubasi selama 30 menit di dalam es. Campuran diberi perlakuan kejut panas selama 45 detik pada suhu 42 ºC kemudian diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Sebanyak 100 μl media 2YT (Lampiran 7) ditambahkan pada campuran lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ºC pada kecepatan 250 rpm dalam inkubator bergoyang. Selanjutnya bakteri tersebut disebar pada media LB padat yang mengandung antibiotik 50 mg/L higromisin dan 50 mg/L kanamisin (Lampiran 8) sebagai verifikasi hasil transformasi E.coli DH5α. HASIL Isolasi Plasmid pSL 16 dan Isolasi gen Gα dari Plasmid pSL16 Proses isolasi mengikuti metode Suharsono et al. (2002) dengan cara lisis alkalin. Plasmid pSL16 berhasil diisolasi dari bakteri E.coli. Elektroforesis DNA plasmid pSL16 menghasilkan 3 pita yang bervariasi berdasarkan topologi plasmid (Gambar 1A2). Berdasarkan hasil kuantifikasi menggunakan spektrofotometer UV-VIS, konsentrasi DNA plasmid yang diperoleh adalah 5,933 ng/μl. Berdasarkan spektrofotometri kualitas DNA yang diisolasi adalah baik yang ditunjukkan dengan perbandingan nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm adalah 1,8. Hasil isolasi berupa plasmid yang mengandung gen Gα dijadikan cetakan untuk mengisolasi gen Gα menggunakan PCR yang sudah ditambahkan situs pemotongan enzim XbaI dan SpeI. Primer yang didesain dengan penambahan situs pemotongan enzim XbaI bertindak sebagai primer forward. Primer yang bertindak sebagai primer reverse adalah primer yang sudah ditambahkan situs pemotongan enzim SpeI. Hasil PCR menghasilkan 1 fragmen yang berukuran 1380 pb yang kemudian dielusi menggunakan Gel/PCR DNA fragment Extraction kit (Geneaid) (Gambar 1B)
4 amplifikasi menghasilkaan satu berukuran 1295pb (Gambaar 3). 1
fragmen
2
1650 pb 1380 pb 1000 pb
1
1295
pb b
2 B
A
Hasil isolasi plasmid pSL L16 dan Gambar 1 H Gen Gα. (A)) Plasmid SL16 hasil isolasi, (1) penanda p λ 50 ng, (2) plasmid pSL16, (B) Fragm men Gα m hasil PCR menggunakan primer SL-F dann SL L-R V Eksprresi Persiapan Vektor Vektor berupa plassmid pMSH11 telah berhasil diiisolasi dari bakteri b E.colii. Hasil elekroforesis menunjukkkan adanya dua d pita plasmid p pMSH1. yang meerupakan Berdasarkann hasil spektrrofotometer UV-VIS U DNA yangg diisolasi berkualitas dengan konsentrasi 6,713 ng/μl. Vektor pMSH H1 hasil mudian dipootong mengggunakan isolasi kem enzim restrikksi XbaI dan SpeI S (Gambaar 2). 1
2
3
CR dari hasil ligasi pMSH H1 dan Gambar 3 PC Gα α. (1) DNA m marker (2) Fragmen Gα α dengan prim mer 35S-F dan n L4 H Ligasi ke dalam Bakteri B Introduksi Hasil E.coli Hasil ligasi telah diintrooduksikan ke dalam bakteri E.colii galur DH5α dan E. Coli teersebut telah dibiakkkan di mediia LB padatt yang mengandung antibiotik 500 mg/L higro omisin L kanamisin uuntuk menyeleeksi E. dan 50 mg/L Coli yang mengandung m plasmid. Beb berapa koloni bakterri E. coli tumbbuh di media seleksi s ini. Bakteri kompeten yyang ditransfo formasi juga j tumbuhh pada mediia tanpa anttibiotik sedangkan bakteri b komp mpeten yang tidak ditransformassi tidak tumbuuh pada mediaa yang mengandung antibiotik (Gaambar 4).
12000 pb p
b
a
Gambar
2
pMSH1 hasil isolassi dan pemotongann dengan enzim restriksi SpeI S & XbaaI. (1) pMSH1 utuh, (2) pMSH1dipootong dengaan SpeI dan XbaI , (3) DNA marrker 1kb l Plus DNA ladder
Ligasi Sisip pan dan Vektor Ekspresi Proses liigasi antara sisipan gen Gα dengan vektor eksprresi pMSH1 menggunakann enzim T4 DNA liggase dan diinnkubasi selam ma satu malam. Hassil ligasi kemuudian di PCR dengan menggunakaan primer sppesifik 35S-F F yang merupakan bagian dari promotor p pMSH dan α. Hasil L4 merupakkan bagian teengah gen Gα
c
kkan di Gambar 4 Baakteri E. Colii yang dibiak media LB. (a) bakteri yang ksi ( b) ditransformasi ddi media selek baakteri yang ditransformaasi ke media yang ttidak mengaandung n yang anntibiotik (c) ssel kompeten mengandung anntibiotik
5 PEMBAH HASAN d Fragmenn gen Gα tellah berhasil diisolasi dengan penaambahan situus pemotongann enzim restriksi XbaaI dan SpeI pada p kedua ujjungnya melalui PCR R. Penambahan situs pemootongan enzim ini dilakukan d agar fragmen gen g Gα dapat disisiipkan ke dallam vektor ekspresi e pMSH1 padda posisi dan orientasi yanng benar untuk ekspreesi. DNA veektor adalah molekul DNA yang dan dipergunakaan untuk membawa memperbanyyak fragm men DNA yang dibawanya (Lehninger 1994). Vektoor yang sering digunnakan adalah plasmid bakteeri yang merupakan materi genettik ekstra kroomosom yang diwarriskan secara tetap (Saambrook 1989). Karakteristik utaama plasmid adalah memiliki orrigin of repliication, adanyya situs pengklonan dan penanda seleksi (Dalee 1995). MSH1 membaawa gen hppt yang Vektor pM menyandikaan enzim ketahanan k t terhadap antibiotik higromisin dan genn npt k t terhadap menyandikaan enzim ketahanan antibiotik kanamisin. k K Kedua gen tersebut digunakan sebagai marrker seleksi (Brown 1996).
dari amplifikkasi ujung proomoter 35S CaMV C (Cauliflower mosaic viruus) yang beru ukuran t pada pMSH1 dan daerah 363 pb yang terdapat L4 yang terlletak pada ekkson ke 10 bagian b tengah gen Gα yang bberukuran 93 32 pb, sehingga seccara keseluruuhan fragmeen ini berukuran 1295 pb. Adanya fragmen terssebut menunjjukkan bahwa vekttor ekspresii pMSH1 sudah mengandung gen Gα pada situs Xba aI dan n Gα SpeI. Ligassi pMSH1 dan gen menghasilkann plasmid rekkombinan pM MSH1Gα yang beruukuran 15380 pb yang meru upakan penjumlahan ukuran darri vektor pM MSH1 d fragmen gen Gα 1380 pb 14000 pb dan (Gambar 5). mudian Plasmid rekombinan haasil ligasi kem diintroduksikkan ke dalam bakteri E.colii galur DH5α. Bakteeri tersebut tuumbuh pada media seleksi beruupa media LB padat yang mengandung antibiotik 500 mg/L higro omisin k dan 50 mg//L kanamisinn. Adanya kolonikoloni bakteeri yang tum mbuh pada media seleksi menunjukkan bahwa proses b transformasi telah berhhasil dan bakteri 1 yang tersebut menngandung plassmid pMSH1 mengandung gen hpt dann npt II baik k yang
G Gambar 5 Petaa fisik daerah T-DNA dari plasmid p rekom mbinan pMSH H1-Gα
p yangg telah diisollasi dan Vektor pMSH1 dipotong dengan d enzim m XbaI dann SpeI menghasilkaan satu pita saja yang beerukuran kurang lebihh 14000 pb lebbih kecil dari pMSH1 p utuh yang tidak dipotonng. Plasmid menjadi m linier karenna pemotongann pada daeraah MCS (multiple clloning site) terjadi penguurangan beberapa paasang basa sajaa. Vektor pMSH1 yanng telah teerpotong m proress ligasi. disisipi olehh gen Gα melalui Proses ligassi menggunakkan suatu ligase yaitu T4 DNA liigase. Pembuuktian bahwaa vektor sudah tersisiipi adalah denngan mengisoolasi gen dan daerah vektor yangg berdekatan dengan gen tersebutt. Amplifikassi DNA dengaan PCR menggunakaan primer speesifik 35S-F dan L4 yang didesaain dari sekuuen vektor ekspresi e pMSH1 daan Gα mennghasilkan fragmen f berukuran 1295 1 pb. Fraggmen tersebut berasal
maupun yang tidak mengandung gen Gα m mengandung gen Gα. menyaandikan neomisin Gen npptII phosphotransf p sferase yang ddapat mendeg gradasi antibiotik kannamisin sehinngga menjadii tidak beracun. E Ekspresi ggen ini akan mendetoksifikkasi senyaw wa aminoglu ukosida melalui fosfo forilasi (Chrisstou et al. 1991). Bakteri yang tidak menganndung pMSH1 1 tidak k dapat tumbuuh pada meddia tersebut karena tidak memilikki gen nptII. G Gen hpt meru upakan gen yang menyandikan hygromisin phosfotransfe p erase yang dapat mendetoksifikkasi antibiotikk higromisin. Bakteri diitransformasi dengan pMSH H1-Gα tumbuh denggan baik di media tanpaa agen seleksi (Gam mbar 4). Hall ini menunjjukkan bahwa selam ma proses trannsformasi bak kteri E. Coli tidak mengalami kerusakan atau
kematian, selain itu bakteri ini digunakan untuk melihat kondisi sel kompeten. Adanya koloni yang tumbuh menunjukkan bakteri kompeten tersebut tidak mengalami kematian. Sedangkan bakteri kompeten tidak dapat hidup di media yang mengandung agen seleksi (Gambar 4c), menunjukkan bahwa agen seleksi berfungsi dengan baik. Gen hpt dan npt II selain untuk seleksi E. coli yang mengandung plasmid pMSH1 juga digunakan untuk seleksi di dalam sel tanaman. Gen penanda seleksi ini digunakan untuk memudahkan seleksi sel atau jaringan yang tertransformasi (Stisklen 1991). SIMPULAN Vektor ekspresi rekombinan telah berhasil dikonstruksi dan dintroduksikan ke dalam bakteri E.coli galur DH5α. Bakteri yang diduga mengandung plasmid rekombinan pMSH1-Gα berhasil ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin dan higromisin. SARAN Koloni yang tumbuh di media seleksi perlu dianalisis dengan PCR, dengan menggunakan primer 35S dan L4 untuk mendapatkan bakteri yang mengandung plasmid rekombinan pMSH1-Gα. DAFTAR PUSTAKA Alberst et al. 2002. Molecular Biology of The Cell. New York: Garlan Science. Anwar S. 1999. Pengklonan gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada kedelai (Glycine max (L). Merril) [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Brown TA. 1996. Genetic a Molecular Approach. India: Routledge Chapman & Hall. Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa L) plants from agronomically important indica and japonica into immature zygotic embryos. Biotechnol 9: 957-966. Dale JW.1995. Application of in Vitro Genetics. Di dalam: Willey, Sons, editor. nd Molecular Genetic of Bactreia. 2 edition. Jhon Willey & Sons. New York, hlm 229232. Frackman S, Kephart. 1999. Rapid Ligation for the pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems. Promega notes 71: 1-8.
Fujisawa Y et al.1999. Suppression of the heterotrimeric G protein causes abnormal morphology, including dwarfism, in rice. Proc Natl Acad Sci 96: 7575-7580. Giok G. 2010. Studi anatomi dan histokimia pada akar kedelai (Glycine max (L). Merril) kandidat mutan protein Gα terhadap cekaman alumunium [skripsi]. Bogor: Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam dan Matematika, Institut Pertanian Bogor. Hartini S. 2008. Induksi mutasi dengan irradiasi sinar gamma pada kedelai (Glycine max (L). Merril) kultivar Slamet dan Lumut [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Kolle RM. 1997. A new family of G-protein regulator-the RGS proteins. Cell Biol 9:143-147. Lehninger. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Fundamental of Biochemstry. Sambrook J, Fritsch EK, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Sticklen MB. 1991. Direct somatic embryogenesis and fertile plants from rice root cultures. Plant Physiol 138:557-580 Srimulyati T. 2007. Keterlibatan protein heterotrimerik Gα terhadap cekaman aluminium pada kedelai (Glycine max (L). Merril) melalui studi histokimia [skripsi]. Bogor: Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam dan Matematika, Institut Pertanian Bogor. Suharsono et al. 2002. The heterotrimeric G protein α subunit act upstream of the small GTPase Rac in disease resistance of rice. Proc Natl Acad Sci 99 20: 13307-13312. Suharsono UW, Suharsono S. 2004. Analisis gen penyandi protein heterotrimetrik G subunit α yang terlibat dalam sistem toleransi tanaman kedelai terhadap cekaman alumunium. Laporan Penelitian Hibah Bersaing tahun ke-I. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Suharsono UW, Suharsono S. 2006. Analisis gen penyandi protein heterotrimerik G subunit α yang terlibat dalam sistem toleransi tanaman kedelai terhadap cekaman aluminium. Laporan Akhir Penelitian Hibah Bersaing XII. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Yamamoto Y, Kobayashi Y, Matsumoto H. 2001. Lipid peroxidation is an early symptom triggered by alumunium, but not the primary cause of elongations inhibition in pea roots. Plant Physiol 125:199-208.
LAMPIRAN
8 Lampiran 1 Komposisi media LB cair ditambah antibiotik Media LB: Bacto Trypton : 10 g/L Bacto Yeast : 5 g/L NaCl : 10 g/L Antibiotik: Antibiotik higromisin : 50 mg/L Antibiotik kanamisin : 50 mg/L atau Ampisilin : 100 mg/L
9 Lampiran 2 Komposisi larutan solution 1 Tris/HCL pH 7,4 25 mM EDTA 10 mM Sukrosa 15 %
10 Lampiran 3 Komposisi larutan solution 2 NaOH 200mM SDS 1%
11
Lampiran 4 Komposisi larutan solution 3 Natrium asetat pH 4,7 3 M
12 Lampiran 5 Komposisi larutan buffer TAE 1x Larutan TAE 50x : 980 ml Akuades steril : 20 ml
13 Lampiran 6 Komposisi larutan TFB MES pH 6,3 : 10 mM : 10 mM CaCl2. 2H2O [Co(NH3)6]Cl3 : 3 mM KCL : 100 mM Gliserol : 10 % Pada pH 7,4
14 Lampiran 7 Komposisi media 2YT Bacto Trypton : 16 g/L Yeast ekstrak : 5 g/L NaCl : 5 g/L Akuades steril :1L
15 Lampiran 8 Komposisi media LB padat ditambah antibiotik Media LB: Bacto Trypton : 10 g/L Bacto Yeast : 5 g/L NaCl : 10 g/L Bacto Agar : 25 g/L Akuades steril : 1L Antibiotik: Antibiotik higromisin : 50 mg/L Antibiotik kanamisin : 50 mg/L
