Mikrotechnika
Mikrotechnika
pénz, idő, tapasztalat
cél: jobban vizsgálható, jobb minőségű preparátum preparálási, festési, egyéb előkészítési eljárások vizsgálat előtt Egyszerűbb vizsgálatokhoz
Igényesebb vizsgálatokhoz
(kaparék, nyúzat, kézi metszetek) replika dörzspreparátum derítés foszlatás/macerálás kiizzítás, stb előkészítés festés tartósítás /lefedés/ (sorozatmetszetek)
SzM FM
FM TEM SEM
Replika készítése felszíni struktúrák vizsgálata – bőrszöveti sejtek mintázata kollodium, celloidin, lakk, körömlakk belső felszínek vizsgálata szilikon gumi, műgyanta kitöltések felülete (belső üregek, járatok vagy egész struktúrák replikái, pl. erezet) feladat fejes káposzta (Brassica oleacea var. capitata) belsőközépsőkülső leveleiről lakk replika készítése normál és fáziskontraszt mikroszkópos vizsgálat
Dörzspreparátum készítése (squash/quetschpräparat) feladat vöröshagyma (Allium cepa) gyökércsúcsból dörzspreparátum készítése kárminecetsavas festés, (orcein festés) 45%-os ecetsavas mosás, vizsgálat normál mikroszkóppal
Derítés (clearing) pigmentek, tartalék tápanyagok eltávolítása – áttetsző minta vizsgálata normál mikroszkóppal hagyományos lúgos-alkoholos derítés 96%-os alkoholos derítés klorálhidrátos derítés fenolos derítés
feladatok A. „Hagyományos” derítés: több lépésben elszíntelenítés 10% KOH (7) + 70% etanol (3) forralás, dv mosás
3% H2O2 oldat
forralás, dv mosás
96% etanol forralás, dv mosás
Ismeretlen fűszerkeverék „meghatározása” derítéssel B. 96% etanolos derítés: pletyka (Tradescantia sp.) levél (sebzés – H2O2 felszabadulás) 50mM TrisHCl (pH 6.0) puffer DAB (diamino-benzidin) festés – H2O2 kimutatás 96% etanolos derítés forralás 96%-os etanolban dv mosás
Igényesebb mikrotechnikai munkák strukturális kutatások citokémiai kutatások hisztokémiai kutatások (immunkémiai kutatások) Több idő, több költség, több szakmai felkészültség Élő anyag – Idő – Elváltozások fixálás kémiai fixálás, krio fixálás víztelenítés infiltráció/átitatás beágyazás ( - zselatin, celloidin) - paraffin - műgyanta metszés (mikrotóm, kés, blokk) festés (kézi metszetek is festhetőek!) tartósítás, lefedés
Fixált minta beágyazása paraffinba (műgyantás hasonló elvek alapján)
Paraffinos blokk metszése (műgyantás – hasonlóságok és különbségek)
Az elkészült metszetek festése Deparaffinálás Rehidrálás A festéket tartalmazó oldat víztartalmáig. Festés Differenciálás (Festés-Differenciálás) Dehidratálás A lefedőanyag oldószertartalmának megfelelő mértékig. Lefedés fedőlemezzel
Az oldatok festőkádakban vannak, a metszetek lépésekben az adott festéstől függő folyamatban és idő alatt jutnak el a lefedésig. (Automatizálás lehetséges megfelelő berendezéssel, pl. Leica. TP 1020)
Új alkalmazások:
immunolokalizáció, in situ hibridizáció
feladatok A. szőlő (Vitis vinifera) virág metszése paraffinos blokkból (mikrotóm, kések, blokk előkészítés) metszés metszetek kisimítása metszetek rögzülése előkészített tárgylemezen
paraffinos szőlő virág metszet festése fényzölddel (lichtgrün, 96% etanolban ) Menete: (fixálás – víztelenítés – beágyazás – metszés) metszetek paraffin kioldása, átvitel etanolba xilol xilol : absz. etanol 1:1 absz. etanol 96% etanol festés – 10 perc mosás/differenciálás 96% etanolban (rövid!!!) absz. etanol (tovább apoláros oldószerbe) tartósítás/lefedés – Euparal (ha kanadabalzsam, xilolig kell visszavinni)
B. dohány (Nicotiana tabacum) levél km. paraffinos blokkból (mikrotóm, kések, blokk előkészítés metszés metszetek kisimítása metszetek rögzülése) deparaffinálás - rehidratálás festés DNS festékkel (DAPI, propidium jodid)
C. - bab (Phaseolus vulgaris) levél km. műgyantás blokkból félvékony metszet festése melegítőasztalon festés toluidinkékkel desztillált vizes mosás, szárítás
