Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
3
Peningkatan Spektrum Antibakteri Lisozim Putih Telur dengan Modifikasi Thermal Edy Susanto* *
Program Studi Peternakan Fakultas Peternakan, Jl.Veteran 53 A, Lamongan, Indonesia Abstrak
Tujuan penelitian untuk mengetahui Pengaruh modifikasi thermal terhadap peningkatan spektrum antibakteri lisozim putih telur khususnya pada bakteri gram negatif. Metode penelitian yang digunakan adalah metode percobaan dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yaitu perlakuan suhu 40oC, 45oC, dan 50oC selama 20 menit dan kontrol yang masing-masing diulang 3 kali. Variabel yang diamati meliputi aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim pada M.lysodeikticus dan E.coli, MIC dan berat molekul fraksi protein. Hasil penelitian menunjukkan bahwa modifikasi thermal dengan perlakuan suhu yang berbeda memberikan pengaruh yang nyata (P<0,05) terhadap peningkatan spektrum antibakteri lisozim putih telur. Perlakuan suhu 50 oC selama 20 menit pada ekstrak lisozim putih telur memberikan hasil penghambatan tertinggi yaitu 12,92% terhadap bakteri gram negatif E.coli dengan Konsentrasi 1,18 mg/ml. Kata Kunci : Lisozim Putih telur, Modifikasi Thermal PENDAHULUAN Lisozim merupakan salah satu ingredient pengawet makanan yang aman (Lesnierowski dan Kijowski, 2007). Kajian Susanto (2012) menyebutkan bahwa lisozim digunakan untuk pengawetan makanan karena kemampuannya sebagai antibakteri (Vachier et al., 1995 ; Saravanan, Shanmugam, Preethi, Sathish, Anand, Amitesh, dan Devadoss, 2009). Lisozim utamanya banyak ditemukan di putih telur ayam dan bisa dibuat dalam skala komersial sebagai preparat yang mengandung aktivitas biologi (Lesnierowski dan Kijowski, 2007). Produksi telur di dunia sangat besar yaitu mencapai 61.111.000 ton (Belitz, Grosch, dan Schieberle, 2009). Sehingga produksi lisozim putih telur sangat potensial dikembangkan dalam skala industri. Lisozim mempunyai aktivitas antibakteri yaitu menghidrolisis ikatan β-1,4 dari homopolimer N-asetilglukosamin (Glc Nac) dan heteropolimer asam muramik Glc Nac-N-Asetil, yang melisis sel bakteri gram positif (Araki et al., 2003 ; Saravanan et al., 2009). Aktivitas antimikroba lisozim terbatas terhadap strain gram positif, padahal selama ini mikroorganisme yang banyak mengkontaminasi pangan asal ternak disebabkan oleh bakteri gram negatif. Perlakuan pemanasan (thermal) bisa mengakibatkan perubahan konformasi molekul lisozim, yaitu memunculkan gugus hidrofobik ke permukaan lisozim. Perubahan ini dapat meningkatkan kemampuan lisozim untuk menempel ke lipopolisakarida bakteri gram negatif (Radziejewskar dan Kijowski, 2003). Modifikasi tersebut diharapkan dapat meningkatkan spektrum antibakteri lisozim terhadap bakteri gram negatif. MATERI DAN METODE Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Putih telur ayam Ras berumur 1 tahun, asam asetat 1 N (Merck), NaCl (Merck), KCL (Merck) , NH4Cl (Merck), Buffer Phosphat (Na2HPO4 0,1 N) (Merck), Silica (SiO2) (PT.Panadia Corporation Indonesia), Aquadest, 30% bis-akrilamid (Merck), 1M HCL pH 6,8 (Merck), 1M tris HCL pH 8,8 (Merck), Aquabidest, 10% APS (Merck), 10% SDS (Merck), TEMED (Merck), Coomasie blue R-250 (Merck), Methanol (Merck), aquadest, asam asetat glasial (Merck), Gliserol 50% (Merck), Bromophenol blue 1% (Merck), Kultur bakteri : Micrococcus lysodeikticus (Sigma), E-coli (Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya) dan buffer fosfat (pH 6,24) dari NaH2PO4 (Merck) dan Na2HPO4 (Merck), Pepton (Oxoid), NB (Oxoid), NA (Oxoid), Vegetable Pepton Broth (Oxoid) dan Vegetable Pepton Agar (Oxoid). Lysozyme 0.1 mg/mL (Sigma Chemical), NaCl (Merck), Coomassie Blue G-250 (Merck), ethanol 95% (Merck) dan asam fosfat (H 3PO4) 85% (Merck). Alat
3
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
4
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex), beaker glass (Pyrex), pengaduk (Pyrex), pipet (Pyrex), petridish (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), aluminium foil, kertas whatman no.1, analitical balance (Mettler PM 200 Switzerland), Vortex (Janke 43480), refrigerated (Panasonic), magnetic stirrer 3,5 cm (Labinco), centrifuge Refrigerated Mikro 22 R (Hettich) , dan pH meter CG.818T (Schoot Gerate), Water bath digital tipe J.26, Seperangkat alat SDS-PAGE (Bio-Rad Mini Protean 3), eppendorf, micropippet 10µl - 1000 µl (Hamilton syringe), beaker glass, blue tip, yellow tip, micropippet 10µl - 1000 µl (Hamilton syringe), kuvet, spektrofotometer UV-2100 (Unico), spektrofotometer nano drop (ND-1000). Metode Ekstraksi lisozim dari putih telur Ektraksi lisozim dilakukan dengan cara menyiapkan 20 ml putih telur lalu ditambahkan asam asetat 1 N untuk mengatur tingkat pH sesuai perlakuan. Kemudian ditambahkan beberapa jenis dan konsentrasi garam sesuai perlakuan sebanyak 3 kali volume putih telur dan distirer selama 15 menit. Silica (SiO2) ditambahkan sebanyak 0,851 gr dan distirer selama 10 menit lalu di tambahkan 20 ml Buffer phosfat (NaH2PO4) dan distirer selama 5 menit. Kemudian dibiarkan semalam pada suhu 4oC, setelah itu distirer selama 5 menit. Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit, kemudian diambil supernatannya untuk dianalisis (Susanto, et al., 2013). Metode Modifikasi Lisozim Modifikasi thermal dilakukan dengan cara menyiapkan aquadest ke dalam water bath kemudian mengatur suhu pada display secara digital dengan perlakuan suhu 40 0C, 450C dan 500C yang masing-masing diulang 3 kali. Sampel diambil sebanyak 5 ml lalu dimasukkan ke dalam waterbath selama 20 menit. sampel di dinginkan sesuai suhu ruang kemudian dianalisis (Susanto, et al., 2013). Metode Penentuan Aktivitas Lisozim Membuat suspensi M.lysodeikticus dan E.coli dengan cara mencampur suspensi bakteri ke dalam 0,067 M Buffer Phosfat (pH 6,24). Kemudian diambil sebanyak 2,98 ml dan dimasukkan kedalam kuvet, lalu di spektrofotometer dengan absorbansi panjang gelombang 450 nm (A 450) hingga terbaca angka 0,6 – 0,7 di display alat. Suspensi yang telah terukur tersebut diambil sebanyak 2,98 ml dan dimasukkan kedalam kuvet, kemudian ditambahkan 20µl sampel ekstrak lisozim dan di campur hingga merata, kemudian dispektrofotometer dengan absorbansi panjang gelombang 450 nm (A 450). Angka yang muncul di display alat dicatat pada 0 detik, 30 detik, 60 detik, 90 detik dan 120 detik. Penurunan absorbansi pada Panjang gelombang 450 nm (DA 450) dari 0,001/min dicatat sebagai 1 unit aktivitas enzim dengan satuan units/ml, dihitung dengan rumus : Aktivitas Lisozim (U/ml) = (Slope A.450/min) / 0,001/min x 0,02 ml) (Jiang, Wang dan Chang, 2001). Metode Penentuan Aktivitas Spesifik Lisozim Aktivitas spesifik lisozim dihitung dengan membagi aktifitas lisozim dengan kadar protein sampel, dengan rumus : Aktivitas Spesifik Lisozim (U/mg) = (U/ml) / (protein mg/ml) (Jiang et al., 2001). Metode Penentuan Recovery Lisozim Recovery lisozim didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang didapat setelah proses ekstraksi (Chou dan Chiang, 1998) dengan rumus : Recovery Lisozim (%) = aktivitas lisozim setelah Ekstraksi x 100 aktivitas lisozim sebelum ekstraksi Metode Penentuan MIC MIC terhadap Micrococcus lysodeicticus dan E-coli ditentukan dangan metode kontak (Radiati, 2002 dan Sulandari, 2010). Metode Penentuan Berat Molekul Fraksi Protein Berat molekul fraksi protein ekstrak lisozim ditentukan dengan SDS-PAGE (Lesnierowski, Kijowski, dan Stangierski, 2003). Analisis Data
4
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
5
Data yang diperoleh dianalisis berdasarkan analisis ragam (ANOVA), apabila terdapat perbedaan antara perlakuan maka dilakukan dua uji lanjutan. yaitu Uji BNT (Beda Nyata Terkecil) dan Uji Jarak Berganda Duncan (UJBD) (Yitnosumarto, 1993). Perhitungan data dilakukan dengan program Microssoft Excel 2007, dan analisis data dilakukan dengan menggunakan program SPSS Versi 16.0. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Modifikasi Thermal pada Ekstrak lisozim terhadap M.lysodeikticus Hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa ekstrak lisozim putih telur hasil modifikasi thermal dengan perlakuan suhu 40oC, 45oC dan 50oC selama 20 menit dan kontrol tidak berpengaruh secara nyata (P>0,05) terhadap aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim yang diujikan pada bakteri grampositif M.lysodeikticus. Rerata hasil tersebut bisa dilihat pada tabel 1 dan perbedaan reratanya disajikan dalam gambar 1. Tabel 1.
Rerata Pengaruh Modifikasi Thermal terhadap Aktivitas Lisozim, Recovery Lisozim, Aktivitas Spesifik Lisozim yang diujikan pada M.lysodeikticus. Rerata Aktivitas Spesifik Lisozim (U/mg)
Perlakuan
Aktifitas lisozim (U/menit)
Recovery Lisozim (%)
Kadar protein (mg/ml)
Kontrol
45504688,16a
85,02r
4084801,45n
11,14v
0
a
r
n
Suhu 40 C
52680475,76
83,47
4728947,55
11,14v
Suhu 450 C
41737646,92a
66,13r
3746646,94n
11,14v
Suhu 500 C
28723013,02a
45,51r
2578367,42n
11,14v
Keterangan :
Superskript yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (P>0.05)
aktivitas lisozim (x100.000 U/mnt) recovery lisozim (%)
600 500 400 300 200
aktivitas spesifik lisozim (x10.000 U/mg) kadar protein(%)
100 0 kontrol
40 C
45 C
50 C
Gambar 1. Perbandingan Rerata Pengaruh Modifikasi Thermal terhadap Aktivitas Lisozim, Recovery Lisozim, Aktivitas Spesifik Lisozim yang diujikan pada M.lysodeikticus
5
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
6
. Tabel 1 dan gambar 1 menunjukkan bahwa rerata aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim yang diujikan pada M.lysodeikticus akan semakin menurun dengan naiknya perlakuan suhu meskipun penurunan tersebut tidak berbeda secara nyata (P>0,05). Rerata tertinggi aktivitas lisozim diperoleh dari perlakuan suhu 40 oC yaitu sebesar 52680475,76 U/menit. Terjadi penurunan recovery lisozim sebesar 19% pada kenaikan suhu 45 0C menuju 500C. o Rerata tertinggi aktivitas spesifik lisozim juga diperoleh dari perlakuan suhu 40 C yaitu sebesar 4728947,55 U/mg dan semakin menurun dengan meningkatnya perlakuan suhu. Modifikasi thermal pada lisozim menyebabkan terjadinya 50-70 % oligomer dan lebih dari 40 % dimer pada molekul enzim. Denaturasi panas lisozim dapat menyebabkan penurunan aktivitas lisozim terhadap bakteri gram positif tetapi memperbaiki aktivitas nya terhadap bakteri gram negatif (Ibrahim et al. 1994 ; Ibrahim, 1998 ; Lesnierowski et al. 2013). MIC Ekstrak Lisozim Hasil Modifikasi Thermal terhadap M.lysodeikticus Uji penghambatan terhadap M.lysodeikticus menunjukkan bahwa penghambatan terbesar diperoleh dari perlakuan suhu 40 oC. Hal ini sesuai dengan variabel sebelumnya yaitu aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim yang menunjukkan hasil serupa. Hasil penentuan konsentrasi penghambatan minimum (MIC) ekstrak lisozim tersebut disajikan pada tabel 2. Tabel 2. MIC Ekstrak Lisozim Hasil Modifikasi Thermal terhadap M.lysodeikcticus
Perlakuan
40oC
Jumlah koloni (Cfu/ml)
Penghambatan ( %)
Volume ekstrak (ml)
Kultur Bakteri (ml)
Vagetable pepton (ml)
Volume akhir (ml)
Konsentrasi Ekstrak (mg/ml)
awal
Kontak 24 jam
0,2
1
3,8
5
0,12
4,8 x 10⁴
1,6 x 10⁴
66,56
0,5
1
3,5
5
0,29
2,1 x 10⁵
TBUD
TBUD
1
1
3
5
0,59
3,9 x 10⁴
6,9 x 10³
82,08
1,5
1
2,5
5
0,88
3,3 x 10⁴
4,8 x 10³
85,38
2
1
2
5
1,18
2,7 x 10⁴
2,0 x 10³
92,64*
Keterangan. * : MIC, TBUD : tidak dapat untuk dihitung Tabel 2 menunjukkan bahwa penghambatan ektrak lisozim hasil modifikasi thermal akan semakin meningkat dengan penambahan konsentrasinya. Konsentrasi penghambatan minimum (MIC) ekstrak lisozim perlakuan suhu 40 0C terhadap M.lysodeikticus adalah 1,18 mg/ml dengan menghasilkan persentase penghambatan sebesar 92,64 %. Penelitian Lesnierowski, Radziejewska dan Kijowski (2001) menunjukkan bahwa 0,5 mg/ml konsentrasi ekstrak lisozim hasil modifikasi thermal mampu menghambat 32% bakteri gram positif M.lysodeicticus. Peningkatan sifat hidrofobisitas permukaan lisozim berkaitan dengan perubahan konformasi yang berperan dalam peningkatan aktifitas antimikroba pada lisozim yang telah dimodifikasi (Ibrahim et al, 1996). Jika residu lisis dari lisozim bereaksi dengan aldehid fenolik, fenilaldehid, maka molekul lisozim mengalami perubahan konformasi dan aktivitas antimikrobanya meningkat baik terhadap bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif (Ibrahim et al, 1994). Pengaruh Modifikasi Thermal pada Ekstrak Lisozim terhadap E.coli Berdasarkan analisis sidik ragam diketahui bahwa ekstrak lisozim putih telur hasil modifikasi thermal dengan perlakuan suhu 40oC, 45oC dan 50oC selama 20 menit dan kontrol memberikan pengaruh perbedaan yang sangat nyata (P<0,01) terhadap aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim yang diujikan pada bakteri gram negatif E.coli. Rerata hasil tersebut bisa dilihat pada tabel 3 dan perbandingan reratanya disajikan dalam gambar 2.
6
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
7
Tabel 3. Rerata Pengaruh Modifikasi Thermal terhadap Aktivitas Lisozim, Recovery Lisozim, Aktivitas Spesifik Lisozim yang diujikan pada E.coli Rerata Aktifitas lisozim (U/menit)
Recovery Lisozim (%)
Aktivitas Spesifik Lisozim (U/mg)
Kadar protein (mg/mL)
Kontrol
107182907,27a
100,00r
9621445,89n
11,14v
Suhu 400 C
389827113,63a
363,70r
34993457,24n
11,14v
Suhu 450 C
326171705,94a
304,31r
29279327,28n
11,14v
Suhu 500 C
502927624,92b
469,22s
45146106,37m
11,14v
Perlakuan
Keterangan :
Superskript huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda sangat nyata (P<0.01)
aktivitas lisozim (x100.000 U/mnt)
6000 5000
recovery lisozim (%)
4000 3000
aktivitas spesifik lisozim (x10.000 U/mg)
2000 1000 0 kontrol
40 C
45 C
50 C
kadar protein (mg/ml)
Gambar 2. Perbandingan Rerata Pengaruh Modifikasi Thermal terhadap Aktivitas Lisozim, Recovery Lisozim, Aktivitas Spesifik Lisozim yang diujikan pada E.coli Berdasarkan Tabel 3 dan gambar 2 diketahui bahwa rerata aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim yang diujikan pada E.coli akan semakin meningkat dengan naiknya perlakuan suhu. Rerata tertinggi aktivitas lisozim recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim diperoleh dari perlakuan suhu 50oC yaitu masing-masing sebesar 502927624,92 U/menit, 469,22 % dan 45146106,37 U/mg. Terjadi interaksi oligomer lisozim dengan membran sel bakteri gram negatif sehingga terjadi peningkatan permukaan hidrofobisitas lisozim (Lesnierowski et al. 2013). Peningkatan permukaan hidrofobisitas larutan protein putih telur terjadi diatas temperatur 50 oC (Plancken et al. 2006 ; Thammarat et al. 2011). Peningkatan aktivitas lisozim pada bakteri gram negatif juga diduga disebabkan adanya polimerasi lisozim akibat peningkatan suhu (Lesnierowski, Radziejewska dan Kijowski, 2001). Penelitian lainnya menyebutkan bahwa modifikasi thermal terhadap lisozim dapat membentuk total polimer 27,2 %, monomer 72,2 % dimer 27,2 % dan trimer 0 % yang bersifat irreversible. MIC Ekstrak Lisozim Hasil Modifikasi Thermal terhadap E.coli Berdasarkan Uji penghambatan terhadap E.coli diketahui bahwa perlakuan suhu 500C menghasilkan persentase penghambatan yang paling besar. Rerata tertinggi variabel sebelumnya yaitu aktivitas lisozim, recovery lisozim dan aktivitas spesifik lisozim juga diperoleh dari perlakuan suhu 500C. Hasil penentuan konsentrasi penghambatan minimum (MIC) ekstrak lisozim tersebut disajikan pada tabel 4.
7
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
8
Tabel 4. MIC Ekstrak Lisozim hasil modifikasi thermal terhadap E.coli
Perlakuan
o
50 C
Volume ekstrak (ml)
Kultur Bakteri (ml)
Vagetable pepton (ml)
Volume akhir (ml)
Konsentrasi Ekstrak (mg/ml)
0,2 0,5 1 1,5 2
1 1 1 1 1
3,8 3,5 3 2,5 2
5 5 5 5 5
0,12 0,29 0,59 0,88 1,18
Jumlah koloni (Cfu/ml) awal 2,8 x 10⁵ 3,0 x 10⁵ 3,0 x 10⁵ 3,1 x 10⁵ 3,1 x 10⁵
Kontak 24 jam 2,7 x 10⁵ 2,8 x 10⁵ 2,9 x 10⁵ 2,8 x 10⁵ 2,7 x 10⁵
Penghambatan ( %) 5,11 7,14 7,76 9,72 12,92
Keterangan : tidak ada yang mencapai penghambatan ≥ 90% Berdasarkan tabel 4 diketahui bahwa secara umum hasil uji penghambatan ekstrak lisozim hasil modifikasi thermal terhadap E.coli belum mencapai MIC (≤ 90%). Persentase penghambatan terhadap E.coli akan semakin tinggi dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak lisozim. Hasil penghambatan tertinggi diperoleh dari ekstrak lisozim perlakuan suhu 50 oC dengan konsentrasi 1,18 mg/ml yaitu sebesar 12,92 %. Aktifitas antimikroba dari lisozim dapat dirubah menjadi aktif terhadap bakteri gram negatif melalui genetik peptide hidrofobik ke terminal C lisozim (Ibrahim et al, 1994). Aktivitas bakteriolitik lisozim terhadap bakteri gram negatif melalui perusakan fungsi antara gugus fosfat dari fosfolipid dengan lipopolisakarida di membran luar bakteri gram negatif (Ibrahim et al., 1994). Hasil Penelitian ini membuktikan bahwa modifikasi thermal lisozim putih telur dapat meningkatkan spektrum antibakteri utamanya pada bakteri gram negatif E.coli. Profil Fraksi Protein Ekstrak Lisozim Hasil Modifikasi Thermal Berdasarkan hasil perhitungan berat molekul diketahui bahwa perlakuan suhu yang berbeda tidak menyebabkan perbedaan pita protein yang diperoleh. Hal ini sama dengan pita protein yang muncul pada proses sebelumnya yaitu perlakuan jenis dan konsentrasi garam.Profil fraksi protein hasil modifikasi thermal dapat dilihat pada gambar 3. 1
2
3
4
M 260 kDa
70 kDa 50 kDa 40 kDa 35 kDa
15 kDa 14,6 kDa
10 kDa
Keterangan: M = Marker, 1 = Perlakuan suhu 0 oC, 2 = Perlakuan suhu 40oC, 3 = Perlakuan suhu 45oC, 4 = Perlakuan suhu 50oC Gambar 6. Profil Fraksi Protein Ekstrak Lisozim Hasil Modifikasi Thermal Gambar 6 menunjukkan bahwa terdapat 3 fraksi protein yang mempunyai berat molekul 78,5 kDa, 54,8 kDa dan protein target dengan berat molekul 14,6 kDa. Munculnya protein non lisozim akibat adanya bentuk polimer lisozim (Lesnierowski, Kijowski dan Stangierski, 2003). Teknik ektraksi dengan silica (SiO2) yang dimodifikasi secara thermal tidak menyebabkan hilangnya protein lisozim. Molekul lisozim terdiri dari empat ikatan disulfida (S – S), hal ini yang
8
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
9
menyebabkan lisozim stabil pada suhu tinggi, bersama dengan enam bagian helix (Lesnierowski, Radziejewska dan Kijowski, 2001). KESIMPULAN Modifikasi thermal dengan perlakuan suhu yang berbeda memberikan pengaruh yang nyata o (P<0,05) terhadap peningkatan spektrum antibakteri lisozim putih telur. Perlakuan suhu 50 C selama 20 menit pada ekstrak lisozim putih telur memberikan hasil penghambatan tertinggi yaitu 12,92% terhadap bakteri gram negatif E.coli dengan Konsentrasi 1,18 mg/ml. REFERENSI Belitz, H. D., W. Grosch, and P. Schieberle, 2009. Eggs. Food Chemistry © Springer. Chou, S. T., and B. H. Chiang, 1998. Reversed Micellar Extraction of Hen Egg Lysozyme. J. Food Sci. 63 (3) : 399-402. Ibrahim, H.R., H. Hatta, M. Fujiki, M. Kim and T. Yamamoto, 1994. Enhanced Antimicrobial Action of Lysozyme Against Gram-Negative Bacteria Due to Modification Penilaldehid. J.Agric Food Chem. 42 : 1813-1817 .
, H.R., S.Highasiguchi, M.Koketsu, L.R.Juneja, M.Kim., T.Yamamoto, Y.Sugimoto, and T.Aoki, 1996. Partially Unfolded Lysozyme at Neutral pH Aglutinates and Kills GramNegative and Gram-Positive Bacteria Through Membrane Damage Mechanism. J.Agric Food Chem. 44 : 3799-3806
Jiang, C. M., M. C. Wang, W. H. Chang, and H. M. Chang, 2001. Isolation of Lysozyme from Hen Egg Albumen by Alchohol-Insoluble Cross-Linked Pea Pod Solid Ion-Exchange Chromatography. J. Food Sci. 66 (8) : 1089-1092. Lesnierowski, G., and J. Kijowski, 2007. Lysozyme. Bioactive Egg Compounds. © Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Lesnierowski, G., J. Kijowski, and J. Stangierski, 2003. DCS, SDS-PAGE and Spectrophotometry for Charactization of Modified Lysozyme. Electronic Journal of Polish Agric.Universities. J. Food Sci. and Tech. 6.(1) Lesnierowski, G., C. Radziejewska, and J. Kijowski, 2001. Antibacterial Activity of Thermally modified Lysozime. Electronic Journal of Polish Agric.Universities. J. Food Sci. and Tech. 4 (2). Lesnierowski G., Borowiak R., C. Radziejewska and J. Stangierski, 2013. Resorcinol as Protective Agent in Thermo-Chemical Modification of Lysozyme Department of Food Quality Management, Faculty of Food Science and Nutrition. Poznan University of Life Sciences. Wojska Polskiego. Poland Radiati, L.E. 2002. Penghambatan Bakteri Enteropatogen oleh Ekstrak Dikloro-Metan Jahe. Jurnal Habitat. Vol. 13 (2): 81-91. Radziejewska, C., G. Lesnirowski, and J. Kijokowski, 2003. Antibacterial Activity of Lysozyme Modified by The Membrane Technique. Electronic Journal of Polish agricultural Universities. J. Food sci. and Tech. 6 (2). Saravanan, R., A. Shanmugam, A. Preethi, K. D. Sathish, K. Anand, S. Amitesh, and F. R. Devadoss, 2009. Studies on isolation and partial purification of lysozyme from egg white of the lovebird (Agapornis species). African J. Biotech. 8 (1) : 107-109. Sulandari, Lilis, 2010. Pengujian Aktivitas Antimikroba dengan Metode Kontak Ekstrak Biji Keluwak (Pangium Edule) Terhadap Bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. Jurnal Boga dan Gizi Universitas Negeri Surabaya. Vol. 6 (1). Susanto E., 2012. Kajian Ektraksi Lisozim Putih Telur dengan menggunakan Mika. J. Ternak Fakultas Peternakan UNISLA Vol.3 No.2 : 19-23 Thammarat K., Soottawat B., and Wonnop V., 2011. Effect of NaCl on thermal aggregation of egg white proteins from duck egg. J. Food Chem. 125: 706–712.
9
Jurnal Ternak, Vol.04, No.02, Desember 2013
ISSN 2086 - 5201
10
Yitnosumarto, S., 1993. Percobaan Rancangan Analisis dan Interpretasinya. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
10
