PENINGKATAN PRODUKSI LISTRIK SEL BAHAN BAKAR MIKROBA DENGAN PENGHILANGAN rpoS DARI Escherichia coli
ANISA NURUL ROSNADIA
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Peningkatan Produksi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba dengan Penghilangan rpoS dari Escherichia coli adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, April 2016
Anisa Nurul Rosnadia NIM F34110016
ABSTRAK ANISA NURUL ROSNADIA. F34110016. Peningkatan Produksi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba dengan Penghilangan rpoS dari Escherichia coli. Dibimbing oleh PRAYOGA SURYADARMA Sel bahan bakar mikroba (Microbial Fuel Cell disingkat MFC) merupakan salah satu alternatif produksi listrik yang memanfaatkan mikroba untuk mengubah energi kimia dalam biomassa menjadi listrik. Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen (NADH), produk metabolisme karbon pusat dan asam nukleat, merupakan komponen utama dalam pembentukan sistem MFC. Peningkatan NADH dilakukan dengan menghilangkan rpoS dan menigkatkan putaran pada kultivasi Escherichia coli untuk merekayasa metabolisme. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan pengaruh penghilangan rpoS pada E. coli dan putaran kultur bergoyang terhadap peningkatan listrik MFC. E.coli dikutivasi dalam kondisi aerobik pada media Luria Bertani yang diperkaya glukosa. Pengukuran tegangan dilakukan di akhir fase stasioner, yakni kultivasi jam ke-24. Tegangan listrik yang dihasilkan E. coli yakni 7.25 mV. Sementara, produksi listrik oleh E. coli yang kehilangan gen rpoS meningkat signifikan, 1.5 kali lipat dari sel induk, yakni 10.25 mV. Peningkatan produksi listrik lebih jauh, yakni 2.25 kali lipat dicapai dengan peningkatan putaran E. coli ∆rpoS, hingga tegangan mencapai 23 mV. Kata Kunci:
Escherichia coli, gen rpoS, kultivasi aerobik, MFC, NADH, oksigenasi ABSTRACT
ANISA NURUL ROSNADIA. F34110016. Enhancement of Electricity Production in Microbial Fuel Cell by Deleting rpoS of Escherichia coli. Supervised by PRAYOGA SURYADARMA Microbial Fuel Cell is one of the alternative electricity production through conversion of chemical energy in the biomass into electricity by microbes. Nicotinamide Adenosin Dinucleotide Hydrogen (NADH), carbon metabolism and nucleic acid metabolism product, is the main component to build the MFC system. The enhancement of NADH is occurred by deleting rpoS and increasing the rotation speed of Escherichia coli cultivation. The objective of this research is investigating the effect of rpoS deletion of E. coli and agitation rate enhancement on electricity production. E. coli is cultivated aerobically in Luria Bertani glucose enriched substrate. The voltage of E. coli MFC is measured in the end of stationary phase, 24h. The voltage produced by E. coli is 7.25 mV. The deletion of rpoS enhance the voltage significantly, until 1.5 times, become 10.25 mV. Further electricity production, up to 2.25 times, is produced by increasing the agitation rate, and the voltage become 23 mV. Keyword: aerobic cultivation, Escherichia coli, MFC, NADH, oxygenation, rpoS gene
PENINGKATAN PRODUKSI LISTRIK SEL BAHAN BAKAR MIKROBA DENGAN PENGHILANGAN rpoS DARI Escherichia coli
ANISA NURUL ROSNADIA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Teknologi Industri Pertanian
DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas rahmat dan ridho dari-Nya skripsi yang berjudul Peningkatan Produksi Listrik Sel Bahan Bakar Mikroba dengan Penghilangan rpoS dari Escherichia coli berhasil diselesaikan. Shalawat dan salam pun penulis curahkan pada Nabi Besar Muhammad SAW Terima kasih yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada: 1. Dr. Prayoga Suryadarma, S.TP, MT selaku dosen pembimbing atas bimbingan, gemblengan, dan motivasinya. 2. Seluruh dosen Teknologi Industri Pertanian atas ilmu yang bermanfaat 3. Seluruh staff dan laboran Teknologi industri Pertanian yang telah banyak membantu hal-hal administratif dan terlaksananya penelitian . 4. Rival, Sabroni, kak Fithri, kak Indra, dan kak Wahyu selaku rekan kerja selama penelitian. Seluruh teman, sahabat, kerabat, dan pihak-pihak lain yang telah banyak 5. membantu namun tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan memberi kontribusi dalam perkembangan ilmu pengetahuan, khususnya perkembangan agroindustri di Indonesia
Bogor, April 2016
Anisa Nurul Rosnadia
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Hipotesis Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian METODOLOGI Bahan Alat Tahapan Penelitian HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh NADH terhadap Tegangan Listrik MFC Pengaruh Perbedaan Lama Kultivasi Anolit terhadap Perbedaan Produksi Tegangan Listrik Perubahan Produksi Tegangan Listrik akibat Penghilangan rpoS dan Peningkatan Laju Oksigenasi SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
vi vi vi 1 1 2 3 3 3 4 4 4 5 6 6 7 9 13 13 13 14 16 20
DAFTAR TABEL 1 Ringkasan analisis bobot sel kering, tegangan spesifik, konsumsi glukosa, piruvat, dan asetat larutan anolit kultur E. coli dan E. coli ∆rpoS 10
DAFTAR GAMBAR 1 Ilustrasi pembentukan listrik dalam Microbial Fuel Cell 2 Produksi tegangan listrik MFC pada perbedaan konsentrasi NADH dalam larutan anolit 3 Produksi tegangan listrik dari larutan anolit pada perbedaan lama kultivasi E. coli BW 25113 4 Jalur pusat metabolisme karbon Escherichia coli pada kondisi aerobik
1 7 8 9
5 Pengaruh penghilangan rpoS dan peningkatan oksigenasi pada anolit kultur E. coli kultivasi selama 24 jam terhadap produksi tegangan listrik 10 6 Metabolisme (a) karbon pusat (b) jalur de novo sintesis pirimidin (c) jalur de novo degradasi pirimidin 12
DAFTAR LAMPIRAN 1 Prosedur pembuatan larutan NADH 2 Prosedur pembuatan rangkaian listrik MFC 3 Prosedur pembuatan stok gliserol 4 Prosedur prakultivasi 5 Prosedur kultivasi 6 Prosedur analisis bobot sel kering 7 Prosedur analisis glukosa sisa 8 Prosedur analisis asam organik
16 16 16 17 17 17 17 18
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Di era modern ini, energi listrik telah menjadi kebutuhan primer bagi manusia. Permintaan tenaga listrik dari tahun ke tahun mengalami peningkatan dengan pertumbuhan rata-rata 10.1 % per tahun (Kementrian ESDM 2015). Di sisi lain, produksi sumber energi listrik seperti minyak mentah dan batu bara justru mengalami penurunan. Selain itu, proses produksi listrik dari sumber-sumber tersebut menghasilkan emisi CO2 yang mengakibatkan efek gas rumah kaca. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mencari sumber energi alternatif yang dapat mengatasi kelangkaan sumber energi dan emisi terhadap lingkungan. Namun, penggunaan beberapa sumber energi alternatif memiliki kekurangan. Penggunaan nuklir beresiko memberi dampak radiasi dan ledakan besar, energi surya membutuhkan biaya tinggi dan lahan luas, sementara energi hidro berpotensi merusak habitat dan efisiensi rendah. Sumber-sumber energi alternatif lain yang ditemukan berasal dari bahan-bahan organik, dimana mikroba memegang peranan penting dalam proses konversi energi, antara lain biogas, bioetanol, gas hidrogen, dan sel bahan bakar mikroba (Microbial Fuel Cell disingkat MFC). Sumber energi baru yang dibutuhkan untuk menjawab kelangkaan dan masalah lingkungan haruslah memiliki efisiensi tinggi, dapat diperbaharui, tidak menghasilkan emisi gas berbahaya, dan tidak membahayakan. MFC merupakan salah satu alternatif produksi listrik yang kuncinya terletak pada aktivitas metabolisme mikroba. MFC diaplikasikan dengan penyusunan sel elektrolisis pada substrat yang mengandung mikroba dan zat lain yang akan direduksi. Pada MFC, elektron hasil metabolisme akan mengalir melalui anoda sirkuit terbuka dan ditangkap oleh elektron akseptor pada katoda (Gambar 1). Proses ini akan menyebabkan perpindahan elektron dari anoda ke katoda (Logan 2007). ˄˄˄
e
O2
glucose
H+ NAD+
MB
e NADH
MB
CO2
acetate
Gambar 1 Mekanisme produksi listrik dalam Microbial Fuel Cell
2 Keuntungan dari penggunaan MFC yakni tingginya efisiensi untuk menghasilkan listrik. Pada sumber energi alternatif konvensional seperti gas metan, bioetanol, dan gas hidrogen, kandungan energi dalam biomassa dan limbah organik dapat dimanfaatkan dalam bentuk energy carrier seperti cairan (bioetanol) dan gas (metan dan hidrogen). Pelepasan energi dalam bentuk gas dan cairan efektif jika bahan tersebut dibakar setelah melalui tahap fermentasi. Sementara pada MFC, energi yang terdapat pada bahan organik dikonversi langsung menjadi energi tanpa melalui pembakaran. Konversi untuk melepas energi ke dalam bentuk-bentuk tersebut menurunkan efisiensi dalam jumlah tinggi. Efisiensi penggunaan bioetanol yakni sebesar 10 %-25%, biogas sebesar 35 %, gas hidrogen 15 %- 30%, dan MFC sebesar 100 %. (Rabaey et al. 2005) Pada awal ditemukannya, MFC terdiri dari dua tabung. Kini berbagai desain telah dikembangkan menjadi tiga hingga satu tabung. Pada desain dua tabung, anoda diisi dengan kultur mikroba sementara katoda diisi dengan bahan kimia yang memiliki potensial tinggi seperti larutan ferisianida. Desain dua tabung memiliki kekurangan dalam hal efisiensi tempat dan limbah bahan kimia. Kekurangan tersebut ditutupi dengan dikembangkannya desain satu tabung dimana peran larutan kimia pada katoda digantikan oleh oksigen di luar tabung. Hal ini dilakukan karena oksigen memiliki kemampuan yang baik dalam menangkap elektron. Selain itu, tidak banyak larutan kimia yang digunakan sehingga minim limbah kimia berbahaya. (Muralidharan et al. 2011) Berbagai parameter yang dapat dikembangkan untuk peningkatan kapabilitas MFC antara lain jalur metabolisme bakteri, efisiensi anoda dan katoda, dan kinerja Proton Exchange Membrane (PEM). Rekayasa jalur metabolisme dilakukan untuk meningkatkan konsentrasi NADH di dalam sel bakteri (Rabaey et al. 2005). Awalnya, bakteri yang digunakan dalam MFC yakni bakteri pereduksi logam. Bakteri ini memiliki sitokrom-c yang berfungsi sebagai pembawa elektron dan dapat keluar dari sel (Park 2001). Namun aplikasi ini sulit dikembangkan karena kurangnya pengetahuan tentang metabolisme bakteri tersebut. Pengembangan MFC dilakukan dengan memperluas jenis bakteri. McKinlay dan Zeikus (2004) menyatakan bahwa E. coli dapat digunakan untuk produksi listrik dengan menggunakan mediator sebagai oksidator NADH dan transpor elektron. Penggunaan E. coli pada MFC didasari pada kemampuannya untuk hidup baik maupun tanpa oksigen dan luasnya penggunaan bakteri tersebut dalam rekayasa genetika sehingga mudah diaplikasikan untuk peningkatan jalur produksi NADH. Selain itu, E. coli efisien dalam mengonsumsi berbagai sumber karbon sehingga murah dan mudah digunakan.
Perumusan Masalah Peningkatan jumlah NADH dalam larutan anolit merupakan hal penting dalam mengembangkan aplikasi MFC. Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen (NADH) merupakan koenzim dalam metabolisme utama seperti metabolisme karbon pusat, sintesis asam lemak, sintesis steroid, dan sintesis asam nukleat. Pada metabolisme karbon pusat, NADH diproduksi dari konversi glukosa di jalur glikolisis dan siklus kreb. Di dalam sel elektrolisis tabung MFC, NADH dioksidasi hingga terbentuk NADH yang kehilangan proton H+ (NAD+), ion
3 hidrogen, dan elektron. Sejumlah elektron hasil oksidasi akan ditangkap oleh anoda dan dialirkan menuju katoda untuk dilepas pada zat dengan nilai potensial lebih tinggi. Aliran elektron dari anoda menuju katoda akan menghasilkan arus listrik. Pada jalur metabolisme karbon pusat, produksi NADH dapat dioptimalkan dengan mengatur kultivasi E. coli pada kondisi stres oksigen (Omilusik 2001) dan menambah konsentrasi karbon pada substrat. Di sisi lain kedua hal tersebut berimplikasi pada overflow metabolism, perubahan konversi piruvat menjadi asetat yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan. Sementara itu, pada jalur metabolisme asam nukleat, NADH dihasilkan di jalur de novo. Oleh karena itu, dibutuhkan strategi peningkatan NADH dalam sel E. coli tanpa efek samping yang menurunkan produksi NADH untuk mendapatkan peningkatan listrik pada MFC.
Hipotesis Peningkatan produksi NADH dalam sel E. coli dapat dilakukan dengan berbagai cara, salah satunya dengan penghilangan rpoS dari E. coli. Gen rpoS merupakan gen yang berperan aktif saat E. coli dikultivasi pada kondisi stres dalam menekan metabolisme di jalur glikolisis, siklus kreb, dan sintesis pirimidin. Selain itu, rpoS mampu meningkatkan pembentukan asetat. Penghilangan rpoS menyebabkan hilangnya dampak rpoS dalam jalur metabolisme sehingga meningkatkan jalur glikolisis, siklus kreb, dan menekan produksi asetat. Selain itu, pada metabolisme asam nukleat, peningkatan terjadi pada sintesis pirimidin di jalur de novo. Jalur glikolisis, siklus kreb, dan sintesis pirimidin merupakan jalur produksi NADH sehingga peningkatan pada jalur tersebut berimplikasi pada peningkatan NADH. Jalur pembentukan asetat merupakan konversi piruvat menjadi asetat sehingga mengurangi laju konversi karbon menuju siklus kreb. Penekanan produksi asetat menunjukkan peningkatan konversi karbon yang memasuki siklus kreb sehingga meniingkatkan produksi NADH. Salah satu kondisi stres yang dapat diberikan pada pertumbuhan E. coli yakni dengan oksigenasi tinggi. Sehubungan dengan upaya peningkatan NADH, peran rpoS yang aktif saat oksigenasi tinggi dikonfirmasi melalui peningkatan oksigenasi pada proses kultivasi E. coli yang telah dihilangkan rpoS-nya. Pengaruh penghilangan rpoS terhadap peningkatan NADH akan lebih optimal saat diberi peningkatan stres oksigen.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengaji pengaruh penghilangan rpoS E. coli terhadap peningkatan produksi tegangan listrik pada MFC sistem tabung tunggal. Selain itu, bertujuan pula untuk mengaji peningkatan lebih lanjut peningkatan tegangan listrik MFC akibat peningkatan oksigenasi pada kultivasi E. coli.
Manfaat Penelitian Penelitian ini bermanfaat sebagai informasi mengenai pengaruh penghilangan rpoS dari E. coli terhadap peningkatan tegangan listrik pada MFC yang digunakan.
4 Selain itu, penelitian ini juga dapat digunakan sebagai informasi peningkatan tegangan listrik akibat peningkatan laju oksigenasi pada kultivasi E. coli.
METODOLOGI Bahan Bakteri yang digunakan sebagai induk adalah E.coli BW25113. Sementara mutan yang digunakan yakni E. coli BW25113 yang telah dihilangkan gen rpoSnya atau disebut E. coli ΔrpoS. Kedua strain didapatkan dari National Bio-resource Project (NBRP) Jepang. Bahan lain yang digunakan antara lain media prakultivasi, media dan bahan kultivasi, serta bahan operasi MFC. Media prakultivasi yang digunakan yakni Luria Bertani (LB) yang terdiri 10 g polypepton, 5 g yeast extract, dan 10 g natrium klorida per liter aquades. Media kultivasi yang digunakan yakni LB yang diperkaya glukosa dengan konsentrasi 40 g per liter aquades. Kultivasi kedua bakteri dilakukan dengan penambahan buffer CaCO3 sebanyak 20 g/L (Suryadarma et al. 2012). Saat pengukuran listrik, bahan lain yang dibutuhkan yakni jembatan garam dan mediator. Jembatan garam yang digunakan dibuat dari bacto agar dengan konsentrasi 10 % dan KCl 4 % dalam aquades (Nair et al. 2013). Mediator yang digunakan yakni Methylene Blue (MB) dengan konsentrasi 300µM terhadap hasil kultivasi dalam tabung MFC (Taskan et al. 2008). Sementara pengukuran listrik untuk melihat pengaruh NADH terhadap produksi listrik, bahan yang digunakan yakni glucose kit dengan konsentrasi glukosa 0.5 g dan 1 g per liter aquades. Bahan yang digunakan untuk analisa glukosa sisa antara lain larutan glukosa dengan konsentrasi 50 ppm hingga 250 ppm dan larutan DNS yang terdiri dari 5.3 g DNS, 9.9 g NaOH, 153 g potassium tartarat, 3.8 g fenol, dan 4.15 g natrium metabisulfit dalam 708 ml aquades. Pada analisa bobot sel kering bahan yang digunakan yakni larutan HC 1M. Sementara pada analisa asam organik, bahan yang digunakan yakni larutan asam organik dan fase bergerak. Asam organik yang digunakan antara lain asam asetat dan piruvat dengan konsentrasi 0.5, 1, dan 2 g per liter aquades. Fase bergerak yang digunakan yakni larutan berpH 2 yang terdiri atas 99 % NaH2PO4 20 mM dan 1 % ACN.
Alat Alat yang digunakan untuk prakultivasi dan kultivasi antara lain labu erlenmeyer 250 ml, buffle flask 250 ml, gelas ukur, gelas piala, mikropipet 1000 µl dan 100 µl, otoklaf 121oC, clean bench, inkubator bergoyang 200 dan 250 rpm suhu 37oC, timbangan analitik, alumunium foil, sudip, dan pH meter Beckman. Pada proses pengukuran tegangan MFC, alat-alat yang digunakan antara lain botol Schott Durant 100 ml, stopper karet yang telah dilubangi, pipa kaca berdiameter ±1 cm dengan panjang 5 cm, 2 buah grafit masing-masing berdiameter 0.3 cm dan memiliki panjang 5.3 cm dan 7 cm, magnetic stirrer, suntikan 10 ml,
5 kabel tembaga dengan panjang ± 50 cm, resistor 100 Ω dan 1 000 Ω, capit buaya, dan multimeter. Sementara pada proses analisa, alat-alat yang dibutuhkan antara lain tabung ulir, spektrofotometer Hach DR 2500, vortex, mikropipet 1000 µl dan 100 µl, eppendorf tube, syringe filter 0,2 µm, sentrifugator 10 000 rpm 4oC, HPLC, dan kolom ZORBAX SB-Aq 883975-914.
Tahapan Penelitian Penentuan Pengaruh Peningkatan Konsentrasi NADH terhadap Produksi Listrik MFC Langkah pertama penentuan pengaruh peningkatan konsentrasi NADH terhadap produksi listrik MFC yakni penyiapan sampel larutan NADH dengankonsentrasi 1 g/L dan 2 g/L yang berasal dari glucose kit (F-Kit 716251). Pembuatan sampel dijelaskan pada Lampiran 1. Sampel dimasukkan ke dalam tabung MFC dan dilarutkan kembali dengan aquades hingga volume total mencapai 115 ml. Detail pembuatan rangkaian MFC dijelaskan pada Lampiran 2. Setelah rangkaian listrik dan sampel siap, magnetic stirrer disiapkan. Multimeter dinyalakan, kemudian ditunggu ±30 detik hingga stabil. Larutan methylene blue dengan konsentrasi 300 µM terhadap seluruh anolit (Taskan et al. 2008) dimasukkan ke dalam tabung. Saat pertama larutan memasuki sampel, saat itulah menit ke-0 pengukuran tegangan listrik dilakukan. Pengukuran tegangan dilakukan tiap menit selama 20 menit (Park et al. 2000). Penentuan Pengaruh Lama Kultivasi terhadap Produksi Listrik MFC Pada proses penentuan pengaruh lama kultivasi terhadap produksi listrik, sampel yang digunakan adalah kultur hasil kultivasi E. coli BW 25113. Penyiapan sampel dilakukan melalui tiga tahapan, yakni pembuatan stok gliserol, prakultivasi, dan kultivasi. Pembuatan stok gliserol digunakan untuk menyimpan E. coli yang akan digunakan dalam penelitian. Gliserol berperan sebagai senyawa krioprotektan yang dapat mengurangi dampak negatif dari pembekuan (Machmud 2001). Prosedur pembuatan stok gliserol dijelaskan dalam Lampiran 3. Prakultivasi dilakukan untuk menyegarkan kembali sel E. coli setelah masa dorman sehingga dapat tumbuh dengan baik saat dikultivasi. Prosedur prakultivasi dapat dilihat di Lampiran 4. Berikutnya, yakni kultivasi, dilakukan secara aerobik menggunakan kultur bergoyang dengan putaran 200 rpm dan suhu 37oC selama 0, 6, 12, 18, dan 24 jam. Detail prosedur kultivasi dapat dilihat di Lampiran 5. Sampel diambil dari masing-masing lama waktu kultivasi. Setelah itu, sampel dimasukkan ke dalam tabung dan pengukuran listrik MFC dilakukan. Penentuan Pengaruh Penghilangan rpoS dan Peningkatan Oksigenasi terhadap Produksi Listrik MFC Pada proses penentuan pengaruh penghilangan rpoS dan peningkatan putaran terhadap produksi listrik, selain E. coli BW 25113, sampel lain yang digunakan yakni hasil kultivasi E. coli BW 25113 ∆rpoS. Tahap penyiapan sampel dilakukan sama seperti pada proses penentuan pengaruh lama kultivasi terhadap produksi listrik, yakni prakultivasi dan kultivasi. Pengaruh penghilangan rpoS
6 dilakukan dengan kultivasi E. coli dengan kultur bergoyang 200 rpm. Sementara pengaruh peningkatan oksigenasi dilakukan dengan meningkatkan putaran pada kultivasi E. coli ∆rpoS dari 200 menjadi 250 rpm. Lama waktu kultivasi masingmasing strain yakni 24 jam. Setelah sampel siap, pengukuran tegangan listrik dilakukan. Analisis Pada penelitian, analisis yang dilakukan antara lain bobot sel kering, glukosa sisa dengan menggunakan DNS, dan asam organik. Sampel diambil setelah proses kultivasi selesai sebelum pengukuran tegangan listrik. Untuk analisis glukosa sisa dan asam organik, sampel terlebih dahulu disimpan dalam eppendorf tube 1.5 ml, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm dan suhu 4oC selama 2 menit untuk memisahkan supernatan dan pelet. Kemudian, supernatan disaring menggunakan syringe filter 0.2 µm. Analisis bobot sel kering dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan E. coli dan langsung dilakukan setelah proses kultivasi. Sampel diukur nilai ODnya menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500 pada absorbansi (λ) 660 nm. Nilai OD yang diperoleh dikonversi dengan dikalikan 0.36 (Ojima et al. 2012). Detail analisis bobot sel kering dapat dilihat pada Lampiran 6. Analisis glukosa sisa dilakukan untuk mengetahui jumlah glukosa yang dikonsumsi E. coli. Sampel yang telah siap dicampur dengan larutan DNS dan diukur OD-nya mengguakan spektrofotometer Hach DR 2500. Nilai OD yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi bobot glukosa berdasarkan kurva standar yang telah dibuat. Prosedur analisis glukosa sisa dan kurva standar dapat dilihat di Lampiran 7. Analisis sisa asam organik dilkukan untuk mengetahui jumlah asam-asam organik yang dihasilkan E.coli selama bermetabolisme. Kolom yang digunakan yakni kolom ZORBAX SB-Aq 883975-914. Sementara fase bergerak yang digunakan antara lain NaH2PO4 20 mM, pH2, 1% ACN. Prosedur analisis asam organik ditunjukkan oleh Lampiran 8.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh NADH terhadap Tegangan Listrik MFC NADH merupakan koenzim yang melepas elektron dalam rangkaian metabolisme bakteri untuk menghasilkan energi (Moat et al. 2002). Kemampuan melepas elektron inilah yang menyebabkan NADH memegang peranan sebagai pendonor elektron (Alim et al. 2007; Saha et al. 2007). Semakin tinggi konsentrasi NADH dalam larutan anolit MFC, semakin banyak elektron yang dapat dihasilkan dan dialirkan dalam sel elektrolisis sehingga tegangan listrik yang dihasilkan semakin tinggi. Untuk mengawali penelitian ini, langkah pertama yang dilakukan yakni konfirmasi pengaruh konsentrasi NADH dalam larutan anolit terhadap produksi tegangan listrik yang dihasilkan (Gambar 2).
7
14 NADH 1 g/l
Tegangan Listrik (mV)
12
NADH 2 g/l
10 8 6 4
2 0 0
5
10 15 Waktu Pengukuran (menit)
20
Gambar 2 Produksi tegangan listrik MFC pada perbedaan konsentrasi NADH dalam larutan anolit Pengukuran tegangan listrik dari dua anolit dengan konsentrasi NADH yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan. Peningkatan konsentrasi NADH dari 1 ke 2 g/l dalam larutan anolit menyebabkan rata-rata peningkatan 10 kali tegangan listrik yang dihasilkan pada MFC. Hal ini sesuai dengan teori yang dinyatakan Park dan Zeikus (2000) bahwa peningkatan konsentrasi NADH dalam larutan anolit mengakibatkan peningkatan tegangan pada MFC. Hasil tersebut juga mengonfirmasi bahwa rangkaian MFC yang digunakan dapat dioperasikan sebagai alat uji pengukuran efektifitas tegangan listrik MFC yang dihasilkan. Dalam sel E. coli, NADH dihasilkan pada jalur metabolisme utama seperti metabolisme karbon pusat (Spaans et al. 2015), sintesis asam lemak (Campbell et al. 2001), sintesis steroid, dan sintesis asam nukleat (Jansen et al. 2014). Pada metabolisme karbon pusat, NADH diproduksi dari konversi glukosa jalur glikolisis, dekarboksilasi oksidatif, dan siklus krebs (Spaans et al. 2015). Pada metabolisme asam nukleat, NADH dihasilkan di jalur de novo dan salvage. Pada jalur ini, NADH berperan dalam menjaga keseimbangan redoks dalam produksi basa pirimidin (Jansen et al. 2014).
Pengaruh Perbedaan Lama Kultivasi Anolit terhadap Perbedaan Produksi Tegangan Listrik Pada studi terdahulu, dinyatakan bahwa pengukuran listrik MFC yang optimum dilakukan saat pertumbuhan anaerobik bakteri E. coli mencapai fase stasioner. Hal ini disebabkan NADH yang diproduksi di fase eksponensial digunakan untuk pertumbuhan, sehingga tidak dapat dioksidasi untuk menghasilkan listrik (Park et al. 2000). Untuk mengonfirmasi lama kultivasi E. coli yang tepat pada kondisi aerobik, maka dilakukan penelitian pengaruh lama kultivasi sel terhadap tegangan listrik MFC yang dihasilkan (Gambar 3)
8
Tegangan Listrik (mV)
2
media tanpa sel (kontrol) 6 jam 12 jam 18 jam 24 jam
1.5
1
0.5
0 0
5
10 15 Waktu Pengukuran (menit)
20
Gambar 3 Produksi tegangan listrik dari larutan anolit pada perbedaan lama kultivasi E. coli BW 25113 Gambar 3 menunjukkan perbedaan tegangan listrik yang dihasilkan berdasarkan perbedaan lama kultivasi. Media tanpa kultur bakteri tidak menghasilkan tegangan sama sekali. Di lain pihak, setelah E. coli diinokulasi dan dikultivasi pada media, tegangan listrik dapat dihasilkan dan terbaca oleh alat ukur multimeter. Hal tersebut mengindikasikan bahwa sel E. coli memiliki peranan penting dalam menghasilkan tegangan listrik MFC . Peningkatan lama kultivasi dari 6 ke 12 dan dari 18 ke 24 jam menyebabkan kenaikan rata-rata tegangan listrik MFC yang dihasilkan. Sementara, peningkatan lama kultivasi dari 12 ke 18 jam menghasilkan rata-rata tegangan listrik yang relatif sama. Hal tersebut mengindikasikan bahwa terdapat perbedaan metabolisme NADH pada masing-masing fase pertumbuhan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, E. coli mengalami fase eksponensial dari jam ke-3 hingga jam ke-12. Setelah itu, pertumbuhan mengalami fase stasioner hingga jam ke-24 (Suryadarma et al. 2012). Berdasarkan hal tersebut, dapat disimpulkan bahwa kenaikan tegangan listrik yang dihasilkan dari lama kultivasi 6 ke 12 jam beriringan dengan pertumbuhan sel pada fase eksponensial. Pada fase ini NADH banyak dihasilkan pada jalur glikolisis dan siklus kreb mengingat pada fase tersebut terjadi laju konsumsi glukosa dan pertumbuhan yang tinggi (Suryadarma et al. 2012). Sementara itu, pada fase stasioner, yakni kultivasi 12 hingga 24 jam, tegangan listrik mengalami peningkatan. Di fase yang sama, meskipun jumlah sel tidak berbeda secara signifikan, namun tegangan yang dihasilkan oleh anolit dengan lama kultivasi 24 jam lebih tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa selain jumlah sel, metabolisme turut menentukan produksi NADH. Setelah E. coli dikultivasi secara aerobik selama 24 jam, metabolisme menjadi optimal untuk produksi NADH dan tegangan listrik. Gambar 4 menunjukkan metabolisme karbon pusat dalam produksi NADH.
9 Glukosa
2 NAD+ 2 NADH Piruvat
Asetat
Asetil Ko-A
Asetil Fosfat
NAD+
2 2 NADH
6 NAD+ 6 NADH
Siklus Kreb
Gambar 4 Jalur pusat metabolisme karbon Escherichia coli pada kondisi aerobic
Perubahan Produksi Tegangan Listrik akibat Penghilangan rpoS dan Peningkatan Laju Oksigenasi Di awal telah disebutkan bahwa kunci penting dari MFC adalah NADH. Pada penelitian ini, upaya peningkatan listrik dilakukan dengan menaikkan konsentrasi NADH dalam sel. Hal ini dilakukan dengan menghilangkan rpoS dan meningkatkan oksigenasi pada proses kultivasi E. coli BW25113 ∆rpoS. Peningkatan oksigenasi dilakukan dengan meningkatkan putaran kultur bergoyang. Perlakuan ini dilakukan berdasarkan teori Lopes et al (2013) yang menyatakan bahwa putaran berbanding lurus dengan transfer oksigen dari fase gas ke fase cair. Putaran ditingkatkan hingga laju bernilai 250 rpm. Persamaan 1 dan 2 berikut menunjukkan korelasi antara koefisien transfer masa oksigen dengan putaran. 0 Pg 𝛿 𝛾 (1) 𝑘𝐿 𝑎 = 𝛼 ( ) (𝑉𝑠) 𝑉 𝑃′𝑔 𝑁𝐷𝑖 3
0.45
0
(2) ) 𝐹𝑔 0.56 Pada persamaan pertama, kLa menunjukkan transfer oksigen, Pg menunjukkan daya pada bioreaktor yang diaerasi, V menunjukkan volume total, vs menunjukkan laju gas permukaan, sementara parameter α, δ, dan γ merupakan konstanta tanpa dimensi. Pada persamaan kedua c menunjukkan konstanta yang bergantung pada impeller, P’g menunjukkan daya bioreaktor tanpa aerasi, N menunjukkan laju putaran, Di menunjukkan diameter impeller, dan Fg menunjukkan laju alir gas volumetrik. Pada E. coli, kinerja rpoS rendah di fase pertumbuhan eksponensial karena gen tersebut masih ditranskripsi. Kinerja rpoS stabil dan mencapai puncaknya di fase stasioner. Hasil konfirmasi pengaruh waktu pertumbuhan dan teori fase optimal rpoS menjadi landasan untuk menggunakan anolit hasil kultivasi E. coli selama 24 jam. Gambar 5 menampilkan hubungan antara tegangan listrik yang dihasilkan dengan penghilangan rpoS dan peningkatan oksigenasi. 𝑃𝑔 = 𝑐 (
10 30
*: Signifikan pada α < 0.05 25
*
*
20 15 10 5 0 E. coli coliBW BW25113 25113 E.E.coli coliBW BW25113 25113 kultivasi kultivasi lajulaju putaran ∆rpoS ∆rpoSkultivasi kultivasilaju laju putaran putaran 200200 rpmrpm putaran200 200rpm rpm
E. coli BW E. BW25113 25113 ∆rpoS kultivasi ∆rpoS kultivasilaju laju putaran 250 putaran 250rpm rpm
Gambar 5 Pengaruh penghilangan rpoS dan peningkatan oksigenasi pada anolit kultur E. coli kultivasi selama 24 jam terhadap produksi tegangan listrik Data di atas memperlihatkan fenomena peningkatan produksi listrik yang signifikan dengan menghilangkan rpoS dan meningkatkan laju putaran pada E. coli BW 25113. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan produksi NADH pada E. coli ∆rpoS, dan peningkatan NADH yang lebih tinggi akibat kenaikan oksigenasi pada E. coli ∆rpoS. Konfirmasi pengaruh penghilangan rpoS dan peningkatan oksigenasi terhadap peningkatan produksi NADH dalam sel E. coli dilakukan analisis bobot sel kering, tegangan spesifik, konsumsi glukosa, asam piruvat, dan asam asetat. Berikut Tabel 1 yang menunjukkan bobot sel kering, tegangan spesifik, konsumsi glukosa, asam piruvat, dan asam asetat. Tabel 1 Ringkasan analisis bobot sel kering, tegangan spesifik, konsumsi glukosa,piruvat, dan asetat larutan anolit kultur E. coli dan E. coli ∆rpoS Anolit
E. coli BW 25113 E. coli BW 25113 ∆rpoS E. coli BW 25113 ∆rpoS
Laju Putaran (rpm) 200 200 250
Bobot Sel Kering (g l-1) 1.9086 ± 0.0938 1.8528 ± 0.0145 1.191 ± 0.0147b)
Konsumsi Glukosa (g l-1) 24.496 ± 0.3903 22.871 ± 0.4277a) 18.951 ± 0.4769b)
a) Signifikan terhadap E. coli BW 25113 b) Signifikan terhadap E. coli BW 25113 ∆rpoS laju putaran 200 rpm
Piruvat (g l-1)
Asetat (g l-1)
1.9559
15.5388
0.6043
4.5036
1.1365
5.1740
11 Penghilangan rpoS menyebabkan peningkatan tegangan listrik secara signifikan, yakni hampir 1.5 kali lipat. Di awal telah disebutkan bahwa peningkatan tegangan listrik berbanding lurus dengan peningkatan NADH yang dihasilkan pada proses metabolisme. Konfirmasi pengaruh penghilangan rpoS terhadap peningkatan NADH yang pertama dianalisis melalui bobot sel kering. Kultivasi E. coli ∆rpoS pada putaran 200 rpm tidak menyebabkan perubahan bobot sel kering yang signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan NADH tidak terjadi akibat peningkatan jumlah sel, namun terjadi akibat peningkatan aktivitas setiap sel dalam menghasilkan NADH. Konfirmasi berikutnya yakni konsumsi glukosa. Analisis konsumsi glukosa menunjukan bahwa tingkat konsumsi glukosa oleh E. coli yang kehilangan rpoS mengalami penurunan secara signifikan. Konfirmasi ketiga yakni analisis asam piruvat dan asetat. Asam piruvat merupakan hasil konversi glukosa di jalur glikolisis, sementara asam asetat adalah hasil konversi piruvat akibat glukosa dan oksigen berlebih (Vemuri et al. 2006). Penghilangan rpoS menyebabkan penurunan produksi asam piruvat dan asetat. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan konversi piruvat selain menuju asetat. Gen rpoS merupakan gen yang berperan sebagai regulator global dan aktif saat sel E. coli dalam kondisi stres (Loewen et al. 1998). Di jalur metabolisme karbon pusat, rpoS menstimulasi kerja gen arcA yang berperan dalam menekan gen gltA sehingga menekan laju asetil ko-A menuju siklus kreb. Selain itu, rpoS menstimulus poxB yang berperan dalam peningkatan laju pembentukan asam asetat (Suryadarma et al. 2012). Oleh karena itu, penghilangan rpoS pada E. coli dapat meningkatkan metabolisme karbon pusat jalur glikolisis dan siklus kreb sementara pembentukan asam asetat terhambat (Suryadarma et al. 2012). Peningkatan jalurjalur tersebut berpengaruh terhadap peningkatan rasio NADH/NAD+. Penurunan konsumsi glukosa pada E. coli ∆rpoS menunjukkan penurunan aktivitas glikolisis total. Perubahan bobot sel kering yang tidak signifikan menunjukkan tidak adanya peningkatan pada jalur siklus kreb. Fakta-fakta tersebut menunjukkan bahwa penghilangan rpoS pada E. coli yang dikultivasi pada putaran 200 rpm selama 24 jam menyebabkan peningkatan konsentrasi NADH, namun bukan dari jalur metabolisme karbon pusat. Selain metabolisme karbon pusat, rpoS pun berperan dalam sintesis asam nukleat. Dong (2009) menyatakan bahwa penghilangan gen rpoS pada E. coli akan meningkatkan performa gen udk, cmk, upp, dan codA yang berperan dalam biosintesis pirimidin dan menekan kinerja gen cdd dan udp yang berperan dalam degradasi pirimidin. Sintesis dan degradasi pirimidin dapat terjadi di jalur de novo dan salvage. Sementara, produksi dan konsumsi NADH terjadi di jalur de novo (Palmer 2014). Sintesis pirimidin menghasilkan NADH sementara degradasi pirimidin mengonsumsi NADH (Palmer 2014). Artinya, penghilangan rpoS dan peningkatan NADH berkorelasi positif dengan sintesis pirimidin di jalur de novo. Jalur ini merupakan jalur metabolisme pembentukan nukleotida berupa basa purin dan pirimidin dengan memanfaatkan asam amino, ribosa-5-fosfat, CO2, dan unit satu karbon sebagai prekursor (Kusnadi et al 2003). Berdasarkan hasil konfirmasi terhadap metabolisme karbon pusat, peningkatan NADH tidak terjadi di jalur tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa pengaruh penghilangan rpoS terjadi di jalur lain, yakni jalur de novo untuk sintesis
12 pirimidin. Gambar 6 menunjukkan mekanisme peningkatan NADH yang terjadi pada penelitian ini akibat penghilangan rpoS dalam E. coli.
Bikarbonat NAD+
Glukosa
2 NAD+ 2 NADH Piruvat NAD+
2 2 NADH
Asetat
NADH Orotidin Monofosfat
Asetil Ko-A
(b) UMP
6 NAD+ 6 NADH
Siklus Kreb
CMP
Urasil
β-alanin
NADH
NAD+
(a) (c) Gambar 6 Metabolisme (a) karbon pusat (b) jalur de novo sintesis pirimidin (c) jalur de novo degradasi pirimidin Dong (2010) menyatakan bahwa rpoS merupakan gen yang aktif saat bakteri berada dalam berbagai kondisi stres, salah satunya yakni tingginya tingkat oksigenasi. Hal ini menjadi dasar dilakukannya konfirmasi terhadap pengaruh oksigenasi terhadap produksi listrik E. coli yang telah dihilangkan rpoS nya. Produksi listrik MFC dari anolit kultur E. coli ∆rpoS yang ditingkatkan putarannya mengalami kenaikan secara signifikan, yakni hampir 2.25 kali lipat dari kultur E. coli ∆rpoS yang dikultivasi dengan putaran 200 rpm. Peningkatan tegangan listrik berbanding lurus dengan peningkatan produksi NADH. Konfirmasi peningkatan NADH melalui peningkatan oksigenasi pada E. coli ∆rpoS dianalisa dari konsumsi glukosa, produksi asam asetat dan piruvat, serta bobot sel kering. Konsumsi glukosa menurun secara signifikan. Hal ini menunjukkan adanya penurunan aktivitas glikolisis. Glukosa yang dikonsumsi kemudian dikonversi menjadi piruvat dan konversi dilanjutkan ke jalur produksi asetat maupun siklus kreb (Vemuri et al. 2006). Produksi asam asetat dan piruvat mengalami kecenderungan sama dengan E. coli ∆rpoS yang dikultivasi dengan putaran 200 rpm, namun dengan jumlah yang sedikit lebih tinggi. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan konversi piruvat ke jalur lain selain asetat. Aktivitas siklus kreb diketahui dari data pertumbuhan. Analisa bobot sel kering menunjukkan adanya penurunan yang signifikan. Fenomena ini menunjukkan adanya penurunan aktivitas siklus kreb. Penurunan glikolisis dan siklus kreb menunjukkan bahwa peningkatan NADH terjadi bukan dari jalur metabolisme karbon pusat. Sama seperti anolit dengan menggunakan kultur E. coli ∆rpoS tanpa peningkatan oksigenasi, peningkatan NADH terjadi di jalur de novo sintesisi pirimidin. Tingginya
13 peningkatan tegangan listrik MFC akibat peningkatan oksigenasi disebabkan karena rpoS merupakan gen yang sensitif terhadap oksigen. Kinerja gen ini tinggi saat bakteri mengalami stres oksigen sehingga dampak kehilangan rpoS berupa peningkatan NADH lebih optimal saat E. coli dikultivasi dengan oksigenasi tinggi.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Penghilangan rpoS pada E. coli meningkatkan tegangan listrik MFC sebesar 1.5 kali lipat dari 7.25 mV hingga 10.25 mV. Peningkatan ini kemungkinan terjadi akibat peningkatan metabolisme pada jalur de novo untuk sintesis nukleotida pirimidin dan penurunan degradasi nukleotida pirimidin. Selain itu, optimasi dampak kehilangan rpoS, yang dilakukan dengan pemberian kondisi stres berupa peningkatan oksigenasi pada kultivasi E. coli, meningkatkan tegangan hingga 2.25 kali lipat dari E. coli ∆rpoS sebelum peningkatan oksigenasi. Tegangan yang diproleh dari kultur E. coli ∆rpoS dengan peningkatan oksigenasi yakni sebesar 23 mV.
Saran Perlu dilakukan uji aktivitas gen yang bekerja di jalur de novo sebagai konfirmasi adanya peningkatan di jalur tersebut.
14 DAFTAR PUSTAKA Albert B, Alexander J, Jullian L, Martin R, Keith R, Peter W. 2002. Molecular biology of the cell. Bethesda, MD (US): National Centre for Biotechnology Information, US National Library of Medicine. Campbell JW, Cronan JE Jr. 2001. Bacterial fatty acid biosynthesis: Targets for antibacterial drug disvovery. Annu Rev Microbiol. 55: 305-332. Champe PC, Harvey RA, Ferier DR. 2005. Lippincotts illustrated reviews: Biochemistry third edition. Philadelphia (US): A Wolters Kluwer Company. Cole J, Crooke H. 1998. Oxygen toxicity, oxygen starvation, and the assembly of cytochrome C-dependent electron transfer chains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 103: 264-268. Dewan A, Beyenal H. 2007. Microbial fuel cells education module. Washington DC (US): The School of Chemical Engineering and Bioengineering, Washington State University. Dong T, Schellhorn HE. 2009. Global effect of rpoS on gene expression in pathogenic Escherichia coli O157:H7 strain. Gen. 10: 349. ---- . 2010. Role of rpoS in virulence of pathogens. Infect Immun. 78: 887-897 Guest JR. 1992. Oxygen regulated gene expression in Escherichia coli. Gen Microbiol. 138: 2253-2263. Hara KY, Kondo A. 2015. ATP regulation in bioproduction. Microbiol Cell Fact. 14: 198 Kusnadi. 2003. Common textbook mikrobiologi. Jakarta: Universitas Pendidikan Indonesia. Loewen P, Hu B, Strutinsky J, Sparling R. 1998. Regulation in the rpoS regulon of Escherichia coli. Microbiol. 44: 707-717 Logan BE. 2007. Microbial fuel cells. Pennsylvania (US): Wiley Interscience, A John Wiley and Sons, Inc Publication. Lustig KD, Kroll K,Sum E, Ramos R, Elmendorf H, Kirschner MW. 1996. A xenopus nodal-related gene that acts in synergy with noggin to induce complete secondary axis and notochord formation. Develop. 122: 32573282. Nair R, Renganathan K, Barathi S, Venkatraman K. 2013. Performance of salt bridge microbial fuel cell at various agarose concentration using hostel sewage waste as substrate. Internat J Advancements in Research Technol. 2: 326-330. Machmud M. 2001. Teknik penyimpanan dan pemeliharaan mikroba [ulasan]. Bul Agrobio. 4: 24-32 McKinlay JB, Zeikus JG. 2004. Extracellular iron reduction is mediated in part by neutral red and hydrogenase in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 70: 3467-3474. Moat AG, Foster JW, Spector MP. 2002. Microbial phsyiology. Hoboken (US): Wiley Liss, Inc. Muralidharan A, Babu OKA, Nirmalraman K, M. Ramya. 2011. Impact of salt concentration on electricity production in microbial hydrogen based salt bridge fuel cell. Indian J Fundamental Appl Life Sci 1: 178-184.
15 Ojima Y, Suryadarma P, Tsuchida K, Taya M. 2012. Accumulation of pyruvate by changing the redox status in Escherichia coli. Biotechnol Lett. 34: 889-893. Omilusik K. 2001. The role of metabolic by-product secretion by Escherichia coli relation to intracellular NADH concentration and re-dox potential. Exp Microbiol Immun. 1: 1-8. Palmer M. 2014. Human metabolism lecture notes. Ontario (USA): Waterloo University. Department of Chemistry. Panja S, Saha S, Basu T. 2006. Role of membrane potential on artificial transformation of E. coli with plasmid DNA. Biotechnol. 127: 14-20 Park DH, Zeikus JG. 2000. Electricity generation in microbial fuel cells using neutral red as an electronophore. Appl Environ Microbiol. 66 :1292-1297 Rabaey K, Lissence G, Verstraete W. 2005. Biofuel for fuel cells: Renewable energy from biomass fermentation. London (UK): IWA Publishing. Rencana Strategis. 2015. Indonesia Energy Outlook. Jakarta: Kementrian Energi dan Sumber Daya Mineral. Singh A, Fard AK, dan Gill RT. 2010. Increased mutation frequency in redox impaired Escherichia coli due to RelA and rpoS mediated repression of DNA. Appl Environ Microbiol. 76: 5463-5470. Spaans, Sebastian K, Weusthuis RA, Oost JVD, Kengen SWM. 2015. NADPH generating systems in bacteria and archaea. Front Microbiol. 6 : 742. Suryadarma P, Ojima Y, Fukuda Y, Akamatsu N, Taya M. 2012. The rpoS deficiency suppresses acetate accumulation in glucose-enriched culture of Escherichia coli under an aerobic condition. Front Chem Sci Eng. 6: 152157. Taskan E, Ozkaya B, Hasar H. Effect of different mediator concentration on power generation in MFC using Ti-TiO2 electrode. Internat J Energy Sci. 4: 9-11 Vemuri GN, Altman E, Sangurdekar DP, Khodursky AB, Eiteman MA. 2006. Overflow metabolism in Escherichia coli during steady state growth: Transcriptional regulation and effect of the redox ratio. Appl Environ Microbiol. 72: 3653-3661 Verstraete W, Rabaey K, Lissence G, Siciliano SD. 2003. A microbial fuel cell capable of converting glucose to electricity at high rate and effiency. Biotechnol Lett. 25: 1531-1535.
16 Lampiran 1 Pembuatan Larutan NADH (Cat. No. 10716 251 035) Larutan glukosa disiapkan dalam tabung ulir dengan konsentrasi 0.5 g dan 1 g per liter aquades. Masing- masing larutan glukosa diambil sebanyak 0,1 ml dan direaksikan dengan 1 ml larutan 1 dalam kit dan 1.9 ml aquabides lalu ditunggu 3 menit. Reaksi yang terjadi yakni antara glukosa dan adenosine-5’-trifosfat (ATP) dengan katalis enzim heksokinase (HK). Fosfat pada ATP dilepas dan ditangkap oleh glukosa membentuk glukosa-6-fosfat, sementara ATP yang kehilangan fosfat berubah menjadi adenosine-5-difosfat (ADP). Larutan tersebut kemudian direaksikan dengan 0.02 ml suspense 2 dalam kit dan ditunggu selama 15 menit. Reaksi yang terjadi yakni konversi glukosa-6-fosfat hasil reakis sebelumnya oleh enzim glukosa-6-fosfat dehydrogenase menjadi glukonat-6-fosfat, Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Fosfat Hidrogen (NADPH), dan ion H+. Detail reaksi glucose kit ditunjukkan oleh bagan di bawah ini. (1) Glukosa + ATP
(2) Glukosa-6-Fosfat
HK G6P-DH
Glukosa-6-Fosfat + ADP Glukonat-6-Fosfat + NADPH + H+
Lampiran 2 Prosedur pembuatan rangkaian listik MFC Rangkaian yang digunakan merupakan rangkaian elektrolisis dalam satu tabung dimana kultur berperan sebagai anoda sementara oksigen di luar tabung berperan sebagai katoda. Tabung disusun dari botol Schott 100 ml yang ditutup dengan stopper karet. Stopper yang digunakan terlebih dahulu dilubangi dengan 3 lubang yakni lubang untuk jembatan garam, mediator, dan grafit yang lebih panjang (grafit anoda). Sebelum stopper tersebut disusun, dilakukan penyiapan jembatan garam dan mediator terlebih dahulu. Jembatan garam dibuat dengan cara melarutkan bacto agar dan KCl dalam aquades, kemudian dimasukkan ke dalam otoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit. Larutan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam pipa kaca yang telah ditutup dengan alumunium foil pada salah satu sisinya. Larutan tersebut kemudian ditunggu hingga setengah padat. Setelah itu, grafit yang lebih pendek (grafit katoda) dimasukkan ke dalam agar hingga yang tampak di permukaan hanya setengah dari tinggi grafit tersebut. Lalu ditunggu kembali hingga agar benar-benar memadat (Muralidharan et al, 2011). Sementara itu, sebelum dimasukkan ke dalam tabung, mediator MB dilarutkan dalam 5 ml aquades dan dimasukkan dalam suntikan, dan kedua grafit direndam terlebih dahulu dalam HCl 1 M selama satu jam kemudian dalam NaOH 1 M selama satu jam dan dibersihkan dalam aquades. Berikutnya, penyusunan listrik dilakukan. Kabel dipotong menjadi 4 bagian, yakni 2 buah kabel 15 cm dan 10 cm. Kedua kabel 15 cm dihubungkan dengan hambatan 1000 Ω, ujung salah satu kabel kemudian dililitkan pada grafit anoda semenara ujung kabel lainnya dililitkan pada ujung grafit katoda. Pada kabel 10 cm, capit buaya dipasang di masing-masing ujung kabel. Capit buaya kemudian dipasang pada bagian kabel panjang yang telah dihilangkan pelindungnya di aliran anoda dan hal yang sama dilakukan di aliran katoda. Ujung capit buaya yang lain dihubungkan pada multimeter.
17
Lampiran 3 Prosedur pembuatan stok gliserol (Lustig et al. 1996) Preparasi biakan dilakukan dengan membuat stok kultur dalam gliserol. Sebanyak 700 µl gliserol 30 % dan 300 µl sel E. coli hasil prakultivasi dicampur ke dalam eppendorf tube. Proses ini dilakukan di dalam clean bench dan kemudian disimpan dalam freezer. Lampiran 4 Prosedur prakultivasi (Ojima et al. 2012) Prakultivasi dilakukan untuk mengadaptasi sel E. coli agar siap dikultivasi. Sel E. coli dari stok gliserol diinokulasikan pada 50 ml medium larutan Luria Bertani (LB) dan diinkubasi di inkubator bergoyang dengan putaran 100 rpm pada suhu 37oC selama 12 jam. Kemudian optical density (OD) sel tersebut dianalisis menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Sel bisa dilanjutkan ke tahap kultivasi jika OD bernilai 1-1.5. Lampiran 5 Prosedur kultivasi (Ojima et al. 2012) Kultivasi dilakukan secara aerobik. E. coli hasil prakultivasi diinokulasi pada 50 ml LB yang diperkaya glukosa dan ditambahkan CaCO3 sebagai buffer di tiap buffle flask. Kemudian kultur diinkubasi di inkubator bergoyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu 37oC selama 24 jam. Sementara pada E. coli ∆rpoS, kecepatan dilakukan di dua kondisi, yakni 200 rpm dan 250 rpm. Lampiran 6 Prosedur analisis bobot sel kering (Ojima et al. 2012) Pengencerean sampel 1: 10 dilakukan terhadap HCl 1 M. Kemudian, sampel diukur nilai OD nya menggunakan spektrofotometer Hach DR 2500 pada absorbansi (λ) 660 nm. Bobot sel kering (g/l) = 0.36 x OD660 Lampiran 7 Prosedur analisis glukosa sisa Analisis glukosa sisa dilakukan untuk mengetahui jumlah glukosa yang dikonsumsi E. coli. Sampel yang telah siap dicampur dengan larutan DNS dengan perbandingan 1:3. Kemudian dipanaskan di air mendidih selama 5 menit. Setelah itu sampel didinginkan dan diukur OD nya mengguakan spektrofotometer Hach DR 2500. Nilai OD yang diperoleh kemudian dikonversi menjadi bobot glukosa berdasarkan kurva standar yang telah dibuat. Berikut kuva standar larutan DNS yang digunakan.
18 1.0
y = 0.0036x - 0.0591 R² = 0.9821
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0
100
200
300
Kurva standar glukosa Lampiran 8 Prosedur analisis asam organik Analisis sisa asam organik dilkukan untuk mengetahui jumlah asam-asam organik yang dihasilkan E.coli selama metabolisme. Kolom yang digunakan antara lain kolom ZORBAX SB-Aq 883975-914. Fase bergerak yang digunakan yakni NaH2PO4 20 mM, pH2, 1% ACN. Suhu, laju alir, dan panjang gelombang yang digunakan berturut-turut yakni 35oC, 1 ml/menit, dan 210 nm. Setelah semua siap, 20 µl sampel disuntik. Hasilnya kemudian dikonversi melalui kurva standar. 300
y = 531.616x + 1.464 R² = 0.999
Luas area
250 200 150 100
Kurva Standar Asetat
50 0 0
0.2
0.4
Konsentrasi (ppm)
Kurva standar asam asetat
0.6
19
1600 1400
y = 2,966.133x - 21.006 R² = 1.000
Luas area
1200 1000 800 600 400 200
0 0
0.2 0.4 Konsentrasi (ppm)
Kurva standar asam piruvat
0.6
20 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Temanggung tanggal 13 Juli 1993 dari pasangan Bapak Suroso dan Ibu Trisnani Eka S.P. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Pada tahun 2011, penulis menamatkan Sekolah menengah Atas di SMA Negeri 1 Bogor. Di tahun yang sama, penulis diterima di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Undangan. Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif di berbagai organisasi dan kegiatan mengajar. Pada tahun 2011, di ranah Kota Bogor penulis menjadi salah satu staf departemen penelitian dan pengembangan Inspirasi Muda Bogor dan steering committee di Forum Silaturahmi Rohis Bogor (FSRB). Sementara di ranah kampus, penulis mengikuti IPB Political School (IPS). Selanjutnya di tahun 2012 dan 2013, penulis mendapat amanah sebagai wakil Kepala Sekolah IPB Political School. Selain itu, penulis juga aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Teknologi Pertanian (BEM FATETA) sebagai staff Departemen Kajian dan Strategi. Pada tahun 2014, penulis mulai mengajar di bimbingan belajar SIMPLE dan Sanggar Genius Al Ihsan di bawah binaan Yayasan Yatim Mandiri. Selama menjadi mahasiswa juga, penulis mendapatkan beasiswa dari Yayasan Karya Salemba Empat (KSE) dan PT Indofood Sukses Makmur.
