Semiloka Nasional Prospek Industri Sapi Perah Menuju Perdagangan Bebas – 2020
PENGUJIAN YOGHURT PROBIOTIK PADA PERTUMBUHAN BAKTERI (Antimicrobial Activity Tests of Probiotic Yoghurt) MASNIARI POELOENGAN Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor ABSTRACT Probiotic yoghurt was a fermented milk produce, that was known as a functional food and widely consumed as a health food. Yoghurt contained antimicrobial substrates. These substrates were formed by the lactic acid bacteria and the probiotic used as starters to ferment milk as the yoghurt raw material. The objective of this study was to assess the antimicrobial activities of two brands of yoghurt on Salmonella typhii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus. In this conjunction, the yoghurt antimicrobial activities were shown by the clear zones formed around the agar wells. The obtained results demonstrated that the two brands of yoghurt tested were able to control the pathogenic bacterial growths. Further findings pointed out that the yoghurt antimicrobial activities depended on the microorganism species used as starters and the amount of antimicrobial compounds produced during the milk fermentation. Keywords: Probiotic yoghurt, milk, antimicrobial ABSTRAK Yoghurt probiotik adalah salah satu produk susu fermentasi yang dikenal sebagai pangan fungsional. Bakteri asam laktat dan probiotik yang digunakan sebagai starter mampu menghasilkan subtrat antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari yoghurt sebagai antibakteri. Bakteri yang diuji yaitu Salmonella typhii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada perbedaan pada daerah hambat dari keempat bakteri dan kedua produk. Bakteri gram negatif (S. typhii dan E. coli) cenderung lebih mudah dihambat oleh yoghurt produk A dibandingkan bakteri gram positif (S. aureus, B. cereus). Kata kunci: Yoghurt, probiotik, antimikroba
PENDAHULUAN Poduksi makanan yang bersifat fungsional sudah banyak berkembang saat ini. Suatu produk dikatakan sebagai pangan fungsional karena selain mengandung vitamin-vitamin dan mineral esensial, bahan pangan itu mampu meningkatkan kesehatan dan mencegah penyakit. Topik mengenai pangan fungsional banyak membahas tentang peran komponen aktif dalam bahan makanan, produksi serta pemanfaatannya. Alasan tersebut menyebabkan banyak penelitian terhadap kelebihan bahan pangan pada efek kesehatan dilakukan. Salah satu kelebihan tersebut adalah efek antimikroba dari suatu bahan pangan. Yoghurt adalah produk yang diperoleh dari susu yang telah dipasteurisasi, kemudian
difermentasi dengan bakteri tertentu sampai diperoleh keasaman, bau dan rasa yang khas, dengan atau tanpa penambahan bahan lain yang diizinkan. Food and Drug Administration (FDA) menggunakan bakteri asam laktat berupa Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus sebagai standard starter untuk pembuatan yoghurt. Kultur lain bisa ditambahkan tapi tidak disyaratkan. Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus mengubah gula susu (laktosa) menjadi asam laktat sehingga mengakibatkan perubahan konsistensi susu cair menjadi yoghurt (WATER, 2003). Perbandingan yang sesuai antara jumlah Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus sangat diperlukan untuk pembentukan flavour dan tekstur pada yoghurt.
303
Semiloka Nasional Prospek Industri Sapi Perah Menuju Perdagangan Bebas – 2020
Flavour yoghurt ditentukan oleh terbentuknya asam laktat, asetaldehida, asam asetat dan diasetil (RAHMAN et al., 1992). Pembuatan yoghurt diawali dengan pemanasan susu yang akan difermentasi sampai 900C selama 15-30 menit, kemudian didinginkan sampai 430C, diinokulasikan dengan 2% kultur campuran Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus. Sifat yang terpenting dari bakteri asam laktat adalah kemampuannya untuk memfermentasi gula menjadai asam laktat. Sifat ini penting dalam pembuatan produk fermentasi seperti susu fermentasi. Produksi asam oleh bakteri asam laktat berjalan cepat, sehingga pertumbuhan mikroba lain yang tidak diinginkan dapat segera dihambat (FARDIAZ, 1992). Berdasarkan hasil fermentasinya, bakteri asam laktat dikelompokkan menjadi homofermentatif dan heterofermentatif (BRANEN dan DAVIDSON, 1993). Bakteri homofermentatif memecah gula terutama menjadi asam laktat. Streptococcus, Pediococcus dan beberapa spesies Lactobacillus bersifat homofermentatif. Bakteri homofermentatif membentuk 90% atau lebih asam laktat murni (FARDIAZ, 1992). Tujuan penelitian ini untuk mengetahui efektivitas yoghurt sebagai antibakteri pathogen. MATERI DAN METODE Kegiatan penelitian dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu pengumpulan dua macam produk komersial yoghurt A dan B masing-masing mengandung bakteri Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus. Bakteri uji yang digunakan berupa bakteri pathogen yaitu gram positif (Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus) dan gram negatif (Escherichia coli dan Salmonella typhii). Uji efektivitas dua macam produk yoghurt secara in vitro terhadap bakteri uji. Persiapan bakteri uji Bakteri uji yang digunakan yaitu bakteri gram positif (Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus) dan bakteri Gram negatif (Salmonella thypii dan Escherichia
304
coli). Kultur bakteri uji diperbanyak dengan cara diambil dari kultur biakan agar miring dengan ose steril dan diinokulasikan dengan media nutrient agar (NA) dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Kultur bakteri uji harus berumur 24 jam setiap akan dilakukan digunakan. Kultur ini dibuat dengan cara mengambil 1 ose masingmasing bakteri uji dari kultur stock, kemudian diinokulasikan ke dalam media NA pada cawan petri dan diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam. Uji antagonistik yoghurt pada berbagai bakteri uji Metode yang digunakan untuk uji kemampuan antagonistik yoghurt pada berbagai jenis bakteri uji adalah metode difusi sumur (NCCLS, 2000). Kultur bakteri uji yang siap pakai dalam media NA berumur 24 jam diencerkan dalam media pengencer BPW 1% dan dibandingkan dengan larutan McFarland no 0,5 sebanding dengan populasi 108, lalu diencerkan hingga diperoleh populasi 107. sebanyak 1 ml larutan pengencer yang telah diinokulasi bakteri uji dimasukkan ke dalam cawan petri berdiameter 9 cm menggunakan pipet dan ditambahkan Mueller Hinton Agar sebanyak 15-20 ml, sehingga terbentuk agar dengan ketebalan 4 mm. Setiap cawan mewakili satu produk dan satu bakteri, sehingga digunakan 8 cawan setiap kali pengamatan. Setelah agar dalam cawan mengeras, ditengah-tengah agar dibuat lubang sumur dengan menggunakan tabung Durham berdiameter 5 mm (NCCLS menggunakan diameter 6 mm untuk antibiotik) sebanyak 6 sumur setiap cawan. Setiap cawan terdiri dari 3 kali ulangan dan setiap ulangan dilakukan duplo. Sebanyak 50µl yoghurt dipipet kedalam lubang sumur dan dibiarkan meresap kedalam agar selama ± 30 menit pada suhu sekitar 70C. Selanjutnya agar diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam lalu zona penghambatan berupa areal bening di sekeliling sumur yang dihasilkan diukur. Diameter zona penghambatan diukur dengan menggunakan jangka sorong. Zona bening diukur diameternya sebanyak tiga kali di tempat yang berbeda dan
Semiloka Nasional Prospek Industri Sapi Perah Menuju Perdagangan Bebas – 2020
hasilnya dirata-ratakan. Percobaan dilakukan tiga kali ulangan setiap produk. HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas antimikroba yoghurt asal susu sapi Aktivitas antimikroba yogurt asal susu sapi yang ditentukan dengan metode sumur menunjukkan bahwa bahan baku susu sapi baik dari produk A maupun produk B yang difermentasi dengan starter yogurt menghasilkan substrat antimikroba yogurt. Aktivitas penghambatan tersebut ditujukan dengan tidak tumbuhnya bakteri uji disekitar sumur (terdapat zona bening) yang diisi dengan yogurt. Semakin luas zona bening yang terbentuk semakin sensitif bakteri patogen yang diujikan tersebut. Perbedaan kelompok bakteri gram positif dan gram negatif serta sensitifitasnya terhadap antimikroba yogurt asal produk A dan produk B Bakteri yang tergolong dalam bakteri gram positif adalah Bacillus cereus, dan Staphylococcus aureus sedangkan yang tergolong bakteri gram negatif adalah Salmonella thypii, dan Escherichia coli. Analisis ragam terhadap ukuran diameter zona penghambat yogurt asal produk A menunjukkan bahwa senyawa aktif yang terdapat di dalam yogurt sangat nyata menghambat pertumbuhan keempat bakteri yang diuji. Uji lanjut dengan LSM (Least Significant Mean) menunjukkan bahwa ukuran diameter zona hambat bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus tidak berbeda nyata dihambat oleh yogurt (P<0,05) (Tabel 1). Perbedaan zona hambat yang nyata terlihat pada Bacillus cereus dan Salmonella typii. Escherichia coli.merupakan bakteri gram negatif yang paling sensitif terhadap antimikroba yogurt kedua produk dengan rataan diameter zona hambat sebesar 9,07 mm (Tabel 1). Bakteri gram positif yang paling sensitif terhadap antimikroba yogurt kedua bangsa adalah bakteri Staphylococcus aureus dengan rataan diameter zona hambat sebesar
8,83 mm. Bacillus cereus merupakan bakteri gram positif yang paling tidak sensitif terhadap antimikroba yogurt kedua produk dengan rataan diameter zona penghambatan sebesar 6,83 mm. NURDIANA (2002) dalam penelitiannya juga menjelaskan bahwa aktivitas antibakteri yogurt yang terbesar adalah terhadap bakteri uji Escherichia coli yang merupakan bakteri gram negatif, sedangkan bakteri yang paling tidak sensitif adalah bakteri gram positif dari jenis Bacillus. Tabel 1. Aktivitas antimikroba yogurt asal produk A terhadap berbagai bakteri uji Bakteri Escherichia coli Staphylococcus aureus Salmonella typii Bacillus cereus
Rata-rata (mm) 9.07 A 8.83 AB 7.76 B 6.83 C
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan beda nyata (P<0,05)
Analisis ragam terhadap ukuran diameter zona hambat antimikroba yogurt asal produk A pada bakteri yang dikelompokkan berdasarkan perbedaan gram menunjukkan perbedaan yang sangat nyata antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (P<0,01). Bakteri gram negatif cenderung lebih mudah dihambat oleh yogurt asal produk A dibandingkan bakteri gram positif. Rata-rata diameter zona hambat bakteri gram negatif adalah 8.42A sedangkan rataan diameter bakteri gram positif adalah sebesar 7.83 (Tabel 2.). Tabel 2. Aktivitas antimikroba yogurt produk A yang dikelompokkan berdasarkan gram Jenis gram Gram Gram +
Rata-rata (mm) 8.42A 7.83B
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda sangat nyata (P<0,01)
Bakteri gram negatif sensitif terhadap tingkat keasaman yang rendah dibandingkan bakteri gram positif. (RAY, 2003). Daya hambat yogurt yang besar terhadap bakteri gram negatif diduga disebabkan oleh senyawa antibakteri yang berupa asam-asam organik (BRANEN dan DAVIDSON, 2003).
305
Semiloka Nasional Prospek Industri Sapi Perah Menuju Perdagangan Bebas – 2020
Asam laktat mampu melemahkan permeabilitas bakteri gram negatif dengan merusak membran luar bakteri gram negatif. Asam laktat merupakan molekul yang larut dalam air sehingga mampu menembus kedalam periplasma bakteri gram negatif melalui protein porin pada membran luarnya. Pelindung dari permeabilitas membran luar berupa lapisan lipopolisakarida yang terletak pada permukaan membran dirusak oleh asam laktat sehingga substrat antimikroba yang lain yaitu diasetil, bakteriosin, hidrogen peroksida dan laktoperoksidase sistem dapat berpenetrasi kedalam membran sitoplasma (ALOKOMI et al., 2000). Asam laktat berubah menjadi bentuk terdisosiasi dalam membran sitoplasma sehingga menurunkan pH intraseluler dan mengganggu transportasi proton, hidrogen peroksida mengoksidasi membran lipid dan gugus sulfihidril, bakteriosin menghambat sintesis ATP, sedangkan diasetil menonaktifkan enzim melalui reaksi antara grup dikarbonilnya dengan arginin sehingga merubah sisi katalitisnya (RAY, 2000). Bakteri gram positif mempunyai pertahanan terhadap kondisi asam berupa mekanisme pompa proton sehingga mampu menyeimbangkan pH dalam sel dan substrat antimikroba lainnya tidak dapat berpenetrasi ke dalam membran sitoplasma (COTTER dan HILL, 2003). Analisis ragam terhadap ukuran diameter zona penghambatan yogurt asal produk A menunjukkkan bahwa senyawa aktif yang terdapat di dalam yogurt sangat nyata menghambat pertumbuhan empat bakteri yang diuji (P<0,05). Uji lanjut dengan LSM (Least Significant Mean) menunjukkan bahwa ukuran diameter zona hambat bakteri Escherichia coli dan Bacillus cereus tidak berbeda nyata dihambat oleh yogurt kedua produk (P<0,05) (Tabel 3). Tabel 3. Aktivitas antimikroba yogurt produk B terhadap berbagai bakteri uji Bakteri Bacillus cereus Escherichia coli Salmonella typii Staphylococcus aureus
Rata-rata (mm) 7.99A 7.88AB 7.84BC 7.76C
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan beda nyata (P<0,05)
306
Bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella typii juga menunjukkan bahwa ukuran diameter zona hambat tidak berbeda nyata antara kedua bakteri tersebut. Aktivitas hambatan terhadap pengelompokkan bakteri berdasarkan gram tidak mempengaruhi aktivitas hambatan yogurt produk B. Bakteri gram negative dan gram positif sama-sama dihambat oleh yogurt produk B walaupun diameter yang terbentuk lebih rendah dibandingkan hambatan oleh yogurt asal produk A. Diameter hambatan yogurt asal produk B terhadap bakteri gram negatif sebesar 7.85 ± 0.01 mm dan 7.88 ± 0.05 mm untuk kelompok bakteri gram positif (Tabel 4.). Tabel 4. Aktivitas antimikroba yogurt asal produk B dikelompokkan berdasarkan gram Jenis gram Gram – Gram +
Rata-rata (mm) 7.85A 7.88A
Keterangan: Superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda sangat nyata (P<0,01)
KESIMPULAN Yogurt produk A dan produk B menunjukkan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella typhii. Bakteri gram negatif (S. typhii dan E. coli)cenderung lebih mudah dihambat oleh yogurt asal produk A dibandingkan bakteri gram positif (B. cereus, S. aureus). Yogurt susu produk B menghasilkan daya hambat yang sama pada kelompok bakteri gram positif dan gram negatif. DAFTAR PUSTAKA ALOKOMI, H.L., E. SKYTTA dan M. SAARELA. 2000. Lactic acid permeabilizes gram negative bacteria by disrupting outer membrane. Appl and Environ Microbiol. 66 (5): 2001-2005. BRANEN. A.L. dan P.M. DAVIDSON. 1993. Antimicrobials in Foods 2nd ed. Marcel Dekker, Inc., New York.
Semiloka Nasional Prospek Industri Sapi Perah Menuju Perdagangan Bebas – 2020
COTTER, P.D. dan C. HILL. 2003. Surviving the acid test: responses of gram-positive bacteria to low pH. Microbiol and Mol Biol Rev. 67 (3): 429-453. FARDIAZ, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Penerbit PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. NCCLSm 2000. Indentification and antimicrobial susceptibility testing Salmonella serotype Thypii. Manual for identification and Antimicrobial Susceptibility Testing. World Health Organization. New York. NURDIANA, M. 2002. Skripsi. Aktivitas dan Identifikasi golongan senyawa antibakteri yoghurt dari tiga kultur campuran bakteri. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor, Bogor. RAHMAN, A., S. FARDIAZ, W.P. RAHAJU, SULIANTARI dan C.C. NURWITRI. 1992. Teknologi Fermentasi Susu. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor. RAY, B. 2003. Fundamental Food Microbiology 3rd Ed. CRC Press, London. TAMIME, A.Y., dan V.M.E. MARSHALL. 2002. Physiology and biochemistry of fermnted milk. Dalam: B.A. LAW (ed). Microbiology and Biochemistry of chese and fermented milk 2nd edition Chapman and Hall, London. WATER, J.V. 2003. Yoghurt and immunity: The health benefit of fermented milk products that contain lactic acid bacteria. Dalam: E.R. FRANWORTH (Editor), Handbook of Fermented Functional Foods. CRC Press, Florida.
DISKUSI Pertanyaan: 1. Pengaruh probiotik/yoghurt sudah berpuluh tahun yang lalu diketahui dan dibuktikan secara ilmiah, bahwa secara in vivo mempunyai pengaruh “competitive exclusion” terhadap bakteri pathogen serta memperbaiki pencernaan dan absorbsi nutrisi. Mengapa dalam penelitian ini seolaholah hal tersebut tidak disadari/ diketahui penulis? sehingga dilakukan penelitian awal lagi untuk mengetahui aktifitas antimikroba dari yoghurt/ probiotik secara in vitro? 2. Jika penelitian hanya bertujuan menguji kualitas yoghurt A dan B, mengapa tidak dianalisa pH, kandungan bakteri dan kandungan lain di dalam yoghurt A dan B yang berpengaruh dalam aktifitas antimikroba? 3. Menurut penulis, komponen apakah dalam yoghurt/probiotik yang berperan sebagai antimikroba? Karena yogurt bukan antibakteri seperti antibiotika dan tidak ada hubungannya sama sekali dengan resistensi bakteri. Jawaban: 1. Pengaruh probiotik/yoghurt sudah berpuluh tahun yang lalu diketahui dan dibuktikan secara ilmiah, penelitian ini dilakukan lagi dari awal untuk mengetahui apakah probiotik/yoghurt masih sensitif terhadap bakteri uji, karena diketahui sifat bakteri bisa menjadi resisten karena berbagai sebab. 2. Karena dana tidak tersedia 3. Komponen yang berperan sebagai antimikroba yaitu bakteri asam laktat, etanol, diasetil, hydrogen, peroksida dan bakteriosis. Dapat menghasilkan senyawa antimikroba yang aktif menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif dan gram positif.
307
