PENGEMBANGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis UNTUK PENETAPAN KADAR ANTIBIOTIK SEFADROKSIL
HIKMATULLAH
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PENGEMBANGAN METODE SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis UNTUK PENETAPAN KADAR ANTIBIOTIK SEFADROKSIL
HIKMATULLAH
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk Penetapan Kadar Antibiotik Sefadroksil Nama : Hikmatullah NIM : G44076012
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Drs Dudi Tohir, MS NIP 195711041989031001
Rudi Heryanto, SSi, MSi NIP 197604282005011002
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 195012271976032002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian dan studi pustaka yang dilaksanakan pada bulan Juni hingga September 2012 bertempat di Laboratorium Kimia Organik dan Laboratorium Bersama Institut Pertanian Bogor dengan judul Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk Penetapan Kadar Antibiotik Sefadroksil. Penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak Drs Dudi Tohir, MS dan bapak Rudi Heryanto, SSi, MSi selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Pak Sabur dan keluarga besar Laboratorium Kimia Organik yang telah membantu penulis selama menjalani penelitian. Terima Kasih juga kepada Pak Eko dari Laboratorium Bersama yang menyediakan spektrofotometer UV-Vis yang akan digunakan penulis. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Saudari Yuniorita, Saudara Yulianto, Endro yang membantu dalam pencarian literatur dan informasi farmasi lainnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Desember 2012
Hikmatullah
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Serang pada tanggal 9 Oktober 1983 dari Ayah Arsad M Sulaeman dan Ibu Nurhayati. Penulis merupakan putra keempat dari empat bersaudara. Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 21 Bandung dan diterima di IPB pada Program Studi Analisis Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Pada tahun 2004 penulis lulus dari Program Diploma Analisis Kimia setelah menyelesaikan tugas akhir praktik kerja lapangan di Balai Besar Industri Agro, Bogor, Jawa Barat. Setelah lulus, penulis bekerja di PT Panen Djaya Abadi, Jakarta dan PT Guardhian Pharmatama, Tangerang. Tahun 2007, penulis masuk IPB melalui tes pada Program Sarjana Kimia Penyelenggaraan Khusus, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
ABSTRAK HIKMATULLAH. Pengembangan Metode Spektrofotometri UV-Vis untuk Penetapan Kadar Antibiotik Sefadroksil. Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan RUDI HERYANTO. Antibiotik sefadroksil dihasilkan oleh jamur Cephalosporium acremonium dan telah digunakan secara luas. Pada penelitian ini, dikembangkan metode penetapan kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet-tampak (UV-Vis). Metode ini lebih cepat, mudah, murah, dan terbukti memberikan hasil pengukuran yang tidak berbeda nyata dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi yang menjadi rujukan United States Pharmacopeia, untuk waktu hidrolisis selama 30 menit. Panjang gelombang maksimum ialah 355.5 nm untuk pelarut akuades dan 351.8 nm untuk pelarut bufer fosfat pH 5. Validasi metode spektrofotometri UV-Vis menghasilkan akurasi, presisi, linearitas, limit deteksi dan kuantitasi yang memenuhi persyaratan International Conference on Harmonization. Secara keseluruhan, pelarut akuades memberikan hasil validasi yang lebih baik daripada pelarut bufer fosfat pH 5.
ABSTRACT HIKMATULLAH. Development of UV-Vis Spectrophotometric Method for Determination of Cefadroxil in antibiotic. Supervised by DUDI TOHIR and RUDI HERYANTO. Cefadroxil antibiotic is produced by Cephalosporium acremonium fungi and has been utilized widely. In the research, determination of cefadroxil in drug capsule by using ultraviolet-visible (UV-Vis) spectrophotometer was developed. This method is faster, easier, cheaper, and was proven to give results which were not different with the high performance liquid chromatograpy method which is used as the reference method in the Unites States Pharmacopeia for 30 minutes of hydrolysis time. The maximum wavelength was 355.5 nm in aquadest and 351.6 nm in phosphate buffer pH 5. Validation of the UV-Vis spectrophotometric method resulted accuration, precision, linearity, detection limit and quantitation limit complied with International Conference on Harmonization regulations. Overall, aquadest gave better validation results as solven than phosphate buffer pH 5.
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................ DAFTAR GAMBAR ................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ PENDAHULUAN ........................................................................................ BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ................................................................................... Pemilihan Pelarut Standar dan Sampel ............................................... Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis ......................................... Pengukuran Sefadroksil dengan Metode KCKT ............................... HASIL DAN PEMBAHASAN Spektrum Sefadroksil dalam Kapsul Obat ........................................... Kadar Sefadroksil dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis ............ Kadar Sefadroksil dengan Metode KCKT .......................................... Perbandingan Metode Spektrofotometri UV-Vis dengan KCKT ........ Hasil Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis ...............................
vii vii viii 1 1 1 1 2 2 3 4 4 5
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .............................................................................................. Saran ....................................................................................................
6 6
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................
7
LAMPIRAN ..................................................................................................
8
DAFTAR TABEL
1 2 3 4
Halaman Serapan sampel sefadroksil-KOH 1 N .......................................................... 3 Kadar sefadroksil dalam sediaan kapsul obat antobiotik ............................... 4 Hasil uji statistik metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT .................. 5 Hasil validasi metode spektrofotometri UV-Vis ........................................... 6
DAFTAR GAMBAR
1 2
Halaman Spektrum serapan standar sefadroksil dalam akuades dan dalam bufer fosfat pH 5 tanpa pemanasan ........................................................................ 3 Spektrum serapan standar sefadroksil 25 µg/mL dalam akuades dan dalam bufer fosfat pH 5 setelah pemanasan selama 30 menit dengan KOH 1 N ..... 3
1
PENDAHULUAN Antibiotik adalah senyawa organik yang dihasilkan oleh spesies mikroorganisme tertentu dan bersifat toksik bagi spesies mikroorganisme lain. Sifat toksik senyawa antibiotik dapat menghambat pertumbuhan bakteri (efek bakteriostatik) atau langsung membunuh bakteri (efek bakteriosida) (Sumardjo 2008). Sefadroksil adalah antibiotik -laktam generasi pertama dari sefalosporin yang mempunyai aktivitas antibakteri spektrum luas dan bersifat bakteriosida, bekerja dengan menghambat pembentukan dinding sel mikroorganisme (Tjay & Rahardja 2002). Secara umum, obat memiliki efek samping yang tidak diinginkan dan bersifat merugikan bila berlebihan (Ditjen POM 1996). Untuk itu, diperlukan pengawasan yang ketat dalam bidang farmasi, sejak proses pembuatan hingga penetapan kadar pada produk akhir. Penetapan kadar sefadroksil telah banyak dilakukan dengan menggunakan berbagai teknik analisis, di antaranya kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (USP 2011). Salah satu metode lain yang dikembangkan untuk penetapan kadar sefadroksil dalam sediaan farmasi (kapsul) adalah spektrofotometri ultraviolet-tampak (UV-Vis). Kelebihan metode ini di antaranya menghasilkan absorbans maksimum lebih besar dan analisanya lebih cepat. Shantier et al. (2011) telah menunjukkan bahwa penggunaan NaOH memberikan hasil yang sesuai dengan International Conference on Harmonisation (ICH) of Technical Requirement for Registration of Pharmaceutical for Human Use, namun puncak serapannya melebar. Penelitian ini memodifikasi pereaksi basa yang digunakan menjadi KOH. Larutan yang digunakan juga dimodifikasi mengikuti metode KCKT berdasarkan USP (2011). Hasil validasi metode modifikasi ini diharapkan akan memenuhi persyaratan ICH.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah kapsul sefadroksil, standar sefadroksil (U.S. Pharmacopoeia), KH2PO4 (p.a. Merck), pelet KOH (p.a. Merck), dan akuades. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-1700 Shimadzu, kuvet
kuarsa 1 cm, instrumen KCKT Prominence LC20AD Shimadzu, kolom Shim-pack VPODS C18 4.6 mm × 25 cm, neraca analitik, peralatan kaca, komputer, perangkat lunak UV Probe solution versi 2.21, perangkat lunak Microsoft Excel tahun 2007, dan saringan Nilon 0.02 µm. Pemilihan Pelarut Standar dan Sampel Sepuluh mg standar sefadroksil dimasukkan ke dalam gelas piala dan ditambahkan 20 mL akuades kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit. Larutan dipindahkan ke labu takar 100 mL dan ditepatkan volumenya dengan akuades. Larutan stok standar dengan konsentrasi 100 µg/mL tersebut diencerkan menjadi 10, 20, 30, 40, dan 50 µg/mL, masing-masing ditambahkan KOH 1 N dan dimasukkan ke dalam penangas air selama 15, 30, 45, dan 60 menit. Larutan sampel dibuat dengan menimbang serbuk kapsul setara dengan 25 mg sefadroksil dan dimasukkan ke dalam gelas piala, kemudian ditambahkan 60 mL akuades dan diaduk dengan pengaduk magnetik. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan ditepatkan volumenya dengan akuades. Larutan stok sampel dengan konsentrasi 250 µg/mL tersebut diencerkan menjadi 25 µg/mL, lalu ditambahkan KOH 1 N dan dimasukkan ke dalam penangas air selama 15, 30, 45, dan 60 menit Larutan standar dan sampel juga dibuat dalam pelarut bufer fosfat pH 5. Prosedur pembuatannya sama seperti di atas, dengan akuades digantikan oleh bufer tersebut. Sampel adalah kapsul sefadroksil dengan label klaim per kapsul mengandung 500 mg sefadroksil. Semua larutan standar dan sampel diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum. Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis Akurasi Serbuk kapsul setara dengan 5 mg sefadroksil ditimbang dan dimasukan ke dalam gelas piala, kemudian ditambah 60 mL akuades dan diaduk dengan pengaduk magnetik. Larutan dimasukan ke dalam labu takar 100mL dan ditepatkan volumenya dengan akuades. Sepuluh mL larutan sampel 50 µg/mL ini dipipet masing-masing ke dalam 3 buah labu takar berukuran 50 mL, lalu ditambahkan larutan standar 100 µg/mL sebanyak 10, 15, dan 20 mL, dan ditera
2
dengan pelarut. Pengukuran dilakukan 3 kali ulangan. Nilai perolehan kembali dihitung dengan rumus Perolehan kembali (%) =
× 100%
Keterangan: a = konsentrasi sampel + standar yang terukur (mg) b = konsentrasi sampel (mg) c = konsentrasi standar teoretis yang ditambahkan (mg) Presisi Larutan sampel diukur dengan spektrofotometer UV-Vis sebanyak 9 ulangan pada hari yang sama. Nilai presisi diukur dengan menghitung persentase simpangan baku relatif (% RSD) data dengan menggunakan rumus
2
= =1
n–1
RSD (%) =
× 100%
Keterangan : s = simpangan baku RSD = simpangan baku relatif xi = kadar sefadroksil tiap pengulangan = rerata kadar sefadroksil n = jumlah ulangan Linearitas Setiap konsentrasi larutan standar diukur sebanyak 6 ulangan pada kondisi optimum dan ditentukan persamaan garisnya dengan metode regresi linear (y = a + bx). Peubah a menyatakan intersep dan b adalah kemiringan garis. Linearitas kurva kalibrasi dilihat dari nilai koefisien korelasi (r). Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Persamaan linear yang diperoleh pada uji linearitas digunakan untuk menghitung limit deteksi dan limit kuantitasi. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar tersebut dengan rumus sebagai berikut: Limit deteksi = 3.3
Limit kuantitasi = 10 Keterangan: Sa = Simpangan baku intersep b = Rerata kemiringan Pengukuran Sefadroksil dengan Metode KCKT Fase gerak ialah larutan bufer fosfat pH 5, disiapkan dengan melarutkan 13.6 g KH2PO4 dalam 2 L akuades lalu diatur ke pH 5 dengan KOH 10 N yang dicampur dengan asetonitril dengan nisbah 960:40. Larutan disaring dengan saringan nilon sebelum digunakan. Kolom yang dipakai berukuran 4.6 mm × 250 mm dengan fase diam C18, panjang gelombang deteksi 230 nm, dan laju alir 1.5 mL/menit. Standar dibuat dengan menimbang secara saksama sefadroksil lalu dilarutkan dalam larutan bufer fosfat pH 5 hingga diperoleh konsentrasi sekitar 1.06 mg/mL, dan disaring dengan membran nilon. Sebanyak 10 kapsul dikeluarkan isinya, dicampurkan, dihomogenkan dengan mortar. Serbuk obat ini ditimbang setara dengan 212 mg sefadroksil ke dalam labu ukur 200 mL dan ditambahkan 100 mL bufer fosfat pH 5 kemudian di kocok selama 5 menit. Larutan ditera dengan bufer fosfat pH 5, disaring dengan membran nilon. Larutan standar dan sampel diinjeksikan ke dalam sistem KCKT sebanyak 10 µL dengan kondisi kerja yang sama.
HASIL DAN PEMBAHASAN Spektrum Sefadroksil dalam Kapsul Obat Dalam penelitian ini, sefadroksil dihidrolisis dalam pelarut akuades dan bufer fosfat pH 5 yang lazim digunakan pada pemisahan secara KCKT (USP 2011). Pereaksi basa yang digunakan untuk hidrolisis ialah KOH. Sebelumnya, Shantier et al. (2011) telah melaporkan hidrolisis sefadroksil menggunakan pereaksi NaOH dan akuades. KOH digunakan dalam penelitian ini karena merupakan basa kuat juga dan diharapkan memberikan spektrum yang lebih baik dibandingkan dengan menggunakan NaOH yang spektrumnya melebar. Diagram alir penelitian terdapat pada Lampiran 1. Gambar 1 menunjukkan spektrum serapan standar sefadroksil menggunakan 2 pelarut. Terdapat 2 puncak, yaitu puncak A (229 nm untuk akuades dan 228 nm untuk bufer fosfat pH 5) dan puncak B (263 nm untuk akuades dan 262 nm untuk bufer fosfat pH 5).
3
Berdasarkan USP (2011), panjang gelombang sefadroksil dalam akuades ialah 263 nm, maka puncak B merupakan serapan sefadroksil. Serapan puncak B lebih rendah dibandingkan dengan puncak A. Hal ini akan mengakibatkan sensitivitas pengukuran tidak baik pada konsentrasi rendah.
A
B
Gambar 1 Spektrum serapan standar sefadroksil dalam akuades (merah) dan dalam bufer fosfat pH 5 (biru) tanpa pemanasan. Setelah dihidrolisis dengan KOH 1 N dan dipanaskan dalam akuades 98 oC, kedua pelarut memberikan spektrum serapan yang lebih baik (Gambar 2), bila dibandingkan dengan spektrum setelah dihidrolisis dengan NaOH (Shantier et al. 2011). Terbentuk serapan tunggal yang lebih kuat intensitasnya . Puncak A pada Gambar 1 bergeser sebagai akibat pemutusan ikatan C-N pada cincin ß-laktam (Lampiran 2). Hasil ini serupa dengan hasil penelitian Ivama et al. (1999) dalam menentukan kadar sefaklor dalam sediaan farmasi, yaitu puncak kedua pada sefaklor menghilang setelah aminolisis dan bergeser serapan maksimumnya ke 340 nm. Lampiran 3 dan 4 menunjukkan spektrum serapan berbagai konsentrasi standar sefadroksil pada pelarut akuades dan pelarut bufer fosfat pH 5 dengan berbagai waktu pemanasan.
Gambar 2 Spektrum serapan standar sefadroksil 25 µg/mL dalam akuades (merah) dan dalam bufer fosfat pH 5 (biru) setelah pemanasan selama 30 menit dengan KOH 1N.
Hidrolisis sefadroksil dengan KOH menghasilkan larutan berwarna kuning yang memberikan serapan maksimum 355.5 nm pada pelarut akuades dan 351.6 nm pada pelarut bufer fosfat pH 5. Perubahan warna larutan menjadi kuning menunjukkan bahwa proses hidrolisis telah berhasil. Pemutusan ikatan C-N pada cincin ß-laktam mengubah hibridisasi sp3 pada N menjadi sp2 dan proses ini disertai eksitasi elektron yang memunculkan warna kuning. Hidrolisis ß-laktam dimungkinkan karena memiliki regangan sudut yang besar. Atom karbon karbonil sp2 secara normal memiliki sudut ikatan 120o, sedangkan sudut ikatan amida dalam cincin ß-laktam mendekati 90o (Cairns 2004). Hasil ini serupa dengan hasil penelitian Susidarti et al. (2008) dalam menentukan kadar sefadroksil dalam sediaan farmasi, yaitu perubahan larutan menjadi kuning oleh etil asetoasetat dan formaldehida. Selama hidrolisis sampel, intensitas serapan meningkat hingga menit ke-45 (Tabel 1). Efek hiperkromik ini berasal dari gugus auksokrom OH fenolik (Cairns 2004). Tabel 1 Serapan sampel sefadroksil-KOH 1 N Serapan
Waktu pemanasan (menit)* 15 30 45 60 0.4422 0,5668 0.6713 0.6367
Akuades Bufer fosfat 0.4792 0.5582 0.6717 0.6218 pH 5 Keterangan: *= rerata dari 9 ulangan presisi
Kadar Sefadroksil dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis Kadar sefadroksil dalam kapsul obat ditentukan dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum, yaitu 355.5 nm untuk pelarut akuades dan 351.6 nm untuk pelarut bufer fosfat pH 5. Rentang konsentrasi standar yang digunakan adalah 10−50 g/mL. Lampiran 5 dan 6 menunjukkan persamaan kurva standar yang diperoleh pada berbagai waktu pemanasan, berturut-turut dalam kedua pelarut tersebut. Penentuan konsentrasi sefadroksil dalam sampel dilakukan dengan metode standar eksternal, yaitu standar diukur terpisah dengan sampel (Harvey 2000). Semua nilai koefisien korelasi yang didapat memenuhi syarat ICH, yaitu lebih besar dari 0.9970. Hasil ini menunjukkan bahwa metode spektrofotometri UV-Vis mampu memberikan hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi sefadroksil dalam sampel.
4
Tabel 2 menunjukkan kadar sefadroksil dalam sediaan kapsul obat yang diperoleh dari 9 ulangan dengan spektrofotometer UV-Vis. Larutan dalam kedua pelarut memiliki kisaran kadar 503.1 hingga 504.6 mg/kapsul. Lampiran 7 dan 8 menunjukkan perhitungan kadar sefadroksil tersebut. Kadar Sefadroksil dengan Metode KCKT (USP 2011) Metode KCKT yang merujuk pada USP (2011) digunakan sebagai metode pembanding untuk penetapan kadar sefadroksil. Konsentrasi standar sefadroksil yang digunakan adalah 5, 10, dan 15 g/mL, sedangkan sampel dibuat setara dengan 10 g/mL, disiapkan sebanyak 6 kali ulangan. Lampiran 9 dan 10 menunjukkan kromatogram standar dan sampel sefadroksil. Lampiran 11 menunjukkan waktu retensi dan luas puncak standar dan sampel sefadroksil. Waktu retensi sefadroksil berada di sekitar menit ke-3.3. Sedikit perbedaan waktu antara standar dan sampel terjadi karena terdapat perbedaan matriks di antara keduanya. Kurva kalibrasi dibuat sebagai hubungan konsentrasi standar dengan luas puncak yang dihasilkan. Persamaan garis yang diperoleh adalah y = -336887 + 2542421.2x. Nilai koefisien korelasi yang didapat juga sesuai dengan ICH, yaitu lebih besar dari 0.9970, menunjukkan bahwa metode KCKT juga mampu memberikan hasil uji yang proporsional dengan konsentrasi sefadroksil dalam sampel. Perbandingan luas puncak kromatogram standar dan sampel menghasilkan kadar sefadroksil dalam sampel kapsul obat sebesar 505.1 mg/kapsul. Nilai tersebut diperoleh dari rerata 6 kali ulangan.
Perbandingan Metode Spektrofotmetri UV-Vis dengan KCKT Metode spektrofotometri UV-Vis teknik pengerjaannya lebih mudah dibandingkan dengan metode KCKT (sebagai rujukan). Metode alternatif ini didapati memberikan hasil yang sama baiknya dengan metode KCKT. Pengujian statistik dilakukan dengan uji beda nyata, dengan membandingkan varians dan rerata sampel dari kedua metode. Uji-F membandingkan ketelitian kedua metode dan mengukur varians, sedangkan ujit membandingkan ketepatan kedua metode dan mengukur rerata. Hasil uji-F menunjukkan bahwa nilai F hitung lebih kecil daripada F tabel (Tabel 3). Artinya, varians yang dihasilkan dengan metode spektrofotometri UV-Vis tidak berbeda nyata dengan metode KCKT. Sementara itu, uji-t tidak berpasangan mendapatkan nilai thitung lebih kecil daripada ttabel hanya pada waktu pemanasan 30 menit (Tabel 3). Nilai thitung pada menit ke-15, 45, dan 60 lebih besar daripada ttabel. Dapat disimpulkan bahwa nilai rerata yang dihasilkan kedua metode berbeda nyata pada 15, 45, dan 60 menit, tetapi tidak berbeda nyata pada 30 menit waktu pemanasan. Uji beda nyata ini dilakukan pada taraf kepercayaan 95%. Lampiran 12 menunjukkan perhitungan uji distribusi F dan uji t. Hasil uji statistik menyatakan bahwa hasil hidrolisis memberikan varians yang sama untuk semua perlakuan, tetapi menunjukkan perbedaan rerata pada menit ke-15, 45, dan 60. Berdasarkan hasil tersebut kondisi yang baik untuk hidrolisis ialah 30 menit yang memberikan varians yang sama dan tidak berbeda nyata hasilnya bila dibandingkan dengan metode KCKT.
Tabel 2 Kadar sefadroksil dalam sediaan kapsul obat antibiotik Spektrofotometer UV-Vis Parameter 15 menit
Akuades 30 menit 45 menit
KCKT
60 menit
15 menit
504.1
504.1
504.0
504.5
504.2
504.1
505.1
0.9974
0.9993
0.9980
0.9998
0.9998
0.9955
0.9999
0.9998
0.
1.1404
0.5124
0.5360
0.9999
0.8485
0.5671
0.5125
0.9456
0.12
0.22
0.10
0.10
0.20
0.17
0.11
0.10
0.19
Kadar sefadroksil (mg/kapsul)
503.1
504.1
Koefisien korelasi (r)
0.9968
Simpangan baku (SD) Simpangan baku relatif (RSD)
Bufer fosfat pH 5 30 menit 45 menit
60 menit
5
Tabel 3 Uji statistik metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT Larutan
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Waktu (menit)
Uji F Fhitung
Uji t F tabel
thitung
15
1.593
30
0.75
45
1.269
60
1.024
2.289
15
1.271
2.426
30
1.243
45
2.875
60
2.591
Hasil Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis Validasi adalah suatu tindakan untuk membuktikan bahwa suatu proses atau metode dapat memberikan hasil yang konsisten sesuai dengan spesifikasi yang telah ditetapkan dan terdokumentasi dengan baik (Valcarcel 2000). Keabsahan hasil yang didapatkan dari pengembangan metode spektrofotometri UV-Vis perlu dievaluasi dengan melakukan validasi metode. Berdasarkan hasil uji statistik, validasi hanya dilakukan pada menit ke-30. Parameter validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, limit deteksi, dan limit kuantitasi. Akurasi Akurasi atau ketepatan metode analisis ditentukan dengan metode penambahan standar dan dinyatakan sebagai perolehan kembali (%). Standar sefadroksil sebanyak 1.0, 1.5, dan 2.0 mg ditambahkan ke dalam sampel obat yang berisi 0.5 mg sefadroksil. Perolehan kembali pada pelarut akuades berkisar 99.52−100.30%, sedangkan dalam pelarut bufer fosfat pH 5 99.56−100.58% (Tabel 4). Hasil ini sesuai dengan yang disyaratkan oleh ICH, yaitu 98−102%, yang menunjukkan bahwa metode penetapan kadar sefadroksil secara spektrofotometri UV-Vis telah memiliki akurasi yang tinggi dengan hasil pengukuran dekat dengan nilai sebenarnya. Lampiran 12 menunjukkan perhitungan akurasi pada pelarut akuades dan bufer fosfat pH 5. Presisi Presisi menggambarkan kedekatan nilai antara serangkaian pengukuran yang didapat dari sampel yang homogen pada kondisi tertentu (ICH 1996). Nilai presisi merupakan ukuran sebaran data di sekitar nilai tengahnya
ttabel
4.763 3.687
3.687
2.014 2.448
1.448 2.244
2.160
2.160
2.398
dan lazim dituliskan sebagai simpangan baku relatif (RSD) dari sederet pengukuran (Meier & Z nd 2000). Tabel 4 menunjukan nilai presisi yang didapatkan dari 9 kali pengukuran larutan sampel 25 µg/mL. Dalam akuades, nilainya 0.2262% dan dalam bufer fosfat pH 5, 0.1683%. Hasil ini menunjukkan bahwa analisis antibiotik sefadroksil teliti berdasarkan kriteria yang ditetapkan ICH (1996), karena nilai RSD di bawah 2%. Ketelitian yang tinggi menunjukkan bahwa hasil analisis oleh analisis yang sama dalam periode kerja tertentu dan dengan menggunakan larutan dan peralatan yang sama, memiliki keterulangan yang baik. Linearitas Linearitas menunjukkan kemampuan suatu prosedur analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel (ICH 1996). Nilai linearitas dievaluasi sebagai koefisien korelasi (r). Koefisien korelasi menunjukkan hubungan antara jumlah atau konsentrasi sampel dan respons dari persamaan kurva regresi linear (y = a + bx). Penentuan linearitas dilakukan dengan 5 konsentrasim sampel yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50 g/mL, masing-masing sebanyak 6 kali ulangan. Pada pelarut akuades, koefisien korelasi berkisar 0.9997 dan pada pelarut bufer fosfat pH 5 berkisar 0.9993 (Tabel 4). Nilai koefisien korelasi yang tinggi menunjukkan hubungan yang linear antara sinyal detektor yang terukur dan jumlah sefadroksil dalam sampel. Nilai koefisien korelasi yang didapatkan positif, maka kedua peubah mempunyai hubungan searah (Supranto 2001). Nilai kemiringan garis (a) menyatakan sensitivitas suatu metode. Nilai kemiringan yang kecil menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi yang kecil tidak terlalu
6
Tabel 4 Hasil validasi metode spektrofotometri UV-Vis Akuades
Bufer fosfat pH 5
Standar ICH
Simpulan
0.2262
0.1683
0–2
Kedua pelarut memberikan hasil yang teliti
Akurasi (%) a) Standar 1.0 mg
99.52
100.13
b) Standar 1.5 mg c) Standar 2.0 mg
100.30 100.07
100.58 99.55
98 – 102
Hasil pengukuran kedua pelarut dekat dengan nilai sebenarnya
Parameter Presisi (% RSD)
Linearitas Koefisien korelasi
0.9997
0.9993
0.9970
Limit deteksi (µg/mL)
0.2164
0.7087
–
Limit kuantasi (µg/mL)
0.6557
2.1474
–
berpengaruh terhadap sinyal detektor yang dihasilkan. Nilai intersep (b) menyatakan pengaruh matriks pada larutan. Nilai intersep yang semakin jauh dari nol menandakan pengaruh matriks dalam larutan yang semakin besar. Matriks memengaruhi kemampuan suatu metode untuk mengukur konsentrasi terkecil. Hal ini dapat mengganggu penentuan analit dalam sampel yang ditentukan. Lampiran 13 menunjukkan nilai a dan b yang relatif kecil, yang menunjukkan bahwa metode ini cukup sensitif dan pengaruh matriks tidak signifikan. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi Limit deteksi dan limit kuantitasi ditentukan dari persamaan regresi linear rerata hasil uji linearitas. Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit yang dapat dideteksi dan secara statistis dapat dibedakan dari sinyal blangko. Limit kuantitasi adalah jumlah atau konsentrasi terkecil analit yang dapat ditentukan dan dapat dipercaya (Valcarcel 2000). Limit deteksi dan kuantitasi dihitung dari nilai simpangan baku intersep dan rerata kemiringan dari persamaan regresi linear rerata. Limit deteksi metode spektrofotometri UV-Vis pada pelarut akuades ialah 0.2164 g/mL (Tabel 4). Nilai ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi kurang dari 0.2164 g/mL keberadaan sefadroksil menjadi tidak terdeteksi dalam akuades. Limit deteksi pada pelarut bufer fosfat pH 5 lebih tinggi, yaitu 0.7087 g/mL.
Kedua pelarut menunjukkan hubungan linear antara sinyal yang terukur dan jumlah sefadroksil dalam sampel . Konsentrasi terendah pada kedua pelarut yang dapat membedakan sinyal sefadroksil dan blangko Konsentrasi terendah pada kedua pelarut yang memberikan ketelitian dan ketepatan yang baik
Nilai limit kuantitasi diperoleh sebesar 0.6557 g/mL pada pelarut akuades dan 2.1476 g/mL pada pelarut bufer fosfat pH 5. Konsentrasi analit yang terukur di bawah nilai ini akan memberikan ketelitian dan ketepatan yang tidak baik. Lampiran 14 menunjukkan perhitungan limit deteksi dan limit kuantitasi.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Metode spektrofotometri UV-Vis dengan hidrolisis selama 30 menit dapat digunakan dalam penetapan kadar sefadroksil dalam kapsul obat antibiotik. Metode ini memberikan hasil pengukuran yang tidak berbeda nyata dengan metode KCKT. Hasil validasi metode spektrofotometri UV-Vis menghasilkan akurasi, presisi, linearitas, limit deteksi dan kuantitasi yang memenuhi persyaratan ICH. Secara umum, pelarut akuades memberikan hasil validasi yang lebih baik daripada pelarut bufer fosfat pH 5.
Saran Perlu dilakukan analisis terhadap parameter-parameter validasi yang lain seperti intermediet presisi, ketersalinan, spesifisitas, ketangguhan, dan uji kesesuaian sistem.
7
DAFTAR PUSTAKA Cairns D. 2004. Intisari Kimia Farmasi. Puspita RM, penerjemah; Simanjuntak J, editor. Jakarta: ECG. Terjemahan dari: Essential of Pharmaceutical Chemistry. Ditjen POM Depkes RI. 1996. Kompedia Obat Bebas. Jakarta: Ditjen POM Depkes RI. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill. [ICH] International Conference on Harmonization. 1995. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1) [terhubung berkala]. www.ich.org. [1 Nov 2012] Ivama VM et al. 1999. Spectrophotometric determination of cefaclor in pharmaceutical preparations. J Quimica Nova 22:201-204. Meier PC, Z nd RE. 2000. Statistical Methods in Analytical Chemistry. Ed ke-2. New York: J Wiley. Shantier SW, Gadkariem EA, Ibrahim KE, El-Obied HA. 2011. Spectrophotometric determination of cefadroxil in bulk and dosage form using sodium hydroxide. E-J Chem 8(3):1314-1322. Sumardjo D. 2008. Buku Panduan Kuliah mahasiswa Kedokteran Program Strata 1 Fakultas Bioeksata. Jakarta: ECG. Supranto J. 2001. Statistik. Jakarta: Erlangga. Susidarti RA. Rianti A, Martono S. 2008. Penetapan kadar sefadroksil secara spektrofotometri visible menggunakan pereaksi etil asetoasetat dan formaldehida. Maj Farmi Indones 19:41-47. Tjay TH, Rahardja K. 2002. Obat-obat Penting: Khasiat Penggunaan, dan Efekefek Sampingnya. Ed ke-4. Jakarta: Elex Media Komputindo. [USP] United States Pharmacopoiea 2011. USP 34. Maryland: USP Convention. Valcarcel M. 2000. Principle of Analytical Chemistry. Heidelberg: Springer.
DAFTAR LAMPIRAN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Halaman Diagram alir penelitian .................................................................................. 9 Reaksi hidrolisis sefadroksil .. ...................................................................... 10 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam akuades ............... 11 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5.. 12 Kurva standar sefadroksil dalam akuades pada 355.5 nm .......................... 13 Kurva standar sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5 pada 351.5 nm ........... 14 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis dalam akuades ................................................................................. 15 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis dalam bufer fosfat pH 5 .................................................................... 17 Kromatogram standar sefadroksil ................................................................. 19 Kromatogram sampel sefadroksil 10 µg/mL ................................................. 20 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode KCKT ........................ 21 Uji statistika metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT ........................... 22 Perolehan kembali kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis pada waktu pemanasan 30 menit .......................... 24 Linearitas kadar sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis ......... 25 Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis .................................................................. 26
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Standar sefadroksil dan sampel obat
Metode spektrofotometri:
Metode rujukan USP (2011) (KCKT)
1. Preparasi standar dan sampel 2. Penentuan panjang gelombang maksimum 3. Penentuan kurva standar 4. Penentuan kadar sefadroksil dalam sampel
Uji statistika
Validasi metode: Akurasi, presisi, linearitas, limit deteksi, dan kuantitasi Pelarut: Akuades, bufer fosfat pH 5 Waktu hidrolisis: 15, 30, 45, 60 menit
10
Lampiran 2 Reaksi hidrolisis sefadroksil
S HO
CONH
+ KOH NH2
N H3C CH3
O
Sefadroksil
COOH
O
HO
NH
COOH HN
C H
N
O
Turunan 2,5-diketopiperazina
C
C CH3
CH2SH
11
Lampiran 3 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam akuades
(a) Waktu pemanasan 15 menit
(b) Waktu pemanasan 30 menit
(c) Waktu pemanasan 45 menit
(d) Waktu pemanasan 60 menit
Keterangan : = = = = = =
Standar sefadroksil 10 µg/mL Standar sefadroksil 20 µg/mL Standar sefadroksil 30 µg/mL Standar sefadroksil 40 µg/mL Standar sefadroksil 50 µg/mL Sampel kapsul sefadroksil 25 µg/mL
12
Lampiran 4 Spektrum serapan standar dan sampel sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5
(a) Waktu pemanasan 15 menit
(c) Waktu pemanasan 45 menit Keterangan : = = = = = =
Standar sefadroksil 10 µg/mL Standar sefadroksil 20 µg/mL Standar sefadroksil 30 µg/mL Standar sefadroksil 40 µg/mL Standar sefadroksil 50 µg/mL Sampel kapsul sefadroksil 25 µg/mL
(a) Waktu pemanasan 30 menit
(d) Waktu pemanasan 60 menit
13
Waktu pemanasan 15 menit Konsentrasi No Absorbans (µg/mL) 1
10
0.1340
2 3 4 5
20 30 40 50
0.3629 0.5447 0.7275 0.8972
Waktu pemanasan 45 menit Konsentrasi No (µg/mL) 1 10 2 20 3 30 4 40 5 50 Waktu pemanasan 60 menit Konsentrasi No (µg/mL) 1 10 2 20 3 30 4 40 5 50
Absorbans 0.2289 0.4436 0.6627 0.8867 1.1620
Absorbans 0.2059 0.5226 0.7734 1.0244 1.2902
60
y = - 0.016010 + 0.023093x r = 0.9974
1,0000
0,5000 0,0000 0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans 0.2678 0.5357 0.8035 1.0448 1.3392
40
1,5000
Absorbans
10 20 30 40 50
20
Konsentrasi (µg/mL)
1,5000
Absorbans
1 2 3 4 5
y = - 0.034040 + 0.018910x r = 0.9968
1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 0
y = 0.00263 + 0.026519x r = 0.9993
1,0000 0,5000 0,0000 0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans
Waktu pemanasan 30 menit Konsentrasi No (µg/mL)
Absorbans
Lampiran 5 Kurva standar sefadroksil dalam akuades pada 355.5 nm
1,5000
y = - 0.03782 + 0.026704x r = 0.9980
1,0000 0,5000 0,0000 0
20
40
Konsentrasi (µg/mL)
60
14
Lampiran 6 Kurva standar sefadroksil dalam bufer fosfat pH 5 pada 351.5 nm
1
10
0.1832
2 3 4 5
20 30 40 50
0.3698 0.5729 0.7700 0.9730
Absorbans
Waktu pemanasan 15 menit Konsentrasi No Absorbans (µg/mL)
1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000 0
Waktu pemanasan 45 menit Konsentrasi No Absorbans (µg/mL) 1 2 3 4 5
10 20 30 40 50
0.2408 0.5422 0.8342 1.0311 1.3539
Waktu pemanasan 60 menit Konsentrasi No Absorbans (µg/mL) 1 2 3 4 5
10 20 30 40 50
0.2466 0.4935 0.7408 0.9856 1.2334
40
60
Absorbans
y = - 0.00775 + 0.022425x r = 0.9998
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
1,6000 1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000
y = - 0.01409 + 0.027151x r = 0.9955
Absorbans
0.2139 0.4484 0.6581 0.8905 1.1141
1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000
0
20
40
60
Konsentrasi (µg/mL)
Absorbans
10 20 30 40 50
20
Konsentrasi (µg/mL)
Waktu pemanasan 30 menit Konsentrasi No Absorbans (µg/mL) 1 2 3 4 5
y = - 0.02016 + 0.019798x r = 0.9998
1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0,6000 0,4000 0,2000 0,0000
y = 0.00027 + 0.024657x r = 0.9999
0
20
40
Konsentrasi (µg/mL)
60
15
Lampiran 7 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis dalam akuades Waktu pemanasan 15 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.90
0.4431
25.2322
503.1343
2
26.90
0.4429
25.2216
502.9229
3
26.90
0.4424
25.1951
502.3945
4
26.80
0.4409
25.1158
502.6819
5
26.80
0.4403
25.0841
502.0475
6
26.90
0.4442
25.2903
504.2928
7
26.90
0.4426
25.2057
502.6059
8
26.80
0.4416
25.1528
503.4225
9
26.80
0.4422
25.1846
504.0589
Rerata
503.0624
Selang kepercayaan
0.6826
Waktu pemanasan 30 menit
1
Bobot obat (mg) 26.90
0.5668
Konsentrasi terbaca (µg/mL) 25.2375
2
26.90
0.5666
25.2289
503.0685
3
26.80
0.5648
25.1509
503.3844
4
26.90
0.5682
25.2981
504.4483
5
26.80
0.5644
25.1336
503.0382
6
26.90
0.5683
25.3025
504.5361
7
26.80
0.5683
25.3025
506.4187
8
26.90
0.5673
25.2592
503.6727
9
26.80
0.5662
25.2115
504.5973
Ulangan
Absorbans
Rerata
Kadar dalam 1 kapsul (mg) 503.2399
504.0449
Selang kepercayaan
0.8781
Waktu pemanasan 45 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6699
25.1620
503.6066
2
26.80
0.6697
25.1544
503.4545
3
26.80
0.6709
25.1997
504.3612
4
26.90
0.6719
25.2374
503.2380
5
26.80
0.6712
25.2110
504.5873
6
26.90
0.6736
25.3015
504.5161
7
26.90
0.6729
25.2751
503.9897
8
26.80
0.6707
25.1921
504.2090
9
26.80
0.6711
25.2072
504.5113
Rerata Selang kepercayaan
504.0526 0.3945
16
lanjutan Lampiran 7 Waktu pemanasan 60 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6342
25.1655
503.6767
2
26.90
0.6368
25.2629
503.7464
3
26.80
0.6353
25.2067
504.5013
4
26.90
0.6369
25.2666
503.8202
5
26.90
0.6365
25.2516
503.5211
6
27.00
0.6401
25.3865
504.3362
7
26.90
0.6374
25.2854
504.1951
8
26.80
0.6361
25.2367
505.1017
9
26.90
0.6374
25.2854
504.1951
Rerata
504.1215
Selang kepercayaan
Keterangan : 1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil Bobot 10 kapsul dengan isi Bobot 10 kapsul kosong Bobot rerata isi kapsul Contoh perhitungan: (Ulangan 1, waktu pemanasan 60 menit)
Kadar sefadroksil .=.
0.4127
= 6.7302 g = 1.0981 g = 0.56321 g
yy .= .-0.03782 + 0.026701x 0.6342 .= .-0.03782 + 0.026701x 0.6342 + 0.037682 x .= 0.026701 .= 25.1655 µg/mL 25.1655 µg mL ×
1000 mg 1g
×
×
1 mg 1000 µg 500 mg 525 mg
×
100 mL 26.8 mg
×
100 mL 1 mL
× 0.56321 g
.=. 505.5899 mg
.=. 503.6767 mg t × SD √n 2.31 × 0.5360 .=. √9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.4127
17
Lampiran 8 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis dalam bufer fosfat pH 5 Waktu pemanasan 15 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.80
0.4790
25.2126
504.6193
2
26.90
0.4803
25.2783
504.0535
3
26.80
0.4779
25.1571
503.5085
4
26.90
0.4811
25.3187
504.8591
5
26.80
0.4766
25.0914
502.1936
6
26.90
0.4802
25.2733
503.9538
7
26.80
0.4781
25.1672
503.7107
8
26.90
0.4811
25.3187
504.8591
9
26.80
25.2025
504.4171 504.0194 0.7699
0.4788 Rerata Selang kepercayaan
Waktu pemanasan 30 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.80
0.5589
25.2687
505.7422
2
26.90
0.5590
25.2731
503.9498
3
26.80
0.5578
25.2196
504.7594
4
26.90
0.5596
25.2999
504.4842
5
26.80
0.5586
25.2553
505.4740
6
26.80
0.5569
25.1795
503.9569
7
26.90
0.5596
25.2999
504.4842
8
26.80
0.5557
25.1260
502.8861
9
26.80
0.5575 Rerata
25.2062
504.4913 504.4698
Selang kepercayaan
0.6533
Waktu pemanasan 45 menit Ulangan
Bobot obat (mg)
Absorbans
Konsentrasi terbaca (µg/mL)
Kadar dalam 1 kapsul (mg)
1
26.80
0.6699
25.1921
504.2090
2
26.90
0.6727
25.2952
504.3905
3
26.80
0.6695
25.1773
503.9128
4
26.90
0.6727
25.2952
504.3905
5
26.90
0.6723
25.2805
504.0974
6
26.90
0.6717
25.2584
503.6567
7
26.90
0.6715
25.2510
503.5091
8
26.80
0.6709
25.2289
504.9456
9
26.90
0.6731
25.3099
504.6836
Rerata Selang kepercayaan
504.1995 0.4367
18
lanjutan Lampiran 8 Waktu pemanasan 60 menit
1
Bobot obat (mg) 26.80
0.6212
Konsentrasi terbaca (µg/mL) 25.1827
2
26.80
0.6212
25.1827
504.0209
3
26.80
0.6217
25.2023
504.4272
4
26.90
0.6227
25.2435
503.3596
5
26.80
0.6219
25.21111
504.5893
6
26.80
0.6213
25.1868
504.1030
7
26.90
0.6231
25.2598
503.6846
8
26.80
0.6215
25.1949
504.2651
9
26.80
0.6220
25.2152
504.6714
Ulangan
Absorbans
Kadar dalam 1 kapsul (mg) 504.0209
Rerata
504.1269
Selang kepercayaan
Keterangan : 1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil Bobot 10 kapsul dengan isi Bobot 10 kapsul kosong Bobot rerata isi kapsul
= 6.7302 g = 1.0981 g = 0.56321 g
yy = -0.00027 + 0.024657x 0.6212 = -0.000027 + 0.024657x 0.6212 – 0.000027 x= 0.024657 x = 25.1827 µg/mL
Contoh perhitungan: (Ulangan 1, waktu pemanasan 60 menit)
Kadar sefadroksil .=.
0.3946
25.1827 µg 1 mg 100 mL 50 mL × × × × 0.56321 g mL 1000 µg 26.8 mg 5 mL ×
1000 mg 500 mg × .=. 505.5899 mg 1g 525 mg
.=. 504.0209 mg
t × SD √n 2.31 × 0.5125 .=. √9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.3946
19
Lampiran 9 Kromatogram standar sefadroksil 3.343
mAU 1000 230nm,4nm (1.00)
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
-100 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
min
7.0
8.0
9.0
min
(a) Konsentrasi 5 µg/mL 3.363
mAU 230nm,4nm (1.00) 3500 3250 3000 2750 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500 250 0 -250 -500 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
(b) Konsentrasi 10 µg/mL 3.382
mAU 4000 230nm,4nm (1.00)
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
(c) Konsentrasi 15 µg/mL
7.0
8.0
9.0
min
20
Lampiran 10 Kromatogram sampel sefadroksil 10 µg/mL 3.325
mAU 230nm,4nm (1.00) 3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500 0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
min
21
Lampiran 11 Kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode KCKT
Luas puncak 9243138 22255487 34667350
Kadar sefadroksil dalam kapsul obat Waktu retensi Bobot obat Ulangan (menit) (mg) 1 3.325 218 2 3.336 218 3 4 5 6
3.354 3.352 3.363 3.359
216 216 216 216
y = -3368887 + 2542421.2x r = 0.9998
40000000 Luas puncak
Luas puncak dan standar sefadroksil Waktu Konsentrasi No retensi (µg/mL) (menit) 1 5 3.344 2 10 3.362 3 15 3.364
30000000 20000000 10000000 0 0
5
Luas puncak 22752306 22661617
Konsentrasi terbaca (µg/mL) 10.2741 10.2385
Kadar dalam 1 kapsul (mg) 505.5899 503.8380
22538935 22502523 22525714 22436522
10.1902 10.1759 10.1850 10.1499
506.1043 505.3941 505.8460 504.1027
Rerata Selang kepercayaan Keterangan : 1 kapsul ~ 500 mg sefadroksil Bobot 10 kapsul dengan isi Bobot 10 kapsul kosong Bobot rerata isi kapsul
505.1458 0.9916
= 6.7302 g = 1.0981 g = 0.56321 g y .= .-3368887 + 2542421.2x 22752306 .= .-3368887 + 2542421.2x 22752306 + 3368887 x .= 2542421.2 .= 10.2741 µg/mL
Contoh perhitungan: (Ulangan 1 )
Kadar sefadroksil .=.
10 15 Konsentrasi (µg/mL)
10.2741 µg mL ×
1000 mg 1g
×
×
1 mg 1000 µg 500 mg 525 mg
×
200 mL 218.0 mg
×
100 mL 1 mL
× 0.56321 g
.=. 505.5899 mg
.=.505.5899 mg
t × SD √n 2.57 x 0.9456 .=. √9
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.31) .=.
.=. 0.9916
20
22
Lampiran 12 Uji statistika metode spektrofotometri UV-Vis dan KCKT Uji distribusi F No 1
Larutan
Waktu (menit)
Akuades
S2
Fhitung
15
0.7492
1.591
30
1.0916
0.750
45
0.5124
3.402
0.9990
0.895
0.9999
0.893
30
0.8485
1.241
45
0.5671
2.777
60
0.5125
3.401
60 2
15
Bufer fosfat pH 5
S1
0.9451
Keterangan: S1 = Simpangan baku metode spektrofotometri UV-Vis S2 = Simpangan baku metode KCKT
Contoh perhitungan: (Akuades, 15 menit)
F hitung
.= .=
(S 1 )2 (S 2 )2 (0.9451)2 (0.7492)2
.= 0.1591
F tabel (derajat bebas; v1 = 5, v2 = 8 pada taraf kepercayaan 95%) = 3.687 F hitung < F tabel (Varians kedua metode tidak berbeda nyata) Uji perbedaan (uji-t) No 1
2
Larutan Akuadest
Bufer fosfat pH 5
Keterangan :
n1 n2 S2pool
Waktu (menit)
S2pool
Spool
thitung
15
0.6890
0.8301
4.763
30
1.0768
1.0377
2.013
45
0.5051
0.7107
2.919
60
0.5203
0.7213
2.694
15
0.9588
0.9792
2.183
30
0.7866
0.8869
1.446
45
0.5415
0.7359
2.240
60
0.5052
0.7108
2.720
= Jumlah sampel KCKT = 6 = Jumlah sampel spektrofotometri UV-Vis = 9 = Varian dari kedua kelompok
23
lanjutan Lampiran 12 Contoh perhitungan: (Bufer fosfat pH 5, 60 menit) S 2 pool .=
(n 1 –1)2S 1 2 + (n 2 –1)2S 2 2
(n 1 + n 2 – 2) (6–1) 0.94512 + (9–1) 0.51252 .= (6 + 9 – 2) .= 0.5052
S pool .= 0.7108 t hitung .=
| x1 – x2 |
√n
1
S pool
.+ 1
1
n
2
.= |505.1458 – 504.1269| 0.5052 .= 2.270
Derajat bebas =
√
1 .+ 1 6 9
n1 + n2 – 2
=6+9–2 = 13 ttabel dengan derajat bebas = 13 pada taraf kepercayaan 95% = 2.398 thitung < ttabel (tidak berbeda nyata)
24
Lampiran 13 Perolehan kembali kadar sefadroksil dalam kapsul obat dengan metode spektrofotometri UV-Vis pada waktu pemanasan 30 menit Pelarut akuades Standar sefadroksil (mg) Ditambahkan Terukur 0.9968 1.0031
1.5598
2.0552
Sampel sefadroksil terbaca (mg)
Perolehan kembali
Rerata (%)
Selang kepercayaan
RSD (%)
99.52
0.3307
0.13
100.30
0.7743
0.31
100.07
0.7425
0.30
99.37
0.9990
0.5017
99.59
0.9992
99.61
1.5589
99.94
1.5674
0.5017
100.48
1.5671
100.47
2.0554
100.01
2.0511
0.5017
99.80
2.0632
100.39
Pelarut bufer fosfat pH 5 Standar sefadroksil (mg) Ditambahkan
0.9918
1.5242
2.0132
Terukur
Sampel sefadroksil terbaca (mg)
0.9958 0.9909 0.9926 1.5329 1.5307 1.5353 2.0082 2.0018 2.0027
Perolehan kembali
100.40 99.91 100.09 100.57 100.42 100.73 99.75 99.44 99.48
0.5169
0.5169
0.5169
Rerata
Selang
RSD
(%)
kepercayaan
(%)
100.13
0.6177
0.25
100.58
0.3736
0.15
99.55
0.4273
0.17
Contoh perhitungan:
a –b × 100% c 2.5251 – 0.51699 100% .= × 2.0132
Perolehan kembali (%) .=
.= 99.75% Keterangan : a = konsentrasi sampel + konsentrasi standar terukur (mg) b = konsentrasi sampel (mg) c = konsentrasi standar yang ditambahkan (mg) t × SD √3 4.30 × 0.1721 .= √3 .= 0.4273
Selang kepercayaan .=
SD × 100% Rerata 0.1721 .= × 100% 99.55 .= 0.17%
Simpangan baku relatif (%) .=
25
Lampiran 14 Linearitas kadar sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis Serapan standar sefadroksil dalam pelarut akuades Konsentrasi (µg/mL) 10 20 30 40 50
1 0.2264 0.4481 0.6619 0.8807 1.1609
2 0.2266 0.4443 0.6633 0.8821 1.1671
Absorbans 3 4 0.2269 0.2273 0.4463 0.4454 0.6619 0.6616 0.8861 0.8871 1.1635 1.1659
5 0.2289 0.4436 0.6627 0.8867 1.1620
6 0.2244 0.4444 0.6656 0.8801 1.1619
Serapan standar sefadroksil dalam pelarut bufer fosfat pH 5 Konsentrasi (µg/mL) 10 20 30 40 50
1 0.2125 0.4454 0.6536 0.8870 1.1146
2 0.2115 0.4489 0.6609 0.8820 1.1150
Absorbans 3 4 0.2148 0.2139 0.4503 0.4484 0.6591 0.6581 0.8873 0.8905 1.1089 1.1141
5 0.2289 0.4436 0.6627 0.8867 1.1620
Linearitas standar sefadroksil dalam pelarut akuades Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku Selang kepercayaan
= = =
Persaman garis (y = a+ bx) a b r -0.014880 0.023016 0.9970 -0.018960 0.023188 0.9967 -0.016960 0.023130 0.9973 -0.018210 0.023189 0.9971 -0.016010 0.023093 0.9974 -0.017930 0.023107 0.9972 -0.017158 0.023121 0.9971 0.001516 0.000065 0.000248 1.59 × 10-3 6.82 × 10-5 2.60 × 10-4
Linearitas standar sefadroksil dalam pelarut bufer fosfat pH 5 pada 30 menit Ulangan 1 2 3 4 5 6 Rerata Simpangan baku Selang kepercayaan
Contoh perhitungan : (Pelarut bufer fosfat pH 5)
= = =
Persaman garis (y = a+ bx) a b r -0.011120 0.022458 0.9997 -0.008370 0.022401 0.9997 -0.003480 0.022252 0.9997 -0.007750 0.022425 0.9998 -0.016010 0.023093 0.9974 -0.003240 0.022254 0.9997 -0.008328 0.022481 0.9993 0.004828 0.000313 0.000948 5.06 × 10-3 3.28 × 10-4 9.94 × 10-4
t × SD √n 2.57 × 0.004828 .=. √6
Selang kepercayaan (taraf kepercayaan 95%, t : 2.57) .=.
.=. 5.06 × 10-3
6 0.2140 0.4513 0.6595 0.8877 1.1085
26
Lampiran 15 Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) sefadroksil dengan metode spektrofotometri UV-Vis Intersep (a)
Parameter
Kemiringan (b)
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Akuades
Bufer fosfat pH 5
Rerata
-0.017158
-0.008328
0.023121
0.022481
Simpangan baku
0.001516
0.004828
0.000065
0.000313
LOD
.= 3.3 ×
Sa
b 0.001516 .= 3.3 × 0.023121 .= 0.2163 µg/mL
LOQ
.= .=
Sa b 0.001516 10 × 0.023121 10 ×
.= 0.6557 µg/mL
