1. Valldasi Metode Penetapan Kadar Metil-DNA

ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA

BAB 4

BASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. Valldasi Metode Penetapan Kadar Metil-DNA 1.1 Pemurulan Sumpel iUJjmctil-DNA Untuk menentukan kadar [HJ]metil-DNA dengan metode LSC, maka J]ll1etil-DNA terlebih dahulu [H hasil reaksi DNA calf thymus dengan [HJ]MNU, dicuci hingga terbebas dari [HJ]MNU sisa reaksi. Hal ini perlu dilakukan karena [HJ]MNU sisa reaksi juga memberikan respons radioaktif pada pembacaan LSC sehingga akan mengganggu pada penetapan kadarnya. Pemumian [HJ]metil-DNA dilakukan dengan jalan pengendapan ulang dalarn Na-asetat dan etanol 95% sebanyak 2 kali, dan endapan yang dihasilkan dicuci berulang kali hingga pembacaan cacahannya sama dengan blanko (etanol 95 %). Pencucian [HJ]metil-DNA dilakukan minimal 7 kali untuk memastikan bahwa [HJ]metil-DNA yang diperoleh telah terbebas dari sisa [HJ]MNU dan masing masing filtrat cuciannya diambil 2 sampelnya untuk dilakukan penetapan aktifitas radioaktifnya. [H

J1Metil-DNA

dinyatakan bersih jika hasil pembacaan filtrat cucian tidak

ada perbedaan yang bermakna dengan blanko. Data pembacaan aktifitas radioaktif filtrat cucian DNA yang ditampung dipaparkan pada tabel I, sedangkan sebagai pembanding digunakan data pernbacaan aktifitas radioaktif dari blanko (etanol 95 %) disajikan pada tabel 2.

19 LAPORAN PENELITIAN

PENETAPAN KADAR METIL PADA ...

PURWANTO, DJOKO AGUS


20

Tabel J. Pembacaan Filtrat Hasil Cucian Produk Metil-DNA Filtrat cucian metil-DNA ke

Pembacaan LSC (cpm)

1.

2.463 1.852

2.

568

I ,, !

I

542 3.

lIS

, ;

73 4.

45 5\

5.

34

.m)

I, I

54 6.

50 44

~

I.

33 34

Dan hasil tersebut terlihat mulai cucian ke-3 hasil pembacaan LSC menunjukkan niJai yang relatif tetap dan besamya sarna dengan blanko seperti ditunjukkan pada tabel 2. Hal ini rnenunjukkan bahwa di dalam sampel sudah tidak terdapat lagi [HJ]MNU yang tidak bereaksi dengan DNA, jadi pada saat pernbacaan radioaktifitas sampel yang terbaca hanya radioaktifitas [H J]ll1etil yang sudah melekat pada DNA. Dengan demik.an pembacaan radioaktif [H J]ll1etil-DNA tidak terganggu oleh komponen lain di dalam larutan.

LAPORAN PENELITIAN




21

Tabel2. Hasil pembacaan blanko (larulan tris-EDTA pH 7). Pembacaan ke-

Aktifitas radioakrif (cpm)

I

43

2

56

3

31

4

44

5

28

6

40

7

37

8

32

9

48

10

51

i

! I

Rata-rata

41

±. 9

1.2 Reprodusibilitas Reprodusibilitas metode dilakukan dengan menyiapkan 10 tabung LSC yang masing-masing diisi dengan 20 ul sampel [H3]metil-DNA dengan kadar yang sarna dan dibaca hasil pengamatan LSC seperti tabel dibawah ini. Terlihat hasil SD yang diperoleh masih lebih kecil dari harga ketidak pastian U yang dihitung berdasarkan rumus U = k...j N dengan k =1 (Munson, 1981). Hal ini menunjukkan bahwa SD dari percobaan yang dilakukan masih lebih kecil dari penyimpangan teoritis harga rata-rata sebesar

>

34,13 % hingga + 34, 13 %, sebab jika dihitung besarnya U= 1 ...j 211 = 14,5. Dengan' demikian untuk metode LSC, standard deviasi sebesar 13,9 pada harga pembacaan ratarata cacahan 211 cprn masih dapat diterima dengan tingkat penyimpangan tidak lebih dari 3]metil-DNA

34,13 %. Oleh karena itu metode LSC untuk penetapan kadar [H

dapat

dinyatakan rcprodusibel.

LAPORAN PENELITIAN




22

Tabel 3. Reprodusibilitas metode penetapan aktifitas radioaktif [HJ]metil-DNA menggunakan LSC Pembacaan LSC (cpm) Snmpel 1

224

2

210

3

200

4

208

5

244

6

209

7

207

8

195

9

209

10

203

Rata-rata

211

SD

13,9

RSD

6,58 0Yo

I

f....-_.

I

l

I

1.3. Presisi Pembacaau Alat Liquid Scintillation Connter Untuk mengetahui presisi alat terhadap pembacaan sampel maka 2 buah sampel 0,135 pmoJ dan 0,538 pmol dibaca 10 kali pada Liquid Scintillation Counter dengan kondisi yang sama persis agar dapat ditentukan besamya kesalahan yang dilakukan oleh alat dalam rnengamati radioaktifitas sebuah sampel. Terlihat pada tabel 4 bahwa pada sampel [H

3]MNU

0,135 pmol diperoleh

RSD 2,96 % dan pada sampel 0,538 pmol diperoleh RSD 2,73 %, sehingga rata-rata RSD LSC=2,85 %.

LAPORAN PENELITIAN




23

Tabel 4. Penentuan presisi pembacaan alat LSC Pembacaan LSC Sampel [WjMNU Ke

0,135 pmol

0,538 pmol

1

340,6

1295,6

2

343,4

1335,7

3

327,8

1405,2

4

332,3

1368,9

5

341.4

1308,7

6

334,5

1325,4

7

338,7

1337.5

8

319,0

1340.2

9

328,7

1391.0

10

313,9

1387,4

Rata-rata

332,0

1349,9

Sf)

9,8

36,8

RSD

2,96 %

2,73 %

,

Dari tabel ini juga dapat diperoleh bahwa : 0,135 pmol [Hl]mctil-DNA, terbaca cacahan sebanyak 332 epm. I pmol [HJ]metil-DNA = 1/0,135 x 332 = 2459,3 cpm 0,538 pmol [HJ]metil-DNA, terbaea eaeahan sebanyak 1349,9 epm. I pmol [HJ]metil-DNA = 1/0,538 x 1349,9 = 2509,1 epm Rata-rata I pmol [HJ]metil-DNA = (2459,3 + 2509,1)/2

= 2484,2 epm.

Dengan perhitungan ini maka untuk selanjutnya dilakukan konversi bahwa I pmol [HJ]mctil-DNA menghasilkan cacahan 2484,2 cpm.

LAPORAN PENELITIAN




24

1.4. Llnlerltas

Hasil pengarnatan linieritas sampel percobaan dapat dilihat pada tabel 5 dibawah ini. Karcna tidak adanya standard sampel dan kadar sampel yang belum diketahui, maka linieritas dibuat berdasarkan volume sampel dan besarnya cacahan yang terbaca oleh LSC. Dengan dikontrol dengan banyaknya blanko yang meningkat sesuai dengan volume sampel, maka data yang disajikan merupakan hubungan antara radioaktifitas

sampel

dan

pembacaan

cacahan

dan

bukan

disebabkan

karena

meningkatnya volume pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel. Tabel5. Hubungan antara banyaknya sampel dengan pembacaan LSC Banyakuya sampel (Ill)

Pembaeaan

Rata-rata

LSC (epm) 1

2

[. r t..

15

30

50

i

lOO

LAPORAN PENELITIAN

114 112 98 125 137 129 148 156 162 193 174 203 256 271 267 417 391 369 501 713 677


108

130

155

I I

190

265

392

630



Koefisien korelasi (r)

0,998

Persamaan garis regresi

Y = 117,91 + 5,17 X

Harga Sxo

2.54

Harga Vxo

9,68 %

25

r hitung (0,998) > r tabel (0,874) untuk p < 0,01 Hasil pengujian linieritas sampel menunjukkan bahwa nilai r yang diperoleh signifikan pada taraf kepercayaan 1%. Artinya hipotesis nul yang menyatakan tidak ada korelasi antara variabel X dan Y ditolak, atau hipotesis altematifnya ada korelasi antara banyaknya sampel dan pembacaan cacahan oleh LSC. Karena harga r mendekati I maka besar kemungkinannya hubungan keduanya merupakan hubungan yang linier. Walaupun harga Vxo lebih besar dari 5%, artinya koefisien variasi fungsi garis liniemya cukup besar, namun signifikansi korelasi liniernya sangat meyakinkan karena dapat diterima pada derajat kepercayaan kurang dari I % dan besamya mendekati I. Disamping itu semua persyaratan untuk pengujian nilai r dapat dipenuhi yaitu : I. Sampel yang diambil merupakan sampel random. 2. Hubungan antara variabel X dan Y merupakan hubungan yang linier dan hal ini diindikasikan dengan besamya nilai r yang mendekati I atau -I. 3. Variabel X dan Y di dalam populasi memiliki distribusi normal. Besamya harga Vxo pada pengujian ini lebih banyak disebabkaa karen a besamya simpangan pada reprodusibilitas pembacaan LSC. dan bukan karena kekurang linieran hubungan antar kedua variabelnya.

1.5. Peuentuan Balas Deteksi dan Batas Kuantitasi Untuk menentukan batas deteksi dan batas kuantitasi sampel, maka dilakukan pengamatan akufitas radioaktif standard MNU sebab kernampuan deteksinya

LAPORAN PENELITIAN




.16

hanya tergantung pada pembacaan cacahan oleh LSC. Faktor-faktor lain misainya pemadaman (quenching) merupakan suatu yang dapat diperhitungkan bila telah diketahui besamya. Hasil pcngamatan radioaktifitas standard MNU disajikan pada label 6 berikut: Tabel 6 Pembacaan radioaktifitas slandard [H 3]MNU Banyaknya [H'jMNU Pembacaan Rata-rata (pmol)

LSC (cpm)

0,027

108,6

103,7

98,7 103,8 0,054

128,9

131,7

136,5 129,8 0,135

340,6

337,3

343,4

I

327,8 0,269

636,6

674,5

687,7 699,1 0,538

1295,6

1345,5

1335,7 1405,2


: 0,9996

Slope (b)

: 2467,75

Inrersep (a)

: 13,64

Persarnaan garis regresi

: y = 13,64 + 2467,75 X

Harga Sy

: 17,29

Harga Sxo

: 0,007

Harga Vxo

: 3,42 %

r hitung > r label untuk p < 0,01

LAPORAN PENELITIAN




27

Batas deteksi (Limit of

Detection = LaD) dan batas kuantitasi (Limit of

Quantitation = LOQ) dapat dihitung dengan terlebih dahulu menentukan sirnpangan terbesar dari pembacaan derau (noise) 10 blanko yang berisi aquabidest.

Tabel 7. Pembacaan radioaktifitas derau Scintillation Fluid dan pelarut, Derau ke-

Pembaeaan LSC (epm)

1

43

2

56

3

31

4

44

5

28

6

40

7

37

8

32

9

48

10

51

Jumlah

410

Rata-rata

41

Simpangan terbesar (Np) = 56·41 = 15 Sb = Np/2 = 15/2 =7,5 Slope (S) = 2467,75 LaD = k. Sb/S

= 3.7,5/2467,75 = 9,12 x 10,3

pmol

LOQ = k. Sb/S

= 10. 7,5/2467,75 = 30,4 x 10'3 pmol

LAPORAN PENELITIAN




28 1.6. Aku rasi

Akurasi adalah keterdekatan hasil penentuan metode analisis dengan ni lai benar (true value). Pada umumnya akurasi dinyatakan sebagai prosen pendapatan

kembali ( % recovery), yaitu hasil perolehan kembali analit dari matriks sampel dibandingkan dengan respon detektor dari standard murni. Sedangkan dalam hal ini, baik standard murni maupun metode standard yang dianggap dapat menghasilkan true value masih belum ada, sehingga penentuan akurasi belum dapat dilakukan. Pada metode LSC ini, faktor yang amat menentukan adalah pembacaan aktifitas radioaktif [H J]111etil sebab sampel langsung diberi scintllation fluid dan dibaca

aktifitasnya, Walaupun [HJ]metil-DNA dan [HJ]l1letil-nitrosourea merupakan dua senyawa yang berlainan, tetapi karena pada keduanya dibaca radioaktifitas [H J] yang sama, maka [H''[metil-nitrosourea dapat dianggap sebagai standard pada penentuan kadar sampel [HJ]metil-DNA. Pembacaan cacahan hanya dipengaruhi oleh dua hal yaitu radioaktifitas dan pemadaman, Oleh karena itu, besarnya pemadaman (quenching) dari DNA dipertirnbangkan sebagai faktor yang sangat berpengaruh terhadap akurasi metode. 1.7. Pernadaman oleh DNA Untuk mengukur besarnya pemadaman, maka sampel [HJ]MNU diamati aktifitas radioaktifnya, ditambah 50 ul DNA calf thymus 2,41 ppm kemudian diamati lagi, Jadi jika terdapat perbedaan cacahan, maka hanya disebabkan karena penambahan DNA. Setelah semua sampel terbaca, hasil yang diperoleh dianalisis apakah terdapat perbedaan pembacaan cacahan sebelum dan sesudah pemberian DNA dengan student test untuk sampel yang berpasangan. Hal ini dimaksudkan untuk menghindari terjadinya perbedaan pernipetan, wadah dan sebagainya.

LAPORAN PENELITIAN




29

Tabel 8. Pernadaman pembacaan radioaktifitas [H']MNU oleh DNA.

Sampel

[HJ]MNU + 50 III DNA

[H>]MNU

No.

Prosen Pendapatan Kembali

1.

Cacahan (epm) 2.587

[H>]metil DNA(pmol) 1,042

Cacahan (epm) 2.459

[H>]metil DNA(pmol) 0,990

2.

2.024

0,815

2.153

0,867

j()6,38

3.

1.872

0,754

1.756

0,707

93,77

4.

2.453

0,988

2.268

0,913

92,41

5.

2.615

1,053

2.592

1,044

99,15

6.

3.416

1,375

3.296

1,327

96,51

7.

2.251

0,906

2.346

0,944

104,19

8.

2.543

1,024

2.527

1,017

99,32

-

95,01

JUMLAH

786,74

Prosen Pendapatan Kembali Rata-rata

98,34

Jadi besarnya pemadaman rata-rata

= 100 -

98,34

= 1,66 %

Analisis statistik menggunakan Student Test untuk sampel berpasangan sampai pada taraf signifikansi 5% ternyata t hitung < t tabel (lampiran 1). Hal ini berarti hipotesis no1 harus diterirna, artinya tidak ada perbedaan yang bermakna pacta cacahan sampel sebelum dan sesudah pemberian DNA. Jadi proscn pendapatan kembali sebesar 98,34 % secara numerik mernang berbeda dengan nilai benar (true value), namun secara statistik tidak memiliki perbedaan yang bermakna. Dengau demikian besarnya pemadaman oleh DNA rata-rata sebesar 1,66 % juga tidak memiliki nilai yang bermakna. dengan kata lain bahwa tidak terjadi pemadaman oleh DNA.

LAPORAN PENELITIAN




30

2.Penetnpan Kadar DNA dengan Spektrofotometrl 2.l.Pembuutan kurva linter Sebelum dilakukan penetapan kadar DNA, maka terlebih dahulu ditentukan panjang gelombang yang akan digunakan. Untuk maksud tersebut telah dilakukan

penentuan

panjang

menggunakan spektrofotometer gelombang 258,4

11111

gelornbang

maksimum

serapan

DNA

dengan

Shimadzu UV·260 yaitu diperoleh pada panjang

(lampiran 2). Selanjutnya semua pengamatan serapan dilakukan

pada panjang gelombang maksimum tersebut. Hasil penentuan linieritas serapan, disajikan pada tabel 9. Tabel 9. Penentuan linieritas pembacaan serapan DNA Kadar (ng/).!I)

Ii

Absorbansi 0,019 0,017 0,017 0,099 0,098 0,100 0,196 0,193 0,197 0,292 0,291 0,292 0,383 0,383 0,384 0,475 0,478 0,478

1,25 \

6,17

12,19

18,07

23,81

29.41

0,018

0,099

0,195

0,292

0,383

0,477


: 0,9999

Slope (b)

: 0,0163

LAPORAN PENELITIAN

Absorbansl rata-rata




31

Intersep (a)

: -0,0022

Persamaan garis regresi

:y

Harga Sy

: 0,00128

Harga Sxo

: 0,09118

Harga Vxo

: 0,60 %

=

-0,0022 + 0,0163 X

r hi tung > r tabel untuk p < 0,0 I

2.2.Penetapan kadar DNA sampel Kadar

DNA

sampel

ditentukan

secara

spektrofotometri

dengan

menggunakan persamaan garis regresi pada penetapan linieritas dan diperoleh kadar 2,41 ng/ul seperti hasil pada tabel 10 dibawah ini Tabel 10. Penentuan kadar DNA pada sampel [Hl]metil-DNA hasil reaksi in vitro. No.Sumpel

Absorbansi

Kadar (ngllll)

1.

0,036

2,35

2.

0,037

2,41

3.

0,038

2,47

4.

0,037

2,41

Rata-rata

2,41

Dengan dernikian untuk perhitungan selanjutnya digunakan kadar DNA

sebesar 2,41 ng/ul.

3. Penentuan kadar ttejmetil-DNA Kadar [HJ]metil-DNA yang ditentukan dinyatakan dalam prnol/ug DNA untuk menghindari pengaruh ketervariasian jumlah DNA yang dapat diisolasi, Pengaruh pcmadaman diabaikau karena pada penentuannya tidak ada perbedaan yang signifikan antara perubacaan cacahan sampel dan nilai benar.

LAPORAN PENELITIAN




32

Tabel 11. Penetapan kadar [H3]metil-DNA dalam sampel. LSC

Banyaknya

sampel

Cacahan (cpm)

Kadar snmpel (pmol. [H']metill ug DNA

460,0

[H']metil-DNA (prnol) 0,1852

493,4

0,1986

16,41

499,2

0.2010

16,61

455.6

0,1834

15.16

1885,6

0,7591

1766,4

0,7111

14,75

1954,3

0,7868

16,32

f----'2014,6

0,8110

16,83

4450,5

1,7917

4987,0

2,0077

16,66

4613,2

1,8572

15,41

4837,8

1,9476

16,16

5 III

I 20 fll

50 pi

DNA (ug)

I I I

15,3 j

12,1 x 10"

.

48.2 x 1O"

15,75

120,5x1O'

14,87

15,85 ± 0,74

Kadar rata-rata

Terlihat pada tabel 11 bahwa kadar [H 3]metil-DNA yang diperoleh di dalam sampel hasil reaksi DNA dan [H 3]MNU secara in vitro sebesar 15,85 pmol/ug DNA dengan standard deviasi sebesar 0,74 pmol/ug DNA. Hasil ini sedikit lebih besar jika dibandingkan deugan hasil yang diperoleh oleh peneliti terdahulu (Sagher et (II.. 1988) yaitu 2000-4000 dpm/ug DNA yang menggunakan [H

3]MNU

2,5 Ci/mmol. Jika

dikonversikan kedalam [Hl]MNU yang dipergunakan pada penelitian ini yaitu 18.6 Ci/mmol maka diperoleh (18.6/2,5) x 4000 = 29.760 dpm/ 1'8 DNA atau (29.760/2484.2) = 11,98 prnol/ug DNA.

Lebih banyaknya metil-DNA yang terbentuk pada penelitian ini dapat disebabkan karena banyak hal diantaranya adalaah kemumian DNA calf thymus, waktu reaksi yang lebih lama, bufer yang 1ebih baik, pH, suhu, kualitas [Hl]MNU yang bagus dan sebagainya,

LAPORAN PENELITIAN



1. Valldasi Metode Penetapan Kadar Metil-DNA

Recommend Documents