PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA
MUHAMMAD NAZMI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ABSTRAK MUHAMMAD NAZMI. Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul (Annona glabra) Indonesia. Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan BUDI ARIFIN. Sirsak gundul (Annona glabra) termasuk ke dalam famili Annonaceae. Tanaman dari famili Annonaceae telah dilaporkan mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan asetogenin yang sangat baik sebagai antikanker. Tujuan penelitian ini adalah melakukan fraksionasi terpandu-uji toksisitas larva udang (BSLT) dan pencirian ekstrak aktif dari daun A. glabra Indonesia serta mengidentifikasi kandungan fitokimianya. Fraksionasi ekstrak etanol 95% menggunakan ekstraksi cair-cair menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi air kuning, jingga, dan gelap, fraksi kloroform, fraksi residu, fraksi heksana, dan fraksi metanol. Berdasarkan hasil BSLT, fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif dengan nilai LC50 98 ppm. Uji fitokimia, fraksi teraktif tersebut menunjukkan golongan alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin. Fraksionasi lebih lanjut menggunakan eluen heksana-CH2Cl2-metanol (90:40:5) menghasilkan 16 noda. Noda dengan keterpisahan paling baik dianalisis spektrum inframerahnya dan menunjukkan gugus-gugus fungsi dengan ikatan -OH, C=C aromatik, C-H sp2, dan C-H sp3. Kata kunci: Annona glabra, sirsak gundul, uji toksisitas larva udang
ABSTRACT MUHAMMAD NAZMI. Characterization of The Cytotoxic Active Extract from Indonesian Pond Apple (Annona glabra) Leaves. Supervised by GUSTINI SYAHBIRIN and BUDI ARIFIN. Pond apple (Annona glabra) is a member of Annonaceae. It has been reported that plants from Annonaceae family contains alkaloid, flavonoid, and acetogenin having good anticancer potency. The objectives of this research were to fractionate A. glabra leaves assisted with brine-shrimp lethality test (BSLT), to characterize the active extract, and to identify the phytochemical constituents. Fractionation of 95% ethanol extract using liquid-liquid extraction gave 7 fractions, namely yellow, orange, and dark water, chloroform, residue, hexane, and methanol fractions. Based on the BSLT results, chloroform fraction showed the highest activity with LC 50 of 98 ppm. Phytochemical test of the most active fraction showed alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, and tanin components. Subsequent fractionation of the chloroform fraction by using hexane-CH2Cl2-methanol (90:40:5) eluent produced 16 spots. The infrared spectrum of the best separated spot was analyzed and showed functional groups with -OH, aromatic C=C, C-H sp2, and C-H sp3 bonds. Keywords: Annona glabra, brine-shrimp lethality test, pond apple
PENCIRIAN EKSTRAK AKTIF SITOTOKSIK DARI DAUN SIRSAK GUNDUL (Annona glabra) INDONESIA
MUHAMMAD NAZMI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ii
Judul Skripsi Nama NIM
: Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul (Annona glabra) Indonesia : Muhammad Nazmi : G44096002
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr Gustini Syahbirin, MS NIP 19600819 198903 2 002
Budi Arifin, SSi, MSi NIP 19830109 200604 1 004
Diketahui Ketua Departemen Kimia
Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi, MS NIP 19501227 197603 2 002
Tanggal Lulus:
iii
PRAKATA Alhamdulillah. Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pencirian Ekstrak Aktif Sitotoksik dari Daun Sirsak Gundul (Annona glabra) Indonesia”. Salawat serta salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW, keluarga, dan para sahabatnya serta semua pengikutnya hingga akhir zaman. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Gustini Syahbirin, MS dan Budi Arifin, SSi, MSi selaku pembimbing yang senantiasa memberikan arahan, dorongan semangat, dan doa kepada penulis selama melaksanakan penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih atas bantuan serta masukan selama penelitian berlangsung kepada staf laboran Laboratorium Organik Pak Sabur serta kepada Dr Bagus Purwanto, MAgr, Farida Laila, MSi, Atep Dian Supardan, SSi, Ashadi Sasongko, SSi, dan rekan-rekan laboran di Direktorat Program Diploma Analisis Kimia IPB. Terima kasih tak terhingga penulis ucapkan kepada kedua orang tua, istri, kakak, dan adik serta seluruh keluarga, atas doa dan kasih sayangnya. Terima kasih juga dihaturkan kepada Doni, Nanda, Eris, Zulia, Wahyu, Dwi Utami, Ughi, Laras, kepada rekan-rekan mahasiswa diploma IPB dan teman-teman seperjuangan penelitian di Laboratorium Kimia Organik atas kerja samanya, serta rekan-rekan mahasiswa S1 Kimia Alih Jenis atas kebersamaannya. Penulis berharap karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Desember 2012
Muhammad Nazmi
iv
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banyumulek pada tanggal 5 Mei 1986 dari pasangan Bapak H Ahsanul Arifin dan Ibu Nurmah. Penulis adalah putra keempat dari lima bersaudara. Tahun 2005 penulis lulus dari MA Nurul Hakim Kota Kediri dan pada tahun yang sama diterima di Direktorat Program Diploma IPB Program Keahlian Analisis Kimia. Tahun 2007_2008 penulis melaksanakan praktik kerja lapangan di Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Tahun 2008_2009 melaksanakan magang kerja di Shimota Farm Provinsi Ibaraki Jepang. Tahun 2009 penulis melanjutkan pendidikan S1 pada Program Alih Jenis Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB. Tahun 2009_2012 penulis aktif sebagai asisten dosen pada Direktorat Program Diploma IPB, dan pernah bekerja sebagai staf Quality Control pada salah satu pabrik farmasi di daerah Bogor, pada tahun 2006_2008 penulis juga aktif di dalam berbagai organisasi. Di antaranya, penulis pernah menjabat sebagai juru bicara BEM J IPB, anggota komisi disiplin Direktorat Program Diploma IPB, serta aktif di dalam organisasi BKIM IPB.
v
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii PENDAHULUAN ...................................................................................................1 METODE .................................................................................................................1 Alat dan Bahan...........................................................................................................1 Lingkup Kerja ............................................................................................................1
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................3 Kadar Air ...................................................................................................................3 Ekstrak .......................................................................................................................3 Toksisitas dengan Metode BSLT ...............................................................................3 Fitokimia Fraksi Kloroform .......................................................................................4 Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif ..........................................................................4 Analisis Spektrum FTIR ............................................................................................5
SIMPULAN DAN SARAN .....................................................................................6 Simpulan ....................................................................................................................6 Saran ..........................................................................................................................6
DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................6 LAMPIRAN .............................................................................................................8
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak gundul ...................................................... 4 2 Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi kloroform daun sirsak gundul ........................ 4
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Ekstrak hasil fraksionasi daun sirsak gundul ...................................................... 3 2 Hasil partisi ekstrak kloroform dengan berbagai campuran eluen ..................... 4 3 Hasil partisi fraksi kloroform dengan heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) pada λ 366 nm. ............................................................................................................... 5 4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) untuk elusi pertama dan heksana-metanol (90:10) untuk elusi kedua. ......................... 5 5 Spektrum IR noda teratas fraksi kloroform daun sirsak gundul (warna hitam) dibandingkan dengan kloroform (warna merah). ............................................... 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian ........................................................................................ 9 2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul................................................... 10 3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan rendemen yang dihasilkan .......................................................................................................... 11 4 Spektrum FTIR hasil pengukuran ..................................................................... 12 5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009) ........................................................... 13
vii
viii
1
PENDAHULUAN Salah satu tanaman berkhasiat obat yang hidup di iklim tropis ialah sirsak gundul (Annona glabra) yang termasuk famili Annonaceae. Namun, di Indonesia sirsak umumnya masih sebatas dimakan buahnya (Wirakusumah 1995). Padahal, seluruh bagian tanaman sirsak dapat dimanfaatkan lebih luas, misalnya sebagai antitumor dan pestisida (Kintzios dan Barberaki 2004). Famili Annonaceae, termasuk A. glabra, banyak dipelajari karena kemampuannya sebagai antikanker. Senyawa antikanker yang telah ditemukan meliputi golongan alkaloid, flavonoid (Kintzios dan Barberaki 2004, Maria et al. 2007), dan asetogenin. Asetogenin merupakan senyawa antikanker yang paling banyak ditemukan. Terdapat 2100 spesies di dalam famili Annonaceae, dan senyawa asetogenin telah ditemukan pada beberapa spesies antara lain A. squamosa (serikaya), A. muricata (sirsak), A. bullata, A. longifolia, A. reticulata, A. glabra, A. jahnii, A. cherimolia, Asimina triloba, Asimina pariflora, Goniothalamus giganteus, Xylopia aromatica, Rollinia mucosa, dan R. emarginata (McLaughlin 2008). Khasiat atau manfaat tanaman famili Annonaceae di antaranya dapat menurunkan kadar darah dari antigen tumor, memperkecil ukuran tumor, dan menghambat pembelahan sel tumor. Selain itu, dapat meningkatkan pergerakan tubuh, menambah energi, dan memperpanjang waktu hidup (McLaughlin 2008). Sebelum digunakan untuk produk antikanker, senyawa antikanker harus diuji sitotoksisitas terlebih dahulu. Uji ini digunakan untuk memprediksi keberadaan senyawa yang bersifat toksik terhadap sel (Kurnijasanti et al. 2008). Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsipnya, komponen bioaktif bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Uji toksisitas antara lain dilakukan dengan menggunakan metode uji kematian larva udang (BSLT) dengan larva Artemia salina Leach sebagai hewan uji (Zebua 2011). Pada metode BSLT, sifat toksik ekstrak ditentukan dengan menghitung jumlah kematian larva udang pada setiap konsentrasi yang diujikan. Suatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm setelah waktu kontak 24 jam (Meyer et al. 1982).
Kandungan metabolit sekunder tanaman beragam bergantung pada tempat tumbuhnya. Hal ini mendorong pentingnya penelitian kandungan dan khasiat tanaman A. glabra Indonesia. Pada penelitian ini, dilakukan fraksionasi-terpandu uji toksisitas terhadap ekstrak etanol dari daun A. glabra. Salah satu noda dengan keterpisahan yang baik dari fraksi teraktif yang didapat dicirikan kelompok senyawanya dengan spektrofotometer inframerah transformasi Fourier (FTIR).
METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan selama penelitian ini ialah alat-alat kaca, mikropipet, neraca analitik, oven, penguap putar, multiwell 24 sumur, dan alat FTIR Perkin Elmer seri SpectrumOne Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Bahanbahan yang digunakan ialah daun sirsak gundul dari kawasan Kampus IPB Dramaga, etanol 95%, larva A. salina Leach, heksana, kloroform, pelat kromatografi lapis tipis (KLT) aluminium, silika gel G60F254 dari Merck, diklorometana, metanol, dan air suling. Lingkup Kerja Metode penelitian yang dilakukan mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yang meliputi preparasi sampel daun sirsak gundul, penentuan kadar air, ekstraksi daun sirsak, partisi ekstrak etanol, uji toksisitas fraksifraksi ekstrak, serta uji fitokimia dan pencirian gugus fungsi dari salah satu komponen fraksi teraktif. Penentuan Kadar Air Cawan porselen dikeringkan di dalam oven bersuhu 105 °C selama 60 menit. Selanjutnya cawan didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, dan ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan dikeringkan di dalam oven selama 24 jam pada suhu 105 °C. Setelah didinginkan dalam eksikator sekitar 30 menit, cawan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo) dan ditentukan dengan persamaan berikut (AOAC 1984): Kadar air (%) =
A B
100%
2
Keterangan: A = bobot bahan sebelum dikeringkan (g) B = bobot bahan setelah dikeringkan (g) Preparasi dan Ekstraksi Daun Sirsak Gundul Daun sirsak gundul segar dipotong kecilkecil kemudian dicuci dengan air dan dikering-udarakan. Sebanyak kira-kira 1 kg sampel yang sudah kering dimaserasi dengan etanol 95% dengan nisbah 1:8 selama 3×24 jam. Ekstrak dipekatkan dengan penguap putar. Ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang dan dihitung rendemennya dengan persamaan berikut: Keterangan: a = bobot ekstrak (g) b = bobot contoh awal (g) fk = faktor koreksi [(100+kadar air) /100] Partisi Ekstrak (Rupprecht et al. 1990) Ekstrak pekat etanol dipartisi dengan pelarut kloroform-air 1:1. Mula-mula ekstrak dilarutkan dengan kloroform, dimasukkan ke corong pisah, lalu diekstraksi dengan air. Fase organik dan fase residu dipisahkan dari fase air. Fase air hasil ekstraksi dibagi jadi 3 bagian, yaitu fase air dengan wadah gelap, fase air berwarna jingga, dan fase air berwarna kuning. Masing-masing dipekatkan dengan penguap putar dan freeze dry. Selanjutnya ekstrak pekat kloroform dipartisi dengan pelarut heksana-metanol dengan nisbah 1:1, dan setiap fraksi yang didapat juga dipekatkan dengan penguap putar. Uji Toksisitas Fraksi-Fraksi Ekstrak Penetasan Kista A. salina. Sebanyak 50 mg kista A. salina dimasukkan ke dalam wadah berisi air laut yang sudah disaring dan diaerasi. Kista dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Larva yang sudah menetas digunakan untuk uji toksisitas. Uji Toksisitas terhadap A. salina. Larutan stok ekstrak kloroform, ekstrak air, residu, ekstrak heksana, dan ekstrak metanol dibuat dalam konsentrasi 2000 ppm dengan pelarut air laut kemudian diencerkan hingga diperoleh konsentrasi 10, 100, 500, dan 1000 ppm. Ke dalam multiwell dimasukkan 400 μL air laut, 10 ekor larva udang dalam 600 μL air laut, dan 1 mL ekstrak. Ulangan dilakukan sebanyak 3 kali. Multiwell ditutup dengan aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam.
Nilai LC50 ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS. Uji Fitokimia Fraksi Teraktif (Harborne 1987) Alkaloid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 10 mL kloroform lalu ditambahkan 4 tetes NH4OH dan disaring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan 10 tetes H2SO4 2 M, kemudian dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji positif jika berturut-turut didapatkan endapan berwarna jingga, putih, dan cokelat. Saponin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 10 mL air suling panas dan dididihkan selama 5 menit. Campuran disaring dan dikocok kuat selama 10 menit hingga timbul busa. Apabila busa stabil selama 10 menit, maka filtrat positif mengandung saponin. Steroid dan Triterpenoid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 25 mL etanol panas (50 ⁰C), kemudian disaring ke atas kaca arloji dan diuapkan sampai kering. Residu dilarutkan dalam eter dan ditambahkan 3 tetes pereaksi LiebermanBuchard (3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4). Uji positif triterpenoid ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu, sedangkan uji positif steroid ditandai dengan terbentuknya warna hijau atau biru. Tanin. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades panas kemudian disaring. Filtrat ditambahkan dengan FeCl3 1%. Bila dihasilkan warna hijau, biru, atau hitam, maka filtrat positif mengandung tanin. Flavonoid. Sebanyak 0.1 g fraksi ekstrak teraktif dilarutkan dalam 10 mL akuades panas kemudian disaring. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan 0.05 g serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil alkohol, kemudian dikocok kuat. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, jingga, atau kuning pada lapisan amil alkohol. Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif Fraksi ekstrak teraktif ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 5 kali totolan. Setelah kering, langsung dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Eluen yang digunakan ialah campuran CHCl3-MeOH (9:1), CH2Cl2MeOH (19:1), C6H6-EtOAc-MeOH (5:4:1) (Rupprecht et al. 1990), CH2Cl2-MeOH (2:1), heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) (Gleye et
3
al. 2000), dan heksana-metanol (90:1) (Wu et al. 1995). Noda yang dihasilkan dari proses elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Eluen yang menghasilkan noda paling banyak dengan keterpisahan baik dipilih sebagai eluen pada proses pemisahan dengan KLT preparatif. Analisis Spektrum FTIR Salah satu noda dengan keterpisahan paling baik hasil pemisahan dengan KLT preparatif diukur dengan spektrofotometer FTIR. Spektrum yang dihasilkan dianalisis untuk menentukan golongan senyawanya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Kadar air dapat digunakan untuk menentukan jumlah sampel awal yang harus disediakan sampai keseluruhan proses isolasi berakhir. Selain itu, kadar air dapat digunakan untuk mengukur ketahanan sampel terhadap kontaminan jamur atau mikrob. Menurut Winarno (1992), suatu sampel dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama jika memiliki kadar air di bawah 10%. Sampel daun sirsak gundul segar yang digunakan pada penelitian ini mengandung air yang cukup banyak, yaitu 75.45%, sedangkan sampel yang sudah dikeringudarakan (serbuk) mengandung air 9.64% (Lampiran 2). Berdasarkan hasil di atas, sampel daun yang masih basah tidak boleh dibiarkan dalam jangka waktu lama karena dapat menyebabkan tumbuhnya jamur atau mikrob. Sampel dapat disimpan dalam jangka waktu lama jika sudah dikeringudarakan. Selain itu, diperlukan sampel daun segar dalam jumlah banyak karena sebagian besar komponen yang terkandung merupakan air yang terikat secara fisik. Ekstrak Proses ekstraksi pada penelitian ini dilakukan dengan metode maserasi atau perendaman dengan pelarut etanol 95%. Metode ini dipilih untuk mengurangi kemungkinan hilangnya komponen-komponen yang tidak tahan terhadap proses pemanasan. Perendaman sampel pada pelarut organik akan memecah dinding sel tumbuhan akibat perbedaan tekanan di dalam dan luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut pada pelarut organik (Darwis 2000).
Pelarut alkohol lazim digunakan dalam proses ekstraksi awal karena kemampuannya melarutkan komponen polar maupun nonpolar (Harbone 1987). Selain itu, penggunaan alkohol pada ekstraksi awal dapat menambah rendemen senyawa asetogenin (Rupprecht et al. 1990). Penelitian senyawa asetogenin sebelumnya juga banyak melakukan ekstraksi awal dengan pelarut alkohol seperti metanol (Gleye et al. 1998; Chang dan Wu 2001) dan etanol (Wu et al. 1995; Zang et al. 1996; Kim et al. 1998). Etanol digunakan karena lebih aman dibandingkan dengan metanol. Bagan alir proses ekstraksi dan partisi yang dilakukan dapat dilihat pada Lampiran 3. Partisi ekstrak pekat etanol 95% hasil maserasi menghasilkan 7 fraksi, yaitu fraksi air kuning, fraksi air jingga, fraksi air gelap, fraksi kloroform, fraksi residu, fraksi heksana, dan fraksi metanol (Gambar 1). Rendemen setiap fraksi yang dihasilkan dapat dilihat pada Lampiran 3.
Gambar 1
Ekstrak hasil fraksionasi daun sirsak gundul: fraksi etanol 95% (a), fraksi air gelap (b), fraksi air jingga (c), fraksi air kuning (d), fraksi kloroform (e), fraksi heksana (f), fraksi residu (g), dan fraksi metanol (h).
Toksisitas dengan Metode BSLT Uji toksisitas dilakukan untuk menguji potensi sitotoksik dari keseluruhan fraksi hasil partisi ekstrak etanol 95% dengan parameter nilai LC50 yang diperoleh dengan metode BSLT. LC50 merupakan konsentrasi senyawa bioaktif yang dapat menyebabkan kematian 50% populasi hewan uji. Hasil uji BSLT menunjukkan bahwa semua fraksi memiliki nilai LC50 di bawah 1000 ppm (Tabel 1). Menurut Krisnaraju et al. (2005), suatu fraksi dikatakan aktif dan berpotensi sebagai antikanker jika nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa keseluruhan fraksi aktif dan berpotensi sebagai antikanker.
4
Perhitungan LC50 dilakukan dengan metode SPSS pada selang kepercayaan 95%. Tabel 1 Nilai LC50 fraksi ekstrak daun sirsak gundul Ekstrak Fraksi air kuning Fraksi air jingga Fraksi air gelap Fraksi residu Fraksi kloroform Fraksi methanol Fraksi heksana
LC50 (ppm) 828 297 304 884 98 350 377
Fraksi kloroform merupakan fraksi teraktif dengan nilai LC50 paling rendah, yaitu 98 ppm. Oleh karena itu, fraksi tersebut difraksionasi lebih lanjut. Uji fitokimia dilakukan terhadap fraksi kloroform untuk memastikan golongan senyawa yang ada. Fitokimia Fraksi Kloroform Pengujian fitokimia bertujuan menentukan golongan metabolit sekunder yang terdapat di dalam tanaman. Uji fitokimia fraksi kloroform menunjukkan kandungan alkaloid, flavonoid, triterpenoid, steroid, dan tanin (Tabel 2). Rahayu et al. (1993) telah meneliti kandungan senyawa metabolit sekunder bagian daun tumbuhan A. squamosa. Fraksi kloroform daun didapat mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin. Hasil tersebut sama dengan yang diperoleh pada penelitian ini. Senyawa alkaloid dalam fraksi kloroform diduga terkandung paling banyak, berdasarkan intensitas warna yang dihasilkan dari uji fitokimia. Tabel 2
Hasil uji fitokimia ekstrak fraksi kloroform daun sirsak gundul
yang lazim digunakan untuk isolasi asetogenin. Eluen CHCl3-MeOH (9:1) (Gambar 2a) dan CH2Cl2-MeOH (19:1) (Gambar 2b) menghasilkan 2 noda dengan keterpisahan yang tidak baik. Eluen C6H6EtOAc-MeOH (5:4:1) (Gambar 2c) menghasilkan 7 noda dengan keterpisahan yang kurang baik. Campuran CH2Cl2-MeOH (2:1) (Gambar 2d) tidak menghasilkan keterpisahan yang baik, semua noda melebar dan memanjang. Eluen heksana-CH2Cl2MeOH (90:40:5) (Gambar 2e) menghasilkan 16 noda dengan keterpisahan yang relatif baik dibandingkan dengan eluen-eluen sebelumnya. Eluen heksana-metanol (90:1) (Gambar 2f) menghasilkan 6 noda dengan keterpisahan yang baik, tetapi totolan noda masih terlihat pekat yang menunjukkan bahwa masih banyak komponen belum terpisahkan (Gambar 2).
a Gambar 2
b
c
d
e
f
Hasil partisi ekstrak kloroform dengan campuran eluen CHCl3MeOH (9:1) (a), CH2Cl2-MeOH (19:1) (b), C6H6-EtOAc-MeOH (5:4:1) (c), CH2Cl2-MeOH (2:1) (d), heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) (e), dan heksanametanol (90:1) (f).
Campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) memberikan noda paling banyak Golongan senyawa Hasil Keterangan dengan keterpisahan relatif baik dibandingkan dengan eluen lainnya. Eluen ini kemudian Alkaloid (++) terjadi endapan digunakan dalam KLT preparatif. Didapatkan Flavonoid (+) berwarna kuning noda dengan keterpisahan yang paling baik Triterpenoid (+) berwarna merah berwarna merah dengan nilai retardation Steroid (+) berwarna hijau factor (Rf) 0.66 (Gambar 3). Pemilihan noda Saponin (-) tidak berbusa tersebut didasarkan sifat nonpolar dari Tanin (+) berwarna cokelat asetogenin yang aktif sebagai antikanker. Keterangan: (++) terdeteksi banyak, (+) terdeteksi sedikit, (-) Oleh karena itu, penggunaan eluen yang (-) tidak terdeteksi nonpolar akan memisahkan senyawa tersebut paling jauh. Hasil Partisi Fraksi Ekstrak Teraktif Partisi fraksi ekstrak teraktif diawali dengan menguji beberapa eluen campuran
5
Mistry (2009), puncak khas untuk pelarut kloroform berada pada kisaran 3060_2960, 1250_1180, 945_935, dan 830_600 cm-1. Oleh karena itu, serapan dalam spektrum noda teratas hasil KLT preparatif di 626.97, 669.35, 849.42, 877.38, 928.66, 1216.01, 1421.00, 1475.11, 1522.74, dan 2400.11 cm-1 juga berasal dari pelarut kloroform. C H C l 3 pa
L aborato ry T es t Res ul t
8 0.0
70
Gambar 3
Hasil partisi fraksi kloroform dengan heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) pada λ 366 nm.
60
50
40 %T 30
Analisis Spektrum FTIR Noda dengan keterpisahan paling baik hasil KLT preparatif diperiksa lebih lanjut kemurniannya dengan KLT analitik 2 dimensi. Elusi pertama menggunakan campuran eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5), dilanjutkan elusi kedua dengan campuran heksana-metanol (90:10). Proses elusi pertama dan kedua menghasilkan noda tunggal (Gambar 4).
E1 E2
Gambar 4 Hasil KLT 2 dimensi dengan eluen heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) untuk elusi pertama dan heksanametanol (90:10) untuk elusi kedua. Noda hasil KLT preparatif selanjutnya dilarutkan dengan kloroform dan diukur spektrumnya, dibandingkan dengan spektrum kloroform p.a. Spektrum masing-masing dapat dilihat pada Lampiran 4, sedangkan spektrum gabungan ditunjukkan pada Gambar 5. Spektrum IR kloroform dicirikan oleh bilangan gelombang ( ) 757.9 cm-1 yang merupakan daerah vibrasi ulur C-Cl. Selain itu, terdapat vibrasi ulur C-H di 3019.20 cm-1. Spektrum kloroform tersebut sama dengan spektrum kloroform yang dirujuk dari Pavia et al. (2009) (Lampiran 5). Menurut
20
C HC L3 pa s pot mer ah terat as
10
-2.0 4 00 0.0
3 00 0
2 00 0
1 50 0
1 00 0
cm-1
Gambar 5 Spektrum IR noda teratas fraksi kloroform daun sirsak gundul (warna hitam) dibandingkan dengan kloroform (warna merah). Spektrum FTIR noda setelah dikoreksi dengan spektrum kloroform memberikan pendugaan bahwa terdapat gugus fungsi alkohol (-OH) pada 3433.57 (ulur O-H berikatan hidrogen), 3630.31, dan 3682.01 cm-1 (ulur O-H bebas). Kemunculan pita serapan tajam O-H bebas di 3650_3600 cm-1 bersamaan dengan pita serapan lebar O-H berikatan hidrogen di 3400_3300 cm-1 lazim dijumpai ketika spektrum senyawa ditentukan dalam pelarut (Pavia et al. 2009). Hal tersebut diperkuat dengan adanya puncak pada 1016.70 cm-1 yang menunjukkan vibrasi ulur C-O untuk alkohol primer (Mistry 2009). Selain gugus tersebut, diduga terdapat C=C aromatik berdasarkan serapan pada 1475.11 dan 1602.36 cm-1. Serapan kuat pada 3019.20 cm-1 diperkirakan berasal dari C-H sp2 (alkena atau aromatik). Terdapat beberapa serapan gugus C-H, yaitu pada 2837.86 (ulur C-H alifatik alkana), 2944.84 (ulur C-H alifatik alkana), dan 928.66 (tekuk C-H alkena) cm-1. Spektrum FTIR tersebut tidak memberikan puncak pada 1770 dan 1745 cm-1 yang merupakan ciri khas lakton jenuh dan takjenuh dari asetogenin (Rupprecht et al. 1990). Oleh sebab itu, dapat disimpulkan bahwa noda yang diisolasi tersebut bukan golongan asetogenin. Selain itu, tidak terdapat serapan (puncak) untuk gugus karbonil (C=O)
4 50 .0
6
sebagai ciri umum kebanyakan flavonoid (Sukadana 2010). Oleh sebab itu, noda tersebut juga bukan termasuk golongan flavon, flavonol, atau golongan flavonoid lain dengan gugus karbonil di C-4.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Uji toksisitas BSLT menghasilkan fraksi kloroform sebagai fraksi teraktif dari ekstrak daun sirsak gundul (A. glabra) dengan nilai LC50 98 ppm. Berdasarkan hasil uji fitokimia, fraksi tersebut mengandung golongan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, dan tanin. Eluen campuran heksana-CH2Cl2-MeOH (90:40:5) menghasilkan noda paling banyak dengan keterpisahan yang baik. Spektrum FTIR dari salah satu noda dengan keterpisahan yang paling baik menunjukkan keberadaan gugus alkohol (-OH), C=C aromatik, serta C-H sp2 dan sp3. Saran Semua noda hasil KLT preparatif harus diuji dengan BSLT untuk menentukan noda teraktif. Penentuan struktur noda teraktif dilanjutkan dengan spektometer resonans magnet inti dan spektometer massa.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 1984. Official Methods of Analysis. Ed ke-14. Arlington: AOAC. Chang FR, Wu YC. 2001. Novel cytotoxic Annonaceous acetogenins from Annona muricata. J Nat Prod. 64:925-931. Darwis D. 2000. Teknik Dasar Laboratorium dalam Penelitian Senyawa Bahan Hayati. Padang: FMIPA Universitas Andalas. Gleye C, Duret P, Laurens A, Hocquemiller R, Cave A. 1998. cis-Monotetrahydrofuran acetogenins from the roots of Annona muricata. J Nat Prod. 61:576-579. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytocemical Methods.
Kim G et al. 1998. Two new monotetrahydrofuran ring acetogenins, annomuricin E and muricapentocin, from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod. 61:432-436. Kintzios SE, Barberaki MG, editor. 2004. Plants That Fight Cancer. New York: CRC Pr. Krishnaraju AV et al. 2005. Assessment of bioactivity of Indian medicinal plants using brine shrimp (A. salina) lethality assay. Int J Appl Sci Eng. 3:125-134. Kurnijasanti R, Hamid IS, Rahmawati K. 2008. Efek sitotoksik in vitro dari ekstrak buah mahkota dewa (Phaleria marcocapra) terhadap kultur sel kanker mienoma. J Penel Med Eksakta. 7(1):4854. Maria RGV et al. 2007. Flavonoids from Annona dioica leaves and their effects in Ehrlich carcinoma cells, DNAtopoisomerase I and II. J Braz Chem Soc. 18:1554-1559. McLaughlin JL. 2008. Paw Paw and cancer: Annonaceous acetogenins from discovery to commercial products. J Nat Prod. 71:1311-1321. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituent. Planta Medica. 45:31-34. Mistry BD. 2009. A Handbook of Spectroscopic Data Chemistry (UV, IR, PMR, 13C NMR, and Mass Spectroscopy). Jaipur: Oxford. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS, Vyvyan JR. 2009. Introduction to Spectroscopy. Ed ke-4. Belmont: Brooks/Cole. Rahayu RD, Chairul, Harapini M. 1993. Penelitian fitokimia dan efek mikrobial ekstrak serikaya terhadap E. coli. Di dalam: Proyek Litbang Sumber Daya Hayati. Prosiding Seminar Hasil Penelitian dan Pengembangan; Bogor, 14 Jun 1993. Bogor: Puslitbang Biologi-LIPI; 1993. hlm 154-164.
7
Rupprecht JK, Hui YH, McLaughlin JL. 1990. Annonaceous acetogenin: a review. J Nat Prod. 53:237-278. Sukadana IM. 2010. Aktivitas antibakteri senyawa flavonoid dari kulit akar AwarAwar (F. septica). J Kim. 4:63-70. Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. Wirakusumah ES. 1995. Buah dan Sayur untuk Terapi. Jakarta: Swadaya. Wu FE et al. 1995. Two new cytotoxic monotetrahydrofuran Annonaceous acetogenins, annomuricins A and B, from the leaves of Annona muricata. J Nat Prod. 58:830-836. Zebua NI. 2011. Aktivitas hambatan gabungan ekstrak kunyit (Curcuma domestica Va), temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb), dan lempuyang (Zingiber zerumbet) terhadap poliferasi sel kanker usus besar HCT (ATCC-CCL 116) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
7
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Daun sirsak
Penentuan kadar air Pengeringan sampel Maserasi dengan etanol 95% Ekstrak etanol Partisi dengan CHCl3-H2O
Ekstrak residu
Ekstrak CHCl3
Ekstrak H2O
Partisi dengan heksanametanol
Ekstrak metanol
Ekstrak heksana
Uji toksisitas (BSLT)
Ekstrak teraktif KLT analitik KLT preparatif Uji fitokimia
Noda dengan keterpisahan paling baik
Spektrofotometer FTIR
10
Lampiran 2 Hasil penentuan kadar air daun sirsak gundul Segar Ulangan 1 2 3
Massa awal (g) Cawan sampel 6.5050 3.0034 6.4353 2.9670 6.1543 3.0750
Massa akhir (g) cawan + sampel 7.2456 7.1482 6.9217
Bobot sampel kering (g) 0.7406 0.7129 0.7674 Rerata
Kadar air (%) 75.34 75.97 75.04 75.45
Massa akhir (g) cawan + sampel 5.2052 4.7320 4.7536
Bobot sampel kering (g) 1.7562 1.4120 1.5986 Rerata
Kadar air (%) 9.98 9.45 9.48 9.64
Setelah dikeringkan Ulangan 1 2 3
Massa awal (g) cawan sampel 3.4490 1.9508 3.3200 1.5594 3.1550 1.7661
11
Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi dan partisi asetogenin Annonaceae dan rendemen yang dihasilkan Serbuk daun A. glabra (505.52 g)
Zat larut etanol 95% (5.07%)
Ampas/sisa (94.93%)
Partisi CHCl3-H2O (1:1)
Residu (5.04%)
Zat larut H2O (22.50%)
Air gelap (32.44%)
Air kuning (21.62%)
Zat larut CHCl3 (72.46%)
Air jingga (45.94%)
Zat larut MeOH 90% (86.40%)
Partisi heksanaMeOH 90% (1:1)
Zat larut heksana (13.60%)
12
Lampiran 4 Spektrum FTIR hasil pengukuran s pot mer ah terat as L aborato ry T es t Res ul t
8 3.0
C HC L3 pa 70 1045.98
3689.00 1475.62
60
928.69 1522.76
50
3621.12
626.96
2399.79 1420.48 3019.65
%T
40 669.24
30 C H C l 3 pa
20
1215.63
10 757.55
-2.0 4 00 0.0
3 00 0
2 00 0
1 50 0
1 00 0
4 50 .0
cm-1
Spektrum FTIR kloroform p.a L aborato ry T es t Res ul t
8 5.0 80
s pot mer ah terat as
70
60
1602.36 877.38
50
%T
1333.68 1475.11
3682.01
495.17
849.42
2837.86
40
626.97
3433.57
1522.74
928.66
2400.11 1421.00
30
2944.84 3630.32
20
10
1016.70
3019.20
669.35 1216.01 757.95
-3.0 4 00 0.0
3 00 0
2 00 0
1 50 0
1 00 0
cm-1
Spektrum FTIR noda teratas dari fraksi kloroform A. glabra dengan pelarut kloroform p.a
4 50 .0
13
Lampiran 5 Spektrum kloroform (Pavia et al. 2009)
