ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ALKALOID DALAM EKSTRAK DAUN SIRSAK HUTAN (Annona glabra)
MELLA YANTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Identifikasi Senyawa Alkaloid dalam Ekstrak Daun Sirsak Hutan (Annona glabra) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2014 Mella Yanti NIM G44090029
ABSTRAK MELLA YANTI. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Alkaloid dalam Ekstrak Daun Sirsak Hutan (Annona glabra). Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan PURWANTININGSIH SUGITA. Tumbuhan sirsak hutan (Annona glabra) banyak digunakan sebagai obat tradisional. Dalam penelitian sebelumnya, ekstrak etanol daun sirsak hutan diketahui memiliki toksisitas terhadap larva udang dan embrio ikan zebra. Hasil uji fitokimia menunjukkan keberadaan alkaloid yang dominan dalam fraksi kloroform yang merupakan fraksi teraktif dari ekstrak tersebut. Penelitian ini bertujuan mengisolasi senyawa alkaloid dalam fraksi kloroform tersebut. Ekstrak alkaloid total diperoleh sebanyak 0.95 g (0.1%). Fraksionasi dengan kolom kromatografi menunjukkan keberadaan alkaloid yang terdeteksi pada fraksi D dalam eluen CHCl3-MeOH (90:10). Fraksi D memiliki 6 noda yang terdeteksi sebagai alkaloid berdasarkan kromatogram lapis tipis dengan eluen CHCl3-MeOH (85:15). Pemisahan noda tersebut pada kromatografi lapis tipis preparatif hanya menghasilkan 3 noda (D3; 1.1%, D4; 2.1%, dan D5; 1.5%) yang terlihat jelas pada pengamatan di bawah sinar ultraviolet 254 nm. Berdasarkan pencirian dengan kromatografi cair-spektrometer massa, spektrofotometer inframerah transformasi Fourier, dan ultraviolet-tampak, noda D3 diduga memiliki kemiripan dengan alkaloid armepavina. Kata kunci: alkaloid, Annona glabra, isokuinolina
ABSTRACT MELLA YANTI. Isolation dan Identification of Alkaloid from Pond Apple (Annona glabra) Leaf Extract. Supervised by GUSTINI SYAHBIRIN and PURWANTININGSIH SUGITA. Sirsak hutan (Annona glabra), is a plant that has been traditionally used as medicine. In previous studies, ethanol extract of A. glabra leaves has been reported to be toxic against brine shrimp and zebrafish embryo. The result of phytochemical test showed dominant presence of alkaloids in the chloroform fraction, which was the most active fraction of the extract. This study was intended to isolate alkaloids from the chloroform fraction. The total alkaloid extract was obtained as much as 0.95 g (0.1%). Fractionation using column chromatography showed the presence of alkaloids in D fraction obtained by CHCl3-MeOH (90:10) as the eluent. This fraction exhibited 6 spots that were detected as alkaloids based on thin layer chromatography analysis with CHCl3MeOH (85:15) eluent. Following separation of these spots on preparative thin layer chromatography, there were only 3 spots (D3; 1.1%, D4; 2.1%, and D5; 1.5%) with good separation based on ultraviolet spectrum at 254 nm. Based on spectra of liquid chromatography-mass spectrometer, Fourier transformed infrared, and ultraviolet, the D3 spot was predicted to be similar with armepavine. Keywords: alkaloids, Annona glabra, isoquinoline
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ALKALOID DALAM EKSTRAK DAUN SIRSAK HUTAN (Annona glabra)
MELLA YANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi : Isolasi dan Identifikasi Senyawa Alkaloid dalam Ekstrak Daun Sirsak Hutan (Annona glabra) Nama : Mella Yanti NIM : G44090029
Disetujui oleh
Dr Gustini Syahbirin, MS Pembimbing I
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Alkaloid dalam Ekstrak Daun Sirsak Hutan (Annona glabra)” ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini dilaksanakan dari bulan Juni 2013 hingga Agustus 2014 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, FMIPA IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Gustini Syahbirin, MS dan Ibu Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS sebagai pembimbing yang telah memberikan arahan, saran, nasihat, dan semangat selama penelitian. Selain itu penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Budi Arifin SSi, MSi atas segala dukungan semangat, masukan, nasihat, dan segala bantuan sebagai Komisi Pendidikan, Bapak Sabur atas segala motivasi, nasihat, dan pembelajarannya selama di laboratorium, Ibu Endah dan Bapak Azhar atas bantuannya selama analisis LCMS beserta staf yang terkait. Ungkapan terima kasih yang teramat dalam juga penulis sampaikan untuk kedua orang tua yang senantiasa bersabar menanti kelulusan penulis, atas doa, kasih sayang, semangat, dan dukungannya baik moral maupun material. Terima kasih penulis sampaikan kepada orang-orang terdekat yang selalu ada di samping penulis dari awal hingga karya ilmiah ini selesai, yaitu sahabat seperjuangan Kurnia, Andika, Yugo, Kak Lita, Kak Anna, Kak Hilwi, Ichsan, Febrina serta seluruh keluarga DMSO atas segala kebersamaan, semua motivasi, semangat, dan dukungan yang telah diberikan, serta kepada Agung dan Iin yang selalu memberikan semangat dan motivasi di kala penulis patah semangat. Semoga Allah SWT melimpahkan kebaikan yang telah diberikan. Amin. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, November 2014
Mella Yanti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Metode Penelitian HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Kasar Etanol Daun Sirsak Hutan Isolat Alkaloid dari Ekstrak Kasar Etanol Hasil Pemisahan Komponen Alkaloid Ciri-ciri Noda D3, D4, dan D5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
viii viii viii 1 2 2 2 3 3 5 6 7 11 11 11 12 14 16
DAFTAR TABEL 1 2
Senyawa alkaloid yang telah ditemukan dalam genus Annona Rendemen fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom ekstrak alkaloid total
4 6
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4
Kerangka isokuinolina dan turunannya 1 Hasil uji kualitatif alkaloid pada ekstrak kasar 4 Kromatogram KLT ekstrak alkaloid total dengan eluen CHCl3-MeOH (9:1) 6 Kromatogram fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom (A) dan pola pemisahan fraksi D dengan eluen terbaik CHCl3-MeOH (85:15) (B) 7 5 Kromatogram lapis tipis preparatif fraksi D diamati di bawah sinar UV 254 nm dengan eluen CHCl3-MeOH (85:15) 7 6 Kromatogram LC noda D3 dalam pelarut metanol dengan eluen asetonitril-air (95:5) 8 7 Pola fragmentasi noda D3 pada Rt 4.39 menit 8 8 Senyawa alkaloid yang struktur molekulnya memiliki nilai pada tanaman A. squamosa dan A. rugulosa 9 9 Spektrum ultraviolet noda D3 dengan pelarut metanol p.a. 10 10 Spektrum FTIR noda D3 10
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3
Bagan alir penelitian Rendemen ekstrak kasar daun sirsak hutan (A. glabra) Rendemen ekstrak alkaloid total
14 15 15
PENDAHULUAN Alkaloid merupakan senyawa metabolit sekunder yang paling banyak jumlah strukturnya. Senyawa ini banyak terdapat di dalam tumbuhan dan tersebar di seluruh bagiannya, terutama di bagian daun dan batang (Hesse 2002). Tumbuhan berbunga (Angiospermae) merupakan sumber terbesar senyawa alkaloid. Salah satu tumbuhan tersebut adalah famili Annonaceae, khususnya pada genus Annona. Alkaloid yang ditemukan umumnya termasuk ke dalam kelompok isokuinolina (Gambar 1) seperti yang telah ditemukan Campos et al. (2008) pada tumbuhan Annona sericea. Selain itu, ditemukan juga kelompok turunannya, yaitu benzilisokuinolina (Chen et al. 2001) pada Annona cherimola, aporfina (Bhakuni et al. 1972; Hasrat et al. 1997a, 1997b; Chang et al. 1998; Fofana et al. 2011; da Cruz et al. 2011; Vendramin et al. 2013) pada Annona squamosa, Annona muricata, Annona purpurea, dan Annona rugulosa, serta oksoaporfina (Bhaumik et al. 1979; Santos et al. 2003; Yang et al. 2004; Dutra et al. 2012) pada Annona dioica dan Annona pickelii. Senyawa tersebut memiliki aktivitas biologis yang beragam, antara lain sebagai antidepresi (Hasrat et al. 1997a, 1997b), dan penghambat sel tumor (Warthen et al. 1969).
Gambar 1 Kerangka isokuinolina dan turunannya Sirsak hutan (Annona glabra) merupakan salah satu spesies Annonaceae yang dikenal dengan istilah pond apple. Tumbuhan ini berasal dari daerah Amerika, Asia Tenggara, dan Taiwan bagian selatan, tetapi tumbuh pula di Indonesia, salah satunya di daerah Bogor, antara lain di wilayah kampus IPB Dramaga. Negara Taiwan telah banyak meneliti tumbuhan tersebut, yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat di berbagai wilayah sebagai obat tradisional. Di wilayah Andes, Peru, tumbuhan ini dimanfaatkan untuk obat radang selaput lendir yang disebabkan oleh asma, masyarakat Amazon menggunakannya sebagai obat diabetes, penenang, dan antikejang, sementara masyarakat Kalimantan dan Afrika memanfaatkannya sebagai obat demam (Zuhud 2011). Chang et al. (2000) telah meneliti buah dan batang sirsak hutan yang dikumpulkan dari Pingtung, Taiwan. Dari penelitian tersebut diperoleh 12 senyawa alkaloid, 5 senyawa steroid, dan 2 senyawa amida. Aktivitas biologis yang dimiliki tumbuhan ini di antaranya sebagai antimikrob, antijamur, insektisida, dan sporisida (Padmaja et al. 1995). Penelitian Hendana (2012) dan Nazmi (2013) pada daun sirsak hutan dari
2
kawasan Kampus IPB Dramaga mendapatkan bahwa berdasarkan uji toksisitas ekstrak etanol daun dengan metode toksisitas letal larva udang dan toksisitas embrio ikan zebra, fraksi kloroform adalah fraksi teraktif. Uji fitokimia menunjukkan keberadaan alkaloid sebagai metabolit sekunder yang dominan. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan dengan mengisolasi dan mencirikan senyawa alkaloid dalam fraksi kloroform tersebut.
BAHAN DAN METODE Sampel yang digunakan adalah daun sirsak hutan yang diperoleh dari Lahan Praktik Lapangan Teknik Pertanian, Kampus IPB Dramaga, Bogor. Daun yang dipilih adalah yang tidak berlubang, bebas hama dan ulat, berwarna hijau tua dengan tulang daun yang kokoh, serta diambil pada bagian tengah dan pangkal dahan.
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat kaca, kolom 20 cm, spektrofotometer ultraviolet kromatografi, pelat kaca ukuran 20 cm tampak (UV-Vis) Shimadzu UV 1601 di Laboratorium Terpadu, IPB, spektrofotometer inframerah transformasi Fourier (FTIR) Shimadzu IRPrestige-21 di Puslit BATAN, Pasar Jumat, dan kromatografi cair-spektrometer massa (LCMS) Xevo G2-S Q-Tof di Puslabfor, Mabes Polri. Bahan yang digunakan meliputi daun sirsak hutan, pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf, silika gel 60 (0.040−0.063 mm), pelat silika gel 60 GF254, kloroform p.a. dan etanol yang telah didistilasi.
Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu analisis pendahuluan, isolasi alkaloid, pemisahan komponen, pemurnian, dan analisis senyawa alkaloid. Bagan alir penelitian ini dijelaskan dalam Lampiran 1. Ekstraksi Sebanyak 840 g serbuk kering daun sirsak diekstraksi dengan cara maserasi. Proses maserasi dilakukan dengan merendam sampel dalam etanol 96% selama 3 24 jam pada suhu ruang. Filtrat yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar hingga didapatkan ekstrak pekat. Uji Alkaloid (Harborne 1987) Sebanyak 0.1 g ekstrak dilarutkan dalam 10 mL kloroform dan ditambahkan amoniak pekat hingga suasana basa, kemudian disaring. Filtrat ditambahkan H2SO4 2 M dan dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (takberwarna)
3
dipisahkan ke dalam 3 sumur berbeda pada lempeng tetes, masing-masing ditambahkan dengan beberapa tetes pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf. Uji positif alkaloid berturut-turut ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih kekuningan, endapan cokelat, dan endapan jingga. Isolasi Alkaloid (Chang et al. 2000) Ekstrak dipartisi menggunakan campuran kloroform-air (1:1) dengan melarutkan ekstrak terlebih dahulu dalam kloroform. Lapisan kloroform (bagian bawah) dipisahkan dan diekstraksi dengan asam asetat 5% hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (bagian atas) dipisahkan dan dibasakan dengan NH4OH pekat hingga pH 9−10, lalu diekstraksi kembali dengan kloroform. Lapisan kloroform dipisahkan dan dipekatkan dengan penguap putar hingga diperoleh ekstrak alkaloid total. Pemisahan dan Pemurnian Komponen alkaloid dipisahkan menggunakan kolom kromatografi berdiameter 2.5 cm dan panjang 50 cm dengan kapasitas sampel maksimum 1 g. Ekstrak dimasukkan ke dalam kolom yang telah dikemas. Proses elusi dilakukan menggunakan pelarut n-heksana, kloroform, etil asetat, dan metanol dengan berbagai variasi kepolaran secara bertingkat, dimulai dari pelarut nonpolar. Setiap 50 mL eluat yang terkumpul diuji dengan kromatografi lapis tipis (KLT). Eluat yang menunjukkan noda dengan nilai Rf yang sama pada eluen CHCl3-MeOH (9:1) digabungkan menjadi 1 fraksi. Setiap fraksi tersebut diperiksa keberadaan alkaloidnya dengan cara menyemprotkan pereaksi alkaloid pada pelat KLT. Fraksi yang paling kuat alkaloidnya dipisahkan lebih lanjut dengan KLT preparatif hingga didapatkan noda tunggal. Pencirian Senyawa Alkaloid Senyawa alkaloid dianalisis dengan LC-MS, spektrofotometer UV-Vis, dan FTIR. Sampel untuk analisis LCMS dilarutkan dalam pelarut metanol, lalu dirunning dengan laju alir 0.4 mL/menit selama 20 menit. Kolom C18 dianalisis pada suhu 50 °C dan eluen air-asetonitril dengan metode ionisasi penyemprotan elektron (ESI+). Spektrum UV diukur dalam pelarut metanol p.a. dan dipayar pada panjang gelombang 200−800 nm dengan interval 0.2 nm. Spektrum FTIR diukur pada 2−3 cc larutan sampel dalam metanol. Larutan dimasukkan dalam pelat attenuated total reflectance (ATR), lalu dianalisis dan diamati spektrumnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Kasar Etanol Daun Sirsak Hutan Ekstrak kasar etanol daun sirsak hutan yang diperoleh dari proses maserasi sebanyak 119.8610 g, dengan rendemen sebesar 14.27% (Lampiran 2), berupa cairan kental berwarna hijau kehitaman. Cara maserasi dipilih untuk menghindari rusaknya senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap panas (suhu
4
>40 °C). Pelarut yang digunakan adalah etanol 96%. Menurut Pranata (1997), alkaloid dengan kondisi terikat asam organik dapat larut baik dalam etanol 96%. Alkohol juga merupakan pelarut organik yang umum digunakan dalam proses maserasi karena dapat melarutkan komponen polar maupun nonpolar (Harborne 1987). Pelarut etanol ini telah digunakan oleh beberapa peneliti, di antaranya Bhakuni et al. (1972) dan Bhaumik et al. (1979) pada A. squamosa, Hasrat et al. 1997a, 1997b (A. muricata), Santos et al. (2003) (A. dioica), dan Vendramin et al. (2013) (A. rugulosa). Ekstrak etanol diuji kualitatif alkaloid dengan beberapa pereaksi. Pereaksi Dragendorf berupa larutan kompleks dari logam bismut berwarna jingga yang memberikan sinyal positif berupa endapan jingga (Gambar 2A). Pereaksi Mayer berupa larutan kompleks dari logam merkuri berwarna putih dengan memberikan sinyal positif berupa endapan putih (Gambar 2B). Pereaksi Wagner merupakan larutan I2 dalam kalium iodida berwarna cokelat pekat dan sinyal positif ditandai oleh terbentuknya endapan cokelat (Gambar 2C). Hasil uji menunjukkan bahwa daun sirsak hutan positif mengandung senyawa alkaloid.
Gambar 2 Hasil uji kualitatif alkaloid pada ekstrak kasar Chang et al. (2000) dan Hsieh et al. (2004) telah menganalisis senyawa kimia yang terkandung dalam buah dan batang sirsak hutan. Senyawa alkaloid yang berhasil ditemukan adalah anobraina, lisikamina, nornusiferina, anonaina, Nformilanonaina, asimilobina, nordomestisina, stefarina, kikemanina, dehidrokoridalmina, azaantrakuinon, dan liriodenina. Tabel 1 menampilkan data senyawa alkaloid yang telah ditemukan pada tumbuhan dalam genus Annona. Tabel 1 Senyawa alkaloid yang telah ditemukan dalam genus Annona Spesies Senyawa alkaloid Anonaina, liriodenina, anobraina, A. squamosa xilofina, glausina, anoskualina, (Bhakuni et al. 1972; Bhaumik et al. koridina, rumerina, norlaurelina, 1979; Yang et al. 2004) dan O-metilarmepavina. Anonaina, retikulina, stefarina, A. muricata nornusiferina, (Leboeuf et al. 1981; Hasrat et al. 1997a, asimilobina, 1997b; Fofana et al. 2011) xilofina, dan anomurisina. Liriodenina, argentinina, dan A. montana (Wu et al. 1993) anolatina. Lirinidina, taliksimina, dan A. purpurea (Chang et al. 1998) norpurpureina. Anoserin A&B, serianoin, dan A. cherimola (Chen et al. 2001) romukosina.
5
Tabel 1 Senyawa alkaloid yang telah ditemukan dalam genus Annona lanjutan Liriodenina, geovanina, dan A. dioica (Santos et al. 2003) lisiodiplodina. Lisikamina, isoboldina, (S)-retikulina, A. sericea (Campos et al. 2008) nornusiferina, dan nornantenina. Liriodenina, anonaina, retikulina, A. salzmani (da Cruz et al. 2011) xilofina, asimilobina, dan kleistofilin. Liriodenina, lisikamina, asimilobina, dan A. pickelii (Dutra et al. 2012) nornusiferina. Anonaina, asimilobina, liriodenina, A. rugulosa isoboldina, retikulina, xilofina, N(Vendramin et al. 2013) nornusiferina, dan lanuginosina.
Isolat Alkaloid dari Ekstrak Kasar Etanol Alkaloid diisolasi berdasarkan prinsip ekstraksi asam-basa. Alkaloid memiliki sifat basa dari atom nitrogen penyusunnya. Umumnya alkaloid di dalam tumbuhan terikat dengan asam organik membentuk garam. Garam alkaloid ini yang kemudian diekstraksi dengan pelarut organik yang sesuai. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah kloroform. Pranata (1997) mengatakan bahwa kloroform dapat melarutkan alkaloid dengan baik dan telah umum digunakan dalam proses isolasi. Kloroform memiliki sifat semipolar sehingga dapat dengan baik melarutkan alkaloid. Namun, tidak hanya senyawa alkaloid yang terekstraksi, tetapi juga senyawa metabolit sekunder lainnya yang memiliki kepolaran berdekatan dengan kloroform. Hal ini telah dibuktikan oleh Hsieh et al. (2004) yang menemukan senyawa diterpenoid, steroid, dan asetogenin juga terlarut dalam kloroform. Larutan asam organik atau anorganik digunakan untuk memisahkan alkaloid dari senyawa metabolit sekunder lain yang ikut terekstraksi dalam kloroform. Alkaloid akan terlarut dalam larutan asam karena kondisinya dalam bentuk garam. Penambahan NH4OH bertujuan melepaskan ikatan alkaloid dengan asamnya sehingga alkaloid kembali berada dalam kondisi bebas. Penambahan NH4OH dihentikan pada pH 9−10. Selanjutnya alkaloid dalam kondisi bebas dapat diekstraksi dengan pelarut kloroform. Isolat alkaloid total berupa ekstrak berwarna cokelat pekat sebanyak 0.9479 g (0.11%) (Lampiran 3). Untuk menentukan banyaknya senyawa alkaloid yang terekstraksi, dilakukan uji KLT, lalu keberadaan alkaloid dideteksi secara kualitatif dengan menyemprotkan pereaksi Dragendorf pada kromatogram. Hasil positif akan ditunjukkan oleh noda jingga yang tertinggal pada kromatogram (Gambar 3). Hasil uji menunjukkan adanya 8 noda yang terpisah dengan nilai Rf noda tersebut sekaligus ditampilkan dalam kromatogram.
6
Gambar 3 Kromatogram KLT ekstrak alkaloid total dengan eluen CHCl3-MeOH (9:1)
Hasil Pemisahan Komponen Alkaloid Ekstrak alkaloid total dipisahkan komponen-komponennya dengan kromatografi kolom, dihasilkan 6 fraksi dengan rendemen bobot dalam setiap fraksi ditunjukkan pada Tabel 2. Fraksi-fraksi tersebut selanjutnya diuji fitokimia terhadap alkaloidnya dengan menyemprotkan pereaksi Wagner pada kromatogram hasil KLT. Fraksi yang didapati positif alkaloid adalah fraksi D (0.1628 g). Keterpisahan komponen alkaloid fraksi D tersebut di dalam eluen CHCl3-MeOH (9:1) belum baik. Hal ini terlihat dari munculnya noda dengan pola memanjang seperti tampak pada kromatogram (Gambar 4A). Oleh karena itu, dicari eluen lain yang menghasilkan keterpisahan antar komponen lebih baik. Eluen terbaik yang diperoleh adalah CHCl3-MeOH (85:15), yang menghasilkan 6 noda pada kromatogram KLT-nya (Gambar 4B). Fraksi D selanjutnya dipisahkan dengan KLT preparatif menggunakan eluen terbaik tersebut. Tabel 2 Rendemen fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom ekstrak alkaloid total Fraksi Eluen Rendemen (%) A n-Heksana-CHCl3 (10:90) 8.76 B 100% CHCl3 5.24 C CHCl3-EA (50:50) 7.89 D CHCl3-MeOH (90:10) 17.17 E CHCl3-MeOH (80:10) 6.04 F CHCl3-MeOH (80:20) 5.93
7
A B Gambar 4 Kromatogram fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom (A) dan pola pemisahan fraksi D dengan eluen terbaik CHCl3-MeOH (85:15) (B) Kromatogram lapis tipis preparatif fraksi D (Gambar 5) memberikan keterpisahan yang dapat dilihat jelas di bawah sinar UV 254 nm untuk noda D3, D4, dan D5. Rendemen ketiga noda tesebut berturut-turut adalah 1.1% (10 mg), 2.1% (20 mg), dan 1.5% (14 mg).
Gambar 5 Kromatogram lapis tipis preparatif fraksi D diamati di bawah sinar UV 254 nm dengan eluen CHCl3-MeOH (85:15)
Ciri-ciri Noda D3, D4, dan D5 Hasil LC-MS noda D3, D4, dan D5 Kromatogram LC menunjukkan hubungan waktu retensi (Rt) dengan % kelimpahan. Setiap puncak yang muncul pada Rt tertentu diduga merupakan 1 senyawa. Kromatogram LC noda D3 (Gambar 6) masih menunjukkan campuran senyawa, terlihat dari munculnya banyak puncak. Namun, senyawa dengan % kelimpahan yang cukup tinggi muncul pada Rt 0.80, 2.89, 4.39, 5.08, 6.71, 10.25, 12.67, 16.81, dan 17.85 menit. Di antara senyawa-senyawa tersebut, senyawa yang diduga alkaloid ditentukan dari keberadaan atom nitrogen, yaitu puncak dengan Rt 2.89, 4.39, 5.08, dan 6.71 menit. Masing-masing puncak tersebut kemudian diamati pola pemisahan spektrum MS-nya. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa senyawa dengan Rt 4.39 menit memiliki pola fragmentasi
8
yang lebih baik, yaitu sesuai dengan senyawa dugaan atau memiliki % kelimpahan ion molekul mendekati 100%.
Gambar 6
Kromatogram LC noda D3 dalam pelarut metanol dengan eluen asetonitril-air (95:5)
Spektrum MS menunjukkan hubungan antara nilai massa per muatan (m/z) dan % kelimpahan (Gambar 7). Spektrum MS noda D3 pada Rt 4.39 menit menunjukkan bobot molekul (BM) 313 g/mol dengan kelimpahan ion molekul pada m/z 314 (M+H) paling tinggi (puncak dasar). Kemudian elemental composition report (ECP) molekul ini dianalisis untuk menduga rumus molekul.
Gambar 7 Pola fragmentasi noda D3 pada Rt 4.39 menit Senyawa bernitrogen dengan BM 313 g/mol paling mungkin memiliki rumus molekul C19H23NO3, dengan kemiripan sebesar 99.65%. Dari rumus molekul tersebut, dapat ditentukan angka ketidakjenuhan (UN) atau indeks defisiensi hidrogen (IHD) untuk menduga struktur alkaloid yang dimiliki senyawa tersebut. Persamaan (1) digunakan untuk menghitung nilai UN (Pavia et al. 2001). CaHbOcNdXe, X: F, Cl, Br, dan I
(
) (
)
(1)
9
Kromatogram LC noda D4 dan D5 juga menunjukkan keberadaan campuran senyawa. Senyawa pada noda D4 dengan % kelimpahan yang cukup tinggi muncul pada Rt 0.79, 4.17, 5.95, 6.23, 6.58, 6.87, 9.97, 10.96, 12.69, 16.66, dan 17.58 menit, sedangkan pada noda D5 muncul pada Rt 2.89, 3.93, 4.43, 6.60, 10.97, 11.94, 15.75, 16.33, dan 18.10 menit. Puncak dengan kemungkinan alkaloid untuk noda D4 ada pada Rt 0.79, 4.17, 5.95, 6.23, 6.87, 10.96, 16.66, 17.58 menit, dan untuk noda D5 ada pada Rt 3.93, 6.60, 10.97 menit. Pengamatan pola fragmentasi spektrum MS pada setiap puncak alkaloid tersebut mendapatkan pola fragmentasi terbaik berturut-turut pada puncak dengan Rt 6.23 dan 6.60 menit. Spektrum MS untuk noda D4 dengan Rt 6.23 menit maupun noda D5 dengan Rt 6.60 menit menunjukkan BM 295 g/mol, dengan puncak ion molekul pada m/z 296 (M+H) menjadi puncak dasar. Berdasarkan elemental composition report (ECP), noda D4 dan D5 paling mungkin memiliki rumus molekul C19H21NO2 (kemiripan 64.77%) dan C15H21NO5 (kemiripan 12.54%). Tidak ditentukannya nilai UN atau IHD untuk kedua noda tersebut disebabkan oleh % kemiripan rumus molekulnya yang berada di bawah 95%. Oleh karena itu, pendugaan struktur selanjutnya hanya difokuskan pada noda D3 dengan Rt 4.39 menit saja dan analisis spektroskopi sebagai pendukungnya. Hasil perhitungan UN noda D3 ialah , sehingga dalam struktur molekul tersebut diduga terdapat cincin heterosiklik jenuh dengan atom N dan 2 cincin benzena ( , 6 ikatan rangkap 2 dan 2 cincin siklik). Dugaan tersebut memberikan gambaran kerangka struktur benzilisokuinolina yang merupakan turunan dari alkaloid isokuinolina. Senyawa alkaloid yang pernah dilaporkan dalam genus Annona dan struktur molekulnya memiliki nilai ialah retikulina (1), O-metilarmepavina (2), dan armepavina (3) (Gambar 8).
Gambar 8 Senyawa alkaloid yang struktur molekulnya memiliki nilai pada tanaman A. squamosa dan A. rugulosa Berdasarkan hasil analisis LC-MS tersebut, noda D3 diduga merupakan senyawa alkaloid armepavina. Pendugaan tersebut berdasarkan kemiripan nilai BM dan rumus molekulnya, sedangkan spektrum MS tidak dapat dianalisis, karena pola pemisahan tidak cukup baik untuk diinterpretasikan. Data MS pembanding belum dimiliki, sebab Bhaumik et al. (1979) tidak melakukan analisis MS pada alkaloid O-metilarmepavina yang diperolehnya.
10
Spektrum UV-Vis Noda D3 Spektrum UV-vis diukur menggunakan pelarut metanol p.a dengan nilai cutoff 205 nm. Pengukuran diawali dengan perlakuan baseline (nilai serapan pelarut dibuat 0), sehingga hasil yang terukur merupakan serapan dari sampel. Spektrum UV-Vis (Gambar 9) menampilkan hubungan panjang gelombang dan nilai serapan (absorbans). Nilai serapan diperoleh pada panjang gelombang 210, 282, dan 359 nm. Ciri khas senyawa alkaloid ialah adanya atom nitrogen yang memiliki pasangan elektron bebas. Atom nitrogen ini menyerap sinar UV pada panjang gelombang >270 nm (Fessenden dan Fessenden 1998). Dibandingkan dengan data UV senyawa O-metilarmepavina (Bhaumik et al. 1979) dalam pelarut metanol, terdapat kemiripan panjang gelombang antara hasil pengukuran (282 nm) dan data pembanding (280 nm). Perbedaan panjang gelombang ini mungkin disebabkan oleh perbedaan kondisi atau posisi atom nitrogen dalam strukturnya.
Gambar 9 Spektrum ultraviolet noda D3 dengan pelarut metanol p.a. Spektrum FTIR noda D3 Spektrum FTIR menunjukkan hubungan antara nilai bilangan gelombang dan intensitas transmitansnya. Noda D3 memunculkan serapan pada bilangan gelombang 3485.37, 3182.55, 2922.16, 1660.71, 1111.00, 1060.85, dan 1004.91 cm-1 (Gambar 10).
Gambar 10 Spektrum FTIR noda D3
11
Serapan pada bilangan gelombang 1060.85 cm-1 diduga berasal dari ikatan C−N amina 1°, 2°, atau 3°. Hal ini didukung oleh serapan pada 3485.37 cm-1 yang merupakan serapan ulur N−H amina 1° atau 2°. Senyawa alkaloid umumnya ditemukan dalam bentuk amina 2° atau 3°, sebagian kecil saja yang ditemukan dalam bentuk amina 1°. Kemungkinan lain adanya ikatan C−N antara atom N dan C alifatik diduga dari serapan di 2922.16 cm-1 yang terdeteksi sebagai ikatan C−H alkana. Serapan di 1660.71 cm-1 dengan intensitas lemah diduga merupakan ikatan C=N imina yang serapannya akan muncul dari intensitas lemah sampai kuat. Nilai serapan pada 1004.91 cm-1 mengarahkan dugaan pada ikatan C−O, yang kemungkinan dihasilkan oleh alkaloid yang memiliki substituen O-metil atau –OH. Ikatan C−O tersebut akan terdeteksi dalam spektrum FTIR pada serapan 1120 cm-1 untuk substitusi O-metil dan 1150-1100 cm-1 untuk –OH (alkohol 2° atau 3°). Serapan di 1111.00 cm-1 diduga menunjukkan ikatan C−O−C dari substitusi O-metil dan atau –OH dari armepavina. Senyawa aromatik (benzena) terdeteksi dari ikatan C=C aromatik dan C-H aromatik yang masingmasing memunculkan serapan di 1600 dan 1475 cm-1; 3150−3050 cm-1. Serapan di 3182.55 cm-1 diduga berasal dari ikatan C-H aromatik, sedangkan ikatan C=C aromatik tidak terdeteksi dalam spektrum (Pavia et al. 2001). Sebagian besar puncak yang terdeteksi pada spektrum IR memiliki kemiripan gugus ikatan dengan senyawa armepavina. Hanya sebagian kecil, yaitu serapan pada 3485.37 dan 1660.71 cm-1 yang diduga berasal dari senyawa lain. Nilai-nilai serapan tersebut bukan merupakan nilai yang statis, tetapi pada umumnya terdeteksi pada kisaran nilai tersebut. Adanya kedekatan nilai serapan memungkinkan kemiripan gugus fungsi yang muncul.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak alkaloid total diperoleh sebanyak 0.95 g (0.1%) dari daun sirsak hutan. Pemisahan komponen alkaloid dengan metode kromatografi kolom dan KLT preparatif menghasilkan 3 noda alkaloid (D3, 1.05%; D4, 2.11%; D5, 1.48%). Berdasarkan hasil pencirian dengan LC-MS, spektrofotometer UV-Vis dan FTIR, noda D3 diduga merupakan senyawa armepavina.
Saran Alkaloid perlu dideteksi di setiap tahapan proses isolasi agar tidak ada senyawa yang tertinggal. Pemisahan awal dengan metode kromatografi cair vakum (KCV) juga perlu dilakukan agar senyawa alkaloid yang diperoleh lebih baik kemurniannya.
12
DAFTAR PUSTAKA Bhakuni DS, Tewari S, Dhar MM. 1972. Aporphine alkaloids of Annona squamosa. Phytochemistry. 11(5):1819-1822. Bhaumik PK, Mukherjee B, Juneau JP, Bhacca NS, Mukherjee R. 1979. Alkaloids from leaves of Annona squamosa. Phytochemistry. 18(9):1584-1586. Campos FR, Batista RL, Batista CL, Costa EV, Barison A, dos Santos AG, Pinheiro ML. 2008. Isoquinoline alkaloids from leaves of Annona sericea Annonaceae. Biochem Syst Ecol. 36:804-806.. Chang FR, Wei JL, Teng CM, Wu YC. 1998. Two new 7-dehydroaporphine alkaloids and antiplatelet action aporphines from the leaves of Annona purpurea. Phytochemistry. 49(7):2015-2018. Chang FR, Chen CY, Hsieh TJ, Cho CP, Wu YC. 2000. Chemical constituents from Annona glabra III. J Chinese Chem Soc. 47:913-920. Chen CY, Chang FR, Pan WB, Wu YC. 2001. Four alkaloids from Annona cherimola. Phytochemistry. 56:753-757. Cochrane CB, Nair PK, Melnick SJ, Resek AP, Ramachandran C. 2008. Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human leukemia cell lines. Anticancer Res. 28:965-972. da Cruz PEO, Costa EV, de Souza Moraes VR, de Lima Nogueira PC, Vendramin ME, Barison A, Ferreira AG, do Nascimento Prata AP. 2011. Chemical constituents from the bark of Annona salzmani (Annonaceae). Biochem Syst Ecol. 39:872-875. Dutra LM, Costa EV, de Souza Moraes VR, de Lima Nogueira PC, Vendramin ME, Barison A, Prata APN. 2012. Chemical constituents from the leaves of Annona pickelii. Biochem Syst Ecol. 41:115-118. Fessenden & Fessenden. 1998. Kimia Organik, terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka, edisi ketiga, jilid 2. Jakarta (ID): Erlangga. Fofana S, Ziyaev R, Abdusamatov A. 2011. Alkaloids from Annona muricata leaves. Chem Nat Compd. 47(2):944-945. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): ITB. Terjemahan dari: Phytocemical Methods. Hasrat JA, de Bruyne T, de Backer JP, Vauquelin G, Vlietinck AJ. 1997a. Isoquinoline derivatives isolated from the fruits of Annona muricata as 5HTergic 5-HT1A receptor agonists in rats: unexploited antidepressive (Leads) Products. J Pharm Pharmacol. 49(11):1145-1149. Hasrat JA, Pieters L, de Backer JP, Vauquelin G, Vlietinck AJ. 1997b. Screening of medicinal plants from Suriname for 5-HT1A ligands: bioactive isoquinoline alkaloids from the fruit of Annona muricata. Phytomedicine. 4(2):133-140. Hendana W. 2012. Toksisitas akut ekstrak daun sirsak ratu (Annona muricata) dan sirsak hutan (Annona glabra) sebagai potensi anti kanker [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Hesse M. 2002. Alkaloids Nature’s Curse or Blessing. Zurich (CH): J Wiley. Hsieh TJ, Wu YC, Chen SC, Huang CS, Chen CY. 2004. Chemical constituents from Annona glabra. J Chinese Chem Soc. 51:869-876.
13
Leboeuf M, Legueut C, Cave A, Descondois JF, Forgacs P, Jacquemin H. 1981. Alkaloids of Annonaceae XXIX: alkaloids of Annona muricata. Planta Med. 42(5):37-44.. Nazmi M. 2013. Pencirian ekstrak aktif sitotoksik dari daun sirsak gundul (Annona glabra) Indonesia [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Padmaja V, Thankamany V, Hara N, Fujimoto Y, Hisham A. 1995. Biological activities of Annona glabra. J Ethnopharmacol. 48(1):21-24. Pavia DL, Lampman GM, Kriz GS. 2001. Introduction to Spectroscopy. Ed ke-3. Washington (US): Thomson Learning. Pranata FS. 1997. Isolasi alkaloid dari bahan alam. Biota. 2(2):96-99. Santos PR, Morais AA, Filho RB. 2003. Alkaloids from Annona dioica. J Braz Chem Soc. 14(3):396-400. Vendramin ME, Costa EV, dos Santos EP, Belem Pinheiro ML, Barison A, Campos FR. 2013. Chemical constituents from the leaves of Annona rugulosa (Annonaceae). Biochem Syst Ecol. 49:152-155. Warthen D, Gooden EL, Jacobson M. 1969. Tumor inhibitors: liriodenine, a cytotoxic alkaloid from Annona glabra. J Pharm Sci. 58(5):637-638. Wu YC, Chang GY, Yih DC, Kwei YS. 1993. Cytotoxic alkaloids of Annona montana. Phytochemistry. 33(2):497-500. Yang YL, Chang FR, Wu YC. 2004. Annosqualin: a novel alkaloid from the steams of Annona squamosa. Helv Chim Acta. 87(6):1392-1399. Zuhud EA. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta (ID): Agromedia Pustaka.
14
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
15
Lampiran 2 Rendemen ekstrak kasar daun sirsak hutan (A. glabra)
Sampel Daun hutan
sirsak
Bobot Sampel (g) 840.0000
Bobot vial (g) Kosong + ekstrak 96.9750
216.8360
Bobot Ekstrak (g) 119.8610
Rendemen (%)
Bobot Ekstrak (g) 0.9479
Rendemen (%)
14.27
Perhitungan
Lampiran 3 Rendemen ekstrak alkaloid total
Sampel Ekstrak alkaloid Perhitungan
Bobot Sampel (g) 840.0000
Bobot vial (g) kosong + ekstrak 10.6916 11.6395
0.11
16
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta, 16 Juni 1991 dari pasangan Juli Anwar dan Darmiyanti. Penulis merupakan anak keempat dari 4 bersaudara. Tahun 2009, penulis lulus dari SMA Negeri 54 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Ujian Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama menjadi mahasiswi, penulis aktif dalam beberapa kegiatan kemahasiswaan. Tahun 2010 penulis ikut serta dalam kepanitiaan Chemistry Challenge (Pesta Sains Nasional) dan pada Tahun 2011 penulis menjabat sebagai bendahara dalam kegiatan Seminar Nasional Kimia Aplikatif (SENSITIF). Penulis juga mengabdikan diri sebagai asisten kimia TPB selama 4 periode, dan 1 periode sebagai asisten Kimia Organik Bahan Alam di Departemen Kimia, IPB. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Keteknikan Kehutanan dan Pengolahan Hasil Hutan (Pustekolah), Gunung Batu pada bulan Juli-Agustus 2012 dengan judul “Pembuatan Bioetanol dari Buah Lindur (Bruguiera gymnorrhiza) dengan Proses Fermentasi”.
